JPH1033189A - ビオチンの発酵生産 - Google Patents
ビオチンの発酵生産Info
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- JPH1033189A JPH1033189A JP9114571A JP11457197A JPH1033189A JP H1033189 A JPH1033189 A JP H1033189A JP 9114571 A JP9114571 A JP 9114571A JP 11457197 A JP11457197 A JP 11457197A JP H1033189 A JPH1033189 A JP H1033189A
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- biotin
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- C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 デスチオビオチンからビオチンを効率よく製
造する方法を提供すること。 【解決手段】 ｂｉｏＢ遺伝子産物（ＢＩＯＢ）とｎｉ
ｆＵ遺伝子産物（ＮＩＦＵ）および／またはｎｉｆＳ遺
伝子産物（ＮＩＦＳ）を含有する酵素反応系とデスチオ
ビオチンを接触させ、得られたビオチンを反応混合物か
ら単離することを特徴とする、デスチオビオチンからの
ビオチンの製造方法。
造する方法を提供すること。 【解決手段】 ｂｉｏＢ遺伝子産物（ＢＩＯＢ）とｎｉ
ｆＵ遺伝子産物（ＮＩＦＵ）および／またはｎｉｆＳ遺
伝子産物（ＮＩＦＳ）を含有する酵素反応系とデスチオ
ビオチンを接触させ、得られたビオチンを反応混合物か
ら単離することを特徴とする、デスチオビオチンからの
ビオチンの製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はデスチオビオチンか
らビオチンを生産する発酵方法に関するものである。
らビオチンを生産する発酵方法に関するものである。
【０００２】ビオチンは動物、植物および微生物の栄養
源として必須ビタミンの一つであり医薬品または食品添
加物として非常に重要である。
源として必須ビタミンの一つであり医薬品または食品添
加物として非常に重要である。
【０００３】
【従来の技術】ビオチンの発酵生産に関する数多くの研
究がある。エシェリヒア(Escherichia) 株は上記の方法
のために使用可能であることが知られている（例えば、
特開昭61-149091 、WO87／01391 および特開昭62-15508
1 参照）。上記の菌株に加えてバチルス(Bacillus)株
（特開平3-180174）、セラチア(Serratia)株（特開平2-
27980 ）、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)株（特
開平3-240489）が知られている。しかし、これらの方法
は栄養源からビオチンへの炭素回収の低効率およびいく
つかの場合、直接前駆体であるデスチオビオチンの蓄積
のために工業利用には未だに適切ではない。したがっ
て、デスチオビオチンからビオチンへの変換効率の改善
が望まれる。エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)の
休止菌体系を用いたデスチオビオチンからビオチンへの
変換反応〔Antimicrob. Agents Chemother., 21, 5 (19
82) 〕およびエシェリヒア・コリの無細胞抽出液を用い
た変換反応〔J. Biol. Chem., 270, 19158 (1995); Bio
sci. Biotechnol. Biochem., 56,1780 (1992); Eur. J.
Biochem., 224, 173, (1994); Arch. Biochem. Biophy
s., 326, 48 (1996) 〕が知られている。これらの公知
の事実にもとづいて、ビオチンシンターゼ（biotin syn
thase)とともにフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ
（ferredoxin-NADP reductase)およびフラボドキシン
（flavodoxin）の様なタンパク質因子がデスチオビオチ
ンからビオチンへの変換反応に関与していることが解明
されている。しかしながら、これらの条件下では限られ
た有効性のみがデスチオビオチンからビオチンへの変換
反応に認められたにすぎない。他の未知タンパク質がさ
らに効率良くデスチオビオチンをビオチンへ変換する反
応に関与していることが容易に推測された。
究がある。エシェリヒア(Escherichia) 株は上記の方法
のために使用可能であることが知られている（例えば、
特開昭61-149091 、WO87／01391 および特開昭62-15508
1 参照）。上記の菌株に加えてバチルス(Bacillus)株
（特開平3-180174）、セラチア(Serratia)株（特開平2-
27980 ）、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)株（特
開平3-240489）が知られている。しかし、これらの方法
は栄養源からビオチンへの炭素回収の低効率およびいく
つかの場合、直接前駆体であるデスチオビオチンの蓄積
のために工業利用には未だに適切ではない。したがっ
て、デスチオビオチンからビオチンへの変換効率の改善
が望まれる。エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)の
休止菌体系を用いたデスチオビオチンからビオチンへの
変換反応〔Antimicrob. Agents Chemother., 21, 5 (19
82) 〕およびエシェリヒア・コリの無細胞抽出液を用い
た変換反応〔J. Biol. Chem., 270, 19158 (1995); Bio
sci. Biotechnol. Biochem., 56,1780 (1992); Eur. J.
Biochem., 224, 173, (1994); Arch. Biochem. Biophy
s., 326, 48 (1996) 〕が知られている。これらの公知
の事実にもとづいて、ビオチンシンターゼ（biotin syn
thase)とともにフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ
（ferredoxin-NADP reductase)およびフラボドキシン
（flavodoxin）の様なタンパク質因子がデスチオビオチ
ンからビオチンへの変換反応に関与していることが解明
されている。しかしながら、これらの条件下では限られ
た有効性のみがデスチオビオチンからビオチンへの変換
反応に認められたにすぎない。他の未知タンパク質がさ
らに効率良くデスチオビオチンをビオチンへ変換する反
応に関与していることが容易に推測された。
【０００４】さらに、フェレドキシン−ＮＡＤＰレダク
ターゼおよびフラボドキシンの生理的電子伝達系を利用
する代わりに、人工的電子供与体として光還元されたデ
アザフラビンとバチルス・スフェリカス(Bacillus spha
ericus) の精製されたビオチンシンターゼを用いた変換
反応が最近報告されている〔Biochem. Biophys. Res.Co
mmun., 217, 1231 (1995)〕。しかし、報告されている
反応効率はビオチンの工業生産に利用し得るほど十分に
高いものではない。
ターゼおよびフラボドキシンの生理的電子伝達系を利用
する代わりに、人工的電子供与体として光還元されたデ
アザフラビンとバチルス・スフェリカス(Bacillus spha
ericus) の精製されたビオチンシンターゼを用いた変換
反応が最近報告されている〔Biochem. Biophys. Res.Co
mmun., 217, 1231 (1995)〕。しかし、報告されている
反応効率はビオチンの工業生産に利用し得るほど十分に
高いものではない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はデスチ
オビオチンからより効率良くビオチンを生産する方法を
見出すことであり、この目的のためにさまざまなタンパ
ク質因子を評価した。その結果、ニトロゲナーゼ(nitro
genase) の金属クラスター核形成のために必要な鉄およ
び硫黄の供給に関与することが示唆されている〔J. Bac
teriol., 175,6737 (1993) 〕ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ
遺伝子産物（以後、ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳと略す）が
デスチオビオチンからのより多いビオチンの生産にきわ
めて有効であることが見出された。本発明は上記の発見
に基づいている。
オビオチンからより効率良くビオチンを生産する方法を
見出すことであり、この目的のためにさまざまなタンパ
ク質因子を評価した。その結果、ニトロゲナーゼ(nitro
genase) の金属クラスター核形成のために必要な鉄およ
び硫黄の供給に関与することが示唆されている〔J. Bac
teriol., 175,6737 (1993) 〕ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ
遺伝子産物（以後、ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳと略す）が
デスチオビオチンからのより多いビオチンの生産にきわ
めて有効であることが見出された。本発明は上記の発見
に基づいている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明はｂ
ｉｏＢ遺伝子（ビオチンシンターゼをコードする）産物
（以後、ＢＩＯＢと略す）とさらにＮＩＦＵおよび／ま
たはＮＩＦＳを含有する酵素反応系とデスチオビオチン
を接触させ、得られたビオチンを反応混合物から単離す
ることを特徴とする、デスチオビオチンからのビオチン
の製造方法を提供するものであり、かかる製造方法にお
いて、ＢＩＯＢがエシェリヒア・コリのものであり、な
おかつＮＩＦＵおよび／またはＮＩＦＳがクレビシエラ
・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) のものであ
り、もしくは前に記載の製造方法において、該酵素反応
液がＳ−アデノシルメチオニン、Ｌ−システインおよ
び、例えば、ＮＡＤＰＨ、フェレドキシン−ＮＡＤＰレ
ダクターゼおよびフラボドキシンからなる電子供与系ま
たはデアザリボフラビンまたはその機能的同等物からな
る電子供与体を含むものである。
ｉｏＢ遺伝子（ビオチンシンターゼをコードする）産物
（以後、ＢＩＯＢと略す）とさらにＮＩＦＵおよび／ま
たはＮＩＦＳを含有する酵素反応系とデスチオビオチン
を接触させ、得られたビオチンを反応混合物から単離す
ることを特徴とする、デスチオビオチンからのビオチン
の製造方法を提供するものであり、かかる製造方法にお
いて、ＢＩＯＢがエシェリヒア・コリのものであり、な
おかつＮＩＦＵおよび／またはＮＩＦＳがクレビシエラ
・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) のものであ
り、もしくは前に記載の製造方法において、該酵素反応
液がＳ−アデノシルメチオニン、Ｌ−システインおよ
び、例えば、ＮＡＤＰＨ、フェレドキシン−ＮＡＤＰレ
ダクターゼおよびフラボドキシンからなる電子供与系ま
たはデアザリボフラビンまたはその機能的同等物からな
る電子供与体を含むものである。
【０００７】また、本発明の更なる目的は反応をpH６．
０〜８．５、好ましくはpH７．０〜８．０および２０〜
４５℃の温度範囲、好ましくは２５〜４０℃の温度範囲
で行うことからなる上記の製造方法を提供することにあ
る。
０〜８．５、好ましくはpH７．０〜８．０および２０〜
４５℃の温度範囲、好ましくは２５〜４０℃の温度範囲
で行うことからなる上記の製造方法を提供することにあ
る。
【０００８】さらに本発明は、ＢＩＯＢとＮＩＦＵおよ
び／またはＮＩＦＳをコードするＤＮＡ配列そのもの、
もしくはこれらのＤＮＡ配列を有する単一または独立し
た複数のプラスミドにより形質転換された微生物を水性
栄養培地中でデスチオビオチンの存在下で培養し、生産
されたビオチンを培養培地から単離することを特徴とす
る、デスチオビオチンからのビオチンの製造方法を提供
することにある。特に、このような方法においてここで
言う微生物とはエシェリヒア属から選択された微生物で
あり、またここで言う培養は１〜５日間、好ましくは１
〜３日間、pHは５〜９、好ましくは６〜８、１０〜４５
℃温度範囲、好ましくは２５〜４０℃の温度範囲で行わ
れる。
び／またはＮＩＦＳをコードするＤＮＡ配列そのもの、
もしくはこれらのＤＮＡ配列を有する単一または独立し
た複数のプラスミドにより形質転換された微生物を水性
栄養培地中でデスチオビオチンの存在下で培養し、生産
されたビオチンを培養培地から単離することを特徴とす
る、デスチオビオチンからのビオチンの製造方法を提供
することにある。特に、このような方法においてここで
言う微生物とはエシェリヒア属から選択された微生物で
あり、またここで言う培養は１〜５日間、好ましくは１
〜３日間、pHは５〜９、好ましくは６〜８、１０〜４５
℃温度範囲、好ましくは２５〜４０℃の温度範囲で行わ
れる。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明中で用いられる酵素変換反
応系はＢＩＯＢとＮＩＦＵおよび／またはＮＩＦＳのタ
ンパク質因子を含む。上記の反応のためのＢＩＯＢとし
ては、ＢＩＯＢを含む無細胞抽出液、または通常の酵素
精製法により部分精製または完全精製されたＢＩＯＢを
用いることができる。ビオチン・シンターゼ(biotin sy
nthase) 活性を有していれば、如何なるＢＩＯＢをこの
反応に用いても良いが、好ましくはエシェリヒア・コリ
ＢＩＯＢが良い。所望により、以下の方法により大量の
精製ＢＩＯＢを得ることができる。まず、ｂｉｏＢ遺伝
子のコード領域の完全長をカバーする適当な大きさのＤ
ＮＡ断片を持つエシェリヒア・コリの遺伝子ライブラリ
ーを構築する。エシェリヒア・コリのｂｉｏＢ遺伝子は
１．３kbのＮｃｏＩ−ＨａｅIII 断片中に位置している
ことが知られている〔J. Biol. Chem., 263, 19577 (19
88) 〕ので、これらの２つの制限酵素を都合良く使用す
ることができる。この目的のためには、市販されている
さまざまなベクタープラスミドを使用することができ
る。Pharmacia Biotech Co. から入手できるベクタープ
ラスミドｐＴｒｃ９９Ａは当該分野で一般的に使用され
る誘導型発現プラスミドの一つである。次に、遺伝子ラ
イブラリーの組換えプラスミドＤＮＡの混合物をエシェ
リヒア・コリの株から抽出し、エシェリヒア・コリのｂ
ｉｏＢ欠損変異株の形質転換に使用する。この目的のた
めには、エシェリヒア・コリＲ８７５〔bioB17;J. Bact
eriol., 112, 830 (1972)〕が適している。目的のｂｉ
ｏＢ遺伝子の発現によりビオチン非要求性を示すように
なったクローンを選択する。選ばれたクローンはｂｉｏ
Ｂ遺伝子を有しており、さらにその遺伝子を発現する。
この性質を示す如何なる組換えプラスミドもＢＩＯＢを
得るために使用できる。ｐＴｒｃＥＢ１と命名された組
換えプラスミドは目的のプラスミドの一つである。大量
のＢＩＯＢを得るために、常法に従いｐＴｒｃＥＢ１に
より形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝
酒造株式会社）を栄養培地中で培養し発現を誘導する。
生産されたＢＩＯＢは一般的なクロマトグラフィー技術
により単離することができる。あるいは、エシェリヒア
・コリｂｉｏＢ遺伝子発現プラスミドは特開昭61-14909
1 または特開平7-236493に記載されている既知の方法に
従い構築することもできる。
応系はＢＩＯＢとＮＩＦＵおよび／またはＮＩＦＳのタ
ンパク質因子を含む。上記の反応のためのＢＩＯＢとし
ては、ＢＩＯＢを含む無細胞抽出液、または通常の酵素
精製法により部分精製または完全精製されたＢＩＯＢを
用いることができる。ビオチン・シンターゼ(biotin sy
nthase) 活性を有していれば、如何なるＢＩＯＢをこの
反応に用いても良いが、好ましくはエシェリヒア・コリ
ＢＩＯＢが良い。所望により、以下の方法により大量の
精製ＢＩＯＢを得ることができる。まず、ｂｉｏＢ遺伝
子のコード領域の完全長をカバーする適当な大きさのＤ
ＮＡ断片を持つエシェリヒア・コリの遺伝子ライブラリ
ーを構築する。エシェリヒア・コリのｂｉｏＢ遺伝子は
１．３kbのＮｃｏＩ−ＨａｅIII 断片中に位置している
ことが知られている〔J. Biol. Chem., 263, 19577 (19
88) 〕ので、これらの２つの制限酵素を都合良く使用す
ることができる。この目的のためには、市販されている
さまざまなベクタープラスミドを使用することができ
る。Pharmacia Biotech Co. から入手できるベクタープ
ラスミドｐＴｒｃ９９Ａは当該分野で一般的に使用され
る誘導型発現プラスミドの一つである。次に、遺伝子ラ
イブラリーの組換えプラスミドＤＮＡの混合物をエシェ
リヒア・コリの株から抽出し、エシェリヒア・コリのｂ
ｉｏＢ欠損変異株の形質転換に使用する。この目的のた
めには、エシェリヒア・コリＲ８７５〔bioB17;J. Bact
eriol., 112, 830 (1972)〕が適している。目的のｂｉ
ｏＢ遺伝子の発現によりビオチン非要求性を示すように
なったクローンを選択する。選ばれたクローンはｂｉｏ
Ｂ遺伝子を有しており、さらにその遺伝子を発現する。
この性質を示す如何なる組換えプラスミドもＢＩＯＢを
得るために使用できる。ｐＴｒｃＥＢ１と命名された組
換えプラスミドは目的のプラスミドの一つである。大量
のＢＩＯＢを得るために、常法に従いｐＴｒｃＥＢ１に
より形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝
酒造株式会社）を栄養培地中で培養し発現を誘導する。
生産されたＢＩＯＢは一般的なクロマトグラフィー技術
により単離することができる。あるいは、エシェリヒア
・コリｂｉｏＢ遺伝子発現プラスミドは特開昭61-14909
1 または特開平7-236493に記載されている既知の方法に
従い構築することもできる。
【００１０】前記反応に使用されるＮＩＦＵとＮＩＦＳ
としては、ＮＩＦＵとＮＩＦＳを含有する無細胞抽出
液、または通常の酵素精製法により部分精製されたＮＩ
ＦＵとＮＩＦＳを用いることができる。デスチオビオチ
ンからビオチンへの変換反応に効果を示すものならば、
如何なるＮＩＦＵとＮＩＦＳをこの反応に用いても良
い。しかしながら、好ましくはクレビシエラ・ニューモ
ニエのＮＩＦＵとＮＩＦＳが良い。クレビシエラ・ニュ
ーモニエＭ５ａ１はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を持つよ
く研究されている菌株である。クレビシエラ・ニューモ
ニエのｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子は以下の方法により得
られる。まず、クレビシエラ・ニューモニエＭ５ａ１の
遺伝子ライブラリーはＢａｍＨＩのような制限酵素によ
り切断されたＤＮＡ断片を使用して構築する。目的のｎ
ｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子はクレビシエラ・ニューモニエ
染色体ＤＮＡ中の２．５kbのＢａｍＨＩ断片に含まれる
ことが知られているので〔J. Bacteriol., 169, 4024
(1987) 〕、２．３〜２．６kbの長さのＤＮＡ断片を回
収し、適当な微生物中で複製できるベクタープラスミド
に連結する。ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株
式会社）とエシェリヒア・コリＪＭ１０９遺伝子ライブ
ラリーを構築するためのベクタープラスミドと宿主微生
物の適した組み合わせの一つである。報告されているｎ
ｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子のＤＮＡ配列をもとに合成され
たオリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーハイブ
リダイゼーションのような常法に従って目的のクローン
を選択することができる。次に、ｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺
伝子を有するＤＮＡ断片を他の発現ベクタープラスミド
にサブクローニングする。ｐＴｒｃ９９Ａのような誘導
型発現ベクターはｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発現する
ためには好ましい。エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐ
ＫＮｎｉｆ０４）はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発現す
るのに適したクローンの一つである。なお、European B
ioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambridge,
GB) などの配列データバンクから得ることができる公表
されているｂｉｏＢ、ｎｉｆＵ、およびｎｉｆＳ遺伝子
の配列をもとに、当該分野で公知の方法（EP747 483 な
どを参照）に従ってこれらの遺伝子ＤＮＡを合成するこ
とも可能である。如何なるＢＩＯＢ、ＮＩＦＵまたはＮ
ＩＦＳをコードするＤＮＡ配列でも、公表されているＤ
ＮＡ配列にもとづいて、周知のＰＣＲ技術により任意の
微生物から単離することが可能である。そのような微生
物はIndustrial Property 〔(1991) 1, 29-40 〕に記載
されている菌株保存機関、例えばThe American Type Cu
lture Collection (ATCC) などから入手することができ
る。
としては、ＮＩＦＵとＮＩＦＳを含有する無細胞抽出
液、または通常の酵素精製法により部分精製されたＮＩ
ＦＵとＮＩＦＳを用いることができる。デスチオビオチ
ンからビオチンへの変換反応に効果を示すものならば、
如何なるＮＩＦＵとＮＩＦＳをこの反応に用いても良
い。しかしながら、好ましくはクレビシエラ・ニューモ
ニエのＮＩＦＵとＮＩＦＳが良い。クレビシエラ・ニュ
ーモニエＭ５ａ１はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を持つよ
く研究されている菌株である。クレビシエラ・ニューモ
ニエのｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子は以下の方法により得
られる。まず、クレビシエラ・ニューモニエＭ５ａ１の
遺伝子ライブラリーはＢａｍＨＩのような制限酵素によ
り切断されたＤＮＡ断片を使用して構築する。目的のｎ
ｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子はクレビシエラ・ニューモニエ
染色体ＤＮＡ中の２．５kbのＢａｍＨＩ断片に含まれる
ことが知られているので〔J. Bacteriol., 169, 4024
(1987) 〕、２．３〜２．６kbの長さのＤＮＡ断片を回
収し、適当な微生物中で複製できるベクタープラスミド
に連結する。ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株
式会社）とエシェリヒア・コリＪＭ１０９遺伝子ライブ
ラリーを構築するためのベクタープラスミドと宿主微生
物の適した組み合わせの一つである。報告されているｎ
ｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子のＤＮＡ配列をもとに合成され
たオリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーハイブ
リダイゼーションのような常法に従って目的のクローン
を選択することができる。次に、ｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺
伝子を有するＤＮＡ断片を他の発現ベクタープラスミド
にサブクローニングする。ｐＴｒｃ９９Ａのような誘導
型発現ベクターはｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発現する
ためには好ましい。エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐ
ＫＮｎｉｆ０４）はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発現す
るのに適したクローンの一つである。なお、European B
ioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambridge,
GB) などの配列データバンクから得ることができる公表
されているｂｉｏＢ、ｎｉｆＵ、およびｎｉｆＳ遺伝子
の配列をもとに、当該分野で公知の方法（EP747 483 な
どを参照）に従ってこれらの遺伝子ＤＮＡを合成するこ
とも可能である。如何なるＢＩＯＢ、ＮＩＦＵまたはＮ
ＩＦＳをコードするＤＮＡ配列でも、公表されているＤ
ＮＡ配列にもとづいて、周知のＰＣＲ技術により任意の
微生物から単離することが可能である。そのような微生
物はIndustrial Property 〔(1991) 1, 29-40 〕に記載
されている菌株保存機関、例えばThe American Type Cu
lture Collection (ATCC) などから入手することができ
る。
【００１１】本発明において使用される微生物の培養は
既知の方法によって行うことができる。同化できる炭素
源、消化できる窒素源、無機塩そして微生物の生育に必
要な栄養素を含有する水性培地を水性栄養培地として使
用することができる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、フラクトース、ラクトース、ガラクトース、シュー
クロース、マルトース、澱粉、デキストリンまたはグリ
セリンなどを使用することができる。窒素源としては、
例えばペプトン、脱脂大豆粕、コーンスティープリカ
ー、肉エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
尿素またはこれらの混合物を使用することができる。さ
らに無機塩としては、カルシウム、マグネシウム、亜
鉛、マンガン、コバルト、鉄などの硫酸塩、塩酸塩また
はリン酸塩などを使用することができる。また必要な
ら、通常の栄養素もしくは動物オイル、野菜オイル、も
しくは鉱物オイルなどの消泡剤を水性栄養培地に添加す
ることもできる。得られた微生物が抗生物質耐性マーカ
ーを有している場合、該当する抗生物質を培地に添加す
ることもできる。目的の遺伝子の発現がイソプロピル−
ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によ
り誘導される場合、この化合物が培地中に存在すること
も可能である。培地のpHは５〜９が適当であるが、好ま
しくは６〜８が良い。培養温度は１０〜４５℃が適当で
あるが、好ましくは２５〜４０℃が良い。培養時間は通
常１〜５日間であるが、１〜３日間が好ましい。
既知の方法によって行うことができる。同化できる炭素
源、消化できる窒素源、無機塩そして微生物の生育に必
要な栄養素を含有する水性培地を水性栄養培地として使
用することができる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、フラクトース、ラクトース、ガラクトース、シュー
クロース、マルトース、澱粉、デキストリンまたはグリ
セリンなどを使用することができる。窒素源としては、
例えばペプトン、脱脂大豆粕、コーンスティープリカ
ー、肉エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
尿素またはこれらの混合物を使用することができる。さ
らに無機塩としては、カルシウム、マグネシウム、亜
鉛、マンガン、コバルト、鉄などの硫酸塩、塩酸塩また
はリン酸塩などを使用することができる。また必要な
ら、通常の栄養素もしくは動物オイル、野菜オイル、も
しくは鉱物オイルなどの消泡剤を水性栄養培地に添加す
ることもできる。得られた微生物が抗生物質耐性マーカ
ーを有している場合、該当する抗生物質を培地に添加す
ることもできる。目的の遺伝子の発現がイソプロピル−
ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によ
り誘導される場合、この化合物が培地中に存在すること
も可能である。培地のpHは５〜９が適当であるが、好ま
しくは６〜８が良い。培養温度は１０〜４５℃が適当で
あるが、好ましくは２５〜４０℃が良い。培養時間は通
常１〜５日間であるが、１〜３日間が好ましい。
【００１２】培養により得られた菌体からの無細胞抽出
液の調製には超音波処理、ガラスビーズ存在下での破砕
またはフレンチプレスによるものなどの常法が利用でき
る。細胞破砕後、得られた溶液は細胞残骸の分離のため
遠心操作され、その上清は無細胞抽出液として使用でき
る。
液の調製には超音波処理、ガラスビーズ存在下での破砕
またはフレンチプレスによるものなどの常法が利用でき
る。細胞破砕後、得られた溶液は細胞残骸の分離のため
遠心操作され、その上清は無細胞抽出液として使用でき
る。
【００１３】酵素反応系は反応成分として上記のように
調製された無細胞抽出液中に含まれるＢＩＯＢとＮＩＦ
Ｕおよび／もしくはＮＩＦＳか部分精製された同反応成
分を含有する。上記のタンパク質に加えて、本反応の基
質としてデスチオビオチンが添加される。デスチオビオ
チンの添加量は使用される酵素反応系に応じて変更でき
る。Ｄ−型もしくはＤ−型とＬ−型の混合物であるデス
チオビオチンが基質として使用できる。Ｓ−アデノシル
メチオニン、Ｌ−システインおよびデアザリボフラビン
またはその機能的同等物のような電子供与体の添加は本
反応を促進する。本反応のためのデアザリボフラビンま
たはその機能的同等物のような電子供与系（特に人工的
電子供与体として）の代わりに、ＮＡＤＰＨとともにフ
ェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼとフラボドキシン
を生理的電子供与系として使用することができる。これ
らの添加成分の至適濃度は使用される酵素反応系に応じ
て変更できる。しかし一般に、５０μM 〜２mM Ｓ−ア
デノシルメチオニン、１０μM 〜２mM Ｌ−システイン
および１０〜１，０００μM デアザリボフラビンが推奨
される。
調製された無細胞抽出液中に含まれるＢＩＯＢとＮＩＦ
Ｕおよび／もしくはＮＩＦＳか部分精製された同反応成
分を含有する。上記のタンパク質に加えて、本反応の基
質としてデスチオビオチンが添加される。デスチオビオ
チンの添加量は使用される酵素反応系に応じて変更でき
る。Ｄ−型もしくはＤ−型とＬ−型の混合物であるデス
チオビオチンが基質として使用できる。Ｓ−アデノシル
メチオニン、Ｌ−システインおよびデアザリボフラビン
またはその機能的同等物のような電子供与体の添加は本
反応を促進する。本反応のためのデアザリボフラビンま
たはその機能的同等物のような電子供与系（特に人工的
電子供与体として）の代わりに、ＮＡＤＰＨとともにフ
ェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼとフラボドキシン
を生理的電子供与系として使用することができる。これ
らの添加成分の至適濃度は使用される酵素反応系に応じ
て変更できる。しかし一般に、５０μM 〜２mM Ｓ−ア
デノシルメチオニン、１０μM 〜２mM Ｌ−システイン
および１０〜１，０００μM デアザリボフラビンが推奨
される。
【００１４】反応進行のため、ビオチン生成に悪影響を
およぼさない緩衝液が利用できる。Tris−ＨＣｌ緩衝液
が好ましく使用できる。酵素反応はpH領域６．０〜８．
５、さらに好ましくはpH領域７．０〜８．０で行うのが
適切である。反応温度は２０〜４５℃間、さらに好まし
くは２５〜４０℃間が適切である。反応促進にデアザリ
ボフラビンを使用する場合は、反応混合物から約１０cm
の距離をおいた蛍光灯からの照射を利用した光還元によ
り反応が開始される。反応時間は３０分から３時間程度
である。酵素が活性を有している限り、より長い反応時
間も有効である。
およぼさない緩衝液が利用できる。Tris−ＨＣｌ緩衝液
が好ましく使用できる。酵素反応はpH領域６．０〜８．
５、さらに好ましくはpH領域７．０〜８．０で行うのが
適切である。反応温度は２０〜４５℃間、さらに好まし
くは２５〜４０℃間が適切である。反応促進にデアザリ
ボフラビンを使用する場合は、反応混合物から約１０cm
の距離をおいた蛍光灯からの照射を利用した光還元によ
り反応が開始される。反応時間は３０分から３時間程度
である。酵素が活性を有している限り、より長い反応時
間も有効である。
【００１５】前記の酵素反応系の他に、ｎｉｆＵとｎｉ
ｆＳ遺伝子を直接利用することも可能である。例えば、
ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子をすでに記載
したように調製し、単一もしくは独立した複数のプラス
ミドに組込み、エシェリヒア・コリのような宿主微生物
に通常の形質転換法により導入する。そして、培養系も
しくは休止菌体系によりデスチオビオチンからビオチン
を生産することも可能である。また所望により、この微
生物の無細胞抽出液を用いた酵素反応系も利用すること
ができる。ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子を
同時に高発現するように改良されている如何なるエシェ
リヒア・コリも利用することが可能である。これらの菌
株中では、特にエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒ
ｃＥＢ１、ｐＫＮｎｉｆ０５）およびエシェリヒア・コ
リＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）が好ましい。
ｆＳ遺伝子を直接利用することも可能である。例えば、
ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子をすでに記載
したように調製し、単一もしくは独立した複数のプラス
ミドに組込み、エシェリヒア・コリのような宿主微生物
に通常の形質転換法により導入する。そして、培養系も
しくは休止菌体系によりデスチオビオチンからビオチン
を生産することも可能である。また所望により、この微
生物の無細胞抽出液を用いた酵素反応系も利用すること
ができる。ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子を
同時に高発現するように改良されている如何なるエシェ
リヒア・コリも利用することが可能である。これらの菌
株中では、特にエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒ
ｃＥＢ１、ｐＫＮｎｉｆ０５）およびエシェリヒア・コ
リＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）が好ましい。
【００１６】前記の条件でデスチオビオチンから生産さ
れたビオチンは容易に回収することができる。この目的
のためには、ビオチンの種々の性質に適応した、ある生
産物を溶液から抽出する一般的な方法を使用することが
できる。したがって、例えば、固形物を溶液から除去し
た後、濾液中のビオチンを活性炭吸着させ、溶出させ、
さらにイオン交換樹脂で精製すれば良い。別の方法とし
ては、濾液を直接イオン交換樹脂に供し、溶出後、目的
の生産物をアルコールと水の混合物から再結晶させても
良い。
れたビオチンは容易に回収することができる。この目的
のためには、ビオチンの種々の性質に適応した、ある生
産物を溶液から抽出する一般的な方法を使用することが
できる。したがって、例えば、固形物を溶液から除去し
た後、濾液中のビオチンを活性炭吸着させ、溶出させ、
さらにイオン交換樹脂で精製すれば良い。別の方法とし
ては、濾液を直接イオン交換樹脂に供し、溶出後、目的
の生産物をアルコールと水の混合物から再結晶させても
良い。
【００１７】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に
より限定されるものではない。
に説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に
より限定されるものではない。
【００１８】実施例１：エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺
伝子のクローニングおよび発現 （１）染色体ＤＮＡの調製 エシェリヒア・コリＨＢ１０１〔J. Mol. Biol., 41, 4
59 (1969);宝酒造株式会社〕をＬＢ培地（トリプトン１
％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％；pH
７．５）１００ml中で３７℃、１０時間培養を行い、菌
体を遠心分離で集めた。菌体からフェノール法(Experim
ents with gene fusions, Cold SpringHarbor Laborato
ry Press 1984, pp. 137-139; Sambrook et al. 1989 "
Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory
Press) により染色体ＤＮＡを抽出精製し、０．７mgの
染色体ＤＮＡを得た。
伝子のクローニングおよび発現 （１）染色体ＤＮＡの調製 エシェリヒア・コリＨＢ１０１〔J. Mol. Biol., 41, 4
59 (1969);宝酒造株式会社〕をＬＢ培地（トリプトン１
％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％；pH
７．５）１００ml中で３７℃、１０時間培養を行い、菌
体を遠心分離で集めた。菌体からフェノール法(Experim
ents with gene fusions, Cold SpringHarbor Laborato
ry Press 1984, pp. 137-139; Sambrook et al. 1989 "
Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory
Press) により染色体ＤＮＡを抽出精製し、０．７mgの
染色体ＤＮＡを得た。
【００１９】（２）遺伝子ライブラリーの調製 図１に示す方法に従い、（１）で得られた染色体ＤＮＡ
３μg をＮｃｏＩとＨａｅIII を用いて完全に切断し、
アガロースゲル電気泳動により１．２〜１．５kbのＤＮ
Ａ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＳｍａ
Ｉで切断したベクタープラスミドｐＴｒｃ９９Ａ(Pharm
acia Biotech Co., Pharmacia, Uppsala, Sweden) とDN
A ligation Kit（宝酒造株式会社）を用いて使用説明書
に従い連結させた。次いで、連鎖反応後のＤＮＡを常法
(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press 1982, pp. 252-253)に従いエシェリヒア・コリＪ
Ｍ１０９〔Gene, 33, 103 (1985)〕に導入し、ＬＢ寒天
培地上で１００μg/mlのアンピシリン耐性を示す形質転
換株を選んだ。その結果、強力なトリプトファン／ラク
トースハイブリッドプロモーター（ｔｒｃプロモータ
ー）〔Gene, 69, 301-315 (1988)〕の下流に染色体ＤＮ
Ａ断片が挿入された、３，０００種類のクローンを遺伝
子ライブラリーとして得た。
３μg をＮｃｏＩとＨａｅIII を用いて完全に切断し、
アガロースゲル電気泳動により１．２〜１．５kbのＤＮ
Ａ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＳｍａ
Ｉで切断したベクタープラスミドｐＴｒｃ９９Ａ(Pharm
acia Biotech Co., Pharmacia, Uppsala, Sweden) とDN
A ligation Kit（宝酒造株式会社）を用いて使用説明書
に従い連結させた。次いで、連鎖反応後のＤＮＡを常法
(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press 1982, pp. 252-253)に従いエシェリヒア・コリＪ
Ｍ１０９〔Gene, 33, 103 (1985)〕に導入し、ＬＢ寒天
培地上で１００μg/mlのアンピシリン耐性を示す形質転
換株を選んだ。その結果、強力なトリプトファン／ラク
トースハイブリッドプロモーター（ｔｒｃプロモータ
ー）〔Gene, 69, 301-315 (1988)〕の下流に染色体ＤＮ
Ａ断片が挿入された、３，０００種類のクローンを遺伝
子ライブラリーとして得た。
【００２０】遺伝子ライブラリーを有するアンピシリン
耐性形質転換株を１００μg/mlのアンピシリンを含むＬ
Ｂ培地５０mlで３７℃、１６時間培養を行い、遠心分離
により菌体を回収した。得られた菌体から、アルカリ変
性法(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborat
ory Press 1982, pp.90-91) によりプラスミドＤＮＡプ
ールを抽出した。
耐性形質転換株を１００μg/mlのアンピシリンを含むＬ
Ｂ培地５０mlで３７℃、１６時間培養を行い、遠心分離
により菌体を回収した。得られた菌体から、アルカリ変
性法(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborat
ory Press 1982, pp.90-91) によりプラスミドＤＮＡプ
ールを抽出した。
【００２１】（３）エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子
を有する組換えプラスミドの選択 （２）で得られたプラスミドＤＮＡプールを常法に従い
エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子欠損変異株Ｒ８７５
〔J. Bacteriol., 112, 830-839 (1972)〕に導入した。
エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子を有するクローンを
得るために、アンピシリン耐性かつビオチン非要求性を
示す形質転換株を１００μg/mlアンピシリン、０．０７
５U/mlアビジンおよび０．１mMイソプロピル−ベータ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（以後、ＩＰＴＧと略す）
を含むＬＢ寒天培地上で選択した。
を有する組換えプラスミドの選択 （２）で得られたプラスミドＤＮＡプールを常法に従い
エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子欠損変異株Ｒ８７５
〔J. Bacteriol., 112, 830-839 (1972)〕に導入した。
エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子を有するクローンを
得るために、アンピシリン耐性かつビオチン非要求性を
示す形質転換株を１００μg/mlアンピシリン、０．０７
５U/mlアビジンおよび０．１mMイソプロピル−ベータ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（以後、ＩＰＴＧと略す）
を含むＬＢ寒天培地上で選択した。
【００２２】得られた形質転換株の一つを１００μg/ml
アンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、菌体から組換え
プラスミドを抽出し、単離したプラスミドを制限酵素を
用いて分析した。この組換えプラスミドはｂｉｏＢ遺伝
子を含む１．３kbのＮｃｏＩ−ＨａｅIII 断片を有して
おり、ｐＴｒｃＥＢ１（図２参照）と命名した。また、
このｐＴｒｃＥＢ１を持つエシェリヒア・コリＪＭ１０
９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）
とした。
アンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、菌体から組換え
プラスミドを抽出し、単離したプラスミドを制限酵素を
用いて分析した。この組換えプラスミドはｂｉｏＢ遺伝
子を含む１．３kbのＮｃｏＩ−ＨａｅIII 断片を有して
おり、ｐＴｒｃＥＢ１（図２参照）と命名した。また、
このｐＴｒｃＥＢ１を持つエシェリヒア・コリＪＭ１０
９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）
とした。
【００２３】（４）エシェリヒア・コリ中でのｂｉｏＢ
遺伝子の発現 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）を１
００μg/アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、一晩前
培養し、この前培養液０．１mlを試験管中の同じ培地５
mlへ移した。３７℃、３時間培養後、ｔｒｃプロモータ
ーを誘導するためにＩＰＴＧを２mMになるように添加
し、４時間培養を続けた。菌体を回収し、生理食塩水で
洗浄した後、菌体を超音波処理により破砕した。ｂｉｏ
Ｂ遺伝子の発現の確認を行うために、全細胞タンパク質
についてLaemmli の方法〔Nature,227, 680-685 (1970)
〕に従い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ＢＩ
ＯＢは全細胞タンパク質の約２％まで高生産されてい
た。
遺伝子の発現 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）を１
００μg/アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、一晩前
培養し、この前培養液０．１mlを試験管中の同じ培地５
mlへ移した。３７℃、３時間培養後、ｔｒｃプロモータ
ーを誘導するためにＩＰＴＧを２mMになるように添加
し、４時間培養を続けた。菌体を回収し、生理食塩水で
洗浄した後、菌体を超音波処理により破砕した。ｂｉｏ
Ｂ遺伝子の発現の確認を行うために、全細胞タンパク質
についてLaemmli の方法〔Nature,227, 680-685 (1970)
〕に従い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ＢＩ
ＯＢは全細胞タンパク質の約２％まで高生産されてい
た。
【００２４】実施例２：ＢＩＯＢの単離 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）を１
００μg/mlのアンピシリンを含む２L テリフィック・ブ
ロース（ＴＢ; ２４g/L 酵母エキス／ディフコ社製、１
２g/L トリィプトン／ディフコ社製、４g/L グリセリ
ン、２．３１g/Lリン酸一カリウム、１２．５４g/L リ
ン酸二カリウム）で好気的に３７℃、３時間培養した。
ＢＩＯＢタンパク質の発現は１mMのＩＰＴＧ添加後さら
に３時間培養することにより誘導させた。細胞は８，０
００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌し、０．１M ＮａＣ
ｌと１mM ＥＤＴＡを含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH
８．１（以後、ＴＢと略す）で洗菌後、１mM ＥＤＴＡ
を含まない同バッファーで再度洗菌し、−８０℃で使用
まで凍結保存した。以下のカラム操作は特に記述のない
場合は室温下で実施し、他の操作は４〜１０℃で実施し
た。ＢＩＯＢはカラム・クロマトグラフィーでの赤色バ
ンドと一致するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量３７kDa
のタンパク質バンドとして追跡した。細胞は５mM ２−
メルカプトエタノール（以後、２−ＭＥと略す）を含む
６０mlのＴＢを用いて融解後、０．２５mMフェニルメチ
ルスルホニルフルオロリド、１０μg/mlデオキシリボヌ
クレアーゼＩおよび１０μg/mlリボヌクレアーゼＡ存在
下でフレンチプレスによって破砕し、細胞残骸は１５，
０００×ｇ、３０分の遠心分離で除去した。溶液は５mM
２−ＭＥを含むＴＢで２００mlにした後、同容量（２
００ml）の２０％硫安 (w/v)を含むＴＢを添加した。１
mM ＥＤＴＡ添加後、溶液中のタンパク質は２mM ２−
ＭＥと１０％硫安を含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyop
earl 650M （４．４×１０cm; 東ソー株式会社）に吸着
させ、同平衡化バッファーで洗浄後、１０％硫安を含ま
ない同平衡化バッファーで溶出させた。溶出画分は４倍
容の２mM ２−ＭＥを含むＴＢで希釈し、２mM ２−Ｍ
Ｅを含むＴＢで平衡化したQ-Sepharose（４．４×１０c
m; Pharmacia Biotech Co.)に吸着させた。同平衡化バ
ッファーで洗浄後、溶出は１，２００mlの０〜０．５M
ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。ＮａＣｌ濃度
０．３M 付近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、１０％硫
安(w/v) 添加後、２mM ２−ＭＥと１０％硫安(w/v) を
含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyopearl 650S （２．２
×５cm; 東ソー株式会社製）に吸着させた。同平衡化バ
ッファーで洗浄後、溶出は２５０mlの１０〜０％硫安
（w/v)の直線濃度勾配により実施した。硫安濃度６％付
近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、Centriprep-30 (Ami
con, Inc.)により約３mlに濃縮後、２mM ２−ＭＥと
０．２５M ＮａＣｌを含むＴＢで平衡化したHiPrep Sep
hacryl S200HR 26/60 (Pharmacia BiotechCo.）を通過
させた。赤色をともなうＢＩＯＢピークを回収し、同容
量の２mM２−ＭＥを含むＴＢで希釈した後、同希釈バッ
ファーで平衡化したRESOURCE Q６ml（Pharmacia Biotec
h Co. ）に吸着させた。洗浄後、溶出は１２０mlの０〜
０．５M ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。赤色
をともなうＢＩＯＢピークを回収した。貯蔵前に、ＢＩ
ＯＢは１mMチオスレイトール（以後、ＤＴＴと略す）を
含む５０mM Tris −ＨＣｌ／pH８．１バッファーで約１
mg/ml タンパク質終濃度に希釈後、１００μM ＦｅＣｌ
3 、５０μM Ｎａ2 Ｓと室温下２時間嫌気的にインキュ
ベートさせた。余剰のイオンとＤＴＴは０．２mM ＤＴ
Ｔを含む０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．５バッファーで
平衡化したSephadex G-25 (M, 1.5 x18 cm, Pharmacia
Biotech Co.）を通過させることにより除去した。ＢＩ
ＯＢタンパク質は２０〜３０mg/ml タンパク質終濃度ま
で濃縮した後、−８０℃に貯蔵した。上記の方法で調製
されたＢＩＯＢタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上
で分子量約３７kDa を示す単一バンドとして８０％以上
と推定された（図３参照）。上記の方法で調製されたＢ
ＩＯＢタンパク質は典型的な鉄／イオウタンパク質の吸
収スペクトルパターンを示した（図４参照）。
００μg/mlのアンピシリンを含む２L テリフィック・ブ
ロース（ＴＢ; ２４g/L 酵母エキス／ディフコ社製、１
２g/L トリィプトン／ディフコ社製、４g/L グリセリ
ン、２．３１g/Lリン酸一カリウム、１２．５４g/L リ
ン酸二カリウム）で好気的に３７℃、３時間培養した。
ＢＩＯＢタンパク質の発現は１mMのＩＰＴＧ添加後さら
に３時間培養することにより誘導させた。細胞は８，０
００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌し、０．１M ＮａＣ
ｌと１mM ＥＤＴＡを含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH
８．１（以後、ＴＢと略す）で洗菌後、１mM ＥＤＴＡ
を含まない同バッファーで再度洗菌し、−８０℃で使用
まで凍結保存した。以下のカラム操作は特に記述のない
場合は室温下で実施し、他の操作は４〜１０℃で実施し
た。ＢＩＯＢはカラム・クロマトグラフィーでの赤色バ
ンドと一致するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量３７kDa
のタンパク質バンドとして追跡した。細胞は５mM ２−
メルカプトエタノール（以後、２−ＭＥと略す）を含む
６０mlのＴＢを用いて融解後、０．２５mMフェニルメチ
ルスルホニルフルオロリド、１０μg/mlデオキシリボヌ
クレアーゼＩおよび１０μg/mlリボヌクレアーゼＡ存在
下でフレンチプレスによって破砕し、細胞残骸は１５，
０００×ｇ、３０分の遠心分離で除去した。溶液は５mM
２−ＭＥを含むＴＢで２００mlにした後、同容量（２
００ml）の２０％硫安 (w/v)を含むＴＢを添加した。１
mM ＥＤＴＡ添加後、溶液中のタンパク質は２mM ２−
ＭＥと１０％硫安を含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyop
earl 650M （４．４×１０cm; 東ソー株式会社）に吸着
させ、同平衡化バッファーで洗浄後、１０％硫安を含ま
ない同平衡化バッファーで溶出させた。溶出画分は４倍
容の２mM ２−ＭＥを含むＴＢで希釈し、２mM ２−Ｍ
Ｅを含むＴＢで平衡化したQ-Sepharose（４．４×１０c
m; Pharmacia Biotech Co.)に吸着させた。同平衡化バ
ッファーで洗浄後、溶出は１，２００mlの０〜０．５M
ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。ＮａＣｌ濃度
０．３M 付近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、１０％硫
安(w/v) 添加後、２mM ２−ＭＥと１０％硫安(w/v) を
含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyopearl 650S （２．２
×５cm; 東ソー株式会社製）に吸着させた。同平衡化バ
ッファーで洗浄後、溶出は２５０mlの１０〜０％硫安
（w/v)の直線濃度勾配により実施した。硫安濃度６％付
近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、Centriprep-30 (Ami
con, Inc.)により約３mlに濃縮後、２mM ２−ＭＥと
０．２５M ＮａＣｌを含むＴＢで平衡化したHiPrep Sep
hacryl S200HR 26/60 (Pharmacia BiotechCo.）を通過
させた。赤色をともなうＢＩＯＢピークを回収し、同容
量の２mM２−ＭＥを含むＴＢで希釈した後、同希釈バッ
ファーで平衡化したRESOURCE Q６ml（Pharmacia Biotec
h Co. ）に吸着させた。洗浄後、溶出は１２０mlの０〜
０．５M ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。赤色
をともなうＢＩＯＢピークを回収した。貯蔵前に、ＢＩ
ＯＢは１mMチオスレイトール（以後、ＤＴＴと略す）を
含む５０mM Tris −ＨＣｌ／pH８．１バッファーで約１
mg/ml タンパク質終濃度に希釈後、１００μM ＦｅＣｌ
3 、５０μM Ｎａ2 Ｓと室温下２時間嫌気的にインキュ
ベートさせた。余剰のイオンとＤＴＴは０．２mM ＤＴ
Ｔを含む０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．５バッファーで
平衡化したSephadex G-25 (M, 1.5 x18 cm, Pharmacia
Biotech Co.）を通過させることにより除去した。ＢＩ
ＯＢタンパク質は２０〜３０mg/ml タンパク質終濃度ま
で濃縮した後、−８０℃に貯蔵した。上記の方法で調製
されたＢＩＯＢタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上
で分子量約３７kDa を示す単一バンドとして８０％以上
と推定された（図３参照）。上記の方法で調製されたＢ
ＩＯＢタンパク質は典型的な鉄／イオウタンパク質の吸
収スペクトルパターンを示した（図４参照）。
【００２５】実施例３：クレビシエラｎｉｆＵおよびｎ
ｉｆＳ遺伝子のクローニングおよび発現 （１）染色体ＤＮＡの調製 クレビシエラ・ニューモニエＭ５ａ１〔Nature, 237, 1
02 (1972) 〕をＬＢ培地５０mlで３７℃、１０時間培養
した。菌体を遠心分離により回収し、染色体ＤＮＡをフ
ェノール法により抽出した。
ｉｆＳ遺伝子のクローニングおよび発現 （１）染色体ＤＮＡの調製 クレビシエラ・ニューモニエＭ５ａ１〔Nature, 237, 1
02 (1972) 〕をＬＢ培地５０mlで３７℃、１０時間培養
した。菌体を遠心分離により回収し、染色体ＤＮＡをフ
ェノール法により抽出した。
【００２６】（２）遺伝子ライブラリーの調製 図５に示した方法に従い、クレビシエラ・ニューモニエ
ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子のクローニングを行っ
た。染色体ＤＮＡ（２μg)をＢａｍＨＩにより完全に切
断し、アガロースゲル電気泳動により２．３〜２．６kb
のＤＮＡ断片を得た。ベクタープラスミドｐＵＣ１９
（宝酒造株式会社）をＢａｍＨＩで完全に切断した後、
自己連結を避けるためにアルカリホスファターゼによる
処理を行った。得られた染色体ＤＮＡ断片をDNA ligati
on Kit（宝酒造株式会社）を使用して上記処理を行った
ｐＵＣ１９に連結し、連鎖反応後のＤＮＡを常法に従い
エシェリヒア・コリＪＭ１０９に導入した。ＬＢ寒天培
地上で１００μg/mlアンピシリン耐性形質転換株を選択
し、染色体ＤＮＡ断片を持つ２，０００種類のクローン
を遺伝子ライブラリーとして得た。
ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子のクローニングを行っ
た。染色体ＤＮＡ（２μg)をＢａｍＨＩにより完全に切
断し、アガロースゲル電気泳動により２．３〜２．６kb
のＤＮＡ断片を得た。ベクタープラスミドｐＵＣ１９
（宝酒造株式会社）をＢａｍＨＩで完全に切断した後、
自己連結を避けるためにアルカリホスファターゼによる
処理を行った。得られた染色体ＤＮＡ断片をDNA ligati
on Kit（宝酒造株式会社）を使用して上記処理を行った
ｐＵＣ１９に連結し、連鎖反応後のＤＮＡを常法に従い
エシェリヒア・コリＪＭ１０９に導入した。ＬＢ寒天培
地上で１００μg/mlアンピシリン耐性形質転換株を選択
し、染色体ＤＮＡ断片を持つ２，０００種類のクローン
を遺伝子ライブラリーとして得た。
【００２７】（３）クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆ
Ｕ、ｎｉｆＳ遺伝子を有するクローンの選択 クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子
を有するクローンの選択はManiatisらによる方法(Molec
ular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press
1982, pp. 326-328)によって記載されたプロトコルに従
って、コロニーハイブリダイゼーションにより行った。
Ｕ、ｎｉｆＳ遺伝子を有するクローンの選択 クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子
を有するクローンの選択はManiatisらによる方法(Molec
ular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press
1982, pp. 326-328)によって記載されたプロトコルに従
って、コロニーハイブリダイゼーションにより行った。
【００２８】寒天培地上で生育したコロニーをナイロン
膜（Hybond-N, Amersham Co.) に移し、アルカリにより
溶菌させた後、変性したＤＮＡを膜上に固定した。ハイ
ブリダイゼーションはDIG DNA Labeling and Detection
system (Boehringer Mannheim Co., Mannheim, German
y)を使用し、使用説明書に従って行った。ｎｉｆＵ、ｎ
ｉｆＳ遺伝子の一部の配列を有する２本のオリゴヌクレ
オチドを合成した。この配列を以下に示す： ｎｉｆＵプローブ ５′AGAGGAGCACGACGAGGGCAAGCTGATC
TGCAAAT ｎｉｆＳプローブ ５′CGTTGGTCAGCGTGATGTGGGCGAATAA
CGAAACC ２本のオリゴヌクレオチドの３′末端をDIG Oligonucle
otide 3'-End LabelingKit (Boehringer Mannheim Co.)
により標識し、２本の標識オリゴヌクレオチドの混合
物をハイブリダイゼーション用プローブとして使用し
た。プローブがハイブリダイズしたクローンはDIG Lumi
nescent Detection Kit (Boehringer Mannheim Co.) に
より検出した。その結果、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子を
有するクローンとして２６個の候補が得られた。
膜（Hybond-N, Amersham Co.) に移し、アルカリにより
溶菌させた後、変性したＤＮＡを膜上に固定した。ハイ
ブリダイゼーションはDIG DNA Labeling and Detection
system (Boehringer Mannheim Co., Mannheim, German
y)を使用し、使用説明書に従って行った。ｎｉｆＵ、ｎ
ｉｆＳ遺伝子の一部の配列を有する２本のオリゴヌクレ
オチドを合成した。この配列を以下に示す： ｎｉｆＵプローブ ５′AGAGGAGCACGACGAGGGCAAGCTGATC
TGCAAAT ｎｉｆＳプローブ ５′CGTTGGTCAGCGTGATGTGGGCGAATAA
CGAAACC ２本のオリゴヌクレオチドの３′末端をDIG Oligonucle
otide 3'-End LabelingKit (Boehringer Mannheim Co.)
により標識し、２本の標識オリゴヌクレオチドの混合
物をハイブリダイゼーション用プローブとして使用し
た。プローブがハイブリダイズしたクローンはDIG Lumi
nescent Detection Kit (Boehringer Mannheim Co.) に
より検出した。その結果、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子を
有するクローンとして２６個の候補が得られた。
【００２９】４個の候補クローンを選び、候補クローン
を持つ形質転換株を１００μg/mlのアンピシリンを含む
ＬＢ培地で培養した。菌体からアルカリ変性法により組
換えプラスミドを抽出し、制限酵素（ＢａｍＨＩ、Ｖｓ
ｐＩ、ＳｃａＩ）による解析を行った。次いで、ALFred
DNA sequencer (Pharmacia Biotech Co.)を使用して挿
入ＤＮＡ断片の両末端から３００〜４００塩基の配列を
決定した。決定された塩基配列はBeynonにより報告され
ているクレビシエラ・ニューモニエのｎｉｆＵ、Ｓクラ
スターの塩基配列〔J. Bacteriol., 169, 4024-4029 (1
987)〕と同じ配列であった。この結果は、得られたクロ
ーンがクレビシエラ・ニューモニエのｎｉｆＵ、Ｓクラ
スターを有していることを示していた。ｎｉｆＵ、Ｓク
ラスターがベクター中のラクトース（ｌａｃ）プロモー
ターと同方向に挿入された組換えプラスミドをｐＫＮｎ
ｉｆ０１と命名した。また、ｎｉｆＵ、Ｓクラスターが
ｌａｃプロモーターと逆方向に挿入された組換えプラス
ミドをｐＫＮｎｉｆ０２と命名した（図５参照）。
を持つ形質転換株を１００μg/mlのアンピシリンを含む
ＬＢ培地で培養した。菌体からアルカリ変性法により組
換えプラスミドを抽出し、制限酵素（ＢａｍＨＩ、Ｖｓ
ｐＩ、ＳｃａＩ）による解析を行った。次いで、ALFred
DNA sequencer (Pharmacia Biotech Co.)を使用して挿
入ＤＮＡ断片の両末端から３００〜４００塩基の配列を
決定した。決定された塩基配列はBeynonにより報告され
ているクレビシエラ・ニューモニエのｎｉｆＵ、Ｓクラ
スターの塩基配列〔J. Bacteriol., 169, 4024-4029 (1
987)〕と同じ配列であった。この結果は、得られたクロ
ーンがクレビシエラ・ニューモニエのｎｉｆＵ、Ｓクラ
スターを有していることを示していた。ｎｉｆＵ、Ｓク
ラスターがベクター中のラクトース（ｌａｃ）プロモー
ターと同方向に挿入された組換えプラスミドをｐＫＮｎ
ｉｆ０１と命名した。また、ｎｉｆＵ、Ｓクラスターが
ｌａｃプロモーターと逆方向に挿入された組換えプラス
ミドをｐＫＮｎｉｆ０２と命名した（図５参照）。
【００３０】（４）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３
の構築（図６参照） ベクタープラスミドpBluescriptII-SK+ （東洋紡株式会
社）をＨｉｎｃIIとＢａｍＨＩ完全に切断した。組換え
プラスミドｐＫＮｎｉｆ０２をＶｓｐＩで完全に切断
し、末端をDNA Blunting Kit（宝酒造株式会社）により
平滑化した後、ＢａｍＨＩで完全切断した。ｎｉｆＵ、
Ｓクラスターを含む２．４kbの断片をアガロースゲル電
気泳動により得た。２．４kbの断片を切断処理を行った
pBluescriptII-SK+ にDNA ligation Kitを使用して挿入
し、組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３を得た。
の構築（図６参照） ベクタープラスミドpBluescriptII-SK+ （東洋紡株式会
社）をＨｉｎｃIIとＢａｍＨＩ完全に切断した。組換え
プラスミドｐＫＮｎｉｆ０２をＶｓｐＩで完全に切断
し、末端をDNA Blunting Kit（宝酒造株式会社）により
平滑化した後、ＢａｍＨＩで完全切断した。ｎｉｆＵ、
Ｓクラスターを含む２．４kbの断片をアガロースゲル電
気泳動により得た。２．４kbの断片を切断処理を行った
pBluescriptII-SK+ にDNA ligation Kitを使用して挿入
し、組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３を得た。
【００３１】（５）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０４
の構築（図７参照） ベクタープラスミドｐＴｒｃ９９ＡをＫｐｎＩとＢａｍ
ＨＩで完全に切断した。組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ
０３をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで完全に切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりｎｉｆＵ、Ｓクラスターを含む
２．４kbのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した．２．
４kbの断片を切断処理をしたｐＴｒｃ９９ＡとDNA liga
tion Kitを使用して連結させた。その結果、ｎｉｆＵ、
Ｓクラスターがｔｒｃプロモーターの下流に挿入された
組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０４を得た。組換えプラ
スミドｐＫＮｎｉｆ０４を持つエシェリヒア・コリＪＭ
１０９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ
０４）と命名した。
の構築（図７参照） ベクタープラスミドｐＴｒｃ９９ＡをＫｐｎＩとＢａｍ
ＨＩで完全に切断した。組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ
０３をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで完全に切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりｎｉｆＵ、Ｓクラスターを含む
２．４kbのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を回収した．２．
４kbの断片を切断処理をしたｐＴｒｃ９９ＡとDNA liga
tion Kitを使用して連結させた。その結果、ｎｉｆＵ、
Ｓクラスターがｔｒｃプロモーターの下流に挿入された
組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０４を得た。組換えプラ
スミドｐＫＮｎｉｆ０４を持つエシェリヒア・コリＪＭ
１０９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ
０４）と命名した。
【００３２】（６）クレビシエラｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺
伝子の発現 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）を
１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で３０℃、
一晩前培養した。０．１mlの前培養液を５mlの同じ培地
入りの試験管に移した。３０℃、３時間培養後、ｔｒｃ
プロモーターを誘導するためにＩＰＴＧを１mMになるよ
うに添加し、３時間培養を続けた。菌体を集め、生理食
塩水で洗浄後、超音波処理により菌体を破砕した。ｎｉ
ｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子の発現の確認を行うために、全細
胞タンパク質についてLaemmli の方法〔Nature, 227, 6
80-685 (1970) 〕に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。Ｎ
ＩＦＵ、ＮＩＦＳは細胞中で高生産されていた。
伝子の発現 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）を
１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地で３０℃、
一晩前培養した。０．１mlの前培養液を５mlの同じ培地
入りの試験管に移した。３０℃、３時間培養後、ｔｒｃ
プロモーターを誘導するためにＩＰＴＧを１mMになるよ
うに添加し、３時間培養を続けた。菌体を集め、生理食
塩水で洗浄後、超音波処理により菌体を破砕した。ｎｉ
ｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子の発現の確認を行うために、全細
胞タンパク質についてLaemmli の方法〔Nature, 227, 6
80-685 (1970) 〕に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。Ｎ
ＩＦＵ、ＮＩＦＳは細胞中で高生産されていた。
【００３３】実施例４：ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳ含有／
非含有のエシェリヒア・コリ無細胞抽出液の調製 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）お
よびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）
を１００μg/mlのアンピシリンを含むテリフィック・ブ
ロース（実施例２参照）で好気的に３０℃、３時間培養
した。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳの発現は１mM ＩＰＴＧ
添加後さらに３時間培養することで誘導させた。細胞は
８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌し、０．１M
ＮａＣｌと１mM ＥＤＴＡを含むＴＢで洗菌後、１mM
ＥＤＴＡを含まない同バッファーで２度洗菌し、−８０
℃で使用まで凍結保存した。
非含有のエシェリヒア・コリ無細胞抽出液の調製 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）お
よびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）
を１００μg/mlのアンピシリンを含むテリフィック・ブ
ロース（実施例２参照）で好気的に３０℃、３時間培養
した。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳの発現は１mM ＩＰＴＧ
添加後さらに３時間培養することで誘導させた。細胞は
８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌し、０．１M
ＮａＣｌと１mM ＥＤＴＡを含むＴＢで洗菌後、１mM
ＥＤＴＡを含まない同バッファーで２度洗菌し、−８０
℃で使用まで凍結保存した。
【００３４】それぞれの株の無細胞抽出液は以下のよう
に調製した。細胞は解凍し、湿式細胞重量に対して約２
倍容の、０．２mM ２−ＭＥを含む０．１M Tris−ＨＣ
ｌ／pH７．５で懸濁した。懸濁液中の細胞は脱気、アル
ゴン置換させた後にアルゴン封入した密閉チューブ中で
ソニケーター（Bioruptor,コスモバイオ社製）により破
砕した。不溶性物質は１００，０００×ｇ、３０分の遠
心分離で除去した。得られた上清を無細胞抽出液として
使用した。この無細胞抽出液の総タンパク質濃度は６％
トリクロロ酢酸によるタンパク質沈殿、アセトンによる
タンパク質洗浄後、ＢＣＡタンパク質アッセイシステム
（PIERCE, Rockford, IL 61105, USA)により定量した。
上記の方法によりタンパク質濃度約３０mg/ml の無細胞
抽出液が得られた。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳを発現する
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）の
無細胞抽出液はｐＴｒｃ９９Ａを持つエシェリヒア・コ
リＪＭ１０９と同タンパク質濃度下で比較して著しい赤
色を示した。無細胞抽出液はアルゴン封入状態で−８０
℃で保存した。
に調製した。細胞は解凍し、湿式細胞重量に対して約２
倍容の、０．２mM ２−ＭＥを含む０．１M Tris−ＨＣ
ｌ／pH７．５で懸濁した。懸濁液中の細胞は脱気、アル
ゴン置換させた後にアルゴン封入した密閉チューブ中で
ソニケーター（Bioruptor,コスモバイオ社製）により破
砕した。不溶性物質は１００，０００×ｇ、３０分の遠
心分離で除去した。得られた上清を無細胞抽出液として
使用した。この無細胞抽出液の総タンパク質濃度は６％
トリクロロ酢酸によるタンパク質沈殿、アセトンによる
タンパク質洗浄後、ＢＣＡタンパク質アッセイシステム
（PIERCE, Rockford, IL 61105, USA)により定量した。
上記の方法によりタンパク質濃度約３０mg/ml の無細胞
抽出液が得られた。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳを発現する
エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）の
無細胞抽出液はｐＴｒｃ９９Ａを持つエシェリヒア・コ
リＪＭ１０９と同タンパク質濃度下で比較して著しい赤
色を示した。無細胞抽出液はアルゴン封入状態で−８０
℃で保存した。
【００３５】実施例５：In vitro酵素反応（ＤＡＦシス
テム） 酵素反応混合液は全容量５０μl 中に１００μM デスチ
オビオチン、１，０００μM Ｓ−アデノシルメチオニン
（ＳＡＭ）、２００μM Ｌ−システイン、５０μM デア
ザリボフラビン（ＤＡＦ）、０．６mg/ml （１６μM)Ｂ
ＩＯＢタンパク質、２０mgタンパク質／mlのエシェリヒ
ア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）およびエシェ
リヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）からの無細
胞抽出液の混合物および０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．
５を含む。３００μl ガラススピッツ管内の酵素反応混
合液は暗所下、弱い吸引とアルゴン加圧により嫌気状態
とした。反応は３０℃で２０W の蛍光灯から１０cm距離
の光照射により開始させた。反応８０分後、反応は９５
℃加熱により停止させ、生成したビオチンはラクトバチ
ルス・プランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用いた微生
物定量法で定量した。エシェリヒア・コリＪＭ１０９
（ｐＫＮｎｉｆ０４）およびエシェリヒア・コリＪＭ１
０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）からの２種類の無細胞抽出液は
反応混合液中に一定のタンパク質濃度２０mg/ml で、さ
まざまな比率で混合させた。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳを
発現しているエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎ
ｉｆ０４）の無細胞抽出液の比率が上昇するのに対応し
て、顕著なビオチン生産の増加が認められた。エシェリ
ヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）の無細胞抽
出液の含有率が６４％の場合、対照より約１．８倍高い
ビオチン生産が認められた（表１）。
テム） 酵素反応混合液は全容量５０μl 中に１００μM デスチ
オビオチン、１，０００μM Ｓ−アデノシルメチオニン
（ＳＡＭ）、２００μM Ｌ−システイン、５０μM デア
ザリボフラビン（ＤＡＦ）、０．６mg/ml （１６μM)Ｂ
ＩＯＢタンパク質、２０mgタンパク質／mlのエシェリヒ
ア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）およびエシェ
リヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）からの無細
胞抽出液の混合物および０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．
５を含む。３００μl ガラススピッツ管内の酵素反応混
合液は暗所下、弱い吸引とアルゴン加圧により嫌気状態
とした。反応は３０℃で２０W の蛍光灯から１０cm距離
の光照射により開始させた。反応８０分後、反応は９５
℃加熱により停止させ、生成したビオチンはラクトバチ
ルス・プランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用いた微生
物定量法で定量した。エシェリヒア・コリＪＭ１０９
（ｐＫＮｎｉｆ０４）およびエシェリヒア・コリＪＭ１
０９（ｐＴｒｃ９９Ａ）からの２種類の無細胞抽出液は
反応混合液中に一定のタンパク質濃度２０mg/ml で、さ
まざまな比率で混合させた。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳを
発現しているエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎ
ｉｆ０４）の無細胞抽出液の比率が上昇するのに対応し
て、顕著なビオチン生産の増加が認められた。エシェリ
ヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）の無細胞抽
出液の含有率が６４％の場合、対照より約１．８倍高い
ビオチン生産が認められた（表１）。
【００３６】
【表１】
【００３７】実施例６：ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉ
ｆＳ遺伝子を同時発現するエシェリヒア・コリの構築 （１）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０５の構築（図８
参照） ベクタープラスミドｐＭＷ２１８（株式会社ニッポンジ
ーン）をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで完全に切断した。ｎｉ
ｆＵ、Ｓクラスターを含む２．４kbのＫｐｎＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片を実施例３で構築した組換えプラスミドｐＫＮ
ｎｉｆ０３から単離し、切断したｐＭＷ２１８とDNA li
gation Kitを使用して連結させた。その結果、ｎｉｆ
Ｕ、Ｓクラスターがｌａｃプロモーターの下流に挿入さ
れた組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０５が得られた。
ｆＳ遺伝子を同時発現するエシェリヒア・コリの構築 （１）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０５の構築（図８
参照） ベクタープラスミドｐＭＷ２１８（株式会社ニッポンジ
ーン）をＫｐｎＩとＢａｍＨＩで完全に切断した。ｎｉ
ｆＵ、Ｓクラスターを含む２．４kbのＫｐｎＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片を実施例３で構築した組換えプラスミドｐＫＮ
ｎｉｆ０３から単離し、切断したｐＭＷ２１８とDNA li
gation Kitを使用して連結させた。その結果、ｎｉｆ
Ｕ、Ｓクラスターがｌａｃプロモーターの下流に挿入さ
れた組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０５が得られた。
【００３８】ベクタープラスミドｐＭＷ２１８と組換え
プラスミドｐＫＮｎｉｆ０５をエシェリヒア・コリＪＭ
１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）に常法に従い導入し、１００
μg//ml のアンピシリンと１０μg/mlのカナマイシンを
含むＬＢ寒天培地上で形質転換株を選択した。組換えプ
ラスミドｐＴｒｃＥＢ１とベクタープラスミドｐＭＷ２
１８を持つエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒ
ア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１およびｐＭＷ２１
８) と命名した。また、組換えプラスミドｐＴｒｃＥＢ
１とｐＫＮｎｉｆ０５を持つエシェリヒア・コリＪＭ１
０９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ
１、ｐＫＮｎｉｆ０５）と命名した。
プラスミドｐＫＮｎｉｆ０５をエシェリヒア・コリＪＭ
１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）に常法に従い導入し、１００
μg//ml のアンピシリンと１０μg/mlのカナマイシンを
含むＬＢ寒天培地上で形質転換株を選択した。組換えプ
ラスミドｐＴｒｃＥＢ１とベクタープラスミドｐＭＷ２
１８を持つエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒ
ア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１およびｐＭＷ２１
８) と命名した。また、組換えプラスミドｐＴｒｃＥＢ
１とｐＫＮｎｉｆ０５を持つエシェリヒア・コリＪＭ１
０９をエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ
１、ｐＫＮｎｉｆ０５）と命名した。
【００３９】（２）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０６
の構築（図９参照） 組換えプラスミドｐＴｒｃＥＢ１をＢａｍＨＩで完全に
切断した後、自己連結を避けるためにアルカリホスファ
ターゼによる処理を行った。組換えプラスミドｐＫＮｎ
ｉｆ０２をＶｓｐＩで完全切断した。切断後のｐＫＮｎ
ｉｆ０２の末端をDNA Blunting Kitを使用して平滑化
し、ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造株式会社）をDNA liga
tion Kitを使用して連結させた。ＢａｍＨＩで完全に切
断した後、ｎｉｆＵ、Ｓクラスターを含む２．４kbのＢ
ａｍＨＩ断片をアガロースゲル電気泳動により回収し
た。２．４kbの断片を上記処理を行ったｐＴｒｃＥＢ１
にDNAligation Kitを使用して挿入した。その結果、ｂ
ｉｏＢ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子がｔｒｃプロモータ
ーの下流に挿入された組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０
６が得られた。組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０６を持
つエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）と命名した。
の構築（図９参照） 組換えプラスミドｐＴｒｃＥＢ１をＢａｍＨＩで完全に
切断した後、自己連結を避けるためにアルカリホスファ
ターゼによる処理を行った。組換えプラスミドｐＫＮｎ
ｉｆ０２をＶｓｐＩで完全切断した。切断後のｐＫＮｎ
ｉｆ０２の末端をDNA Blunting Kitを使用して平滑化
し、ＢａｍＨＩリンカー（宝酒造株式会社）をDNA liga
tion Kitを使用して連結させた。ＢａｍＨＩで完全に切
断した後、ｎｉｆＵ、Ｓクラスターを含む２．４kbのＢ
ａｍＨＩ断片をアガロースゲル電気泳動により回収し
た。２．４kbの断片を上記処理を行ったｐＴｒｃＥＢ１
にDNAligation Kitを使用して挿入した。その結果、ｂ
ｉｏＢ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子がｔｒｃプロモータ
ーの下流に挿入された組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０
６が得られた。組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０６を持
つエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）と命名した。
【００４０】（３）ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵおよびｎｉｆＳ
遺伝子のエシェリヒア・コリ中での同時発現 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＫ
Ｎｎｉｆ０５）およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（ｐＫＮｎｉｆ０６）を１００μg/mlのアンピシリンと
１０μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地および１００
μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地中でそれぞれ３０
℃、一晩前培養した。０．１mlの前培養液を５mlの同じ
培地入りの試験管に移した。３０℃、３時間培養後、発
現を誘導するためにＩＰＴＧを１mMになるように添加
し、３時間培養を続けた。菌体を集め、生理食塩水で洗
浄後、超音波処理により菌体を破砕した。ｂｉｏＢ、ｎ
ｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子の発現の確認を行うため
に、全細胞タンパク質についてLaemmli の方法〔Natur
e, 227, 680-685 (1970) 〕に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を行った。ＢＩＯＢ、ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク
質は細胞中でともに高生産されていた。
遺伝子のエシェリヒア・コリ中での同時発現 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＫ
Ｎｎｉｆ０５）およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（ｐＫＮｎｉｆ０６）を１００μg/mlのアンピシリンと
１０μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地および１００
μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地中でそれぞれ３０
℃、一晩前培養した。０．１mlの前培養液を５mlの同じ
培地入りの試験管に移した。３０℃、３時間培養後、発
現を誘導するためにＩＰＴＧを１mMになるように添加
し、３時間培養を続けた。菌体を集め、生理食塩水で洗
浄後、超音波処理により菌体を破砕した。ｂｉｏＢ、ｎ
ｉｆＵおよびｎｉｆＳ遺伝子の発現の確認を行うため
に、全細胞タンパク質についてLaemmli の方法〔Natur
e, 227, 680-685 (1970) 〕に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を行った。ＢＩＯＢ、ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク
質は細胞中でともに高生産されていた。
【００４１】実施例７：発酵によるビオチンの生産 （１）エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ
１、ｐＫＮｎｉｆ０５）およびエシェリヒア・コリＪＭ
１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）によるビオチンの生産エシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＭＷ２
１８) とエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ
１、ｐＫＮｎｉｆ０５) を１００μg/mlのアンピシリ
ン、１０μg/mlのカナマイシンおよび２００μg/mlのデ
スチオビオチンを含む５０mlのＰＣ培地（グリセリン２
％、プロテアーゼペプトン５％、カザミノ酸２％、Ｋ2
ＨＰＯ4 １％、ＫＣｌ ０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ０．０５％、ＭｎＳＯ4 ４−６Ｈ2 Ｏ ０．００１
％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．００１％；pH７．０）に
植菌し３０℃で３時間振とう培養を行った。そして、ｔ
ｒｃプロモーターを誘導するためにＩＰＴＧを１mMにな
るように添加し、３０℃で２７時間振とう培養を行っ
た。また、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９
９Ａ）、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ
１) およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉ
ｆ０６）は１００μg/mlのアンピシリンと２００μg/ml
のデスチオビオチンを含む５０mlのＰＣ培地に植菌し、
上記と同様に培養を行った。
１、ｐＫＮｎｉｆ０５）およびエシェリヒア・コリＪＭ
１０９（ｐＫＮｎｉｆ０６）によるビオチンの生産エシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１、ｐＭＷ２
１８) とエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ
１、ｐＫＮｎｉｆ０５) を１００μg/mlのアンピシリ
ン、１０μg/mlのカナマイシンおよび２００μg/mlのデ
スチオビオチンを含む５０mlのＰＣ培地（グリセリン２
％、プロテアーゼペプトン５％、カザミノ酸２％、Ｋ2
ＨＰＯ4 １％、ＫＣｌ ０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ０．０５％、ＭｎＳＯ4 ４−６Ｈ2 Ｏ ０．００１
％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．００１％；pH７．０）に
植菌し３０℃で３時間振とう培養を行った。そして、ｔ
ｒｃプロモーターを誘導するためにＩＰＴＧを１mMにな
るように添加し、３０℃で２７時間振とう培養を行っ
た。また、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃ９
９Ａ）、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ
１) およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉ
ｆ０６）は１００μg/mlのアンピシリンと２００μg/ml
のデスチオビオチンを含む５０mlのＰＣ培地に植菌し、
上記と同様に培養を行った。
【００４２】培養終了後、１．５mlの培養液を遠心分離
して菌体を除き、培養上清を回収した。培養上清中のビ
オチン生産量はラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣ
Ｃ８０１４）による微生物定量法により測定した。それ
ぞれ４株のビオチン生産量の平均を表２に示す。
して菌体を除き、培養上清を回収した。培養上清中のビ
オチン生産量はラクトバチルス・プランタラム（ＡＴＣ
Ｃ８０１４）による微生物定量法により測定した。それ
ぞれ４株のビオチン生産量の平均を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】実施例８：ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳの単離 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＫＮｎｉｆ０４）を
１００μg/mlのアンピシリンを含む１L テリフィック・
ブロースで好気的に２６℃、３時間培養した。ＮＩＦＵ
およびＮＩＦＳの発現は１mM ＩＰＴＧ添加後さらに３
時間培養することにより誘導させた。細胞（５．４ｇ湿
式重量）は８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌
し、０．１M ＮａＣｌと１mM ＥＤＴＡを含む２０mM T
ris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーで洗菌後、１mM Ｅ
ＤＴＡを含まない同バッファーで２度洗菌し、−８０℃
で使用まで凍結保存した。
１００μg/mlのアンピシリンを含む１L テリフィック・
ブロースで好気的に２６℃、３時間培養した。ＮＩＦＵ
およびＮＩＦＳの発現は１mM ＩＰＴＧ添加後さらに３
時間培養することにより誘導させた。細胞（５．４ｇ湿
式重量）は８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌
し、０．１M ＮａＣｌと１mM ＥＤＴＡを含む２０mM T
ris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーで洗菌後、１mM Ｅ
ＤＴＡを含まない同バッファーで２度洗菌し、−８０℃
で使用まで凍結保存した。
【００４５】以下のカラム操作は特に記述のない場合は
室温下で嫌気的に実施し、他の操作は４〜１０℃で嫌気
的に実施した。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク質はＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質バンドとして追跡した。
細胞を５mMジチオスレイトール（以後、ＤＴＴと略す）
を含む４０mlの２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４によっ
て融解後、０．５mMフェニルメチルスルホニルフルオロ
リド、１０μg/mlデオキシリボヌクレアーゼＩ、１０μ
g/mlリボヌクレアーゼＡおよび５mMピリドキサルリン酸
存在下フレンチプレスによって破砕した。細胞残骸は
７，７００×ｇ、３０分の遠心分離で除去し、不溶性画
分は４８，０００×ｇ、３０分の遠心分離で除去した。
溶液は同バッファーで５０mlにした後、硫酸ストレプト
マイシンを１％(w/v) 終濃度で添加した。不溶物を４
８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で除去した後、上清
に固形硫安を30% 飽和濃度に添加した。室温下、１０分
間の緩やかな撹拌後、ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク
質を含む沈殿を４８，０００×ｇ、１０分の遠心分離に
より得た。沈殿を５mM ＤＴＴを含む２０mM Tris −Ｈ
Ｃｌ／pH７．４バッファーで再溶解後、４８，０００×
ｇ、３０分の遠心分離で得られる上清を５mM ＤＴＴを
含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーで平衡
化したRESOURCE Q（6 ml, Pharmacia Biotech Co.)に吸
着させた。同バッファーで洗浄後、溶出を１５０mlの０
〜０．５M ＮａＣｌの直線濃度勾配により行った。ＮＩ
ＦＵおよびＮＩＦＳタンパク質はＮａＣｌ濃度０．３M
付近の２０mlの画分に共溶出され、ＰＭ−３０膜（Amic
on, Inc.）により３．５mlに濃縮した。濃縮されたタン
パク質溶液は５mM ＤＴＴと０．２５M ＮａＣｌを含む
２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーを用いてHi
Prep Sephacryl S200HR 26/60 (Pharmacia Biotech C
o.）を通過させた。すべてのＮＩＦＳタンパク質はＮＩ
ＦＵタンパク質との複合体として、またＮＩＦＵタンパ
ク質の一部は単量体として回収された。ＮＩＦＵ／Ｓ複
合体は分子量約１４０kDa の位置に溶出され、ＮＩＦＵ
単量体は分子量約３５kDa の位置に溶出された。１８ml
のＮＩＦＵ／Ｓ複合体を含む画分および２４mlのＮＩＦ
Ｕ単量体を含む画分をそれぞれCentriPlus-30 (Amicon,
Inc.)により３mlに濃縮した後、−８０℃で保存した。
室温下で嫌気的に実施し、他の操作は４〜１０℃で嫌気
的に実施した。ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク質はＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質バンドとして追跡した。
細胞を５mMジチオスレイトール（以後、ＤＴＴと略す）
を含む４０mlの２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４によっ
て融解後、０．５mMフェニルメチルスルホニルフルオロ
リド、１０μg/mlデオキシリボヌクレアーゼＩ、１０μ
g/mlリボヌクレアーゼＡおよび５mMピリドキサルリン酸
存在下フレンチプレスによって破砕した。細胞残骸は
７，７００×ｇ、３０分の遠心分離で除去し、不溶性画
分は４８，０００×ｇ、３０分の遠心分離で除去した。
溶液は同バッファーで５０mlにした後、硫酸ストレプト
マイシンを１％(w/v) 終濃度で添加した。不溶物を４
８，０００×ｇ、２０分の遠心分離で除去した後、上清
に固形硫安を30% 飽和濃度に添加した。室温下、１０分
間の緩やかな撹拌後、ＮＩＦＵおよびＮＩＦＳタンパク
質を含む沈殿を４８，０００×ｇ、１０分の遠心分離に
より得た。沈殿を５mM ＤＴＴを含む２０mM Tris −Ｈ
Ｃｌ／pH７．４バッファーで再溶解後、４８，０００×
ｇ、３０分の遠心分離で得られる上清を５mM ＤＴＴを
含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーで平衡
化したRESOURCE Q（6 ml, Pharmacia Biotech Co.)に吸
着させた。同バッファーで洗浄後、溶出を１５０mlの０
〜０．５M ＮａＣｌの直線濃度勾配により行った。ＮＩ
ＦＵおよびＮＩＦＳタンパク質はＮａＣｌ濃度０．３M
付近の２０mlの画分に共溶出され、ＰＭ−３０膜（Amic
on, Inc.）により３．５mlに濃縮した。濃縮されたタン
パク質溶液は５mM ＤＴＴと０．２５M ＮａＣｌを含む
２０mM Tris −ＨＣｌ／pH７．４バッファーを用いてHi
Prep Sephacryl S200HR 26/60 (Pharmacia Biotech C
o.）を通過させた。すべてのＮＩＦＳタンパク質はＮＩ
ＦＵタンパク質との複合体として、またＮＩＦＵタンパ
ク質の一部は単量体として回収された。ＮＩＦＵ／Ｓ複
合体は分子量約１４０kDa の位置に溶出され、ＮＩＦＵ
単量体は分子量約３５kDa の位置に溶出された。１８ml
のＮＩＦＵ／Ｓ複合体を含む画分および２４mlのＮＩＦ
Ｕ単量体を含む画分をそれぞれCentriPlus-30 (Amicon,
Inc.)により３mlに濃縮した後、−８０℃で保存した。
【００４６】実施例９：精製ＮＩＦＵ/S複合体およびＮ
ＩＦＵ単量体のビオチン生成に対する影響 無細胞抽出液を含まない酵素反応混合液は、全容量５０
μl 中に１００μM デスチオビオチン、１，０００μM
ＳＡＭ、２００μM Ｌ−システイン、５０μMデアザリ
ボフラビン、０．６mg/ml （１６μM)ＢＩＯＢタンパク
質、１０mM ＤＴＴおよび０．１M Tris−ＨＣｌ／pH
７．５を含んでいた。３００μl ガラススピッツ管内の
酵素反応混合液は暗所下弱い吸引とアルゴン加圧により
嫌気状態とした。反応は３０℃で２０W 蛍光灯から１０
cm距離の光照射により開始させた。反応８０分後、反応
は９５℃加熱により停止させ、生成したビオチンはラク
トバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用い
た微生物定量法で定量した。
ＩＦＵ単量体のビオチン生成に対する影響 無細胞抽出液を含まない酵素反応混合液は、全容量５０
μl 中に１００μM デスチオビオチン、１，０００μM
ＳＡＭ、２００μM Ｌ−システイン、５０μMデアザリ
ボフラビン、０．６mg/ml （１６μM)ＢＩＯＢタンパク
質、１０mM ＤＴＴおよび０．１M Tris−ＨＣｌ／pH
７．５を含んでいた。３００μl ガラススピッツ管内の
酵素反応混合液は暗所下弱い吸引とアルゴン加圧により
嫌気状態とした。反応は３０℃で２０W 蛍光灯から１０
cm距離の光照射により開始させた。反応８０分後、反応
は９５℃加熱により停止させ、生成したビオチンはラク
トバチルス・プランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用い
た微生物定量法で定量した。
【００４７】精製ＮＩＦＵ／Ｓ複合体および精製ＮＩＦ
Ｕ単量体添加の酵素反応混合液に対する影響を検討し
た。１３μM 精製ＮＩＦＵ／Ｓ複合体添加または３０μ
M 精製ＮＩＦＵ単量体添加は約４倍高いビオチン生産を
示した。１３μM 精製ＮＩＦＵ／Ｓ複合体および３０μ
M 精製ＮＩＦＵ単量体添加は約９倍高いビオチン生産を
示した（表３参照）。
Ｕ単量体添加の酵素反応混合液に対する影響を検討し
た。１３μM 精製ＮＩＦＵ／Ｓ複合体添加または３０μ
M 精製ＮＩＦＵ単量体添加は約４倍高いビオチン生産を
示した。１３μM 精製ＮＩＦＵ／Ｓ複合体および３０μ
M 精製ＮＩＦＵ単量体添加は約９倍高いビオチン生産を
示した（表３参照）。
【００４８】
【表３】
【図１】エシェリヒア・コリｂｉｏＢ遺伝子のクローニ
ング手順を示す。
ング手順を示す。
【図２】組換えプラスミドｐＴｒｃＥＢ１の構造を示す
略図である。
略図である。
【図３】精製されたエシェリヒア・コリＢＩＯＢのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
Ｓ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】精製されたエシェリヒア・コリＢＩＯＢの吸収
スペクトルを示す図である。
スペクトルを示す図である。
【図５】クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵおよびｎ
ｉｆＳクラスターのクローニング工程および組換えプラ
スミドｐＫＮｎｉｆ０２の構造を示す略図である。
ｉｆＳクラスターのクローニング工程および組換えプラ
スミドｐＫＮｎｉｆ０２の構造を示す略図である。
【図６】クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵおよびｎ
ｉｆＳクラスターを有する組換えプラスミドｐＫＮｎｉ
ｆ０３の構築工程を示す略図である。
ｉｆＳクラスターを有する組換えプラスミドｐＫＮｎｉ
ｆ０３の構築工程を示す略図である。
【図７】ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子発現プラスミドｐＫ
Ｎｎｉｆ０４の構築工程を示す略図である。
Ｎｎｉｆ０４の構築工程を示す略図である。
【図８】ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子発現プラスミドｐＫ
Ｎｎｉｆ０５の構築工程を示す略図である。
Ｎｎｉｆ０５の構築工程を示す略図である。
【図９】ｂｉｏＢ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子発現プラ
スミドｐＫＮｎｉｆ０６の構築工程を示す略図である。
スミドｐＫＮｎｉｆ０６の構築工程を示す略図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年７月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】前記反応に使用されるＮＩＦＵとＮＩＦＳ
としては、ＮＩＦＵとＮＩＦＳを含有する無細胞抽出
液、または通常の酵素精製法により部分精製されたＮＩ
ＦＵとＮＩＦＳを用いることができる。デスチオビオチ
ンからビオチンへの変換反応に効果を示すものならば、
如何なるＮＩＦＵとＮＩＦＳをこの反応に用いても良
い。しかしながら、好ましくはクレビシエラ・ニューモ
ニエのＮＩＦＵとＮＩＦＳが良い。クレビシエラ・ニュ
ーモニエＭ５ａ１はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を持つよ
く研究されている菌株である。クレビシエラ・ニューモ
ニエのｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子は以下の方法により得
られる。まず、クレビシエラ・ニューモニエＭ５ａ１の
遺伝子ライブラリーはＢａｍＨＩのような制限酵素によ
り切断されたＤＮＡ断片を使用して構築する。目的のｎ
ｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子はクレビシエラ・ニューモニエ
染色体ＤＮＡ中の２．５kbのＢａｍＨＩ断片に含まれる
ことが知られているので〔J. Bacteriol., 169, 4024
(1987) 〕、２．３〜２．６kbの長さのＤＮＡ断片を回
収し、適当な微生物中で複製できるベクタープラスミド
に連結する。ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株
式会社）とエシェリヒア・コリＪＭ１０９は遺伝子ライ
ブラリーを構築するためのベクタープラスミドと宿主微
生物の適した組み合わせの一つである。報告されている
ｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子のＤＮＡ配列をもとに合成さ
れたオリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーハイ
ブリダイゼーションのような常法に従って目的のクロー
ンを選択することができる。次に、ｎｉｆＵとｎｉｆＳ
遺伝子を有するＤＮＡ断片を他の発現ベクタープラスミ
ドにサブクローニングする。ｐＴｒｃ９９Ａのような誘
導型発現ベクターはｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発現す
るためには好ましい。エシェリヒア・コリＪＭ１０９
（ｐＫＮｎｉｆ０４）はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発
現するのに適したクローンの一つである。なお、Europe
an Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambrid
ge, GB) などの配列データバンクから得ることができる
公表されているｂｉｏＢ、ｎｉｆＵ、およびｎｉｆＳ遺
伝子の配列をもとに、当該分野で公知の方法（EP747 48
3 などを参照）に従ってこれらの遺伝子ＤＮＡを合成す
ることも可能である。如何なるＢＩＯＢ、ＮＩＦＵまた
はＮＩＦＳをコードするＤＮＡ配列でも、公表されてい
るＤＮＡ配列にもとづいて、周知のＰＣＲ技術により任
意の微生物から単離することが可能である。そのような
微生物はIndustrial Property 〔(1991) 1, 29-40 〕に
記載されている菌株保存機関、例えばThe American Typ
e Culture Collection (ATCC) などから入手することが
できる。
としては、ＮＩＦＵとＮＩＦＳを含有する無細胞抽出
液、または通常の酵素精製法により部分精製されたＮＩ
ＦＵとＮＩＦＳを用いることができる。デスチオビオチ
ンからビオチンへの変換反応に効果を示すものならば、
如何なるＮＩＦＵとＮＩＦＳをこの反応に用いても良
い。しかしながら、好ましくはクレビシエラ・ニューモ
ニエのＮＩＦＵとＮＩＦＳが良い。クレビシエラ・ニュ
ーモニエＭ５ａ１はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を持つよ
く研究されている菌株である。クレビシエラ・ニューモ
ニエのｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子は以下の方法により得
られる。まず、クレビシエラ・ニューモニエＭ５ａ１の
遺伝子ライブラリーはＢａｍＨＩのような制限酵素によ
り切断されたＤＮＡ断片を使用して構築する。目的のｎ
ｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子はクレビシエラ・ニューモニエ
染色体ＤＮＡ中の２．５kbのＢａｍＨＩ断片に含まれる
ことが知られているので〔J. Bacteriol., 169, 4024
(1987) 〕、２．３〜２．６kbの長さのＤＮＡ断片を回
収し、適当な微生物中で複製できるベクタープラスミド
に連結する。ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造株
式会社）とエシェリヒア・コリＪＭ１０９は遺伝子ライ
ブラリーを構築するためのベクタープラスミドと宿主微
生物の適した組み合わせの一つである。報告されている
ｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子のＤＮＡ配列をもとに合成さ
れたオリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーハイ
ブリダイゼーションのような常法に従って目的のクロー
ンを選択することができる。次に、ｎｉｆＵとｎｉｆＳ
遺伝子を有するＤＮＡ断片を他の発現ベクタープラスミ
ドにサブクローニングする。ｐＴｒｃ９９Ａのような誘
導型発現ベクターはｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発現す
るためには好ましい。エシェリヒア・コリＪＭ１０９
（ｐＫＮｎｉｆ０４）はｎｉｆＵとｎｉｆＳ遺伝子を発
現するのに適したクローンの一つである。なお、Europe
an Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambrid
ge, GB) などの配列データバンクから得ることができる
公表されているｂｉｏＢ、ｎｉｆＵ、およびｎｉｆＳ遺
伝子の配列をもとに、当該分野で公知の方法（EP747 48
3 などを参照）に従ってこれらの遺伝子ＤＮＡを合成す
ることも可能である。如何なるＢＩＯＢ、ＮＩＦＵまた
はＮＩＦＳをコードするＤＮＡ配列でも、公表されてい
るＤＮＡ配列にもとづいて、周知のＰＣＲ技術により任
意の微生物から単離することが可能である。そのような
微生物はIndustrial Property 〔(1991) 1, 29-40 〕に
記載されている菌株保存機関、例えばThe American Typ
e Culture Collection (ATCC) などから入手することが
できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】実施例２：ＢＩＯＢの単離 エシェリヒア・コリＪＭ１０９（ｐＴｒｃＥＢ１）を１
００μg/mlのアンピシリンを含む２L テリフィック・ブ
ロース（ＴＢ; ２４g/L 酵母エキス／ディフコ社製、１
２g/L トリィプトン／ディフコ社製、４g/L グリセリ
ン、２．３１g/Lリン酸一カリウム、１２．５４g/L リ
ン酸二カリウム）で好気的に３７℃、３時間培養した。
ＢＩＯＢタンパク質の発現は１mMのＩＰＴＧ添加後さら
に３時間培養することにより誘導させた。細胞は８，０
００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌し、０．１M ＮａＣ
ｌと１mM ＥＤＴＡを含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH
８．１（以後、ＴＢと略す）で洗菌後、１mM ＥＤＴＡ
を含まない同バッファーで再度洗菌し、−８０℃で使用
まで凍結保存した。以下のカラム操作は特に記述のない
場合は室温下で実施し、他の操作は４〜１０℃で実施し
た。ＢＩＯＢはカラム・クロマトグラフィーでの赤色バ
ンドと一致するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量３７kDa
のタンパク質バンドとして追跡した。細胞は５mM ２−
メルカプトエタノール（以後、２−ＭＥと略す）を含む
６０mlのＴＢを用いて融解後、０．２５mMフェニルメチ
ルスルホニルフルオロリド、１０μg/mlデオキシリボヌ
クレアーゼＩおよび１０μg/mlリボヌクレアーゼＡ存在
下でフレンチプレスによって破砕し、細胞残骸は１５，
０００×ｇ、３０分の遠心分離で除去した。溶液は５mM
２−ＭＥを含むＴＢで２００mlにした後、同容量（２
００ml）の２０％硫安 (w/v)を含むＴＢを添加した。１
mM ＥＤＴＡ添加後、溶液中のタンパク質は２mM ２−
ＭＥと１０％硫安を含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyop
earl 650M （４．４×１０cm; 東ソー株式会社）に吸着
させ、同平衡化バッファーで洗浄後、１０％硫安を含ま
ない同平衡化バッファーで溶出させた。溶出画分は４倍
容の２mM ２−ＭＥを含むＴＢで希釈し、２mM ２−Ｍ
Ｅを含むＴＢで平衡化したQ-Sepharose（４．４×１０c
m; Pharmacia Biotech Co.)に吸着させた。同平衡化バ
ッファーで洗浄後、溶出は１，２００mlの０〜０．５M
ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。ＮａＣｌ濃度
０．３M 付近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、１０％硫
安(w/v) 添加後、２mM ２−ＭＥと１０％硫安(w/v) を
含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyopearl 650S （２．２
×５cm; 東ソー株式会社製）に吸着させた。同平衡化バ
ッファーで洗浄後、溶出は２５０mlの１０〜０％硫安
（w/v)の直線濃度勾配により実施した。硫安濃度６％付
近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、Centriprep-30 (Ami
con, Inc.)により約３mlに濃縮後、２mM ２−ＭＥと
０．２５M ＮａＣｌを含むＴＢで平衡化したHiPrep Sep
hacryl S200HR 26/60 (Pharmacia BiotechCo.）を通過
させた。赤色をともなうＢＩＯＢピークを回収し、同容
量の２mM２−ＭＥを含むＴＢで希釈した後、同希釈バッ
ファーで平衡化したRESOURCE Q６ml（Pharmacia Biotec
h Co. ）に吸着させた。洗浄後、溶出は１２０mlの０〜
０．５M ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。赤色
をともなうＢＩＯＢピークを回収した。貯蔵前に、ＢＩ
ＯＢは１mMジチオスレイトール（以後、ＤＴＴと略す）
を含む５０mM Tris −ＨＣｌ／pH８．１バッファーで約
１mg/ml タンパク質終濃度に希釈後、１００μM ＦｅＣ
ｌ3 、５０μM Ｎａ2 Ｓと室温下２時間嫌気的にインキ
ュベートさせた。余剰のイオンとＤＴＴは０．２mM Ｄ
ＴＴを含む０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．５バッファー
で平衡化したSephadex G-25 (M, 1.5x 18 cm, Pharmaci
a Biotech Co.）を通過させることにより除去した。Ｂ
ＩＯＢタンパク質は２０〜３０mg/ml タンパク質終濃度
まで濃縮した後、−８０℃に貯蔵した。上記の方法で調
製されたＢＩＯＢタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上で分子量約３７kDa を示す単一バンドとして８０％以
上と推定された（図３参照）。上記の方法で調製された
ＢＩＯＢタンパク質は典型的な鉄／イオウタンパク質の
吸収スペクトルパターンを示した（図４参照）。
００μg/mlのアンピシリンを含む２L テリフィック・ブ
ロース（ＴＢ; ２４g/L 酵母エキス／ディフコ社製、１
２g/L トリィプトン／ディフコ社製、４g/L グリセリ
ン、２．３１g/Lリン酸一カリウム、１２．５４g/L リ
ン酸二カリウム）で好気的に３７℃、３時間培養した。
ＢＩＯＢタンパク質の発現は１mMのＩＰＴＧ添加後さら
に３時間培養することにより誘導させた。細胞は８，０
００×ｇ、２０分の遠心分離で集菌し、０．１M ＮａＣ
ｌと１mM ＥＤＴＡを含む２０mM Tris −ＨＣｌ／pH
８．１（以後、ＴＢと略す）で洗菌後、１mM ＥＤＴＡ
を含まない同バッファーで再度洗菌し、−８０℃で使用
まで凍結保存した。以下のカラム操作は特に記述のない
場合は室温下で実施し、他の操作は４〜１０℃で実施し
た。ＢＩＯＢはカラム・クロマトグラフィーでの赤色バ
ンドと一致するＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量３７kDa
のタンパク質バンドとして追跡した。細胞は５mM ２−
メルカプトエタノール（以後、２−ＭＥと略す）を含む
６０mlのＴＢを用いて融解後、０．２５mMフェニルメチ
ルスルホニルフルオロリド、１０μg/mlデオキシリボヌ
クレアーゼＩおよび１０μg/mlリボヌクレアーゼＡ存在
下でフレンチプレスによって破砕し、細胞残骸は１５，
０００×ｇ、３０分の遠心分離で除去した。溶液は５mM
２−ＭＥを含むＴＢで２００mlにした後、同容量（２
００ml）の２０％硫安 (w/v)を含むＴＢを添加した。１
mM ＥＤＴＡ添加後、溶液中のタンパク質は２mM ２−
ＭＥと１０％硫安を含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyop
earl 650M （４．４×１０cm; 東ソー株式会社）に吸着
させ、同平衡化バッファーで洗浄後、１０％硫安を含ま
ない同平衡化バッファーで溶出させた。溶出画分は４倍
容の２mM ２−ＭＥを含むＴＢで希釈し、２mM ２−Ｍ
Ｅを含むＴＢで平衡化したQ-Sepharose（４．４×１０c
m; Pharmacia Biotech Co.)に吸着させた。同平衡化バ
ッファーで洗浄後、溶出は１，２００mlの０〜０．５M
ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。ＮａＣｌ濃度
０．３M 付近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、１０％硫
安(w/v) 添加後、２mM ２−ＭＥと１０％硫安(w/v) を
含むＴＢで平衡化したPhenyl-Toyopearl 650S （２．２
×５cm; 東ソー株式会社製）に吸着させた。同平衡化バ
ッファーで洗浄後、溶出は２５０mlの１０〜０％硫安
（w/v)の直線濃度勾配により実施した。硫安濃度６％付
近溶出のＢＩＯＢピークを回収し、Centriprep-30 (Ami
con, Inc.)により約３mlに濃縮後、２mM ２−ＭＥと
０．２５M ＮａＣｌを含むＴＢで平衡化したHiPrep Sep
hacryl S200HR 26/60 (Pharmacia BiotechCo.）を通過
させた。赤色をともなうＢＩＯＢピークを回収し、同容
量の２mM２−ＭＥを含むＴＢで希釈した後、同希釈バッ
ファーで平衡化したRESOURCE Q６ml（Pharmacia Biotec
h Co. ）に吸着させた。洗浄後、溶出は１２０mlの０〜
０．５M ＮａＣｌの直線濃度勾配により実施した。赤色
をともなうＢＩＯＢピークを回収した。貯蔵前に、ＢＩ
ＯＢは１mMジチオスレイトール（以後、ＤＴＴと略す）
を含む５０mM Tris −ＨＣｌ／pH８．１バッファーで約
１mg/ml タンパク質終濃度に希釈後、１００μM ＦｅＣ
ｌ3 、５０μM Ｎａ2 Ｓと室温下２時間嫌気的にインキ
ュベートさせた。余剰のイオンとＤＴＴは０．２mM Ｄ
ＴＴを含む０．１M Tris−ＨＣｌ／pH７．５バッファー
で平衡化したSephadex G-25 (M, 1.5x 18 cm, Pharmaci
a Biotech Co.）を通過させることにより除去した。Ｂ
ＩＯＢタンパク質は２０〜３０mg/ml タンパク質終濃度
まで濃縮した後、−８０℃に貯蔵した。上記の方法で調
製されたＢＩＯＢタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ
上で分子量約３７kDa を示す単一バンドとして８０％以
上と推定された（図３参照）。上記の方法で調製された
ＢＩＯＢタンパク質は典型的な鉄／イオウタンパク質の
吸収スペクトルパターンを示した（図４参照）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】（３）クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆ
Ｕ、ｎｉｆＳ遺伝子を有するクローンの選択 クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子
を有するクローンの選択はManiatisら(Molecular Cloni
ng, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982, pp.
326-328)によって記載されたプロトコルに従って、コロ
ニーハイブリダイゼーションにより行った。
Ｕ、ｎｉｆＳ遺伝子を有するクローンの選択 クレビシエラ・ニューモニエｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ遺伝子
を有するクローンの選択はManiatisら(Molecular Cloni
ng, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982, pp.
326-328)によって記載されたプロトコルに従って、コロ
ニーハイブリダイゼーションにより行った。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】（４）組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３
の構築（図６参照） ベクタープラスミドpBluescriptII-SK+ （東洋紡株式会
社）をＨｉｎｃIIとＢａｍＨＩで完全に切断した。組換
えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０２をＶｓｐＩで完全に切断
し、末端をDNA Blunting Kit（宝酒造株式会社）により
平滑化した後、ＢａｍＨＩで完全切断した。ｎｉｆＵ、
Ｓクラスターを含む２．４kbの断片をアガロースゲル電
気泳動により得た。２．４kbの断片を切断処理を行った
pBluescriptII-SK+ にDNA ligation Kitを使用して挿入
し、組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３を得た。
の構築（図６参照） ベクタープラスミドpBluescriptII-SK+ （東洋紡株式会
社）をＨｉｎｃIIとＢａｍＨＩで完全に切断した。組換
えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０２をＶｓｐＩで完全に切断
し、末端をDNA Blunting Kit（宝酒造株式会社）により
平滑化した後、ＢａｍＨＩで完全切断した。ｎｉｆＵ、
Ｓクラスターを含む２．４kbの断片をアガロースゲル電
気泳動により得た。２．４kbの断片を切断処理を行った
pBluescriptII-SK+ にDNA ligation Kitを使用して挿入
し、組換えプラスミドｐＫＮｎｉｆ０３を得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 喜安 達也 神奈川県藤沢市本町３−９−３−103 (72)発明者 長橋 喜恵 神奈川県藤沢市湘南台６−３−２−203
Claims (2)
- 【請求項１】 ｂｉｏＢ遺伝子産物（ＢＩＯＢ）とｎｉ
ｆＵ遺伝子産物（ＮＩＦＵ）および／またはｎｉｆＳ遺
伝子産物（ＮＩＦＳ）を含有する酵素反応系とデスチオ
ビオチンを接触させ、得られたビオチンを反応混合物か
ら単離することを特徴とする、デスチオビオチンからの
ビオチンの製造方法。 - 【請求項２】 ｂｉｏ遺伝子産物（ＢＩＯＢ）とｎｉｆ
Ｕ遺伝子産物（ＮＩＦＵ）および／またはｎｉｆＳ遺伝
子産物（ＮＩＦＳ）をコードするＤＮＡ配列そのもの、
もしくはこれらのＤＮＡ配列を有する単一または独立し
た複数のプラスミドにより形質転換された微生物を水性
栄養培地中でデスチオビオチンの存在下で培養し、得ら
れたビオチンを培養液から単離することを特徴とする、
デスチオビオチンからのビオチンの製造方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96107064 | 1996-05-06 | ||
| EP96107064.6 | 1996-05-06 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1033189A true JPH1033189A (ja) | 1998-02-10 |
| JPH1033189A5 JPH1033189A5 (ja) | 2005-04-07 |
| JP4084440B2 JP4084440B2 (ja) | 2008-04-30 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| BR (1) | BR9703055A (ja) |
| DE (1) | DE69722852T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| DE19806872A1 (de) * | 1998-02-19 | 1999-08-26 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von Biotin |
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|---|---|---|---|---|
| JPS61149091A (ja) | 1984-12-24 | 1986-07-07 | Nippon Soda Co Ltd | ビオチン合成酵素をコ−ドする二重鎖ｄｎａ、それを含む微生物及びビオチンの製造法 |
| CA1317245C (en) * | 1985-08-26 | 1993-05-04 | Eric F. Fisher | System for biotin synthesis |
| JPS62155081A (ja) | 1985-12-27 | 1987-07-10 | Shiseido Co Ltd | 新規微生物およびそれを用いる醗酵法によるビオチンの製造法 |
| JP2722504B2 (ja) | 1988-07-14 | 1998-03-04 | 田辺製薬株式会社 | 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法 |
| FR2642768B1 (fr) | 1989-01-19 | 1991-05-17 | Transgene Sa | Procede perfectionne pour l'expression de la biotine dans bacillus sphaericus |
| JPH03240489A (ja) | 1990-02-19 | 1991-10-25 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規なプラスミド、それを保有するコリネ型細菌及びビオチンの製造法 |
| JPH06339371A (ja) * | 1991-04-15 | 1994-12-13 | Nippon Zeon Co Ltd | クレビシエラ属に属する形質転換微生物及びそれを用いたビオチンの製造方法 |
| PL177635B1 (pl) * | 1992-10-02 | 1999-12-31 | Lonza Ag | Rekombinacyjny materiał genetyczny, plazmidy i mikroorganizmy zawierające ten rekombinacyjny materiał genetyczny oraz biotechnologiczny sposób syntezy biotyny |
| JP3240489B2 (ja) | 1993-01-21 | 2001-12-17 | 株式会社日立製作所 | Ｉｇｂｔの過電流保護装置及びｉｇｂｔの保護装置 |
| JPH07236493A (ja) | 1994-03-03 | 1995-09-12 | Shiseido Co Ltd | デスチオビオチンからビオチンへの変換方法 |
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- 1997-04-24 DK DK97106762T patent/DK0806479T3/da active
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- 1997-05-02 JP JP11457197A patent/JP4084440B2/ja not_active Expired - Fee Related
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- 1997-05-05 BR BR9703055A patent/BR9703055A/pt active Search and Examination
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