JPH1038844A - オンラインバイオセンサー - Google Patents
オンラインバイオセンサーInfo
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- JPH1038844A JPH1038844A JP8214946A JP21494696A JPH1038844A JP H1038844 A JPH1038844 A JP H1038844A JP 8214946 A JP8214946 A JP 8214946A JP 21494696 A JP21494696 A JP 21494696A JP H1038844 A JPH1038844 A JP H1038844A
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- electrode
- biosensor
- cell
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 微小領域での定量測定を目的としたオンライ
ンバイオセンサーを提供する。 【解決手段】 キャピラリのサンプリング部分、酵素反
応器、電気化学検出器を配置したフローセル、吸引モー
ドで駆動されるシリンジポンプからなるオンラインバイ
オセンサー。キャピラリのサンプリング部分、酵素修飾
電極を配置したフローセル、吸引モードで駆動されるシ
リンジポンプからなるオンラインバイオセンサー。フロ
ーセルの好適な例にはラディアルフロー型薄層セルがあ
る。 【効果】 高い選択性、長期安定性、感度が達成され
る。
ンバイオセンサーを提供する。 【解決手段】 キャピラリのサンプリング部分、酵素反
応器、電気化学検出器を配置したフローセル、吸引モー
ドで駆動されるシリンジポンプからなるオンラインバイ
オセンサー。キャピラリのサンプリング部分、酵素修飾
電極を配置したフローセル、吸引モードで駆動されるシ
リンジポンプからなるオンラインバイオセンサー。フロ
ーセルの好適な例にはラディアルフロー型薄層セルがあ
る。 【効果】 高い選択性、長期安定性、感度が達成され
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は培養細胞の計測にお
いて単一細胞などの微小領域での定量測定を目的とした
バイオセンサーに関する。
いて単一細胞などの微小領域での定量測定を目的とした
バイオセンサーに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、神経科学や分子生物学などの発展
により、生体内の微小領域に含まれる生理活性物質をリ
アルタイムで計測しようという試みが数多くなされてい
る。その中で電気化学的な分析法は、（１）微少量の計
測に適している、（２）感度が比較的高い、（３）選択
的な膜や酵素などで電極を修飾することにより高選択的
な測定が可能である、（４）簡便で低価格のセンサーを
作製することができる、などの特徴を有している。生体
を生かしたままで直接、電気化学的に生理活性物質を測
定する試みとしては、炭素繊維電極などの微小電極を直
接生体内の特定領域に挿入して、その場計測を行うか、
又はマイクロダイヤリシスプローブと呼ばれる１〜５ｍ
ｍ程度の微小な透析膜を図２に示すように生体中に挿入
し、ポンプにより透析液を送って、生体に含まれる生理
活性物質を膜を介してサンプリングし、オンラインで電
気化学センサーに送り込むことにより生体物質をリアル
タイム計測している。センサーに目的物質と選択的に反
応し電気化学的に活性な物質を生成する酵素膜などを修
飾した電極を用いることにより、グルコース、ラクトー
スなどの糖類、グルタミン酸などの神経伝達物質がリア
ルタイムで計測されている。すなわち、図２は、生体内
〔イン ビボ（in vivo)〕計測を目的とし、マイクロダ
イヤリシス膜を用いる一般的なバイオセンサーの基本構
造を示す図である。一方、培養細胞などの計測では細胞
一個の計測など、マイクロメーターオーダーの微小領域
の計測が求められている。微小電極法では直径数μｍの
炭素繊維電極が容易に利用できるため、カテコールアミ
ンなど電極で直接電気化学反応して計測できる神経伝達
物質などでは単一細胞レベルの計測が行われている〔例
えば、Ｔ．Ｊ．シュレーダー（T.J.Schroeder)、Ｊ．
Ａ．ヤンコウスキー（J.A.Jankowski)、Ｋ．Ｔ．カワゴ
ー（K.T.Kawagoe)、Ｒ．Ｍ．ワイトマン（R.M.Wightma
n) 、Ｃ．レフロウ（C.Lefrou) 、及びＣ．アマトア
（C.Amatore)、アナリチカルケミストリー（Analytical
Chemistry) 、第６４巻、第３０７７〜３０８３頁（１
９９２）〕。また、走査型電気化学顕微鏡を利用してマ
イクロメータオーダーの微小領域での酵素反応や免疫反
応の検出が試みられている〔例えば、Ｈ．シク（H.Shik
u)、Ｔ．マツエ（T.Matsue) 、及びＩ．ウチダ（I.Uchi
da) 、アナリチカル ケミストリー、第６８巻、第１２
７６〜７８頁（１９９６）〕。一方、マイクロダイヤリ
シスプローブと電気化学検出を組合せたセンサーを利用
した、培養細胞の計測が行われており（例えば丹羽、鳥
光、森田、オズボーン、山本、電気化学会６３回大会予
稿）、微小電極法に比較し、定量性や長期安定性に優
れ、キャリブレーションしやすいのが特徴である。
により、生体内の微小領域に含まれる生理活性物質をリ
アルタイムで計測しようという試みが数多くなされてい
る。その中で電気化学的な分析法は、（１）微少量の計
測に適している、（２）感度が比較的高い、（３）選択
的な膜や酵素などで電極を修飾することにより高選択的
な測定が可能である、（４）簡便で低価格のセンサーを
作製することができる、などの特徴を有している。生体
を生かしたままで直接、電気化学的に生理活性物質を測
定する試みとしては、炭素繊維電極などの微小電極を直
接生体内の特定領域に挿入して、その場計測を行うか、
又はマイクロダイヤリシスプローブと呼ばれる１〜５ｍ
ｍ程度の微小な透析膜を図２に示すように生体中に挿入
し、ポンプにより透析液を送って、生体に含まれる生理
活性物質を膜を介してサンプリングし、オンラインで電
気化学センサーに送り込むことにより生体物質をリアル
タイム計測している。センサーに目的物質と選択的に反
応し電気化学的に活性な物質を生成する酵素膜などを修
飾した電極を用いることにより、グルコース、ラクトー
スなどの糖類、グルタミン酸などの神経伝達物質がリア
ルタイムで計測されている。すなわち、図２は、生体内
〔イン ビボ（in vivo)〕計測を目的とし、マイクロダ
イヤリシス膜を用いる一般的なバイオセンサーの基本構
造を示す図である。一方、培養細胞などの計測では細胞
一個の計測など、マイクロメーターオーダーの微小領域
の計測が求められている。微小電極法では直径数μｍの
炭素繊維電極が容易に利用できるため、カテコールアミ
ンなど電極で直接電気化学反応して計測できる神経伝達
物質などでは単一細胞レベルの計測が行われている〔例
えば、Ｔ．Ｊ．シュレーダー（T.J.Schroeder)、Ｊ．
Ａ．ヤンコウスキー（J.A.Jankowski)、Ｋ．Ｔ．カワゴ
ー（K.T.Kawagoe)、Ｒ．Ｍ．ワイトマン（R.M.Wightma
n) 、Ｃ．レフロウ（C.Lefrou) 、及びＣ．アマトア
（C.Amatore)、アナリチカルケミストリー（Analytical
Chemistry) 、第６４巻、第３０７７〜３０８３頁（１
９９２）〕。また、走査型電気化学顕微鏡を利用してマ
イクロメータオーダーの微小領域での酵素反応や免疫反
応の検出が試みられている〔例えば、Ｈ．シク（H.Shik
u)、Ｔ．マツエ（T.Matsue) 、及びＩ．ウチダ（I.Uchi
da) 、アナリチカル ケミストリー、第６８巻、第１２
７６〜７８頁（１９９６）〕。一方、マイクロダイヤリ
シスプローブと電気化学検出を組合せたセンサーを利用
した、培養細胞の計測が行われており（例えば丹羽、鳥
光、森田、オズボーン、山本、電気化学会６３回大会予
稿）、微小電極法に比較し、定量性や長期安定性に優
れ、キャリブレーションしやすいのが特徴である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】培養細胞の計測におい
て細胞は通常１０μｍ前後の大きさを有するために、測
定に用いる電極、あるいはサンプリングプローブは細胞
と同一オーダーまで微小化する必要がある。マイクロダ
イヤリシスと電気化学センサーを組合せた方法では、高
感度で定量性に優れる反面、マイクロメーターオーダー
の透析チューブを作製するのが極めて困難なため単一細
胞レベルでの測定が難しい。またプローブが小さくなる
と目的物質の回収率（外部溶液から何％の目的物質を透
析してサンプルできるかを示す数値）が減少するために
高感度な測定が難しい。一方、ファイバー型の微小電極
では、単一細胞レベルでのサイズまで容易に微小化で
き、電気化学反応を容易に起こす化合物については、極
めて高感度に検出することができるが、電気化学反応を
起こさず、酵素反応と電極反応を組合せて測定を行う系
では微小電極上に固定化できる酵素量が少なく、利用す
る酵素によっては長期安定性に劣る。また、共存物質が
存在する系では、その影響をすべて電極上で除く必要が
あるため、高い選択性を得るのが困難であるなどの欠点
を有している。また、酵素反応に補酵素などの物質が必
要な場合測定を行う培養系にその物質を加える必要があ
り、その生体試料への影響を常に考慮する必要があっ
た。本発明の目的は、前記したような問題点を解決し
た、微小領域での定量測定を目的とするオンラインバイ
オセンサーを提供することにある。
て細胞は通常１０μｍ前後の大きさを有するために、測
定に用いる電極、あるいはサンプリングプローブは細胞
と同一オーダーまで微小化する必要がある。マイクロダ
イヤリシスと電気化学センサーを組合せた方法では、高
感度で定量性に優れる反面、マイクロメーターオーダー
の透析チューブを作製するのが極めて困難なため単一細
胞レベルでの測定が難しい。またプローブが小さくなる
と目的物質の回収率（外部溶液から何％の目的物質を透
析してサンプルできるかを示す数値）が減少するために
高感度な測定が難しい。一方、ファイバー型の微小電極
では、単一細胞レベルでのサイズまで容易に微小化で
き、電気化学反応を容易に起こす化合物については、極
めて高感度に検出することができるが、電気化学反応を
起こさず、酵素反応と電極反応を組合せて測定を行う系
では微小電極上に固定化できる酵素量が少なく、利用す
る酵素によっては長期安定性に劣る。また、共存物質が
存在する系では、その影響をすべて電極上で除く必要が
あるため、高い選択性を得るのが困難であるなどの欠点
を有している。また、酵素反応に補酵素などの物質が必
要な場合測定を行う培養系にその物質を加える必要があ
り、その生体試料への影響を常に考慮する必要があっ
た。本発明の目的は、前記したような問題点を解決し
た、微小領域での定量測定を目的とするオンラインバイ
オセンサーを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はオンラインバイオセンサー関する発
明であって、キャピラリのサンプリング部分、酵素反応
器、電気化学検出器を配置したフローセル、吸引モード
で駆動されるシリンジポンプからなることを特徴とす
る。また、本発明の第２の発明は他のオンラインバイオ
センサー関する発明であって、キャピラリのサンプリン
グ部分、酵素修飾電極を配置したフローセル、吸引モー
ドで駆動されるシリンジポンプからなることを特徴とす
る。
発明の第１の発明はオンラインバイオセンサー関する発
明であって、キャピラリのサンプリング部分、酵素反応
器、電気化学検出器を配置したフローセル、吸引モード
で駆動されるシリンジポンプからなることを特徴とす
る。また、本発明の第２の発明は他のオンラインバイオ
センサー関する発明であって、キャピラリのサンプリン
グ部分、酵素修飾電極を配置したフローセル、吸引モー
ドで駆動されるシリンジポンプからなることを特徴とす
る。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明のオンラインバイオセンサーの構造を図１に
示す。すなわち図１は培養系での単一細胞計測など、微
小領域の計測を目的とした本発明のオンラインセンサー
の基本構造を示す図である。本発明においては、従来ミ
リメーターオーダーの透析膜を介してサンプリングを行
っていたオンラインバイオセンサーにおいてサンプリン
グ部分を先端がマイクロメートルオーダーまで微小化す
ることができるマイクロキャピラリ化し、吸引により試
料をサンプリング化するため、マイクロダイヤリシス法
に比較し、より微小領域での測定が可能になる。また、
ダイヤリシス法のように微小化による回収率の低下がな
いために高感度で測定ができる。次に、サンプリングキ
ャピラリと検出用電極の間に微小な反応器を挿入するこ
とにより、（１）目的物質の酵素反応による電気化学的
な活性物質の生成、（２）妨害物質の除去、などをオン
ラインで行うことができるために、修飾した微小電極を
用いる計測に比較し目的物質の高い反応効率や、妨害物
質に対する高い選択性を実現することができる。更に、
酵素反応や電極反応に必要な物質を測定試料内に加える
ことなく、従来のマイクロダイヤリシス法同様に図７に
示す合流回路により加えることが容易に行えるために、
複雑な反応も行うことができる特徴を有している。本発
明においては、フローセルとして、ラディアルフロー型
薄膜セルを用いることが好適である。
る。本発明のオンラインバイオセンサーの構造を図１に
示す。すなわち図１は培養系での単一細胞計測など、微
小領域の計測を目的とした本発明のオンラインセンサー
の基本構造を示す図である。本発明においては、従来ミ
リメーターオーダーの透析膜を介してサンプリングを行
っていたオンラインバイオセンサーにおいてサンプリン
グ部分を先端がマイクロメートルオーダーまで微小化す
ることができるマイクロキャピラリ化し、吸引により試
料をサンプリング化するため、マイクロダイヤリシス法
に比較し、より微小領域での測定が可能になる。また、
ダイヤリシス法のように微小化による回収率の低下がな
いために高感度で測定ができる。次に、サンプリングキ
ャピラリと検出用電極の間に微小な反応器を挿入するこ
とにより、（１）目的物質の酵素反応による電気化学的
な活性物質の生成、（２）妨害物質の除去、などをオン
ラインで行うことができるために、修飾した微小電極を
用いる計測に比較し目的物質の高い反応効率や、妨害物
質に対する高い選択性を実現することができる。更に、
酵素反応や電極反応に必要な物質を測定試料内に加える
ことなく、従来のマイクロダイヤリシス法同様に図７に
示す合流回路により加えることが容易に行えるために、
複雑な反応も行うことができる特徴を有している。本発
明においては、フローセルとして、ラディアルフロー型
薄膜セルを用いることが好適である。
【０００６】
【実施例】以下、実施例及び図面を参照して本発明を更
に具体的に説明する。なお本発明は以下の実施例のみに
限定されるものではない。
に具体的に説明する。なお本発明は以下の実施例のみに
限定されるものではない。
【０００７】実施例１ 図３は、本発明によるオンラインバイオセンサーの一実
施例による構成を説明する概略図である。図３中におい
てサンプリング部分は、内径０．７ｍｍのガラスキャピ
ラリをマイクロピペット製作器（成茂、ＰＰ８３）によ
り溶融延伸することにより先端内径１５μｍのサンプリ
ング部分を作製し、内径約１００μｍのテフロンチュー
ブ（ＣＭＡマイクロダイヤリシス社製）を延伸した側の
反対側から奥まで差し込んでエポキシにより封入した。
図３に示すようにそのチューブを３ｃｍの微小白金管を
通してラディアルフロー型電気化学検出器に導入した。
検出に用いた電極を図４に示す。すなわち、図４は検出
器修飾電極の断面図である。なお、図４において、符号
１はグラッシーカーボン（ＧＣ）電極、２は西洋ワサビ
ペルオキシターゼを含むオスミウム−ポリビニルピリジ
ンフィルム、３は牛血アルブミン／グルタミン酸酸化酵
素／グルタルアルデヒド＝１／１／０．１を意味する。
図４に示すように直径６ｍｍのグラッシーカーボン（Ｇ
Ｃ）電極〔バイオアナリチカル システムズ（Bioanaly
tical systems)社製〕とし、表面を過酸化水素を低い電
位で還元する性質を有する西洋ワサビペルオキシターゼ
（ＨＲＰ）を含むオスミウム（Ｏｓ）ポリビニルピリジ
ン酸化還元ポリマー（Ｏｓポリマー）〔例えば、アナリ
チカル ケミストリー、第６４巻、第３０８４〜３０９
０頁（１９９２）〕、及びグルタミン酸酸化酵素（ヤマ
サ醤油社製）と牛血アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社
製）をグルタルアルデヒドに架橋したものをＯｓポリマ
ー上により２層に修飾した。ラディアルフローセルのア
ウトレット側はテフロンチューブを介してシリンジポン
プ（ＣＭＡマイクロダイヤリシス社製）と接続した。シ
リンジポンプは治具により、通常と逆に吸引モードで駆
動するように改造した。このセンサーと白金チューブ電
極と修飾したＧＣ電極を液体クロマトグラフィ用バイポ
テンシオスタットＬＣ４Ｃ（バイオアナリチカル シス
テムズ社製）に接続した。参照電極は銀／塩化銀電極を
用い、ラディアルフローセル中に配置してある。また対
向電極はフローセルのブロック（ステンレス製）を利用
した。測定は、白金管電極を４００ｍＶに、修飾ＧＣ電
極を０ｍＶに電位設定し、初めにリン酸緩衝生理食塩水
を流速１６μｌ／ｍｉｎで送液し、その後、Ｌ−グルタ
ミン酸１μｍｏｌ／リットルを含むリン酸緩衝溶液の測
定を行った。リン酸緩衝溶液をグルタミン酸を含む溶液
に切り替えると約３０秒後に電流が増加し始め、−１６
ｎＡの定常電流値が得られた。この値は、サンプリング
されたグルタミン酸がすべて酸化されたと仮定した時の
理論値の７０％以上の値を示しており、反応効率の大き
いラディアルフロー型薄層セル中に電気化学検出器を配
置したことによるものである。次にＬ−グルタミン酸１
μｍｏｌ／リットルとＬ−アスコルビン酸２０μｍｏｌ
／リットルを含むリン酸緩衝生理食塩水の測定を行う
と、白金管電極では約１．２μＡの酸化反応による定常
電流が観測された。一方、修飾ＧＣ電極では−１１ｎＡ
の定常状態電流（還元電流）が観測された。しかしなが
ら、白金管電極に電位を印加せずに測定を行うと、修飾
ＧＣ電極の定常電流値は２ｎＡとなり、グルタミン酸を
検出することは困難であった。白金管電極でプレ電解を
行うことにより、妨害物質であるＬ−アスコルビン酸を
ほとんど除去し、Ｌ−グルタミン酸を選択的に検出する
ことができた。
施例による構成を説明する概略図である。図３中におい
てサンプリング部分は、内径０．７ｍｍのガラスキャピ
ラリをマイクロピペット製作器（成茂、ＰＰ８３）によ
り溶融延伸することにより先端内径１５μｍのサンプリ
ング部分を作製し、内径約１００μｍのテフロンチュー
ブ（ＣＭＡマイクロダイヤリシス社製）を延伸した側の
反対側から奥まで差し込んでエポキシにより封入した。
図３に示すようにそのチューブを３ｃｍの微小白金管を
通してラディアルフロー型電気化学検出器に導入した。
検出に用いた電極を図４に示す。すなわち、図４は検出
器修飾電極の断面図である。なお、図４において、符号
１はグラッシーカーボン（ＧＣ）電極、２は西洋ワサビ
ペルオキシターゼを含むオスミウム−ポリビニルピリジ
ンフィルム、３は牛血アルブミン／グルタミン酸酸化酵
素／グルタルアルデヒド＝１／１／０．１を意味する。
図４に示すように直径６ｍｍのグラッシーカーボン（Ｇ
Ｃ）電極〔バイオアナリチカル システムズ（Bioanaly
tical systems)社製〕とし、表面を過酸化水素を低い電
位で還元する性質を有する西洋ワサビペルオキシターゼ
（ＨＲＰ）を含むオスミウム（Ｏｓ）ポリビニルピリジ
ン酸化還元ポリマー（Ｏｓポリマー）〔例えば、アナリ
チカル ケミストリー、第６４巻、第３０８４〜３０９
０頁（１９９２）〕、及びグルタミン酸酸化酵素（ヤマ
サ醤油社製）と牛血アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社
製）をグルタルアルデヒドに架橋したものをＯｓポリマ
ー上により２層に修飾した。ラディアルフローセルのア
ウトレット側はテフロンチューブを介してシリンジポン
プ（ＣＭＡマイクロダイヤリシス社製）と接続した。シ
リンジポンプは治具により、通常と逆に吸引モードで駆
動するように改造した。このセンサーと白金チューブ電
極と修飾したＧＣ電極を液体クロマトグラフィ用バイポ
テンシオスタットＬＣ４Ｃ（バイオアナリチカル シス
テムズ社製）に接続した。参照電極は銀／塩化銀電極を
用い、ラディアルフローセル中に配置してある。また対
向電極はフローセルのブロック（ステンレス製）を利用
した。測定は、白金管電極を４００ｍＶに、修飾ＧＣ電
極を０ｍＶに電位設定し、初めにリン酸緩衝生理食塩水
を流速１６μｌ／ｍｉｎで送液し、その後、Ｌ−グルタ
ミン酸１μｍｏｌ／リットルを含むリン酸緩衝溶液の測
定を行った。リン酸緩衝溶液をグルタミン酸を含む溶液
に切り替えると約３０秒後に電流が増加し始め、−１６
ｎＡの定常電流値が得られた。この値は、サンプリング
されたグルタミン酸がすべて酸化されたと仮定した時の
理論値の７０％以上の値を示しており、反応効率の大き
いラディアルフロー型薄層セル中に電気化学検出器を配
置したことによるものである。次にＬ−グルタミン酸１
μｍｏｌ／リットルとＬ−アスコルビン酸２０μｍｏｌ
／リットルを含むリン酸緩衝生理食塩水の測定を行う
と、白金管電極では約１．２μＡの酸化反応による定常
電流が観測された。一方、修飾ＧＣ電極では−１１ｎＡ
の定常状態電流（還元電流）が観測された。しかしなが
ら、白金管電極に電位を印加せずに測定を行うと、修飾
ＧＣ電極の定常電流値は２ｎＡとなり、グルタミン酸を
検出することは困難であった。白金管電極でプレ電解を
行うことにより、妨害物質であるＬ−アスコルビン酸を
ほとんど除去し、Ｌ−グルタミン酸を選択的に検出する
ことができた。
【０００８】細胞計測を行うために、ラット大脳の神経
細胞をシャーレー上に２０日間培養した。この培養細胞
の一つの細胞に図５のようにマニピュレーターを用いて
キャピラリを近接させて細胞近傍の溶液を連続サンプリ
ングしながら、もう一本のキャピラリから１００ｍＭの
塩化カリウム水溶液を極微量細胞に振りかけると、電流
値が−０．５ｎＡ減少した。これは神経細胞の刺激によ
るグルタミン酸放出をセンサーによりリアルタイムに計
測できたことを示している。なお、図５は本発明のセン
サーによる単一神経細胞からの神経伝達物質放出計測の
概略図である。
細胞をシャーレー上に２０日間培養した。この培養細胞
の一つの細胞に図５のようにマニピュレーターを用いて
キャピラリを近接させて細胞近傍の溶液を連続サンプリ
ングしながら、もう一本のキャピラリから１００ｍＭの
塩化カリウム水溶液を極微量細胞に振りかけると、電流
値が−０．５ｎＡ減少した。これは神経細胞の刺激によ
るグルタミン酸放出をセンサーによりリアルタイムに計
測できたことを示している。なお、図５は本発明のセン
サーによる単一神経細胞からの神経伝達物質放出計測の
概略図である。
【０００９】実施例２ 図６は、本発明によるオンラインバイオセンサーの一実
施例による構成を説明する概略図である。装置は基本的
に実施例１と同様なものを使用し、白金管電極の代り
に、コリンオキシターゼとカタラーゼの２種類の酵素を
固定化したビーズ充てんした酵素反応器を接続した。ま
た、検出には６ｍｍのＧＣ電極にＨＲＰを含むＯｓポリ
マーフィルム、アセチルコリンエステラーゼとカタラー
ゼの２種類の酵素をグルタルアルデヒドにより架橋した
フィルムにより修飾したものを用いた。測定はアセチル
コリンの高感度な選択的測定を目的とした。１μＭ（Ｍ
＝ｍｏｌ／リットル）のアセチルコリンを含むリン酸緩
衝溶液を送液すると、送液開始後３０秒後に還元電流が
流れ始め、−３１ｎＡの定常電流値が得られた。次に、
２μＭのコリンと、１００ｎＭのアセチルコリンを含む
緩衝溶液の測定を行ったところ、−３．０ｎＡの値が得
られ、コリンがプレカラム内のコリンオキシターゼです
べて酸化され、発生した過酸化水素もすべてカタラーゼ
により分解されていることが分かった。一方、炭素ファ
イバー電極上にアセチルコリンエステラーゼとコリンオ
キシターゼを固定化した電極では同一の溶液に対して−
６０ｎＡの値が得られ、コリンの反応によりアセチルコ
リンのみの濃度を評価することが困難だった。本発明の
センサーでは２μＭのコリン存在下で２．５ｎＭまでの
濃度の測定を定量的に行うことができた。
施例による構成を説明する概略図である。装置は基本的
に実施例１と同様なものを使用し、白金管電極の代り
に、コリンオキシターゼとカタラーゼの２種類の酵素を
固定化したビーズ充てんした酵素反応器を接続した。ま
た、検出には６ｍｍのＧＣ電極にＨＲＰを含むＯｓポリ
マーフィルム、アセチルコリンエステラーゼとカタラー
ゼの２種類の酵素をグルタルアルデヒドにより架橋した
フィルムにより修飾したものを用いた。測定はアセチル
コリンの高感度な選択的測定を目的とした。１μＭ（Ｍ
＝ｍｏｌ／リットル）のアセチルコリンを含むリン酸緩
衝溶液を送液すると、送液開始後３０秒後に還元電流が
流れ始め、−３１ｎＡの定常電流値が得られた。次に、
２μＭのコリンと、１００ｎＭのアセチルコリンを含む
緩衝溶液の測定を行ったところ、−３．０ｎＡの値が得
られ、コリンがプレカラム内のコリンオキシターゼです
べて酸化され、発生した過酸化水素もすべてカタラーゼ
により分解されていることが分かった。一方、炭素ファ
イバー電極上にアセチルコリンエステラーゼとコリンオ
キシターゼを固定化した電極では同一の溶液に対して−
６０ｎＡの値が得られ、コリンの反応によりアセチルコ
リンのみの濃度を評価することが困難だった。本発明の
センサーでは２μＭのコリン存在下で２．５ｎＭまでの
濃度の測定を定量的に行うことができた。
【００１０】実施例３ 図７は、本発明によるオンラインバイオセンサーの一実
施例による構成を説明する概略図である。装置は基本的
に実施例１と同様なものを使用し、合流回路により、酸
素を飽和させたリン酸緩衝生理食塩水を白金管電極直後
に合流させた。測定は、白金管電極を４００ｍＶに、修
飾ＧＣ電極を０ｍＶに電位設定し、初めに合流回路を取
り付けずにシリンジポンプでリン酸緩衝生理食塩水を流
速１６μｌ／ｍｉｎで吸引し、その後、Ｌ−グルタミン
酸１〜１００μｍｏｌ／リットルを含むリン酸緩衝溶液
の測定を行った。リン酸緩衝溶液をグルタミン酸を含む
溶液に切り替えると約３０秒後に電流が増加し始め、−
１６ｎＡの定常電流値が得られた。次にＬ−グルタミン
酸１０μｍｏｌ／リットルと５０μｍｏｌ／リットル、
１００μｍｏｌ／リットルの溶液を測定するとそれぞれ
−１５５ｎＡ、−６００ｎＡ、−９３０ｎＡとなり良い
直線性を得ることができなかった。一方、合流回路を連
結して、サンプル側と合流側の溶液量がほぼ１：１にな
るように送液して測定を行うと、グルタミン酸濃度、
１、１０、５０、１００μｍｏｌ／リットルに対して−
８．２ｎＡ、−７９ｎＡ、−３９０ｎＡ、−７６０ｎＡ
となり、低濃度側での電流値は希釈により約半分に減少
したが、１〜１００μｍｏｌ／リットルのグルタミン酸
計測に関しての直線性は向上した。これはグルタミン酸
酸化酵素が、高濃度のグルタミン酸の測定の際に酸素不
足を生じることによる応答低下が、酸素を飽和させた溶
液を連続的に流すことにより、酸素不足を来すことなく
酵素反応が進行したためである。グルタミン酸の測定で
は、グルタミン酸酸化酵素の替りにグルタメートジハイ
ドロゲナーゼを用いることもできる。その際には補酵素
としてＮＡＤ+ を供給する必要がある。この際にもサン
プル溶液中にＮＡＤ+ を加えることなく、グルタメート
ジハイドロゲナーゼを固定化した反応器（あるいは電
極）直前にＮＡＤ+を含む溶液を合流させることにより
微小領域計測を目的としたセンサーを形成することがで
きる。
施例による構成を説明する概略図である。装置は基本的
に実施例１と同様なものを使用し、合流回路により、酸
素を飽和させたリン酸緩衝生理食塩水を白金管電極直後
に合流させた。測定は、白金管電極を４００ｍＶに、修
飾ＧＣ電極を０ｍＶに電位設定し、初めに合流回路を取
り付けずにシリンジポンプでリン酸緩衝生理食塩水を流
速１６μｌ／ｍｉｎで吸引し、その後、Ｌ−グルタミン
酸１〜１００μｍｏｌ／リットルを含むリン酸緩衝溶液
の測定を行った。リン酸緩衝溶液をグルタミン酸を含む
溶液に切り替えると約３０秒後に電流が増加し始め、−
１６ｎＡの定常電流値が得られた。次にＬ−グルタミン
酸１０μｍｏｌ／リットルと５０μｍｏｌ／リットル、
１００μｍｏｌ／リットルの溶液を測定するとそれぞれ
−１５５ｎＡ、−６００ｎＡ、−９３０ｎＡとなり良い
直線性を得ることができなかった。一方、合流回路を連
結して、サンプル側と合流側の溶液量がほぼ１：１にな
るように送液して測定を行うと、グルタミン酸濃度、
１、１０、５０、１００μｍｏｌ／リットルに対して−
８．２ｎＡ、−７９ｎＡ、−３９０ｎＡ、−７６０ｎＡ
となり、低濃度側での電流値は希釈により約半分に減少
したが、１〜１００μｍｏｌ／リットルのグルタミン酸
計測に関しての直線性は向上した。これはグルタミン酸
酸化酵素が、高濃度のグルタミン酸の測定の際に酸素不
足を生じることによる応答低下が、酸素を飽和させた溶
液を連続的に流すことにより、酸素不足を来すことなく
酵素反応が進行したためである。グルタミン酸の測定で
は、グルタミン酸酸化酵素の替りにグルタメートジハイ
ドロゲナーゼを用いることもできる。その際には補酵素
としてＮＡＤ+ を供給する必要がある。この際にもサン
プル溶液中にＮＡＤ+ を加えることなく、グルタメート
ジハイドロゲナーゼを固定化した反応器（あるいは電
極）直前にＮＡＤ+を含む溶液を合流させることにより
微小領域計測を目的としたセンサーを形成することがで
きる。
【００１１】
【発明の効果】以上、説明したように本発明によるオン
ラインバイオセンサーはキャピラリのサンプリング部
分、酵素反応器、薄層電気化学検出器、吸引モードで駆
動されるシリンジからなるか、あるいはオンラインバイ
オセンサー、あるいは、キャピラリのサンプリング部
分、酵素修飾電気化学検出器、吸引モードで駆動される
シリンジポンプからなることを特徴とする。このセンサ
ーではサンプリング部がガラスキャピラリのために従来
のマイクロダイヤリシス膜をサンプリングプローブに用
いるオンラインセンサーに比較し微小化が極めて容易
で、微小領域の計測用センサーとして有効である。ま
た、サンプリング部分と検出器の間に妨害物質を反応さ
せてオンラインで除去する酵素反応器や前電解用の電極
を挿入することができるため、ファイバー型の微小電極
に比較し高い選択性を実現することができる。更に電極
のサイズはある程度大きくても良いために、寿命に問題
がある酵素をファイバー型電極に比較し多く固定化で
き、長期安定性に優れている。更に、目的物質の計測に
酸素や補酵素などの第３の化学物質を連続的に供給する
際にも、測定対象溶液に試薬を加えることなく他の溶液
溜からオンラインで合流させることができる利点を有し
ており、培養神経細胞での伝達物質計測や単一細胞での
計測など神経化学や単一細胞レベルでの研究のツールと
して極めて利用価値が高い。それに加え、ラディアルフ
ロー型薄層セルを用いると高い電気化学反応の反応効率
が達成され、より高感度な計測が可能になる。
ラインバイオセンサーはキャピラリのサンプリング部
分、酵素反応器、薄層電気化学検出器、吸引モードで駆
動されるシリンジからなるか、あるいはオンラインバイ
オセンサー、あるいは、キャピラリのサンプリング部
分、酵素修飾電気化学検出器、吸引モードで駆動される
シリンジポンプからなることを特徴とする。このセンサ
ーではサンプリング部がガラスキャピラリのために従来
のマイクロダイヤリシス膜をサンプリングプローブに用
いるオンラインセンサーに比較し微小化が極めて容易
で、微小領域の計測用センサーとして有効である。ま
た、サンプリング部分と検出器の間に妨害物質を反応さ
せてオンラインで除去する酵素反応器や前電解用の電極
を挿入することができるため、ファイバー型の微小電極
に比較し高い選択性を実現することができる。更に電極
のサイズはある程度大きくても良いために、寿命に問題
がある酵素をファイバー型電極に比較し多く固定化で
き、長期安定性に優れている。更に、目的物質の計測に
酸素や補酵素などの第３の化学物質を連続的に供給する
際にも、測定対象溶液に試薬を加えることなく他の溶液
溜からオンラインで合流させることができる利点を有し
ており、培養神経細胞での伝達物質計測や単一細胞での
計測など神経化学や単一細胞レベルでの研究のツールと
して極めて利用価値が高い。それに加え、ラディアルフ
ロー型薄層セルを用いると高い電気化学反応の反応効率
が達成され、より高感度な計測が可能になる。
【図１】培養系での単一細胞計測など、微小領域の計測
を目的とした本発明のオンラインバイオセンサーの基本
構造を示す図である。
を目的とした本発明のオンラインバイオセンサーの基本
構造を示す図である。
【図２】生体内計測を目的とし、マイクロダイヤリシス
膜を用いる一般的なバイオセンサーの基本構造を示す図
である。
膜を用いる一般的なバイオセンサーの基本構造を示す図
である。
【図３】本発明の実施例１に示すオンライングルタミン
酸センサーの構造を示す図である。
酸センサーの構造を示す図である。
【図４】図３に示す検出器修飾電極の断面図である。
【図５】本発明のセンサーによる単一神経細胞からの神
経伝達物質放出計測の概略図である。
経伝達物質放出計測の概略図である。
【図６】本発明の実施例２に示すオンラインアセチルコ
リンセンサーの構造を示す図である。
リンセンサーの構造を示す図である。
【図７】本発明の実施例３に示す高濃度のグルタミン酸
計測用オンラインセンサーの構造を示す図である。
計測用オンラインセンサーの構造を示す図である。
１：グラッシーカーボン（ＧＣ）電極、２：西洋ワサビ
ペルオキシターゼを含むオスミウム−ポリビニルピリジ
ンフィルム、３：牛血アルブミン／グルタミン酸酸化酵
素／グルタルアルデヒド＝１／１／０．１
ペルオキシターゼを含むオスミウム−ポリビニルピリジ
ンフィルム、３：牛血アルブミン／グルタミン酸酸化酵
素／グルタルアルデヒド＝１／１／０．１
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 森田 雅夫 東京都新宿区西新宿三丁目19番２号 日本 電信電話株式会社内 (72)発明者 田部井 久男 東京都武蔵野市御殿山一丁目１番３号 エ ヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロジ株 式会社内
Claims (3)
- 【請求項１】 キャピラリのサンプリング部分、酵素反
応器、電気化学検出器を配置したフローセル、吸引モー
ドで駆動されるシリンジポンプからなることを特徴とす
るオンラインバイオセンサー。 - 【請求項２】 キャピラリのサンプリング部分、酵素修
飾電極を配置したフローセル、吸引モードで駆動される
シリンジポンプからなることを特徴とするオンラインバ
イオセンサー。 - 【請求項３】 フローセルとしてラディアルフロー型薄
層セルを用いることを特徴とする請求項１又は２記載の
オンラインバイオセンサー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8214946A JPH1038844A (ja) | 1996-07-29 | 1996-07-29 | オンラインバイオセンサー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8214946A JPH1038844A (ja) | 1996-07-29 | 1996-07-29 | オンラインバイオセンサー |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1038844A true JPH1038844A (ja) | 1998-02-13 |
Family
ID=16664190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8214946A Pending JPH1038844A (ja) | 1996-07-29 | 1996-07-29 | オンラインバイオセンサー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1038844A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001061497A (ja) * | 1999-08-27 | 2001-03-13 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | ヒスタミンセンサ |
| JP2004077257A (ja) * | 2002-08-15 | 2004-03-11 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 化学物質の高感度電気化学検出方法、及び化学物質の高感度検出装置 |
| JP2004361189A (ja) * | 2003-06-03 | 2004-12-24 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | オンラインカテコールアミンセンシングデバイス |
| CN103698541A (zh) * | 2013-12-19 | 2014-04-02 | 山东省科学院生物研究所 | 谷氨酸发酵在线检测系统及采用该系统在线检测的方法 |
| CN112834581A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-25 | 陕西师范大学 | 用于动态检测的便携式检测发生器及其应用和使用方法 |
-
1996
- 1996-07-29 JP JP8214946A patent/JPH1038844A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001061497A (ja) * | 1999-08-27 | 2001-03-13 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | ヒスタミンセンサ |
| JP2004077257A (ja) * | 2002-08-15 | 2004-03-11 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 化学物質の高感度電気化学検出方法、及び化学物質の高感度検出装置 |
| JP2004361189A (ja) * | 2003-06-03 | 2004-12-24 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | オンラインカテコールアミンセンシングデバイス |
| CN103698541A (zh) * | 2013-12-19 | 2014-04-02 | 山东省科学院生物研究所 | 谷氨酸发酵在线检测系统及采用该系统在线检测的方法 |
| CN112834581A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-25 | 陕西师范大学 | 用于动态检测的便携式检测发生器及其应用和使用方法 |
| CN112834581B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-10-03 | 陕西师范大学 | 用于动态检测的便携式检测发生器及其应用和使用方法 |
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