JPH1036286A - 貯蔵に安定なフィブリノーゲン調製物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 組織接着剤として用いるための濃縮フィブリ
ノーゲン溶液を調製するための、もしくは別の用途、例
えば、点滴物のためのフィブリノーゲン溶液を調製する
ための貯蔵に安定なフィブリノーゲン調製物を得るこ
と。 【解決手段】 凍結乾燥した形態の貯蔵に安定なフィブ
リノーゲン調製物であって、（ｉ）凍結乾燥した上記調
製物が、室温で水に溶解された場合に少なくとも７０mg
/ml のフィブリノーゲン濃度を有する溶液への再構成時
間が１５分まで、好ましくは７分より短いようにフィブ
リノーゲンの溶解性を改善する物質を含み、（ii）上記
調製物から得られた即時使用可能な組織接着性溶液が、
トロンビン−ＣａＣｌ₂ 溶液と混合した後に生理学的フ
ィブリン構造を有するフィブリン血餅を形成することを
特徴とする、フィブリノーゲン調製物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組織接着剤として
用いるための濃縮フィブリノーゲン溶液を調製するため
の、もしくは別の用途、例えば、点滴物のためのフィブ
リノーゲン溶液を調製するための貯蔵に安定なフィブリ
ノーゲン調製物に関する。

【０００２】上記貯蔵に安定なフィブリノーゲン調製物
は、凍結乾燥した形態で、あるいは冷凍貯蔵された（特
に高度に濃縮された）フィブリノーゲン溶液として存在
することができ、そしてそれらが以前から知られていた
即時使用可能な(ready-to-use)フィブリノーゲン溶液お
よび／または組織接着性溶液と同様の調製物より、それ
ぞれより簡便にそしてより迅速に再構成および融解され
得るという利点を有している。

【０００３】さらに、本発明はまた、本発明の調製物か
ら得ることができるフィブリノーゲン溶液および／また
は組織接着性溶液にも関する。

【０００４】フィブリノーゲンを基にした組織接着剤
は、ヒトもしくは動物の組織もしくは器官部分の継ぎ目
のない(seamless)結合および／または継ぎ目を補強する
結合、創傷の封鎖、止血、および創傷の治癒の促進に用
いられる。

【０００５】それらの作用様式は、トロンビンの働きに
より、即時使用可能な液体組織接着剤に含まれている
（可溶性）フィブリノーゲンが（不溶性の）フィブリン
に変換され、そして同様にそれらに含まれている第XIII
因子も第XIIIa 因子へと活性化されるという事実に基づ
いている。これにより形成されたフィブリンは、組織接
着剤の有効性に必須の高分子に架橋されるのである。必
要とされるトロンビン活性は接着されるべき組織（創傷
表面）に由来するか、あるいはトロンビンとＣａ²⁺イオ
ンとを含む溶液の形態で封鎖過程で組織接着剤に添加す
ることもできる。

【０００６】

【従来の技術】フィブリノーゲンを基にした組織接着剤
はＡＴ−Ｂ−３５９ ６５３、ＡＴ−Ｂ−３５９ ６５
２およびＡＴ−Ｂ−３６９ ９９０から既に公知であ
る。フィブリノーゲンおよび第XIII因子は別にして、そ
れらはまたフィブロネクチンおよびアルブミンのような
さらなるタンパク質、ならびに場合によっては抗生物質
をも含んでいる。組織接着剤は、冷凍貯蔵溶液の形態
で、もしくは凍結乾燥物としてのいずれかで市場に出さ
れているが、それは液体溶液の場合、それらは長時間に
わたって非常に安定というわけではないからである。こ
のような環境は、商品が、それらを適用する前に、それ
らの凍結乾燥物から解凍、すなわち融解あるいは再構成
されなければならないということに結びつく。どちらの
方法も多大な労力を伴うものである。

【０００７】最適な接着のためには、フィブリノーゲン
濃度が少なくとも７０mg/ml の即時使用可能な組織接着
性溶液が必要であり、ある量の第XIII因子が必要とさ
れ、それにより、フィブリノーゲン１ｇ当たりの第XIII
因子の単位数で表される、フィブリノーゲンに対する第
XIII因子の比が少なくとも８０となる。

【０００８】そのような調製物により、創傷治癒過程に
おいて、特に、安全な止血、シールの創傷および／また
は組織領域への良好な接着、接着および創傷の封鎖の高
度な強さ、接着剤の完全な再吸収が可能になり、そして
それらは創傷治癒促進特性を有する。

【０００９】しかし、必要な高度なフィブリノーゲンの
濃縮は、結果として凍結乾燥したおよび／または冷凍貯
蔵したフィブリノーゲン調製物は、徐々に既製品、液体
組織接着剤へ再構成されるか、および／または融解
（「溶解」）されるだけで、しかも温度は上昇している
−一般に２５℃以上、ほとんどは３０℃以上−という事
実を生じる。

【００１０】医学的観点からすると、即時使用可能な組
織接着性溶液の迅速な利用可能性が望ましい。なぜな
ら、特に手術上の緊急事態においては、それが決定的に
重要であるためである。

【００１１】さらに、手術を補佐する人の負担をできる
だけ少なくするためにも、できるだけ操作が少ないこと
が即時使用可能な溶液の調製物には要求されるべきであ
り、そしてもしもそれにはこれ以上付加的手段が必要と
されないならば、有利であると考えられる。

【００１２】さらに、医学的な観点からすると、即時使
用可能な組織接着性溶液は、それらのフィブリノーゲン
含有量が高いにも関わらず、室温、すなわち、２０℃で
容易に加工されるのに十分なほど既に流動化しているこ
とが望ましい。

【００１３】比較的流動性の組織接着性溶液は、特に、
組織接着剤が細いカテーテルによって体腔に誘導されて
そこに適用される場合に、あるいは、スプレー技術によ
って適用され、それによりその組織接着剤が噴霧されて
薄い層として創傷表面に適用される場合に有利である。
組織接着剤の適切な適用器具は、既に利用可能である
（ＥＰ０３１５２２２、ＥＰ０４５５６２６）。

【００１４】先行技術のフィブリノーゲン調製物の可溶
性は、ウイルス不活性化法を用いることによりさらに低
下させることができる。それらは、例えば、ＥＰ０１５
９３１１にしたがって、凍結乾燥した物質を熱処理する
という方法で好適に実施される。

【００１５】したがって、凍結乾燥したフィブリノーゲ
ン調製物の可溶性を改良するために多くの努力が傾注さ
れたのである。

【００１６】凍結乾燥物の再構成は特定の添加物により
改良することができることは公知である。したがって、
ＥＰ−Ａ−０３４５２４６は、フィブリノーゲンとは別
に、さらに少なくとも１つの生物学的に受容可能な界面
活性剤を含む凍結乾燥したフィブリノーゲン調製物を記
載している。界面活性剤を添加した結果、凍結乾燥物は
溶媒により改良された湿り気を有するようになり、それ
によりある温度での溶解率が改善するが、フィブリノー
ゲン自体の可溶性は改善しなかった。したがって、その
ような調製物もまた２５℃より高い温度で、このましく
は３７℃より高い温度で再構成されなければならない。

【００１７】ＥＰ−Ａ−０８５９２３は、フィブリノー
ゲンとは別に尿素もしくはグアニジン基を有する物質を
さらに含む凍結乾燥したフィブリノーゲン調製物を記載
している。しかし、それにしたがって作成した組織接着
性調製物は、細胞毒性に作用し、線維芽細胞の成長を阻
害して、変化した非生理学的フィブリン構造を生じ、そ
れによりフィブリンの所望の弾力性およびシールが失わ
れることが示された(Redl et al., Medizinische Welt
36, 769-76 (1985) 参照）。線維芽細胞、すなわち、創
傷治癒過程を開始する細胞の成長を阻害することによ
り、フィブリノーゲンを基にした組織接着剤の所望の創
傷治癒促進特性は失われる。さらに、in vivo 要求され
る高度な接着強度は得られたフィブリンの弾力性の欠除
により損なわれる。

【００１８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、凍結
乾燥した形態のもしくは冷凍貯蔵している液体調製物
（冷凍貯蔵）から得られた形態の貯蔵に安定なフィブリ
ノーゲン調製物を提供することである。この調製物は、
好ましくは装置の加熱および／または撹拌のような付加
的手段を用いずに、即時使用可能なフィブリノーゲンお
よび／または組織接着性溶液に迅速かつ簡単な方法で再
構成および融解され、ここで、上記即時使用可能な組織
接着性溶液（フィブリノーゲン濃度は少なくとも７０mg
/ml)は、容易に加工されるのにすでに十分流動性であ
り、そして、これにも関わらず、上記で考察した公知の
調製物、特にＥＰ−Ａ−０８５９２３に対応するものの
不利な点を持たない。

【００１９】

【課題を解決するための手段】上記目的は本発明により
解決される。ここで、上記調製物は、フィブリノーゲン
および場合によってはさらなるタンパク質ならびにアジ
ュバントおよび添加物とは別に、この調製物の可溶性を
改良し、および／またはそれらの融解温度を低下させ、
そして即時使用可能な組織接着性溶液の室温での粘度を
減少させる少なくとも１つの物質を含む。それにより、
その物質は、それらがフィブリノーゲンの可溶性に与え
る効果によるだけでなく、溶解した調製物がアクチベー
ターと反応してフィブリン血餅が形成される場合の生理
学的フィブリン構造のフォーメーションによっても選択
される。このことは、形成された血餅が生理学的なフィ
ブリン構造、すなわち、生理学的条件下（すなわち、イ
オン強度がおよそ０．１５でpH値がおよそ７．４）でト
ロンビンがフィブリノーゲンに作用することにより形成
された典型的な空間的に分岐したフィブリル構造を有す
るなら、フィブリノーゲン溶液を等容量のトロンビン−
ＣａＣｌ₂ 溶液（実質的に４IUのトロンビンおよび２０
−４０μmol ＣａＣｌ₂/mlを含有する）と混合すること
により証明することができる。この生理学的構造は、不
透明で粘性で可塑性の血餅により肉眼で特徴づけられ
る。代表的な生理学的もしくは非生理学的フィブリン血
餅の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真が、例えば、Redl e
t al., Medizinische Welt 36, 769-76 (1985)の刊行物
に示されている。

【００２０】本発明の調製物は、組織接着剤として用い
られた場合に細胞毒性効果を持たないように構成されて
いる。すなわち、それは細胞によってよく寛容されてお
り、良好な細胞の成長を可能にし、それによる良好な創
傷治癒のための理想的な調製物を提供する。このこと
は、組織接着剤を等容量の半等張性のもしくは等張性の
塩化ナトリウム溶液で希釈することにより証明すること
ができ、線維芽細胞に損傷を与えるような効果は検出さ
れていない。

【００２１】Redlらによれば（上記参照）、フィブリノ
ーゲンもしくは組織接着性溶液は、それが細胞トッピン
グテストにおいて線維芽細胞に損傷を与えるような効果
をおよぼさなければ、一般に、非細胞毒性といわれる。

【００２２】さらに、本発明の調製物は、好ましくは組
織接着剤に対する全てのさらなる要件を満たすように構
成され、それらは、 −ウイルス安全性 −高度な接着強度および／または手当可能な創傷の封鎖
ならびに安全で継続した止血 −プラスミノーゲンおよび／またはフィブリン溶解阻害
剤の含有量の変化による体内での接着の制御可能な耐久
性 −創傷治癒過程における接着剤の完全な再吸収性、およ
び −創傷治癒促進特性 すなわち、通常所望される組織接着剤の生化学的および
物理的性質は、調製物の可溶性を改善するか、および／
またはその融解温度を低下させ、そして室温での即時使
用可能な組織接着剤の粘性を減少させる本発明の組織接
着剤の物質の成分によって事実上、ネガティブな影響を
受けないということである。

【００２３】このことは、以下のさらなる例示的テスト
により実証することができる： −トロンビン溶液との混合後の凝固反応（凝固時間） −フィブリン−γ鎖およびα鎖の架橋 −フィブリン溶解耐性 −引っ張り強さ −接着強度 融解温度は冷凍貯蔵濃縮フィブリノーゲン溶液が温度の
上昇によって融解する温度であると理解される。

【００２４】

【発明の実施の形態】本発明の流動性冷凍貯蔵形態の貯
蔵に安定なフィブリノーゲン調製物は、それが、０〜２
５℃の温度で、好ましくは２０℃未満で、特に好ましく
は１５℃未満で、フィブリノーゲン含有量が少なくとも
７０mg/ml である溶液に融解するように可溶性を改善す
る物質を含む。融解温度が低くなったということは、冷
凍貯蔵した濃縮フィブリノーゲン溶液が、例えば、２０
〜２５℃の周囲の温度（室温）に曝された場合に、それ
がより迅速に融解するという意味である。このことは、
本発明の冷凍貯蔵調製物に特に当てはまり、この調製物
は、即時使用可能な滅菌した使い捨てシリンジに充填さ
れており、無菌性という理由によりプラスチックフィル
ムで２重に密封されている。必要な二重のコーティング
により熱交換はより困難であり、そのため、現在まで、
このようにパックされた冷凍貯蔵調製物は、水槽（３７
℃）という手段によって妥当な時間内に融解する、すな
わち即時使用可能な状態にすることしかできなかった。
しかし、水槽の利用は面倒で、例えば、滅菌状態の維持
に関して、取り扱いの不利を伴うものである。

【００２５】本発明の凍結乾燥したフィブリノーゲンお
よび／または組織接着性調製物はまた、これらが室温
で、フィブリノーゲン含有量が少なくとも７０mg/ml の
溶液に、特別な手段（例えば、ＡＴ−Ｂ−３７１ ７１
９による組み合わせた加熱および撹拌装置）を用いず
に、妥当な時間内に、すなわち、約１／２分〜１５分ま
で、好ましくは７分未満で、特に好ましくは５分未満
で、再構成され得るという利点を有する。現在まで、Ｅ
Ｐ−Ａ−０８５９２３による調製物が唯一の事例であっ
たが、これらの調製物は上記のように重大な不利な点を
有している。

【００２６】さらに、本発明の調製物はまた、他の目
的、例えば、点滴のためのフィブリノーゲン溶液の特に
迅速で容易な提供を可能にする。

【００２７】驚くべきことに、一連の物質が上述の要
件、すなわち、ＥＰ−Ａ−０８５９２３による添加物の
さらなる上述の望ましくない副作用を引き起こすことな
く、フィブリノーゲンの溶解性を増加させ、濃縮冷凍貯
蔵フィブリノーゲンおよび／または組織接着性溶液の融
解温度ならびに室温でのそれらの粘性を低下させるこ
と、を満たしていることが見いだされた。

【００２８】本発明の調製物は、ベンゼン化合物、ピリ
ジン化合物、ピペリジン化合物、ピリミジン化合物、モ
ルホリン化合物、ピロール化合物、イミダゾール化合
物、ピラゾール化合物、フラン化合物、チアゾール化合
物、プリン化合物、あるいはビタミン、核塩基、ヌクレ
オシドもしくはヌクレオチドの群から選択される一以上
の物質を、好ましくはフィブリノーゲン１ｇ当たり、
０．０３mmol〜３mmol、最も好ましくは０．０７mmol〜
１．４mmolの量で含む。

【００２９】凍結乾燥したフィブリノーゲン調製物から
の点滴溶液の調製には、フィブリノーゲンに関して比較
的高い比率の量の上記物質を選択することが有利であ
る。例えば、この物質は、点滴物中のフィブリノーゲン
１ｇ当たり０．１２〜１２mmol、好ましくは０．２８〜
５．６mmolの量で存在し得る。

【００３０】これらの物質は、例えば、安息香酸、ｐ−
アミノ安息香酸（ビタミンＨ）、ｐ−アミノサリチル
酸、ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシサリチル酸、フェ
ニルアラニン、プロカイン、ナイアシン、ナイアシンア
ミド、ピコリン酸、ビタミンＢ₆ （ピリドキシン）、ヒ
ドロキシピリジン、ピリジンジカルボン酸、ピリジンス
ルホン酸、ピペリジンカルボン酸エステル、ピリミジ
ン、バルビツル酸、ウラシル、ウリジン、ウリジンリン
酸（ウリジル酸）、チミン、シトシン、シチジン、ヒド
ロキシピリミジン、チアミン（ビタミンＢ₁)、モルホリ
ン、ピロリドン、イミダゾール、ヒスチジン、ヒダント
イン、ピラゾール、ジカルボン酸、フェナゾン、アデノ
シン、アデノシンリン酸、イノシン、グアノシンリン
酸、α−フロ酸（フラン−２−カルボン酸）、アスコル
ビン酸（ビタミンＣ）およびキサントシンを含む。

【００３１】上記の物質のタイプおよび量は、即時使用
可能な組織接着性調製物が問題なく噴霧され得るために
室温で十分に流動性であり、それに対応する粘度が４０
０cSt 未満、好ましくは３００cSt 未満であり、そして
生理学的血餅が上記の即時使用可能な組織接着性溶液と
トロンビン−ＣａＣｌ₂ 溶液とを１：１の比で混合した
後に形成されるように選択される。

【００３２】本発明のフィブリノーゲン調製物は、濃縮
組織接着性溶液のオスモル濃度が好ましくは５００mOsm
未満、最も好ましくは４００mOsm未満であるような比較
的低い塩含有量によって特徴づけられる。この制限は、
所望の良好な細胞寛容性（細胞毒性特性がない）を得る
ために必要である。本発明の物質により、今や、比較的
低い塩含有量の凍結乾燥フィブリノーゲン調製物を作製
することが可能である。塩含有量が比較的低いにも関わ
らず、この凍結乾燥フィブリノーゲン調製物は、上記の
ように、室温で即時使用可能な比較的流動性の組織接着
性溶液（フィブリノーゲン含有量は少なくとも７０mg/m
l)に再構成され得、そして細胞によって良好に寛容され
る。

【００３３】以前には、室温で可溶性であるが、細胞に
損傷を与えるか(Beriplast, Biocol, Bolheal HG）、細
胞によって良好に寛容されるが上昇した温度−好ましく
は３７℃でしか再構成されない調製物が公知であった(T
issucol)。

【００３４】本発明の調製物はまた、それらの組成物に
よりウイルスに対して安全な調製物として提供され得
る。それらは、ウイルスを不活化または涸渇するための
前処理にもかかわらず良好に溶解する。多工程の熱処理
法、例えば、ＥＰ１５９３１１による６０℃および８０
℃での蒸気処理、あるいは、化学的処理法および／また
は物理的処理法の組合せが特に有効な処理方法である。

【００３５】熱処理法は、溶解性を改善する物質を調製
物に添加する前に行われ、そして場合によっては最終的
な容器に充填する前にナノ濾過を行う。

【００３６】好ましくは、本発明の調製物は、さらに第
XIII因子を含み、場合によっては、創傷治癒の過程で利
点があるフィブロネクチンもしくは少量のプラスミノー
ゲンを含む。

【００３７】一方、ある場合には、本発明の調製物は実
質的にフィブリノーゲンのみからなり、すなわち、フィ
ブリノーゲンを単一の活性物質として含む。

【００３８】さらに好ましい実施態様は、フィブリノー
ゲンおよびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤およ
びプラスミン阻害剤（例えば、アプロチニン、α₂ −プ
ラスミン阻害剤、α₂ −マクログロブリンなど）を基に
した組織接着剤に関する。即時使用可能な組織接着性溶
液は一般に１ml当たり、７０〜１２０mgのフィブリノー
ゲン、場合によっては０．５〜５０U の第XIII因子、場
合によっては０．５〜１５mgフィブロネクチン、０〜１
５０μg のプラスミノーゲン、および０〜２０，０００
KIU のアプロチニン、好ましくは１，０００〜１５，０
００KIU のアプロチニンを含む。好ましい調製物はさら
に、凍結乾燥調製物のより良好な湿り気のため、および
／または冷凍貯蔵調製物の改善のため低濃度の界面活性
剤を含む。

【００３９】本発明を、以下の実施例によりより詳細に
例示する。

【００４０】

【実施例】実施例１：異なる冷凍貯蔵組織接着性溶液の
融解温度 ウイルスを不活化した（蒸気処理した）組織接着性調製
物を公知の方法（ＡＴ−Ｂ−３６９６５３、ＥＰ０３４
５２４６を参照）にしたがって以下のように生成した：

【００４１】プールしたヒトクエン酸処理血漿からの血
漿低温沈降物を緩衝液（２℃で１L当たり６．６ｇのク
エン酸ナトリウム・２Ｈ₂ Ｏ、３．４ｇのＮａＣｌ、１
０ｇグリシン、２５，０００KIU のアプロチニン、およ
び２００IUのヘパリンを含む）で洗浄し、遠心分離し
た。この沈殿物をさらなる緩衝液（９．０ｇのグリシ
ン、１．０ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ₂ Ｏ、２５，
０００KIU のアプロチニン、および０．２ｇのTriton W
R1339 を含む）を用いてタンパク質濃度が４２g/Lにな
るよう調整した。次いで、１L 当たり４．５ｇの純粋な
ヒトアルブミン、および１５，０００U の第XIII因子を
添加し、pH値を７．３に調整した。この溶液をバルクで
凍結乾燥し、水分含量を７．５％に調整し、そしてＮ₂
雰囲気下で１０時間６０℃で加熱した。こうして得られ
たウイルスを不活化した材料を、蒸留水で溶解してタン
パク質濃度を４７g/L とし、滅菌濾過して再び凍結乾燥
した。凍結乾燥した材料の一部を蒸留Ｈ₂ Ｏで溶解し
て、表１に示した添加物（＝即時使用可能な組織接着性
溶液）ありまたはなしでフィブリノーゲン濃度を８５mg
/ml とし、それぞれ２mlを試験管に満たして冷凍貯蔵し
た。

【００４２】このようにして得た冷凍貯蔵組織接着性溶
液の融解温度は以下の融解テストで測定した：

【００４３】冷凍貯蔵した試料を最初に水槽で１０℃の
一定温度３０分間インキュベーションした。その後、こ
の温度を３０分ごとに２．５℃ずつ上昇させた。各イン
キュベーション時間の後に試料の凝固状態を試験管をチ
ッピングすることにより評価した。固体状態から液体状
態への移行は急激に起きたわけではなく、いくつかの温
度工程の範囲にわたっておこり、ゼラチン状の状態と粘
性の移行状態とを経る。

【００４４】このテストによると、試料は、試験管をチ
ッピングしたときに水平な液体レベルが形成されて初め
て、すなわち、試料が出血後直ちに目に見える膨張を起
こさない場合に、「液体」と見なされる。

【００４５】この単純なテストの助けを借りて、組織接
着性溶液が容易に用いられるために所定の温度で十分に
流動的であるかどうかを測定することができる。

【００４６】結果を表１にまとめる。

【００４７】さらに、列挙した組織接着性溶液が、等容
量のトロンビン−ＣａＣｌ₂ 溶液（１ml当たり４IUのト
ロンビン、および４０μmol のＣａＣｌ₂ 、Thrombin 5
00,Immuno AG が生産）と混合した後で生理学的で不透
明、粘性塑性の血餅を所望通り形成したかどうかも調査
した。列挙した全ての組織接着性溶液も同様であった。

【００４８】

【表１】

【００４９】

【表２】

【００５０】実施例２：ナイアシンアミドが組織接着性
溶液の粘度に与える影響 実施例１と同様に、流動性冷凍貯蔵組織接着性溶液（凝
固し得るタンパク質含有量：８１mg/ml)を異なるナイア
シンアミド含有量を用いて作製した。

【００５１】解凍後、異なる温度における動粘度をキャ
ピラリー粘度計で測定した。

【００５２】結果を表２にまとめた。

【００５３】

【表３】

【００５４】実施例３：ピリドキシン・ＨＣｌが組織接
着性溶液の粘度におよぼす影響 実施例２と同様に行った；結果を表３に示す。

【００５５】

【表４】

【００５６】実施例４：ナイアシンアミドが凍結乾燥し
た組織接着性調製物の再構成時間におよぼす影響 凍結乾燥し、ウイルス不活化した組織接着性調製物を加
熱工程まで実施例１と同様に生成した。

【００５７】その後、この材料を蒸留Ｈ₂ Ｏおよび／ま
たは異なる濃度の水性ナイアシンアミド溶液でタンパク
質濃度が３０g/L となるよう溶解し、滅菌濾過し、それ
ぞれ４mlを最終滅菌容器（小さなガラス瓶）に満たして
凍結乾燥した。

【００５８】１．０mlのＨ₂ Ｏもしくは水性アプロチニ
ン溶液を用いて再構成した後、各変性物が１ml当たり８
５mgのフィブリノーゲン含有量を持つ即時使用可能な組
織接着性溶液を得た。室温での必要な再構成時間は手で
緩やかに振盪することにより測定した。数回の測定を数
個の小さな瓶について行った。結果を表４にまとめる。

【００５９】溶媒中の３，０００KIU/mlまでのアプロチ
ニンは再構成時間に有意な影響を及ぼさなかった。

【００６０】

【表５】

【００６１】実施例５：本発明の組織接着剤の細胞適合
性 実施例４の組織接着性調製物を、Redl et al., Med. We
lt 36, 769-776, 1985にしたがってそれらの細胞適合性
について試験した。ＥＰ−Ａ−００８５９２３に対応す
る公知の細胞毒性組織接着性調製物をコントロールとし
て供した。

【００６２】結果：実施例４の全ての調製物（ナイアシ
ンアミド含有量は２００mmol/Lまで）は、細胞によって
よく寛容されることを示した。対照的に、ＥＰ−Ａ−０
０８５９２３に対応する組織接着性調製物は、予想通り
数分で深刻な細胞の損傷にいたり、それによってテスト
システムの感度が確認された。

【００６３】精製された凍結乾燥フィブリノーゲン調製
物（バルク材料）を、実質的にL.A.Kazal et al., Pro
c. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989-994, 1963 にした
がって、フィブリノーゲン含有ヒト血漿画分からのグリ
シン沈殿により生成した。

【００６４】この材料を残存水分が７〜８％になるよう
調整し、さらに、Ｎ₂ 雰囲気下で１０時間、６０℃で、
その後３時間８０℃でウイルスを不活化した。

【００６５】材料の分析結果は以下の通りであった。 タンパク質 ７３．０％(g/g) 凝固可能なタンパク質（フィブリノーゲン） ６９．４％(g/g) Ｎａ₃ −クエン酸・２Ｈ₂ Ｏ １９．５％(g/g)

【００６６】１L 当たり２２ｇのフィブリノーゲンと１
０ｇのヒトアルブミンを含み、異なるナイアシンアミド
含量の溶液（pH７．４）をこの材料のアリコートから作
製し、そしてこれらの溶液のオスモル濃度をＮａＣｌの
添加により約３００mOsmに調整した。

【００６７】滅菌濾過した後、これらの溶液を１２５ml
容の瓶にそれぞれ５０ml入れて凍結乾燥した。

【００６８】このようにして得た凍結乾燥したフィブリ
ノーゲン調製物を、それぞれ５０mlのＨ₂ Ｏで室温で、
手で緩やかに振盪しながら溶解し、再構成時間を測定し
た。それにより、非常に正確な終点が規定された：調製
物は、透過光中でそれ以上目に見える非溶解粒子がなく
なって初めて溶解したと見なされた。結果（三回の測定
の平均値）を次の表にまとめる。

【００６９】

【表６】

【００７０】この実施例は、点滴調製物として用いられ
るよう処方され、そして再構成後の最適な適合性のため
にほぼ等張である本発明の溶解性を改善する物質が、加
熱し凍結乾燥したフィブリノーゲン調製物の不溶性にお
よぼす好ましい影響を示す。

【００７１】実施例７ フィブリノーゲン含有ヒト血漿画分を、実質的にＡＵ−
Ｂ−１８３０６／９２に記載してあるように、ヒト血漿
中に存在するかもしれないＨＩＶのようなウイルスを不
活化するためにTween 80で処理した。

【００７２】この最初のウイルス不活化工程の後、この
材料をさらに実施例６と同様にグリシン沈殿し、得られ
た沈殿物を２５mMのＮａ−クエン酸溶液、pH７．３、０
−２℃で洗浄することにより精製した。

【００７３】精製した沈殿物を溶解して１L 当たり５０
ｇのタンパク質および１０mmolのＮａ−クエン酸、pH
７．３の溶液を生じ、凍結乾燥した。

【００７４】得られた凍結乾燥したバルクの材料を残存
水分が７〜８％となるよう調整し、Ｎ₂ 雰囲気下で１０
時間、６０℃で、その後１時間８０℃でさらにウイルス
を不活化するために加熱した。

【００７５】その後、この材料を、１L 当たり４０mmol
のヒスチジンＨＣｌ、４０mmolのナイアシンアミド、８
０ｇのTween 80、および１００，０００KIU のアプロチ
ニンを含む溶液を用いてタンパク質濃度４０g/L に溶解
し、ＮａＯＨでpH７．３に調整した。ウイルスを不活化
したヒトアルブミンを６g/L の濃度で添加し、オースト
ラリア国特許出願Ａ１５４８／９３にしたがってウイル
スを不活化したヒトの精製第XIII因子を１L 当たり１
５，０００U の濃度で添加した。

【００７６】この溶液を滅菌濾過し、それぞれ２．５ml
を滅菌した最終容器（ガラス瓶）に入れ、凍結乾燥し
た。

【００７７】１．０mlの水もしくはアプロチニン溶液を
用いて再構成した際には、１ml当たり９０mgのフィブリ
ノーゲン、２．５mgのフィブロネクチン、１５mgのアル
ブミン、１００μmol のヒスチジンおよび１００μmol
のナイアシンアミドを含む即時使用可能な組織接着性溶
液が得られた。

【００７８】室温での平均再構成温度は実施例４で測定
したようにわずか４分であった。

【００７９】実施例７は、本発明の溶解性を改善する物
質の組合せが、高度に可溶性の凍結乾燥組織接着性調製
物の提供において特に効果的であることを示している。
この組織接着性調製物は同時に、操作の間の２回の異な
るそして独立したウイルス不活化工程故に非常に高度な
ウイルス安全性を有している。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 即時使用可能な組織接着性溶液を迅速に
   調製するための凍結乾燥した形態の貯蔵に安定なフィブ
   リノーゲン調製物であって、 （ｉ）該凍結乾燥した調製物が、室温で水に溶解した場
   合に少なくとも７０mg/ml のフィブリノーゲン濃度を有
   する溶液への再構成時間が１５分まで、好ましくは７分
   より短いようにフィブリノーゲンの溶解性を改善する物
   質を含み、そして（ii）該調製物から得られた該即時使
   用可能な組織接着性溶液が、トロンビン−ＣａＣｌ₂ 溶
   液との混合後に生理学的フィブリン構造を有するフィブ
   リン血餅を形成することを特徴とする、フィブリノーゲ
   ン調製物。
2. 【請求項２】 即時使用可能な組織接着性溶液を迅速に
   調製するための冷凍貯蔵した形態の貯蔵に安定なフィブ
   リノーゲン調製物であって、 （ｉ）該冷凍貯蔵した調製物が、この調製物が０〜２５
   ℃の温度で、好ましくは２０℃未満の温度で、少なくと
   も７０mg/ml のフィブリノーゲン濃度を有する溶液に融
   解し得るようにフィブリノーゲンの溶解性を改善する物
   質を含み、そして（ii）該調製物から得られた該即時使
   用可能な組織接着性溶液が、トロンビン−ＣａＣｌ₂ 溶
   液との混合後に生理学的フィブリン構造を有する血餅を
   形成することを特徴とする、フィブリノーゲン調製物。
3. 【請求項３】 前記フィブリノーゲンの溶解性を改善す
   る物質が、ベンゼン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジ
   ン、モルホリン、ピロール、イミダゾール、ピラゾー
   ル、フラン、チアゾールおよびプリンから誘導される化
   合物の群から選択され、ここで、該物質は前記調製物中
   の選択された濃度において細胞毒性を有さないことを特
   徴とする、請求項１または２に記載の調製物。
4. 【請求項４】 前記フィブリノーゲンの溶解性を改善す
   る物質が、ビタミンの群から選択されることを特徴とす
   る、請求項１または２に記載の調製物。
5. 【請求項５】 前記フィブリノーゲンの溶解性を改善す
   る物質が、核塩基、ヌクレオシド、もしくはヌクレオチ
   ドの群から選択されることを特徴とする、請求項１また
   は２に記載の調製物。
6. 【請求項６】 前記フィブリノーゲンの溶解性を改善す
   る物質が、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸（ビタミン
   Ｈ′）、ｐ−アミノサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、
   ヒドロキシサリチル酸、フェニルアラニン、プロカイ
   ン、ナイアシン、ナイアシンアミド、ピコリン酸、ビタ
   ミンＢ₆ （ピリドキシン）、ヒドロキシピリジン、ピリ
   ジンジカルボン酸、ピリジンスルホン酸、ピペリジンカ
   ルボン酸エステル、ピリミジン、バルビツル酸、ウラシ
   ル、ウリジン、ウリジンリン酸、チミン、シトシン、シ
   チジン、ヒドロキシピリミジン、チアミン（ビタミンＢ
   ₁)、モルホリン、ピロリドン、イミダゾール、ヒスチジ
   ン、ヒダントイン、ピラゾールジカルボン酸、フェナゾ
   ン、アデノシン、アデノシンリン酸、イノシン、グアノ
   シンリン酸、α−フロ酸（フラン−２−カルボン酸）、
   アスコルビン酸（ビタミンＣ）およびキサントシンであ
   る、請求項３に記載の調製物。
7. 【請求項７】 前記物質がフィブリノーゲン１ｇ当たり
   ０．０３〜３mmol、好ましくは０．７〜１．４mmolの量
   で含まれていることを特徴とする、１以上の上記請求項
   のいずれか１項に記載の調製物。
8. 【請求項８】 前記組織接着性溶液が、１ml当たり４IU
   のトロンビンと４０μmol のＣａＣｌ₂ を含む当容量の
   トロンビン−ＣａＣｌ₂ 溶液と混合した後に、不透明で
   粘性弾性のフィブリン血餅を、３７℃で最大１０分以内
   に形成することができることを特徴とする、１以上の上
   記請求項のいずれか１項に記載の調製物。
9. 【請求項９】 前記組織接着性溶液が細胞毒性効果を持
   たないことを特徴とする、１以上の上記請求項のいずれ
   か１項に記載の調製物。
10. 【請求項１０】 前記組織接着性溶液を等容量の等張塩
    化ナトリウム溶液で希釈した後では線維芽細胞に損傷を
    与える効果が検出されないことを特徴とする、１以上の
    上記請求項のいずれか１項に記載の調製物。
11. 【請求項１１】 １以上の上記請求項のいずれか１項に
    記載の調製物の再構成および／または融解により得られ
    得る即時使用可能な組織接着性溶液。
12. 【請求項１２】 ベンゼン、ピリジン、ピペリジン、ピ
    リミジン、モルホリン、ピロール、イミダゾール、ピラ
    ゾール、フラン、チアゾールおよびプリンから選択され
    るフィブリノーゲンの溶解性を改善する物質を含む凍結
    乾燥したフィブリノーゲン調製物であって、該物質が存
    在する濃度において細胞毒性を持たない、調製物。
13. 【請求項１３】 ビタミンの群から選択されるフィブリ
    ノーゲンの溶解性を改善する物質を含む、凍結乾燥した
    フィブリノーゲン調製物。
14. 【請求項１４】 核塩基、ヌクレオシドもしくはヌクレ
    オチドの群から選択されるフィブリノーゲンの溶解性を
    改善する物質を含む凍結乾燥したフィブリノーゲン調製
    物。
15. 【請求項１５】 前記フィブリノーゲンの溶解性を改善
    する物質が、例えば、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸
    （ビタミンＨ′）、ｐ−アミノサリチル酸、ヒドロキシ
    安息香酸、ヒドロキシサリチル酸、フェニルアラニン、
    プロカイン、ナイアシン、ナイアシンアミド、ピコリン
    酸、ビタミンＢ₆ （ピリドキシン）、ヒドロキシピリジ
    ン、ピリジンジカルボン酸、ピリジンスルホン酸、ピペ
    リジンカルボン酸エステル、ピリミジン、バルビツル
    酸、ウラシル、ウリジン、ウリジンリン酸、チミン、シ
    トシン、シチジン、ヒドロキシピリミジン、チアミン
    （ビタミンＢ₁)、モルホリン、ピロリドン、イミダゾー
    ル、ヒスチジン、ヒダントイン、ピラゾールジカルボン
    酸、フェナゾン、アデノシン、アデノシンリン酸、イノ
    シン、グアノシンリン酸、α−フロ酸（フラン−２−カ
    ルボン酸）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）およびキサ
    ントシンであることを特徴とする、請求項１２〜１４の
    いずれか１項に記載の凍結乾燥したフィブリノーゲン調
    製物。
16. 【請求項１６】 前記物質が０．１２〜１２mmol/gフィ
    ブリノーゲンの量で含まれていることを特徴とする、請
    求項１２に記載のフィブリノーゲン調製物。
17. 【請求項１７】 前記物質が０．２８〜５．６mmol/gフ
    ィブリノーゲンの量で含まれていることを特徴とする、
    請求項１２に記載のフィブリノーゲン調製物。