JPH1033194A - 糖質又は複合糖質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タイプ１型糖鎖を特異的に、かつ簡便に付加
するリモデリング反応、該反応を利用した簡便な糖質又
は複合糖質の製造方法を提供する。 【解決手段】 タイプ１型糖鎖構造のラクト−Ｎ−ビオ
シド結合のみに特異的に作用するグリコシダーゼの存在
下、下記式（化１）： Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｘ ＋ Ｙ → Ｇａｌ
β１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｘ （式中Ｘは糖質、複合糖質、若しくはアグリコンとなり
うる化学物質、Ｙは糖質又は複合糖質を示す）で表され
る転移反応を行う糖質又は複合糖質の製造方法。該方法
により得た糖質又は複合糖質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖鎖工学又は医薬
分野等に有用な、酵素の糖質転移能を利用した、リモデ
リングした糖質又は複合糖質の製造方法、並びに該製造
方法により得られた糖質又は複合糖質に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖質及び複合糖質（糖タンパク質、糖脂
質、プロテオグリカン等）は、生物の細胞、体液、果
実、種や、微生物の細胞又はその培養液中に存在し、そ
れら生体内で様々な重要な生理活性に関与しているとい
うことが知られている。それ故に、近年、その生理活性
を医薬品として利用しようという試みが盛んに行われて
いる。更に、糖質及び複合糖質の糖鎖の修飾、又は置換
を行い、その生理活性を改変し新しいタイプの医薬を創
製しようという試みも行われている。糖質及び複合糖質
の糖鎖の修飾、又は置換を行うには化学的な方法と酵素
的方法がある。これらの方法のうち酵素的方法が、タン
パク質の変性を起こすことのない緩衝液等の水溶液中で
実施可能であり、また酵素が特異的に作用するという点
で利用されている。現在広く利用されているリモデリン
グの手法は、ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオ
ケミストリー（European Journal of Biochemistry) 、
第１９１巻、第７５〜８３頁（１９９０）に記載されて
いるように、エキソグリコシダーゼ又はグリコシルトラ
ンスフェラーゼを用いた糖鎖の非還元末端からの逐次変
換である。また、エンドグリコシダーゼを用いた糖転移
反応の報告は、ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第２
６１巻、第１２０００〜１２００５頁（１９８６）に記
載のフラボバクテリウム メニンゴセプチカム（Flavob
acterium meningosepticum) 由来のエンド−β−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼＦ（エンド−Ｆ）に関するも
のと、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー、第２６４巻、第１９８９３〜１９８９７頁（１９８
９）に記載のディプロコッカス ニューモニエ（Diploc
occus pneumoniae) 由来のエンド−α−Ｎ−アセチルガ
ラクトサミニダーゼに関するものがある。前者はグリセ
ロールがアクセプターとなるという報告であり、後者は
グリセロール、トリス、ｐ−ニトロフェノール、セリ
ン、スレオニンがアクセプターとなるという報告であ
る。一方、糖質や複合糖質が直接アクセプターとなる糖
鎖のリモデリング機構の報告としては、特開平５−６４
５９４号公報に記載のアルスロバクター プロトホルミ
エ（Arthrobacter protophormiae) 由来のエンド−β−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンド−Ａ）に関す
るものと、特開平７−５９５８７号公報に記載のエンド
−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（エンド−Ｍ）
に関するものがある。前述のように、糖鎖をリモデリン
グした複合糖質の安定性や生理活性が天然の複合糖質に
比べて増強されれば、医薬品に応用した場合、非常に有
利である。また糖鎖において、その非還元末端にタイプ
１型のＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造及びタイプ２型
のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造の２種類の構造がし
ばしば見出される。それらの糖鎖構造と機能の解析を行
う上で、該糖鎖構造を糖加水分解酵素によって除いた
り、逆に糖転移酵素によって付加するといった糖鎖リモ
デリング手法は極めて有用である。しかしながら、従来
のエキソグリコシダーゼ又はグリコシルトランスフェラ
ーゼを用いたリモデリングの手法では、糖残基１つ１つ
について酵素反応を行う必要があり、反応ステップが多
くなり大変煩雑である。また、前述のエンド−Ｆやディ
プロコッカス ニューモニエ由来のエンド−α−Ｎ−ア
セチルガラクトサミニダーゼを用いた糖転移反応の場合
も、糖質や複合糖質がアクセプターとなるものではな
い。一方、エンド−Ａやエンド−Ｍを用いる糖転移反応
は、糖質や複合糖質が直接アクセプターとなる糖鎖のリ
モデリング反応であり、現在、最も簡便で実用的な糖鎖
のリモデリング方法である。しかしながら、これらは糖
鎖において、その非還元末端のタイプ１型糖鎖構造又は
タイプ２型糖鎖構造を特異的にリモデリングすることは
できない。

【０００３】本発明者らは以前タイプ１型糖鎖構造に特
異的に作用しラクト−Ｎ−ビオースを遊離させる酵素、
ラクト−Ｎ−ビオシダーゼを見出している〔プロシーデ
ィングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザＵＳＡ（Proceedings of the
National Academy of Sciences of the ＵＳＡ）、第
８９巻、第８５１２〜８５１６頁（１９９２）、ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６８
巻、第１８５６０〜１８５６６頁（１９９３）〕。この
酵素の特異性により糖鎖中のタイプ１型構造とタイプ２
型構造を識別することができるようになり、構造解析が
極めて容易になった。しかしながら、糖質及び複合糖質
にタイプ１型糖鎖構造及びタイプ２型糖鎖構造を付加さ
せることは容易ではなく、いままでのところは厳密な転
移特異性を示す２種の糖転移酵素の作用、つまり、β−
Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼの働きに
続き、β−１、３及びβ−１、４ガラクトシルトランス
フェラーゼの働きを用いる方法が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、酵素法
を用いた糖鎖のリモデリングは、反応条件が温和なこと
などから有用性が高い。しかしながら、従来のエキソグ
リコシダーゼやエンドグリコシダーゼでは、タイプ１型
糖鎖を特異的に、しかも簡便に付加させることはでき
ず、またβ−Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラ
ーゼとβ−１、３ガラクトシルトランスフェラーゼを用
いる方法は、反応条件の設定や反応ステップが多くなり
大変煩雑になるなどの問題から極めて困難であった。本
発明の目的は、タイプ１型糖鎖を特異的に、かつ簡便に
付加するリモデリング反応、該反応を利用した簡便な糖
質又は複合糖質の製造方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は糖質又は複合糖質の製造方法に関す
る発明であって、タイプ１型糖鎖構造のラクト−Ｎ−ビ
オシド結合のみに特異的に作用するグリコシダーゼの存
在下、下記式（化１）：

【０００６】

【化１】Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｘ ＋ Ｙ →
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｘ

【０００７】（式中Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡ
ｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｘは糖質、複合糖質、
若しくはアグリコンとなりうる化学物質、Ｙは糖質又は
複合糖質を示す）で表される転移反応を行うことを特徴
とする。 また、本発明の第２の発明は、本発明の第１
の発明の製造方法により得られた糖質又は複合糖質に関
する。

【０００８】本発明者らは、タイプ１型糖鎖を特異的
に、かつ１段階の反応で転移を行えることが期待できる
グリコシダーゼを用いて、糖質及び複合糖質に糖鎖を転
移させ、従来の安定性及び活性が増強された新規糖質及
び複合糖質の製造をすべく、鋭意研究したところ、タイ
プ１型糖鎖構造を特異的に認識し糖質及び複合糖質へ転
移を行う活性を有するグリコシダーゼを見出し、その反
応方法を更に研究した結果、本発明を完成した。本発明
は、タイプ１型糖鎖構造のラクト−Ｎ−ビオシド結合の
みに特異的に作用するグリコシダーゼを用いて、糖質及
び複合糖質の糖鎖をリモデリングすることを特徴とする
糖質及び複合糖質の製造方法である。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明におけるタイプ１型糖鎖構造のラクト−Ｎ−
ビオシド結合のみに特異的に作用するグリコシダーゼと
しては、ストレプトミセス ｓｐ １４２（Streptomyc
es sp 142 ) 由来のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ〔プロシ
ーディングズ オブザ ナショナル アカデミー オブ
サンエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８９巻、第８
５２１〜８５１６頁（１９９２）〕が挙げられる。該酵
素は下記式（化２）で表される糖鎖に作用してラクト−
Ｎ−ビオシド結合のみを加水分解するという基質特異性
が述べられている。

【００１０】

【化２】 Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒは糖残基を表す）

【００１１】しかしこの酵素が糖鎖の転移反応を行う活
性を保存していることは知られていない。糖鎖又は複合
糖質へのラクト−Ｎ−ビオース転移反応は、本発明者ら
が初めて見出したものである。また、これらに限定され
るものではなく、タイプ１型糖鎖構造のラクト−Ｎ−ビ
オシド結合のみに特異的に作用するグリコシダーゼで転
移活性を有するものであればネーディブ（Native) な酵
素及び遺伝子工学的に得られた酵素、例えば、目的とす
る酵素をコードする遺伝子をベクターに導入し、該ベク
ターを宿主（例えば、大腸菌）に形質転換して得られた
形質転換体を培養し、該培養物から調製した組換体酵
素、目的とする酵素をコードする遺伝子を部位特異的変
異導入法等を用いて改変し、ベクターに導入し、該ベク
ターを宿主（例えば、大腸菌）に形質転換して得られた
形質転換体を培養し、該培養物から調製した組換体酵素
も本発明のタイプ１型糖鎖構造のラクト−Ｎ−ビオシド
結合のみに特異的に作用するグリコシダーゼに含まれ
る。

【００１２】本発明において、前述の式（化１）中のＸ
は糖質、複合糖質若しくはアグリコンとなりうる化学物
質であり、本発明のラクト−Ｎ−ビオシダーゼを用いる
場合、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグリコサ
ミン、ガラクトース、フコース、キシロース、ｐ−ニト
ロフェニルグリコシド誘導体、メチルグリコシド誘導体
等の単糖、これらの２単糖以上のホモオリゴマー、これ
らの２成分以上より成るヘテロオリゴマー等の糖質があ
り、またその末端にＡｓｎや、Ａｓｎを介しポリペプチ
ドが結合した複合糖質、その末端にＴｈｒ又はＳｅｒ
や、Ｔｈｒ又はＳｅｒを介しポリペプチドが結合した複
合糖質、ニトロフェニル誘導体、３−インドール誘導
体、４−メチルウンベリフェロン誘導体、ナフチル誘導
体、レゾルフィン誘導体等のアグリコンとなりうる化学
物質でもよい。また、Ｙは糖質又は複合糖質であり、本
発明のラクト−Ｎ−ビオシダーゼを用いる場合、グルコ
ース、マンノース、Ｎ−アセチルグリコサミン、ガラク
トース、フコース、キシロース、ｐ−ニトロフェニルグ
リコシド誘導体、メチルグリコシド誘導体等の単糖、こ
れらの２単糖以上のホモオリゴマー、これらの２成分以
上より成るヘテロオリゴマー等の糖質があり、またその
末端にＡｓｎや、Ａｓｎを介しポリペプチドが結合した
複合糖質、その末端にＴｈｒ又はＳｅｒや、Ｔｈｒ又は
Ｓｅｒを介しポリペプチドが結合した複合糖質が例示さ
れる。特に、Ｙについては、その非還元末端にＣ−３位
が遊離の糖を有する糖質又は複合糖質を選択することが
好ましい。

【００１３】本発明の転移反応は、通常、原料の糖質又
は複合糖質、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、及び緩衝液を
含む出発溶液に、アクセプターの糖質又は複合糖質を加
えて行われる。原料及びアクセプターの使用量は特に制
限されず、その飽和量まで使用できるが、アクセプター
が過剰に存在する状態が好ましく、通常、２００ｍＭ以
上のアクセプターを使用する。ラクト−Ｎ−ビオシダー
ゼの使用量も特に制限されず広い範囲から適宜選択でき
るが、出発溶液１ｍｌ当り、通常１ｍＵ以上、より好ま
しくは１０ｍＵ〜１０Ｕ程度使用すれば良い。緩衝液と
しては、ｐＨが４〜１０程度の好適な緩衝液を用いれば
良く、通常はｐＨ５付近で酢酸緩衝液中で反応を行うこ
とが好ましい。本発明の転移反応は、出発溶液に有機溶
媒、無機塩等を加えて疎水性状態としてもよく反応し、
有機溶媒として、例えばアセトニトリルを用いれば、水
難溶性の糖質又は複合糖質を使用することができる。ラ
クト−Ｎ−ビオシダーゼの場合、４０％のアセトニトリ
ル存在下でもよく反応する。本発明の転移反応は、ラク
ト−Ｎ−ビオシダーゼを用いる場合、通常、室温〜６０
℃程度、好ましくは３０〜４０℃程度の温度下及びｐＨ
４〜１０程度のｐＨ条件下に行われ、その反応条件にも
よるが、転移反応は通常５分〜６０分程度、好ましくは
１０〜４０分程度で終了する。本発明の転移反応により
生成するリモデリングした糖質又は複合糖質は、公知の
手段に従って反応終了液から容易に分離・精製すること
ができる。例えば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィ
ー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー等により
反応終了液から、リモデリングした糖質又は複合糖質を
分離し、更に濃縮、脱塩、凍結乾燥等を行うことにより
得ることができる。

【００１４】また、本発明の方法で製造した糖質又は複
合糖質は各種糖質分解酵素の基質ともなり、各種有用酵
素の検索にも用いることができる。例えば、ラクト−Ｎ
−ビオシダーゼの存在下、Ｇｌｃ−Ｘ（５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−Ｄ−グルコシド）を作用さ
せ、得られるＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｃ−Ｘ
は、試料中のラクト−Ｎ−ビオシダーゼの検出及び測定
に用いることができる。すなわち試料中の目的の酵素が
存在すれば、Ｇｌｃ−Ｘが遊離し、次にα−グリコシダ
ーゼを作用させれば遊離の５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドールが青色を呈し、ラジオアイソトープや蛍光
計などを必要とせず、試料中の酵素活性を測定すること
ができる。試料としては例えば、微生物の培養液、培養
液からの精製物、動物、植物等からの調製物等を用いる
ことができる。

【００１５】上述したように、本発明の製造方法を用い
ることにより、簡便に医薬品である糖タンパク質に糖鎖
を付加したり、あるいは既に存在する糖鎖の構造の変更
を行うことが可能となり、生体内での安全性や生物活性
が従来品に比べて増強された医薬品を得ることが可能と
なる。特に、癌の転移、浸潤にはタイプ１型糖鎖構造
（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）を基本とする糖鎖が関
与することが知られており、本発明の製造方法は、これ
らの癌転移抑制又は阻止のための医薬品の開発に非常に
有用である。更に、本発明の製造方法で得られた糖鎖又
は複合糖質は、糖質分解酵素の基質として用いることも
可能であり、有用糖質分解酵素の検索に有用である。

【００１６】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定さ
れるものではない。

【００１７】実施例１ ラクトースへの糖鎖の転移反応 （１）プロシーディングズ オブ ザ ナショナル ア
カデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡに
記載の方法に従って、ストレプトミセス ｓｐ１４２を
培養し、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼを調製し、以下実施
例に使用した。該菌株は、Streptomyces sp 142 と表示
し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦ
ＥＲＭ ＢＰ−４５６９として寄託されている。１Ｍの
ラクトース（ナカライテスク社製）の水溶液１．６ｍｌ
に、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を２．０ｍｌ
と、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼを１００ｍＵ含む酵素溶
液０．２ｍｌを加え、次いで５ｍＭ ｐ−ニトロフェニ
ル−β−ラクト−Ｎ−ビオシド（ナカライテスク社製）
を０．２ｍｌ添加し、３７℃で３０分間反応させた。そ
の後、反応液を１００℃にて３分間加熱処理し、反応を
停止させた。こうして得られた反応液を凍結乾燥後、特
開平１−１０１７７号公報に記載の方法に準じピリジル
−（２）−アミノ化（以下、ＰＡ化と略記する）を行
い、ＨＰＬＣにて精製した。このようにしてＰＡ化され
た転移生成物であるＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−
３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡを得た。次にこのＰＡ化
物の組成分析、ＮＭＲ分析を行い、その糖鎖構造がＧａ
ｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ
−ＰＡであることを確認した。

【００１８】（２）上記（１）と同様の条件で転移反応
を行い、反応開始後、２０分、４０分、６０分、１２０
分後にそれぞれをサンプリングし、反応を停止した。こ
うして得られた反応液を凍結乾燥後、上記（１）と同様
にＰＡ化生成物を調製し、その収率を求めた。その結果
を図１に示す。すなわち、図１はラクト−Ｎ−ビオシダ
ーゼを用い、ｐ−ニトロフェニル−β−ラクト−Ｎ−ビ
オシドにラクトースを転移させた際の収率を示す図であ
り、横軸に反応時間（分）、縦軸に収率（％）を示す。
図１からわかるように、反応４０分後で約３％の収率を
示した。

【００１９】

【発明の効果】本発明により、糖質又は複合糖質を直接
アクセプターとする、タイプ１型糖鎖を特異的に、かつ
１段階の反応で、簡便に行える糖質又は複合糖質のリモ
デリング方法が提供される。該方法は目的の糖質又は複
合糖質を効率良く容易に製造でき、また、副生物の生成
も少なく、目的の糖質又は複合糖質の分離精製も容易で
あり、生体内で重要な働きを示す生理活性物質の糖鎖を
リモデリングした物質の製造において有用である。ま
た、本発明の製造方法で得られた糖質又は複合糖質は、
糖質分解酵素の基質として用いることが可能であり、各
種有用酵素の検索に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ラクト−Ｎ−ビオシダーゼの転移反応時間と収
率との関係の１例を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 タイプ１型糖鎖構造のラクト−Ｎ−ビオ
   シド結合のみに特異的に作用するグリコシダーゼの存在
   下、下記式（化１）： 【化１】Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｘ ＋ Ｙ →
   Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−Ｙ ＋ Ｘ （式中Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセ
   チルグルコサミン、Ｘは糖質、複合糖質、若しくはアグ
   リコンとなりうる化学物質、Ｙは糖質又は複合糖質を示
   す）で表される転移反応を行うことを特徴とする糖質又
   は複合糖質の製造方法。
2. 【請求項２】 グリコシダーゼがラクト−Ｎ−ビオシダ
   ーゼである請求項１記載の糖質又は複合糖質の製造方
   法。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載の製造方法
   により得られた糖質又は複合糖質。