JPH1038809A - 化学発光用試薬 - Google Patents
化学発光用試薬Info
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- JPH1038809A JPH1038809A JP21434996A JP21434996A JPH1038809A JP H1038809 A JPH1038809 A JP H1038809A JP 21434996 A JP21434996 A JP 21434996A JP 21434996 A JP21434996 A JP 21434996A JP H1038809 A JPH1038809 A JP H1038809A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】簡便で且つ効果的な化学発光用試薬並びにこれ
を用いた測定方法の提供。 【解決手段】化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃
で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜1
0.0の溶液からなる化学発光用試薬並びにこれを用いた
測定方法。
を用いた測定方法の提供。 【解決手段】化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20℃
で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜1
0.0の溶液からなる化学発光用試薬並びにこれを用いた
測定方法。
Description
【０００１】
【発明の利用分野】本発明は、例えば血清、血漿、尿、
髄液等の生体由来試料中の微量成分を測定する際等に使
用される化学発光用試薬に関する。
髄液等の生体由来試料中の微量成分を測定する際等に使
用される化学発光用試薬に関する。
【０００２】
【発明の背景】化学発光を利用した特定成分の分析・測
定は、その測定感度が高いため特に微量成分の測定の際
に良く利用されている。最近では、この測定感度を更に
上げるために測定時間を長くして、その間の総発光量を
測定することも良く行われている。
定は、その測定感度が高いため特に微量成分の測定の際
に良く利用されている。最近では、この測定感度を更に
上げるために測定時間を長くして、その間の総発光量を
測定することも良く行われている。
【０００３】しかしながら、化学発光による発光量は、
時間と共に減少するのが一般的であるので、測定時間を
長くしても総発光量はそれ程大きくならない場合、言い
換えれば、測定感度はそれ程上昇しない場合も多々あっ
た。
時間と共に減少するのが一般的であるので、測定時間を
長くしても総発光量はそれ程大きくならない場合、言い
換えれば、測定感度はそれ程上昇しない場合も多々あっ
た。
【０００４】尚、化学発光を利用した測定用試薬中に
は、化学発光の感度を増加させるために通常増感剤と呼
ばれる成分が添加されている場合もあるが、上記の如き
現象は、このような成分を添加した試薬を用いた場合で
も生じていた。
は、化学発光の感度を増加させるために通常増感剤と呼
ばれる成分が添加されている場合もあるが、上記の如き
現象は、このような成分を添加した試薬を用いた場合で
も生じていた。
【０００５】そのため、簡便に且つ効果的に化学発光の
総発光量を更に増加させ、感度の高い測定を可能ならし
める化学発光用試薬の開発が望まれている現状にある。
総発光量を更に増加させ、感度の高い測定を可能ならし
める化学発光用試薬の開発が望まれている現状にある。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】本発明は、上記した如き状況
に鑑みなされたもので、その課題は、簡便で且つ効果的
な化学発光用試薬並びにこれを利用した測定方法の提供
にある。
に鑑みなされたもので、その課題は、簡便で且つ効果的
な化学発光用試薬並びにこれを利用した測定方法の提供
にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記した如き課題を解決
するため、本発明は、(1)化学発光物質、増感剤及び、p
Ｋa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含ん
でなる、pＨ9.0〜10.0の溶液からなる化学発光反応用試
薬、の発明である。
するため、本発明は、(1)化学発光物質、増感剤及び、p
Ｋa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含ん
でなる、pＨ9.0〜10.0の溶液からなる化学発光反応用試
薬、の発明である。
【０００８】また、本発明は、(2)化学発光物質、増感
剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩
衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液を用いることを特徴と
する、パーオキシダーゼ活性、過酸化水素又はパーオキ
シダーゼ結合蛋白質の測定方法の発明である。
剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩
衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液を用いることを特徴と
する、パーオキシダーゼ活性、過酸化水素又はパーオキ
シダーゼ結合蛋白質の測定方法の発明である。
【０００９】更にまた、本発明は、(3) a)化学発光物
質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種
以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液と、b)過酸化
水素含有緩衝液との組み合わせからなる化学発光反応用
試薬キットの発明である。
質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種
以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液と、b)過酸化
水素含有緩衝液との組み合わせからなる化学発光反応用
試薬キットの発明である。
【００１０】更にまた、本発明は、(4) 化学発光物
質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝
剤を含む、pＨ8.0〜10.0の溶液と、過酸化水素含有緩
衝液と、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含
む溶液との組み合わせからなる化学発光反応用試薬キッ
ト。
質、増感剤及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝
剤を含む、pＨ8.0〜10.0の溶液と、過酸化水素含有緩
衝液と、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含
む溶液との組み合わせからなる化学発光反応用試薬キッ
ト。
【００１１】更にまた、本発明は、(5)上記(1)の試薬を
用いて化学発光反応を行うことを特徴とする、化学発光
増強方法の発明である。
用いて化学発光反応を行うことを特徴とする、化学発光
増強方法の発明である。
【００１２】即ち、本発明者らは、上記した如き課題を
解決するために鋭意研究の結果、従来の化学発光用試薬
の緩衝剤を、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上
の緩衝剤とし、そのpＨを9.0〜10.0に調整することによ
り、従来よりも更に化学発光の総発光量を増加させ得る
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
解決するために鋭意研究の結果、従来の化学発光用試薬
の緩衝剤を、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上
の緩衝剤とし、そのpＨを9.0〜10.0に調整することによ
り、従来よりも更に化学発光の総発光量を増加させ得る
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】本発明に係る化学発光物質としては、通常
この分野で用いられるものであれば全て使用可能であり
特に限定されないが、その具体例としては、例えばルミ
ノ−ル、例えばイソルミノ−ル，アミノエチルイソルミ
ノ−ル，アミノエチルエチルイソルミノ−ル，アミノプ
ロピルイソルミノ−ル，アミノブチルイソルミノ−ル，
アミノヘキシルエチルイソルミノ−ル等のルミノ−ル誘
導体等の、アルカリ性下、酸化されて化学発光を生じさ
せるルミノール系含窒素複素環式化合物や、例えばアク
リジニウム塩、ルシゲニン等の酸化されて化学発光を生
じさせるアクリジン系含窒素複素環式化合物等が挙げら
れるが、好ましくはルミノ−ルまたその誘導体である。
これらの使用濃度としては、通常この分野で使用される
範囲の中から適宜選択すればよく、特に限定されない
が、具体的には、使用される化学発光物質の種類により
若干異なるが、通常化学発光を行わせる際の濃度として
１μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは３０μＭ〜３ｍＭ、より
好ましくは１００μＭ〜１.５ｍＭの範囲から適宜選択
される。
この分野で用いられるものであれば全て使用可能であり
特に限定されないが、その具体例としては、例えばルミ
ノ−ル、例えばイソルミノ−ル，アミノエチルイソルミ
ノ−ル，アミノエチルエチルイソルミノ−ル，アミノプ
ロピルイソルミノ−ル，アミノブチルイソルミノ−ル，
アミノヘキシルエチルイソルミノ−ル等のルミノ−ル誘
導体等の、アルカリ性下、酸化されて化学発光を生じさ
せるルミノール系含窒素複素環式化合物や、例えばアク
リジニウム塩、ルシゲニン等の酸化されて化学発光を生
じさせるアクリジン系含窒素複素環式化合物等が挙げら
れるが、好ましくはルミノ−ルまたその誘導体である。
これらの使用濃度としては、通常この分野で使用される
範囲の中から適宜選択すればよく、特に限定されない
が、具体的には、使用される化学発光物質の種類により
若干異なるが、通常化学発光を行わせる際の濃度として
１μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは３０μＭ〜３ｍＭ、より
好ましくは１００μＭ〜１.５ｍＭの範囲から適宜選択
される。
【００１４】本発明に係る増感剤としては、通常この分
野で用いられるものであれば全て使用可能であり特に限
定されないが、例えばp-ヨードフェノール、4-ヒドロキ
シケイ皮酸、4-(4'-チアゾリル)フェノール等のフェノ
−ル誘導体、例えば1-ブロモナフトール等のナフト−ル
誘導体、例えば4-(4-ハイドロキシフェニル)オキサゾー
ル等のオキサゾ−ル誘導体、例えば4-(4-ハイドロキシ
フェニル)チアゾール等のチアゾ−ル誘導体、例えば4-
(イミダゾール-1-イル)フェノール等のイミダゾ−ル誘
導体等が挙げられる。また、これらの使用濃度として
は、通常この分野で使用される範囲の中から適宜選択す
ればよく、特に限定されないが、具体的には、使用され
る増感剤の種類により若干異なるが、通常化学発光を行
わせる際の濃度として０.１μＭ〜１０ｍＭ、好ましく
は１００μＭ〜５ｍＭ、より好ましくは０.２ｍＭ〜２
ｍＭの範囲から適宜選択される。尚、これら増感剤は二
種以上組み合わせて用いても良い。
野で用いられるものであれば全て使用可能であり特に限
定されないが、例えばp-ヨードフェノール、4-ヒドロキ
シケイ皮酸、4-(4'-チアゾリル)フェノール等のフェノ
−ル誘導体、例えば1-ブロモナフトール等のナフト−ル
誘導体、例えば4-(4-ハイドロキシフェニル)オキサゾー
ル等のオキサゾ−ル誘導体、例えば4-(4-ハイドロキシ
フェニル)チアゾール等のチアゾ−ル誘導体、例えば4-
(イミダゾール-1-イル)フェノール等のイミダゾ−ル誘
導体等が挙げられる。また、これらの使用濃度として
は、通常この分野で使用される範囲の中から適宜選択す
ればよく、特に限定されないが、具体的には、使用され
る増感剤の種類により若干異なるが、通常化学発光を行
わせる際の濃度として０.１μＭ〜１０ｍＭ、好ましく
は１００μＭ〜５ｍＭ、より好ましくは０.２ｍＭ〜２
ｍＭの範囲から適宜選択される。尚、これら増感剤は二
種以上組み合わせて用いても良い。
【００１５】また、本発明に係る緩衝剤としては、通常
この分野で用いられるものの中から、pＫa値が20℃で8.
0〜10.5、好ましくは8.3〜10.0であるものを二種以上適
宜選択して用いれば足りる。pＫa値が20℃で8.0〜10.5
である緩衝剤の具体例としては、例えばほう酸塩、例え
ばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，エタノー
ルアミン等のアミン系緩衝剤、例えば5,5-ジエチルバル
ビツ−ル酸塩、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グ
リシン(BICINE)，N-シクロヘキシル-3-アミノプロパン
スルホン酸(CAPS)，N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-
アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)，N-シクロヘキシル-
2-アミノエタンスルホン酸(CHES)，N-トリス(ヒドロキ
シメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等
のグッド緩衝剤、炭酸塩等が挙げられ、より好ましいも
のとしては例えばほう酸塩、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、N-
シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、
炭酸塩等が挙げられる。これらの使用濃度としては、通
常この分野で使用される範囲の中から適宜選択すれば足
りる。具体的には、使用される緩衝剤の種類により若干
異なるが、通常化学発光を行わせる際の２種以上の緩衝
剤の合計した濃度として0.05Ｍ〜1.5Ｍ、好ましくは0.7
5Ｍ〜１Ｍ、より好ましくは0.1Ｍ〜0.6Ｍの範囲から適
宜選択される。また、これら２種の緩衝剤のモル比とし
ては、緩衝剤の組み合わせにより異なり、本発明の目的
を達成し得る比率であれば良く、特に限定されないが、
通常１：0.3〜10、好ましくは１：0.5〜５の範囲から適
宜選択される。尚、化学発光の増強効果を考慮すると、
緩衝剤のpＫa値は、20℃で8.3〜10.0であることが望ま
しい。
この分野で用いられるものの中から、pＫa値が20℃で8.
0〜10.5、好ましくは8.3〜10.0であるものを二種以上適
宜選択して用いれば足りる。pＫa値が20℃で8.0〜10.5
である緩衝剤の具体例としては、例えばほう酸塩、例え
ばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，エタノー
ルアミン等のアミン系緩衝剤、例えば5,5-ジエチルバル
ビツ−ル酸塩、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グ
リシン(BICINE)，N-シクロヘキシル-3-アミノプロパン
スルホン酸(CAPS)，N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-
アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)，N-シクロヘキシル-
2-アミノエタンスルホン酸(CHES)，N-トリス(ヒドロキ
シメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等
のグッド緩衝剤、炭酸塩等が挙げられ、より好ましいも
のとしては例えばほう酸塩、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸塩、N-
シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、
炭酸塩等が挙げられる。これらの使用濃度としては、通
常この分野で使用される範囲の中から適宜選択すれば足
りる。具体的には、使用される緩衝剤の種類により若干
異なるが、通常化学発光を行わせる際の２種以上の緩衝
剤の合計した濃度として0.05Ｍ〜1.5Ｍ、好ましくは0.7
5Ｍ〜１Ｍ、より好ましくは0.1Ｍ〜0.6Ｍの範囲から適
宜選択される。また、これら２種の緩衝剤のモル比とし
ては、緩衝剤の組み合わせにより異なり、本発明の目的
を達成し得る比率であれば良く、特に限定されないが、
通常１：0.3〜10、好ましくは１：0.5〜５の範囲から適
宜選択される。尚、化学発光の増強効果を考慮すると、
緩衝剤のpＫa値は、20℃で8.3〜10.0であることが望ま
しい。
【００１６】本発明の化学発光用試薬は、例えば以下の
如くして調製される。即ち、上記した如き化学発光物
質、増感剤、及びpＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種
以上の緩衝剤を、化学発光させる際の濃度が上記した如
き濃度となるように溶解させた、pＨが9.0〜10.0の溶液
を調製すれば、本発明の試薬となる。
如くして調製される。即ち、上記した如き化学発光物
質、増感剤、及びpＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種
以上の緩衝剤を、化学発光させる際の濃度が上記した如
き濃度となるように溶解させた、pＨが9.0〜10.0の溶液
を調製すれば、本発明の試薬となる。
【００１７】本発明の化学発光用試薬は、化学発光物質
が酸化されて化学発光を生じさせる化合物を含むもので
あるので、当該試薬と、例えば過酸化水素、過塩素酸
塩、酸素、過マンガン酸塩、ヨウ素等の酸化剤と例えば
パーオキシダーゼ、例えばヘモグロビン等のヘム化合物
等のパーオキシダーゼ活性を有する物質とを組み合わせ
て反応させることにより、化学発光を生じさせることが
できる。
が酸化されて化学発光を生じさせる化合物を含むもので
あるので、当該試薬と、例えば過酸化水素、過塩素酸
塩、酸素、過マンガン酸塩、ヨウ素等の酸化剤と例えば
パーオキシダーゼ、例えばヘモグロビン等のヘム化合物
等のパーオキシダーゼ活性を有する物質とを組み合わせ
て反応させることにより、化学発光を生じさせることが
できる。
【００１８】従って、本発明の化学発光用試薬に更に上
記した如き酸化剤を含有させることにより、パーオキシ
ダーゼ活性の測定に使用できる試薬となる。
記した如き酸化剤を含有させることにより、パーオキシ
ダーゼ活性の測定に使用できる試薬となる。
【００１９】尚、このような試薬により測定可能なパー
オキシダーゼとしては、その由来は特に限定されず、例
えば西洋ワサビ、パイナップル、イチジク等の植物に由
来するもの、例えばカビ、酵母等の微生物に由来するも
の、例えば動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が
好ましく挙げられる。また、活性測定を行う際のパーオ
キシダーゼは、それ自体（未修飾のもの）であっても、
例えば抗原、抗体等と結合させたもの等でも何れにても
良く、特に限定されない。
オキシダーゼとしては、その由来は特に限定されず、例
えば西洋ワサビ、パイナップル、イチジク等の植物に由
来するもの、例えばカビ、酵母等の微生物に由来するも
の、例えば動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が
好ましく挙げられる。また、活性測定を行う際のパーオ
キシダーゼは、それ自体（未修飾のもの）であっても、
例えば抗原、抗体等と結合させたもの等でも何れにても
良く、特に限定されない。
【００２０】これら試薬を用いて、例えば西洋ワサビ等
に由来するパーオキシダーゼ活性を測定するには例えば
以下の如く行えばよい。即ち、上記した如き化学発光物
質、増感剤、及びpＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種
以上の緩衝剤を、化学発光させる際の濃度が上記した如
き濃度に、また、適当量の酸化剤、例えば過酸化水素を
0.1〜10ｍＭ、好ましくは１〜５ｍＭとなるように溶解
させた、pＨ9.0〜10.0の溶液を発光溶液とする。次い
で、これとパーオキシダーゼを含有する試料とを混合
し、生じる化学発光量をルミノメ−タ−等で測定する。
別に、発光溶液と所定のパーオキシダーゼ活性を有する
標準液とを混合し、生じる化学発光量をルミノメ−タ−
等で測定し、パーオキシダーゼ活性と化学発光量との関
係を表す検量線を作成しておき、得られた試料について
の化学発光量を検量線に当てはめ、試料中のパーオキシ
ダーゼ活性を求める。
に由来するパーオキシダーゼ活性を測定するには例えば
以下の如く行えばよい。即ち、上記した如き化学発光物
質、増感剤、及びpＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種
以上の緩衝剤を、化学発光させる際の濃度が上記した如
き濃度に、また、適当量の酸化剤、例えば過酸化水素を
0.1〜10ｍＭ、好ましくは１〜５ｍＭとなるように溶解
させた、pＨ9.0〜10.0の溶液を発光溶液とする。次い
で、これとパーオキシダーゼを含有する試料とを混合
し、生じる化学発光量をルミノメ−タ−等で測定する。
別に、発光溶液と所定のパーオキシダーゼ活性を有する
標準液とを混合し、生じる化学発光量をルミノメ−タ−
等で測定し、パーオキシダーゼ活性と化学発光量との関
係を表す検量線を作成しておき、得られた試料について
の化学発光量を検量線に当てはめ、試料中のパーオキシ
ダーゼ活性を求める。
【００２１】また、抗体等と結合したパーオキシダーゼ
活性を検出するには、例えば以下の如く行ってもよい。
即ち、測定対象物質を含有する試料をニトロセルロ−ス
膜にブロットし乾燥する。その後、これをマスキング処
理した後、測定対象物質に対する抗体を反応させる。膜
を洗浄後、その抗体をと結合し得る抗体と結合したパー
オキシダーゼを反応させる。洗浄後、膜を前記発光溶液
に浸し、例えばポラロイドフイルム、Ｘ線フィルム等の
フィルム上で露光させ、生じる発光像よりパーオキシダ
ーゼ活性を検出することができる。
活性を検出するには、例えば以下の如く行ってもよい。
即ち、測定対象物質を含有する試料をニトロセルロ−ス
膜にブロットし乾燥する。その後、これをマスキング処
理した後、測定対象物質に対する抗体を反応させる。膜
を洗浄後、その抗体をと結合し得る抗体と結合したパー
オキシダーゼを反応させる。洗浄後、膜を前記発光溶液
に浸し、例えばポラロイドフイルム、Ｘ線フィルム等の
フィルム上で露光させ、生じる発光像よりパーオキシダ
ーゼ活性を検出することができる。
【００２２】また、本発明の化学発光用試薬と上記した
如きパーオキシダーゼ活性を有する物質とを組み合わせ
て用いれば、例えば過酸化水素等の酸化物の測定を行う
ことが可能となる。このような試薬を用いて過酸化水素
を測定するには例えば以下の如く行えばよい。即ち、上
記した如き化学発光物質、増感剤、及びpＫa値が20℃で
8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を、化学発光させる
際の濃度が上記した如き濃度に、また、適当量のパーオ
キシダーゼ活性を有する物質、例えばパーオキシダーゼ
を0.1〜２u/mlとなるように溶解させた、pＨ9.0〜10.0
の溶液を発光溶液とする。次いで、これと過酸化水素を
含有する試料とを混合し、生じる化学発光量をルミノメ
−タ−等で測定する。別に、発光溶液と所定濃度の過酸
化水素を含有する標準液とを混合し、生じる化学発光量
をルミノメ−タ−等で測定し、過酸化水素濃度と化学発
光量との関係を表す検量線を作成しておき、得られた試
料についての化学発光量を検量線に当てはめることによ
り、試料中の過酸化水素濃度を求めることができる。
尚、測定対象となる過酸化水素の由来としては特に限定
されないが、例えばオキシダーゼ反応により生成された
もの等が好ましく挙げられる。
如きパーオキシダーゼ活性を有する物質とを組み合わせ
て用いれば、例えば過酸化水素等の酸化物の測定を行う
ことが可能となる。このような試薬を用いて過酸化水素
を測定するには例えば以下の如く行えばよい。即ち、上
記した如き化学発光物質、増感剤、及びpＫa値が20℃で
8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を、化学発光させる
際の濃度が上記した如き濃度に、また、適当量のパーオ
キシダーゼ活性を有する物質、例えばパーオキシダーゼ
を0.1〜２u/mlとなるように溶解させた、pＨ9.0〜10.0
の溶液を発光溶液とする。次いで、これと過酸化水素を
含有する試料とを混合し、生じる化学発光量をルミノメ
−タ−等で測定する。別に、発光溶液と所定濃度の過酸
化水素を含有する標準液とを混合し、生じる化学発光量
をルミノメ−タ−等で測定し、過酸化水素濃度と化学発
光量との関係を表す検量線を作成しておき、得られた試
料についての化学発光量を検量線に当てはめることによ
り、試料中の過酸化水素濃度を求めることができる。
尚、測定対象となる過酸化水素の由来としては特に限定
されないが、例えばオキシダーゼ反応により生成された
もの等が好ましく挙げられる。
【００２３】また、本発明の試薬を用いれば、例えば血
清、血漿、尿、髄液等の生体由来試料中の微量成分を高
感度に且つ精度良く測定することが可能となる。即ち、
上述した如く本発明の試薬を用いれば、パーオキシダー
ゼ活性や過酸化水素を高感度に且つ精度良く測定し得る
ので、従来のパーオキシダーゼを標識酵素として用いる
酵素免疫測定法や、オキシダーゼ反応を利用した微量成
分の測定法に本発明の試薬を組み合わせて用いれば、こ
れら公知の方法により測定可能な微量成分については、
より高感度に且つ精度良く測定することが可能となるの
である。
清、血漿、尿、髄液等の生体由来試料中の微量成分を高
感度に且つ精度良く測定することが可能となる。即ち、
上述した如く本発明の試薬を用いれば、パーオキシダー
ゼ活性や過酸化水素を高感度に且つ精度良く測定し得る
ので、従来のパーオキシダーゼを標識酵素として用いる
酵素免疫測定法や、オキシダーゼ反応を利用した微量成
分の測定法に本発明の試薬を組み合わせて用いれば、こ
れら公知の方法により測定可能な微量成分については、
より高感度に且つ精度良く測定することが可能となるの
である。
【００２４】本発明の試薬を用いて化学発光を行わせた
場合、反応後の化学発光量は従来のものよりも著しく増
大し、しかもその効果は長時間持続するため、測定時間
を長くした場合にはその総発光量は従来のものよりも著
しく増大する。化学発光物質、増感剤及び、そのうちの
少なくとも一種のpＫa値が8.3〜10.5である二種以上の
緩衝剤を含んでなる、pＨ9.0〜10.0の溶液を用いて化学
発光を行わせるとこのような現象が起こるとは全く意外
なことであった。
場合、反応後の化学発光量は従来のものよりも著しく増
大し、しかもその効果は長時間持続するため、測定時間
を長くした場合にはその総発光量は従来のものよりも著
しく増大する。化学発光物質、増感剤及び、そのうちの
少なくとも一種のpＫa値が8.3〜10.5である二種以上の
緩衝剤を含んでなる、pＨ9.0〜10.0の溶液を用いて化学
発光を行わせるとこのような現象が起こるとは全く意外
なことであった。
【００２５】本発明の、a)化学発光物質、増感剤及び、
pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含
む、pＨ9.0〜10.0の溶液と、b)過酸化水素含有緩衝液と
の組み合わせからなる化学発光反応用試薬キットは、パ
ーオキシダーゼ活性を測定するために好適なものであ
り、その構成要件の好ましい実施態様等は上で述べたと
おりである。
pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含
む、pＨ9.0〜10.0の溶液と、b)過酸化水素含有緩衝液と
の組み合わせからなる化学発光反応用試薬キットは、パ
ーオキシダーゼ活性を測定するために好適なものであ
り、その構成要件の好ましい実施態様等は上で述べたと
おりである。
【００２６】本キットの、a)化学発光物質、増感剤及
び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤
を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液と、b)過酸化水素含有緩衝
液とは、通常１〜10：１〜５、好ましくは１〜４：１〜
２の割合で混合されたものが、パーオキシダーゼ活性測
定用試液として用いられる。
び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤
を含む、pＨ9.0〜10.0の溶液と、b)過酸化水素含有緩衝
液とは、通常１〜10：１〜５、好ましくは１〜４：１〜
２の割合で混合されたものが、パーオキシダーゼ活性測
定用試液として用いられる。
【００２７】上記a)の溶液中の化学発光物質の濃度とし
ては、通常２μＭ〜100ｍＭ、好ましくは60μＭ〜40ｍ
Ｍ、より好ましくは200μＭ〜６ｍＭであり、増感剤の
濃度としては、通常0.2μＭ〜100ｍＭ、好ましくは200
μＭ〜20ｍＭ、より好ましくは0.4μＭ〜10ｍＭであ
り、緩衝剤の濃度としては、二種以上の緩衝剤の濃度の
合計として通常0.05〜1.5Ｍ、好ましくは0.075〜１Ｍ、
より好ましくは0.1〜0.6Ｍである。
ては、通常２μＭ〜100ｍＭ、好ましくは60μＭ〜40ｍ
Ｍ、より好ましくは200μＭ〜６ｍＭであり、増感剤の
濃度としては、通常0.2μＭ〜100ｍＭ、好ましくは200
μＭ〜20ｍＭ、より好ましくは0.4μＭ〜10ｍＭであ
り、緩衝剤の濃度としては、二種以上の緩衝剤の濃度の
合計として通常0.05〜1.5Ｍ、好ましくは0.075〜１Ｍ、
より好ましくは0.1〜0.6Ｍである。
【００２８】また、上記b)の過酸化水素含有緩衝液とし
ては、過酸化水素を0.2ｍＭ〜100ｍＭ、好ましくは２ｍ
Ｍ〜10ｍＭ含有する、pＨが8.3〜10.0、好ましくは8.5
〜9.5の緩衝液が挙げられる。また、この際に用いられ
る緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものであ
れば特に限定されないが、例えばほう酸塩、例えばトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，エタノールアミ
ン等のアミン系緩衝剤、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸
塩、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン(BIC
INE)，N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸
(CAPS)，N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロ
パンスルホン酸(CAPSO)，N-シクロヘキシル-2-アミノエ
タンスルホン酸(CHES)，N-トリス(ヒドロキシメチル)メ
チル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等のグッド緩
衝剤、炭酸塩等が好ましく挙げられ、その使用濃度とし
ては通常 0.01〜1.5Ｍ、好ましくは0.05〜１Ｍ、より
好ましくは0.1〜0.5Ｍの範囲から適宜選択される。
ては、過酸化水素を0.2ｍＭ〜100ｍＭ、好ましくは２ｍ
Ｍ〜10ｍＭ含有する、pＨが8.3〜10.0、好ましくは8.5
〜9.5の緩衝液が挙げられる。また、この際に用いられ
る緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものであ
れば特に限定されないが、例えばほう酸塩、例えばトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，エタノールアミ
ン等のアミン系緩衝剤、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸
塩、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン(BIC
INE)，N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸
(CAPS)，N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロ
パンスルホン酸(CAPSO)，N-シクロヘキシル-2-アミノエ
タンスルホン酸(CHES)，N-トリス(ヒドロキシメチル)メ
チル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等のグッド緩
衝剤、炭酸塩等が好ましく挙げられ、その使用濃度とし
ては通常 0.01〜1.5Ｍ、好ましくは0.05〜１Ｍ、より
好ましくは0.1〜0.5Ｍの範囲から適宜選択される。
【００２９】尚、上記a)の試薬とb)の試薬のpＨは、a)
の試薬とb)の試薬を前記した如き所定のの割合で混合し
て調製される発光溶液のpＨが9.0〜10.0となるように適
宜選択される。また、このようにして調製された発光溶
液中の２種の緩衝剤のモル比としては、緩衝剤の組み合
わせにより異なり、本発明の目的を達成し得る比率であ
れば良く、特に限定されないが、通常１：0.3〜10、好
ましくは１：0.5〜５の範囲から適宜選択される。
の試薬とb)の試薬を前記した如き所定のの割合で混合し
て調製される発光溶液のpＨが9.0〜10.0となるように適
宜選択される。また、このようにして調製された発光溶
液中の２種の緩衝剤のモル比としては、緩衝剤の組み合
わせにより異なり、本発明の目的を達成し得る比率であ
れば良く、特に限定されないが、通常１：0.3〜10、好
ましくは１：0.5〜５の範囲から適宜選択される。
【００３０】また、本発明の、化学発光物質、増感剤
及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む、p
Ｈ8.0〜10.0の溶液と、過酸化水素含有緩衝液と、p
Ｋa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液との組
み合わせからなる化学発光反応用試薬キットも、パーオ
キシダーゼ活性を測定するために好適なものであり、そ
の構成要件の好ましい実施態様等は上で述べたとおりで
ある。
及び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む、p
Ｈ8.0〜10.0の溶液と、過酸化水素含有緩衝液と、p
Ｋa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液との組
み合わせからなる化学発光反応用試薬キットも、パーオ
キシダーゼ活性を測定するために好適なものであり、そ
の構成要件の好ましい実施態様等は上で述べたとおりで
ある。
【００３１】本キットの、化学発光物質、増感剤及
び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む、pＨ
8.0〜10.0の溶液と、過酸化水素含有緩衝液、pＫa
値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液とは、通
常１〜10：１〜５：１〜５、好ましくは１〜４：１〜
２：１〜２の割合で混合されたものが、パーオキシダー
ゼ活性測定用試液として用いられる。
び、pＫa値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む、pＨ
8.0〜10.0の溶液と、過酸化水素含有緩衝液、pＫa
値が20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液とは、通
常１〜10：１〜５：１〜５、好ましくは１〜４：１〜
２：１〜２の割合で混合されたものが、パーオキシダー
ゼ活性測定用試液として用いられる。
【００３２】上記の溶液中の化学発光物質の濃度とし
ては、通常３μＭ〜150ｍＭ、好ましくは90μＭ〜60ｍ
Ｍ、より好ましくは300μＭ〜９ｍＭであり、増感剤の
濃度としては、通常0.3μＭ〜150ｍＭ、好ましくは300
μＭ〜30ｍＭ、より好ましくは0.6μＭ〜15ｍＭであ
り、緩衝剤の濃度としては、通常0.05〜1.5Ｍ、好まし
くは0.075〜１Ｍ、より好ましくは0.1〜0.6Ｍである。
尚、緩衝剤は、２種以上を適宜組み合わせて用いても良
い。
ては、通常３μＭ〜150ｍＭ、好ましくは90μＭ〜60ｍ
Ｍ、より好ましくは300μＭ〜９ｍＭであり、増感剤の
濃度としては、通常0.3μＭ〜150ｍＭ、好ましくは300
μＭ〜30ｍＭ、より好ましくは0.6μＭ〜15ｍＭであ
り、緩衝剤の濃度としては、通常0.05〜1.5Ｍ、好まし
くは0.075〜１Ｍ、より好ましくは0.1〜0.6Ｍである。
尚、緩衝剤は、２種以上を適宜組み合わせて用いても良
い。
【００３３】また、上記の過酸化水素含有緩衝液とし
ては、過酸化水素を0.15ｍＭ〜15ｍＭ、好ましくは0.75
ｍＭ〜7.5ｍＭ含有する、pＨが8.3〜10.0、好ましくは
8.5〜9.5の緩衝液が挙げられる。また、この際に用いら
れる緩衝剤としては、通常この分野で用いられるもので
あれば特に限定されないが、例えばほう酸塩、例えばト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，エタノールア
ミン等のアミン系緩衝剤、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸
塩、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン(BIC
INE)，N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸
(CAPS)，N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロ
パンスルホン酸(CAPSO)，N-シクロヘキシル-2-アミノエ
タンスルホン酸(CHES)，N-トリス(ヒドロキシメチル)メ
チル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等のグッド緩
衝剤、炭酸塩等が好ましく挙げられ、その使用濃度とし
ては通常 0.01〜1.5Ｍ、好ましくは0.05〜１Ｍ、より
好ましくは0.1〜0.5Ｍの範囲から適宜選択される。
ては、過酸化水素を0.15ｍＭ〜15ｍＭ、好ましくは0.75
ｍＭ〜7.5ｍＭ含有する、pＨが8.3〜10.0、好ましくは
8.5〜9.5の緩衝液が挙げられる。また、この際に用いら
れる緩衝剤としては、通常この分野で用いられるもので
あれば特に限定されないが、例えばほう酸塩、例えばト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，エタノールア
ミン等のアミン系緩衝剤、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸
塩、例えばN,N-ビス(2-ヒドロキシメチル)グリシン(BIC
INE)，N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸
(CAPS)，N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロ
パンスルホン酸(CAPSO)，N-シクロヘキシル-2-アミノエ
タンスルホン酸(CHES)，N-トリス(ヒドロキシメチル)メ
チル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等のグッド緩
衝剤、炭酸塩等が好ましく挙げられ、その使用濃度とし
ては通常 0.01〜1.5Ｍ、好ましくは0.05〜１Ｍ、より
好ましくは0.1〜0.5Ｍの範囲から適宜選択される。
【００３４】更にまた、上記の、pＫa値が20℃で8.0
〜10.5である緩衝剤を含む溶液としては、pＫa値が20℃
で8.0〜10.5である緩衝剤を通常0.01〜1.5Ｍ、好ましく
は0.05〜１Ｍ、より好ましくは0.1〜0.5Ｍ含むpＨが8.5
〜11.5、好ましくは9.0〜11.0の溶液が挙げられる。
尚、緩衝剤は、２種以上を適宜組み合わせて用いても良
い。
〜10.5である緩衝剤を含む溶液としては、pＫa値が20℃
で8.0〜10.5である緩衝剤を通常0.01〜1.5Ｍ、好ましく
は0.05〜１Ｍ、より好ましくは0.1〜0.5Ｍ含むpＨが8.5
〜11.5、好ましくは9.0〜11.0の溶液が挙げられる。
尚、緩衝剤は、２種以上を適宜組み合わせて用いても良
い。
【００３５】尚、上記の試薬との試薬との試薬の
pＨは、の試薬との試薬との試薬を前記した如き
所定の割合で混合して調製される発光溶液のpＨが9.0〜
10.0となるように適宜選択される。また、このようにし
て調製された発光溶液中の２種の緩衝剤のモル比として
は、緩衝剤の組み合わせにより異なり、本発明の目的を
達成し得る比率であれば良く、特に限定されないが、通
常１：0.3〜10、好ましくは１：0.5〜５の範囲から適宜
選択される。以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれらにより限定されるものでは
ない。
pＨは、の試薬との試薬との試薬を前記した如き
所定の割合で混合して調製される発光溶液のpＨが9.0〜
10.0となるように適宜選択される。また、このようにし
て調製された発光溶液中の２種の緩衝剤のモル比として
は、緩衝剤の組み合わせにより異なり、本発明の目的を
達成し得る比率であれば良く、特に限定されないが、通
常１：0.3〜10、好ましくは１：0.5〜５の範囲から適宜
選択される。以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれらにより限定されるものでは
ない。
【００３６】
実施例１． （発光溶液） トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3)
0.1Ｍ、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸(pＫa=8.06)0.4
Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイ
ドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝
液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、炭酸ナトリウム(pＫa=10.
28) 0.08Ｍ、ルミノ−ル0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-
(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有
する緩衝液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.35Ｍ、ルミノ−ル 0.53
ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チ
アゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 （操作法）パーオキシダーゼ（POD）標識抗マウス免疫
グロブリン抗体（兎由来、ダコー社製）の所定希釈溶液
の１μｌ(POD含量で537.5pg〜2.1pg)をニトロセルロ−
ス膜上にブロットし室温で乾燥後、所定の発光溶液に浸
した。１分後にニトロセルロース膜を取り出し、ポリ塩
化ビニリデンフィルムで包み、20分後、１時間後、２時
間後、３時間後、４時間後、６時間後に暗室にてＸ線フ
イルムに対して５分露光させた。このフィルムを現像、
定着し、その発光像より検出可能なＰＯＤ量を求めた。
結果を表１に示す。
0.1Ｍ、5,5-ジエチルバルビツ−ル酸(pＫa=8.06)0.4
Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイ
ドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝
液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、炭酸ナトリウム(pＫa=10.
28) 0.08Ｍ、ルミノ−ル0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-
(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有
する緩衝液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.35Ｍ、ルミノ−ル 0.53
ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チ
アゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 （操作法）パーオキシダーゼ（POD）標識抗マウス免疫
グロブリン抗体（兎由来、ダコー社製）の所定希釈溶液
の１μｌ(POD含量で537.5pg〜2.1pg)をニトロセルロ−
ス膜上にブロットし室温で乾燥後、所定の発光溶液に浸
した。１分後にニトロセルロース膜を取り出し、ポリ塩
化ビニリデンフィルムで包み、20分後、１時間後、２時
間後、３時間後、４時間後、６時間後に暗室にてＸ線フ
イルムに対して５分露光させた。このフィルムを現像、
定着し、その発光像より検出可能なＰＯＤ量を求めた。
結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】 表１の結果から、本発明の試薬を用いることにより、長
時間に渡って化学発光を維持することができ、６時間経
過後でも67.2pgのＰＯＤを検出可能であることが判る。
時間に渡って化学発光を維持することができ、６時間経
過後でも67.2pgのＰＯＤを検出可能であることが判る。
【００３８】比較例１． （発光溶液） トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3)
を所定濃度、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、
4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含
有する緩衝液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28)を所定濃度、ルミノ−ル 0.53ｍ
Ｍ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チア
ゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 （操作法）発光溶液として上記のものを用いた以外は、
実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作法により検出可
能なＰＯＤ量を求めた。緩衝剤としてトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンを用いて得られた結果を表２
に、緩衝剤としてほう酸を用いて得られた結果を表３に
夫々示す。示す。
を所定濃度、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、
4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含
有する緩衝液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28)を所定濃度、ルミノ−ル 0.53ｍ
Ｍ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チア
ゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 （操作法）発光溶液として上記のものを用いた以外は、
実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作法により検出可
能なＰＯＤ量を求めた。緩衝剤としてトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンを用いて得られた結果を表２
に、緩衝剤としてほう酸を用いて得られた結果を表３に
夫々示す。示す。
【００３９】
【表２】 ＊−:検出できないことを示す。
【００４０】
【表３】 ＊−:検出できないことを示す。 表２及び３の結果から、20℃でのpＫaが8.0〜10.5であ
る緩衝剤を一種のみ用いた場合は、長時間に渡って化学
発光を維持することができず、本発明に比較してＰＯＤ
の検出感度が大幅に低下することが判る。
る緩衝剤を一種のみ用いた場合は、長時間に渡って化学
発光を維持することができず、本発明に比較してＰＯＤ
の検出感度が大幅に低下することが判る。
【００４１】比較例２． （発光溶液） ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、トリエタノールアミン(p
Ｋa=10.78) 0.15Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07
ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍ
Ｍを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3)
0.1Ｍ、トリエタノールアミン(pＫa=10.78) 0.15Ｍ、
ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロ
キシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(p
Ｈ9.4)。 クエン酸(pＫa=6.39) 0.1Ｍ、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.04Ｍ、ルミノ−ル 0.
53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)
チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28) 0.2Ｍ、りん酸(pＫa=7.22) 0.1
Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイ
ドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝
液(pＨ9.4)。 （操作法）発光溶液として上記のものを用いた以外は、
実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作法により検出可
能なＰＯＤ量を求めた。結果を表４に示す。
Ｋa=10.78) 0.15Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07
ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍ
Ｍを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(pＫa=8.3)
0.1Ｍ、トリエタノールアミン(pＫa=10.78) 0.15Ｍ、
ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロ
キシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(p
Ｈ9.4)。 クエン酸(pＫa=6.39) 0.1Ｍ、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.04Ｍ、ルミノ−ル 0.
53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)
チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28) 0.2Ｍ、りん酸(pＫa=7.22) 0.1
Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイ
ドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝
液(pＨ9.4)。 （操作法）発光溶液として上記のものを用いた以外は、
実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作法により検出可
能なＰＯＤ量を求めた。結果を表４に示す。
【００４２】
【表４】 ＊−:検出できないことを示す。 表４の結果から、20℃でのpＫaが8.0〜10.5である緩衝
剤を一種とそれ以外の緩衝剤とを組み合わせて用いた場
合は、長時間に渡って化学発光を維持することができ
ず、本発明に比較してＰＯＤの検出感度が大幅に低下す
ることが判る。
剤を一種とそれ以外の緩衝剤とを組み合わせて用いた場
合は、長時間に渡って化学発光を維持することができ
ず、本発明に比較してＰＯＤの検出感度が大幅に低下す
ることが判る。
【００４３】比較例３． （発光溶液） ε-アミノカプロン酸(pＫa=10.98) 0.1Ｍ、トリエチ
ルアミン(pＫa=10.78) 0.02Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、
H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−
ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 クエン酸(pＫa=6.39) 0.1Ｍ、トリエチルアミン(pＫa
=10.98) 0.02Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍ
Ｍ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭ
を含有する緩衝液(pＨ9.4)。 （操作法）発光溶液として上記のものを用いた以外は、
実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作法により検出可
能なＰＯＤ量を求めた。結果を表５に示す。
ルアミン(pＫa=10.78) 0.02Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、
H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−
ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 クエン酸(pＫa=6.39) 0.1Ｍ、トリエチルアミン(pＫa
=10.98) 0.02Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2O2 2.07ｍ
Ｍ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル 0.16ｍＭ
を含有する緩衝液(pＨ9.4)。 （操作法）発光溶液として上記のものを用いた以外は、
実施例１と同じ試薬を用い、同様の操作法により検出可
能なＰＯＤ量を求めた。結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】 ＊−:検出できないことを示す。 表５の結果から、20℃でのpＫaが8.0〜10.5の範囲外で
ある緩衝剤を二種組み合わせて用いた場合は、長時間に
渡って化学発光を維持することができず、本発明に比較
してＰＯＤの検出感度が大幅に低下することが判る。
ある緩衝剤を二種組み合わせて用いた場合は、長時間に
渡って化学発光を維持することができず、本発明に比較
してＰＯＤの検出感度が大幅に低下することが判る。
【００４５】実施例２． （発光溶液） ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.4Ｍ、ルミノ−ル 0.53
ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チ
アゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2
O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル
0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 （操作法）所定の発光溶液300μｌとパーオキシダーゼ
（POD）標識抗兎ＩgＧ抗体（豚由来、ダコー社製、パー
オキシダーゼ含量 134pg/μl）１μlとを混合し、所定
時間経過後の化学発光量(Kcpm)をルミノメ−タ（アロカ
社製、ＢＬＲ−２０１型）で測定した。結果を表６に示
す。
ル）アミノメタン(pＫa=8.3) 0.4Ｍ、ルミノ−ル 0.53
ｍＭ、H2O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チ
アゾ−ル 0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 ほう酸(pＫa=9.28) 0.1Ｍ、ルミノ−ル 0.53ｍＭ、H2
O2 2.07ｍＭ、4-(4-ハイドロキシフェニル)チアゾ−ル
0.16ｍＭを含有する緩衝液(pＨ9.4)。 （操作法）所定の発光溶液300μｌとパーオキシダーゼ
（POD）標識抗兎ＩgＧ抗体（豚由来、ダコー社製、パー
オキシダーゼ含量 134pg/μl）１μlとを混合し、所定
時間経過後の化学発光量(Kcpm)をルミノメ−タ（アロカ
社製、ＢＬＲ−２０１型）で測定した。結果を表６に示
す。
【００４６】
【表６】 表６の結果から明らかな如く、本発明の発光溶液である
を用いた場合には、長時間に渡って化学発光を維持す
ることができるが、従来の発光溶液であるを用いた場
合には時間の経過と共に化学発光量が激減することが判
る。
を用いた場合には、長時間に渡って化学発光を維持す
ることができるが、従来の発光溶液であるを用いた場
合には時間の経過と共に化学発光量が激減することが判
る。
【００４７】
【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、例えば血
清、血漿、尿、髄液等の生体由来試料中の微量成分を測
定する際等に使用される化学発光用試薬を提供するもの
であり、本発明を利用することにより、簡便に且つ効果
的に総化学発光量を従来のものよりも著しく増大させる
ことができ、例えば生体由来試料中の微量成分の測定等
をより精度良く実施し得るという効果を奏するので、斯
業に貢献するところ大なる発明である。
清、血漿、尿、髄液等の生体由来試料中の微量成分を測
定する際等に使用される化学発光用試薬を提供するもの
であり、本発明を利用することにより、簡便に且つ効果
的に総化学発光量を従来のものよりも著しく増大させる
ことができ、例えば生体由来試料中の微量成分の測定等
をより精度良く実施し得るという効果を奏するので、斯
業に貢献するところ大なる発明である。
Claims (6)
- 【請求項１】 化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20
℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0
〜10.0の溶液からなる化学発光用試薬。 - 【請求項２】 化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20
℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0
〜10.0の溶液を用いることを特徴とする、パーオキシダ
ーゼ活性又は過酸化水素の測定方法。 - 【請求項３】 化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が20
℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.0
〜10.0の溶液を用いることを特徴とする、パーオキシダ
ーゼ結合蛋白質の測定方法 - 【請求項４】 a)化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が
20℃で8.0〜10.5である二種以上の緩衝剤を含む、pＨ9.
0〜10.0の溶液と、b)過酸化水素含有緩衝液との組み合
わせからなる化学発光反応用試薬キット。 - 【請求項５】 化学発光物質、増感剤及び、pＫa値が
20℃で8.0〜10.5である緩衝剤を含む、pＨ8.0〜10.0の
溶液と、過酸化水素含有緩衝液と、pＫa値が20℃で
8.0〜10.5である緩衝剤を含む溶液との組み合わせから
なる化学発光反応用試薬キット。 - 【請求項６】 請求項１の試薬を用いて化学発光反応を
行わせることを特徴とする、化学発光増強方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21434996A JP3702545B2 (ja) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | 化学発光用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21434996A JP3702545B2 (ja) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | 化学発光用試薬 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1038809A true JPH1038809A (ja) | 1998-02-13 |
| JPH1038809A5 JPH1038809A5 (ja) | 2004-08-12 |
| JP3702545B2 JP3702545B2 (ja) | 2005-10-05 |
Family
ID=16654304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21434996A Expired - Fee Related JP3702545B2 (ja) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | 化学発光用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3702545B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005103676A1 (ja) * | 2004-04-23 | 2005-11-03 | Japan Science And Technology Agency | 水素分布の可視化方法、水素分布の可視化システム、水素分布の可視化用発光試薬、水素検出方法および水素検出試薬 |
| KR20180137338A (ko) * | 2017-06-16 | 2018-12-27 | 대한민국(경찰청장) | 혈흔 탐지용 조성물 |
| WO2023085292A1 (ja) * | 2021-11-12 | 2023-05-19 | 富士フイルム株式会社 | 測定対象物質の測定方法、消毒剤による測定への影響の抑制方法、抑制剤、発光試薬及び試薬キット |
-
1996
- 1996-07-25 JP JP21434996A patent/JP3702545B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005103676A1 (ja) * | 2004-04-23 | 2005-11-03 | Japan Science And Technology Agency | 水素分布の可視化方法、水素分布の可視化システム、水素分布の可視化用発光試薬、水素検出方法および水素検出試薬 |
| KR20180137338A (ko) * | 2017-06-16 | 2018-12-27 | 대한민국(경찰청장) | 혈흔 탐지용 조성물 |
| WO2023085292A1 (ja) * | 2021-11-12 | 2023-05-19 | 富士フイルム株式会社 | 測定対象物質の測定方法、消毒剤による測定への影響の抑制方法、抑制剤、発光試薬及び試薬キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3702545B2 (ja) | 2005-10-05 |
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