JPH1042874A

JPH1042874A - 核酸増幅用ｄｎａポリメラーゼ組成物

Info

Publication number: JPH1042874A
Application number: JP8200446A
Authority: JP
Inventors: Hidesuke Komatsubara; 小松原　　秀介; Masao Kitabayashi; 北林　　雅夫; Hideki Kamimura; 秀喜上村; Fumikiyo Kawakami; 川上　　文清; Yoshihisa Kawamura; 川村　　良久; Masahiro Takagi; 昌宏高木; Tadayuki Imanaka; 忠行今中
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1996-07-30
Publication date: 1998-02-17
Anticipated expiration: 2016-07-30
Also published as: JP3463780B2

Abstract

(57)【要約】【課題】核酸の増幅効率が優れた耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ組成物を提供する。【解決手段】改変前の３’５’エキソヌクレアーゼ活性
を有するＤＮＡポリメラーゼに比べて、０〜５％である
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する改変された
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（第１ＤＮＡポリメラーゼ）
および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼまたは改変前の３’５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比
べて、１００〜６％である３’５’エキソヌクレアーゼ
活性を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（第
２ＤＮＡポリメラーゼ）を含み、第１ＤＮＡポリメラー
ゼおよび第２ＤＮＡポリメラーゼが少なくとも３０塩基
／秒であるＤＮＡ合成速度、ｐＨ８．８にて９５℃、６
時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することがで
きる熱安定性を有することを特徴とする核酸増幅用ＤＮ
Ａポリメラーゼ組成物である。該組成物を使用すること
により長鎖核酸の増幅も可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は核酸増幅用ＤＮＡポ
リメラーゼ組成物および該組成物を含む核酸増幅用試薬
および該試薬を用いる核酸増幅法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）等の核酸を増幅する技術に用いる耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼに関する研究が多くなされている。ＰＣＲ反応
に用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは、主としてサ
ーマス・サ−モフィラス(Thermusthermophilus) 由来の
ＤＮＡポリメラ−ゼ(Tthポリメラーゼ) やサーマス・ア
クアチカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメラ
−ゼ(Taqポリメラーゼ)などが用いられてきた。また、
超好熱始原菌由来のＤＮＡポリメラーゼ、たとえばパイ
ロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由来の
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ、WO92/096
89、特開平5-328969公報）、サーマス・リトラリス(The
rmococcus litoralis)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
(Tliポリメラーゼ、特開平6-7160号公報）などが知られ
ている。

【０００３】本発明者らは熱安定性やＤＮＡ合成速度に
優れたパイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(KODポリメラーゼ、特開平
7-298879号公報) を見い出した。さらに、本発明者らは
パイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ１由来のポリ
メラーゼのＤＮＡの合成速度や熱安定性を保持したま
ま、改変前の該酵素に比べて３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を少なくとも５％以下に低下させた改変酵素を
作り出すことに成功した。該酵素は、ＤＮＡ合成速度が
少なくとも３０塩基／秒であって、ｐＨ８．８（２５℃
での測定値、９５℃にてｐＨを測定することは困難であ
る。）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活
性を保持することができる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで
あって、改変前の酵素に比べて、３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性が少なくとも５％以下に低下した酵素であ
る。該酵素を用いることにより、改変前の酵素を用いる
よりも増幅効率が上昇することも見い出した。

【０００４】一方、長鎖核酸を増幅する方法の１つとし
て、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポ
リメラーゼ(KlenTaq-278) と３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有するＰｆｕポリメラーゼまたはＴｌｉポリ
メラーゼまたはこれらの変異酵素を混合したＤＮＡポリ
メラーゼ組成物を用いて、ＰＣＲを行う方法が報告され
ている（Barns, W.M. (1994) Proc.Natl. Acad. Sci. U
SA 91, 2216-2220) 。また、３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を示さないＴｔｈポリメラーゼと３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を示すＰｆｕポリメラーゼまたは
Ｔｌｉポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ(Thermotog
a maritima) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを混合し
たポリメラーゼ組成物を用いて、ＰＣＲを行う方法が報
告されている（特開平 8-38198号公報) 。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の組成物は１種類のＤＮＡポリメラーゼを用いる場合に
比べて、増幅効率は改善されるものの、熱安定性やＤＮ
Ａ合成速度の異なる２種類のＤＮＡポリメラーゼを用い
ており、決して充分な増幅効率とはいえず、より増幅効
率が優れた方法が待ち望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは鋭
意検討した結果、核酸増幅用のＤＮＡポリメラーゼ組成
物であって、第１ＤＮＡポリメラーゼと、ポリメラーゼ
活性単位で測定すると第１ＤＮＡポリメラーゼよりも少
量の第２ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせからなり、熱
安定性およびＤＮＡ合成速度がほぼ等しいＤＮＡポリメ
ラーゼ、具体的には前記第１ＤＮＡポリメラーゼが天然
に存在する該酵素に比べて、３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性が０〜５％である改変された耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼであり、そして前記第２ＤＮＡポリメラーゼが
天然に存在する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
するＤＮＡポリメラーゼ、または天然に存在する該酵素
に比べて、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が１００
〜６％である改変されたＤＮＡポリメラーゼよりなる群
から選択されるＤＮＡポリメラーゼであるＤＮＡポリメ
ラーゼ組成物を用いることにより、増幅効率の優れたＰ
ＣＲが行えることを見い出し、本発明に到達した。

【０００７】すなわち、本発明は改変前の３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼに比べて、０〜５％である３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（第１ＤＮＡポリメラーゼ）および３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまた
は改変前の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、１００〜６％であ
る３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する改変され
た耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（第２ＤＮＡポリメラー
ゼ）を含み、第１ＤＮＡポリメラーゼおよび第２ＤＮＡ
ポリメラーゼが、少なくとも３０塩基／秒であるＤＮＡ
合成速度、ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる熱安定性を有することを特徴とする核酸増幅
用ＤＮＡポリメラーゼ組成物である。

【０００８】また、本発明はＤＮＡを鋳型とし、プライ
マー、ｄＮＴＰおよび上記ＤＮＡポリメラーゼ組成物を
反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー
伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法である。

【０００９】さらに、本発明は１方のプライマーが他方
のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種の
プライマー、ｄＮＴＰおよび上記ＤＮＡポリメラーゼ組
成物、２価イオン、１価イオンおよび緩衝液を含む核酸
増幅用試薬である。

【００１０】

【発明の実施態様】

【００１１】本発明の第１ＤＮＡポリメラーゼは、改変
前の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼに比べて、０〜５％、好ましくは１
％以下に低下した３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有する酵素である。

【００１２】このような第１ＤＮＡポリメラーゼとして
は、アミノ酸配列が配列番号２に記載のアミノ酸配列の
第１４１、１４２、１４３、２１０および３１１番目の
アミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換したア
ミノ酸配列を有する酵素がある。その一例としては、配
列番号２の１４１番目のアスパラギン酸をアラニンに置
換した酵素、配列番号２の１４３番目のグルタミン酸を
アラニンに置換した酵素、配列番号２の１４１番目のア
スパラギン酸と１４３番目のグルタミン酸をアラニンに
置換した酵素、配列番号２の２１０番目のアスパラギン
をアスパラギン酸に置換した酵素、配列番号２の３１１
番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した酵素など
があげられる。また、配列番号１４２番目のイソロイシ
ンをアルギニンに置換した酵素も含まれる。

【００１３】本発明の第１ＤＮＡポリメラーゼとして
は、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼがある。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。

【００１４】本発明の第１ＤＮＡポリメラーゼとして
は、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼがある。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１
４１、１４２、１４３、２１０および３１１番目のアミ
ノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換したアミノ
酸配列

【００１５】本発明の第１ＤＮＡポリメラーゼとして
は、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼがある。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２の第１４１番目のアスパラギ
ン酸をアラニンに、第１４２番目のイソロイシンをアル
ギニンに、第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに、
第１４１番目のアスパラギン酸と第１４３番目のグルタ
ミン酸をアラニンに、第２１０番目のアスパラギンをア
スパラギン酸に、第３１１番目のチロシンをフェニルア
ラニンに置換したアミノ酸配列

【００１６】本発明の第２ＤＮＡポリメラーゼは、３’
−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼまたは改変前の３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、１
００〜６％、好ましくは９０〜３０％である３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を有する改変された耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼである。このような第２ＤＮＡポリメラ
ーゼとしては、アミノ酸配列が配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列を有する酵素または配列番号２に記載のアミノ
酸配列の第１４０、１４２および１４４番目のアミノ酸
を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する酵素が
ある。その一例としては、配列番号２の第１４２番目の
イソロイシンをアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパ
ラギン、グルタミンまたはリジンに置換したアミノ酸配
列、または第１４４番目のスレオニンをバリンに置換し
た酵素などがあげられる。

【００１７】本発明の第２ＤＮＡポリメラーゼとして
は、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼがある。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列

【００１８】本発明の第２ＤＮＡポリメラーゼとして
は、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼがある。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
１００〜６％、好ましくは９０〜３０％である３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列のエキ
ソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ₁Ｄ
Ｘ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃の少
なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミ
ノ酸配列なお、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ
ポリメラーゼのアミノ酸配列中には、このエキソヌクレ
アーゼに関して高度に保存されたアミノ酸領域が知られ
ている（EXO I, EXO II, EXO III、図４）。エキソＩ
（ＥＸＯ１）領域にはＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフが存在
し、これらのアミノ酸、Ｄ（アスパラギン酸）とＥ（グ
ルタミン酸）はエキソヌクレアーゼ活性に必須であるこ
とが知られている。

【００１９】本発明の第２ＤＮＡポリメラーゼとして
は、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼがある。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
１００〜６％、好ましくは９０〜３０％である３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。アミノ酸配列：配列番号２の第１４０、１４２および１
４４番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸
配列

【００２０】本発明の第２ＤＮＡポリメラーゼとして
は、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼがある。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
１００〜６％、好ましくは９０〜３０％である３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２の第１４２番目のイソロイシ
ンをアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グ
ルタミン、またはリジンに置換したアミノ酸配列、また
は第１４４番目のスレオニンンをバリンに置換したアミ
ノ酸配列

【００２１】第１ＤＮＡポリメラーゼおよび第２ＤＮＡ
ポリメラーゼのＤＮＡ合成速度は少なくとも３０塩基／
秒、好ましくは１００〜１２０塩基／秒であって、ｐＨ
８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理
で６０％以上の活性を保持できる耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼである。本発明の第１ＤＮＡポリメラーゼおよび第
２ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤポリメラーゼまたは該
酵素の変異体であることが好ましい。

【００２２】本発明では、第２ＤＮＡポリメラーゼの活
性が、第１ＤＮＡポリメラーゼの活性よりも小さいこと
が好ましく、第１ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位につ
き、第２ＤＮＡポリメラーゼが０．０２〜０．１単位で
あることが好ましい。

【００２３】これらの改変された酵素を製造する方法と
しては、例えば天然型ＫＯＤポリメラーゼをコードする
遺伝子に変異を導入して、蛋白工学的手法により、天然
型ＫＯＤポリメラーゼに比べて３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性が低下した新規な酵素を製造する方法があ
る。

【００２４】変異を導入するためのＫＯＤポリメラーゼ
をコードする遺伝子は特に限定されないが、本発明の一
実施態様は、パイロコッカス(Pyrococcous) ｓｐ．ＫＯ
Ｄ由来の配列表・配列番号３に記載の遺伝子を用いた。

【００２５】本発明の別な実施態様は、配列番号１に記
載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子に変異を導入
して、天然型ＫＯＤポリメラーゼに比べて３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性が低下した新規な酵素を製造す
る。

【００２６】天然型ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子に変異を
導入する方法は、既知のいかなる方法でも用いることが
できる。例えば天然型ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子ＤＮＡ
と変異源となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射によ
る方法などから、蛋白工学的な手法、例えばＰＣＲ法や
部位特異的変異などの方法を用いることができる。ま
た、遺伝子修復機構が欠損されたため、高頻度に遺伝子
に変異が起こる大腸菌を用いた in vivoでの変異の導入
も可能である。本発明で使用したカメレオン site-dire
cted mutagenesisキット（ストラタジーン社製）とは、
(1) 目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性さ
せ、該プラスミドに変異プライマーと選択プライマーと
アニーリングさせる。(2) 次にＤＮＡポリメラーゼでＤ
ＮＡ合成を行った後、ライゲースにてライゲーション反
応を行う。(3) 選択プライマー中に存在しないが、鋳型
となるプラスミドに存在する制限酵素でプラスミドを切
断し、変異の挿入されていないＤＮＡを切断する。(4)
次に残されたプラスミドで大腸菌を形質転換する。(5)
形質転換体から変異プラスミドを調製し、(3),(4) を繰
り返し、目的とする変異の挿入されたプラスミドを得る
方法である。

【００２７】上記のようにして得られた改変ポリメラー
ゼ遺伝子を、例えばｐＬＥＤ−Ｍ１、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔなどのベクターに挿入し、例えば大腸菌に形質転
換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布
し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例え
ばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２
０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出す
る。菌体を破砕する方法は、公知のいかなる手法を用い
てもよく、例えば超音波処理やガラスビール破砕のよう
な物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いる
ことができる。この粗酵素を熱処理、例えば８０℃、３
０分間処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性を測定する。次に３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を測定し、両者の活性比率を天然型
ＫＯＤポリメラーゼを比較することにより、３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性の低下した酵素をスクリーニン
グすることができる。

【００２８】上記方法により選抜された菌株から精製Ｄ
ＮＡポリメラーゼを取得する方法は、公知のいかなる手
法を用いても良く、例えば下記方法がある。栄養培地に
培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理
的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた
粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理
し、その後、硫安沈殿によりＫＯＤポリメラーゼ画分を
回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（フ
ァルマシア・バイオテク）ゲル濾過等の方法により脱塩
を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロース、
ヘパリンセファロースなどのカラムクロマトグラフィー
により分離、精製し、精製酵素標品を得ることができ
る。この精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ
単一のバンドを示す程度に純化される。

【００２９】本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型
ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリ
ヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌ
クレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェート
を共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデ
オキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型
依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。

【００３０】その活性測定法は、酵素活性が高い場合に
は、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発
明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌお
よび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて
攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１
０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液
１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷す
る。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフ
ィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄
し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウ
ンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌ
クレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位は
この条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを
酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。Ａ：４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１６ｍＭ塩化マグネシウム１５ｍＭジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌＢＳＡＢ：２μｇ／μｌ活性化仔牛胸腺ＤＮＡＣ：１．５ｍＭｄＮＴＰ（２５０cpm/pmol〔³Ｈ〕ｄＴＴＰ）Ｄ：２０％トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）Ｅ：１μｇ／μｌキャリアーＤＮＡ

【００３１】本発明において、３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’
−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。その活性測
定法は、５０μｌの反応液（120mM Tris-HCl(pH8.8 at
25℃), 10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム，1mM MgCl₂,
0.1% Triton X-100, 0.001% BSA,5 μg トリチウムラ
ベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンチュ
ーブにに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃
で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、
次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加
え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナ
トリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分
放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を
分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレー
ションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶
性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。

【００３２】本発明において、ＤＮＡ合成速度とは、単
位時間当たりのＤＮＡの合成数をいう。その測定法はＤ
ＮＡポリメラーゼの反応液(20mM Tris-HCl(pH7.5), 8mM
塩化マグネシウム、7.5mM ジチオスレイトール、100 μ
g/ml BSA, 0.1mM dNTP, 0.2μCi [α-³²P]dCTP)を、プ
ライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖Ｄ
ＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止
液（50mM 水酸化ナトリウム、10mM EDTA, 5% フィコー
ル、0.05% ブロモフェノールブルー) を加えることによ
り行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガ
ロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオ
ートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーと
してはラベルしたλ/HindIIIを用いる。このマーカーの
バンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定す
ることによって、ＤＮＡ合成速度を求める。

【００３３】本発明において、熱安定性とは、ｐＨ８．
８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理での
残存活性を意味する。

【００３４】本発明の改変前の耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼは、鹿児島県子宝島にて単離した超好熱始菌の１種で
あるパイロコッカス(Pyrococcus)ｓｐ．ＫＯＤ由来の酵
素である。該酵素を生産するＫＯＤの菌学的性質は、特
開平7-298879号公報に記載される。該酵素は上記菌株を
培養して生産される。該酵素は下記理化学的性質を有す
る。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも１２０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列

【００３５】本発明の核酸増幅法では、上記ＤＮＡポリ
メラーゼ組成物を使用して、ＤＮＡを鋳型とし、プライ
マー、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮ
ＴＰ）を反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプ
ライマー伸長物を合成する方法である。

【００３６】本発明の核酸増幅法の１種であるＰＣＲ法
では、まず、試料中の核酸、特に長鎖核酸が２本鎖であ
る場合には熱により変性させ、１本鎖とする。長鎖核酸
が不完全な鎖分離をすれば、プライマーのアニーリング
および伸長反応を妨げるであろう。次いで該１本鎖を鋳
型として該鋳型に相補的なプライマー、好ましくは１方
が他方のＤＮＡ伸長生成物に相補的であるプライマーお
よびｄＮＴＰを本発明のＤＮＡポリメラーゼ組成物を用
いてＰＣＲ反応液中にて反応させる。

【００３７】反応温度は、２段階の温度サイクルを使用
し、増幅される核酸が変性される高温と変性された核酸
にプライマーがアニールしてプライマー伸長が起こる低
温とを交互に繰り返す。通常、９４℃で０．５〜１分間
→ ６８℃で０．５〜１０分間を２５〜４０回繰り返
す。２つのプライマーは鋳型核酸配列の反対の末端にア
ニールし、そして各プライマーの伸長生成物が鋳型核酸
配列の相補的なコピーであり、かつ、その相補体から分
離された時に他方のプライマーにハイブリダイズするこ
とできるような方向で鋳型核酸にアニールする。反応時
間は、伸長反応が鎖の合成を完結するに十分な時間であ
ることが好ましい。２０ｋｂより長い核酸の増幅には、
少なくとも１０〜２０分間のアニーリングおよび伸長時
間が好ましい。

【００３８】長鎖核酸は増幅の間に分解に対して保護さ
れることが好ましく、例えばグリセロール、ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）などを使用する。

【００３９】誤って取り込まれたヌクレオチドの存在
は、鎖の合成を早々と終わらせ、次の回の増幅に向かう
鋳型鎖の数を減少させ、長鎖核酸の増幅効率を低下させ
てします。しかしながら、本発明ではＤＮＡポリメラー
ゼ活性に加えて、反応液中に少量の３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性が存在することにより、プライマー伸長
生成物の合成の間に誤った取込まれたヌクレオチドを除
去し、なお、優勢的なポリメラーゼ活性により完全な鎖
合成を可能とする。

【００４０】反応緩衝液のｐＨと組成、塩（２価イオン
および１価イオン）ならびにプライマーの設計は、長鎖
核酸の増幅効率にとって重要である。ＰＣＲ試薬の調製
は、通常、変性段階前の室温で行うから、別なプライマ
ーや一部の相同な核酸配列へのプライマーの結合を引き
起こすことがある。この非特異的なプライマーの結合か
らも伸長生成物が形成されると、長鎖生成物の増幅効率
を減少させることになる。このような特異的結合を防ぐ
ためには、高温になってから、酵素を添加するなどのい
わゆるホットスタート法が好ましい。

【００４１】本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その活性
を維持するために、２価イオン、例えばマグネシウムイ
オンおよび１価イオン、例えばアンモニウムイオンおよ
び／またはカリウムイオンを共存させることが好まし
い。また、核酸増幅用反応液には、緩衝液およびこれら
のイオンを含むともに、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤、
例えばTriton X-100および緩衝液が存在していてもよ
い。

【００４２】本発明の核酸増幅用試薬は、１方のプライ
マーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的で
ある２種のプライマー、ｄＮＴＰおよび上記ＤＮＡポリ
メラーゼ組成物、マグネシウムイオンおよびアンモニウ
ムイオンおよび／またはカリウムイオン、ＢＳＡおよび
非イオン界面活性剤および緩衝液を含む。本発明では、
第２ＤＮＡポリメラーゼの活性は、第１ＤＮＡポリメラ
ーゼの活性よりも小さいことが好ましく、第１ＤＮＡポ
リメラーゼ２．５単位につき、第２ＤＮＡポリメラーゼ
が０．０２〜０．１単位であることが好ましい。本発明
の試薬には必要により、補助溶解剤、例えばグリセリ
ン、ＤＭＳＯ、ポリエチレングリコールなどを含んでい
てもよい。

【００４３】緩衝液としては、Ｔｒｉｓ緩衝液、トリス
（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン緩衝
液）、Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）グリシン（バイシ
ン緩衝液）などが使用される。最適の緩衝液およびｐＨ
は使用するＤＮＡポリメラーゼに依存する。本発明では
ＫＯＤポリメラーゼおよび該酵素の変異体を使用する場
合は、ｐＨ７．５〜９．２（２５℃において、１０ｍＭ
〜５０ｍＭ、好ましくは２０〜１２０ｍＭである。２価
カチオンはマグネシウムイオンが好ましく、塩化マグネ
シウムなどが使用される。その濃度は１〜２ｍＭである
ことが好ましい。１価カチオンはアンムニウムイオンま
たはカリウムイオンが好ましく、硫酸アンモニウム、グ
ルタミン酸カリウム、酢酸カリウムなどが使用される。
それらの濃度は２〜５０ｍＭであることが好ましい。プ
ライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、１方は
他方のＤＮＡ伸長生成物に相補的であるプライマーであ
ることが好ましい。その濃度は、０．２〜１μＭである
ことが好ましい。

【００４４】次に、実施例を用いて本発明を詳細に説明
する。参考例１超好熱始原菌ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の
クローニング鹿児島県子宝島にて単離した超好熱始原菌ＫＯＤ１株を
９５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から
常法に従い、超好熱始原菌ＫＯＤ株の染色体ＤＮＡを調
製した。パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furi
osus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ) の
保存領域アミノ酸配列に基づき、２種のプライマー(5'-
GGATTAGTATAGTGCCAATGGSSGGCGA-3' および5'-GAGGGCAGA
AGTTTATTCCGAGCTT-3')を合成した。この２種のプライマ
ーを使用し、調製したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応
を行った。

【００４５】ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定
し、アミノ酸配列を決定した後、この増幅ＤＮＡ断片を
プローブとして、ＫＯＤ１株染色体ＤＮＡ制限酵素処理
産物に対してサザンハイブリダイゼーションを行い、Ｄ
ＮＡポリメラーゼをコードする断片のサイズを求めた
（約４〜７Ｋｂｐ）。さらに、この大きさのＤＮＡ断片
をアガロースゲルから回収し、プラスミドｐＢＳ（スト
ラタジーン社製）に挿入し、これらの混合物より大腸菌
(E.coli JM109)を形質転換して、ライブラリーを作製し
た。サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブ
を用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行い、上
記ライブラリーから、ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子を含有すると考えられるクローン株(E.coli
JM109/pSBKOD1)を取得した。

【００４６】取得したクローン株、(E.coli JM109/pSBK
OD1)よりプラスミド、ｐＳＢＫＯＤ１を回収し、常法に
従い、塩基配列を決定した。さらに求められた塩基配列
からアミノ酸配列を推定した。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子は５０１０塩基からなり、１６７０
個のアミノ酸がコードされていた（配列番号１）。

【００４７】完全なポリメラーゼ遺伝子を作成するた
め、２箇所の介在配列（１３７４〜２４５３ｂｐ：２７
０８〜４３１６ｂｐ）をＰＣＲ融合法により取り除い
た。ＰＣＲ融合法では、クローン株より回収したプラス
ミドを鋳型に、３組のプライマーを組み合わせて、各々
ＰＣＲを行い、介在配列を除いた３断片を増幅した。こ
の際、ＰＣＲに用いるプライマーは、他の断片と結合す
る側に結合相手と同様な配列がくるように設計した。ま
た、両端には別々な制限酵素サイト（Ｎ末端側：Ｅｃｏ
ＲＶ、Ｃ末端側：ＢａｍＨＩ）が創出されるように設計
した。次いで、ＰＣＲ増幅断片中、構造上中央に位置す
る断片と、Ｎ末端側に位置する断片を混合し、ＰＣＲを
各々の断片をプライマーとして行った。また、同様に構
造上、中央に位置する断片と、Ｃ末端側に位置する断片
を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行っ
た。このようにして得られた２種の断片を用いて再度Ｐ
ＣＲを行い、介在配列が取り除かれ、Ｎ末端にＥｃｏＲ
Ｖ、Ｃ末端にＢａｍＨＩサイトを有するＫＯＤ１株由来
のＤＮＡポリメラーゼをコードする完全な形の遺伝子断
片を取得した。更に、同遺伝子をＴ７プロモーターで誘
導可能な発現ベクター、ｐＥＴ−８ｃのＮｃｏＩ／Ｂａ
ｍＨＩサイト、先に創出した制限酵素サイトを利用し、
サブクローニングして、組換え発現ベクター（ｐＥＴ−
ｐｏｌ）を得た。なお、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ
３）／ｐＥＴ−ｐｏｌは、生命工学工業研究所へ寄託さ
れている（ＦＥＲＭＢＰ−５５１３）。

【００４８】参考例２ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子のサブクローニング耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを改変するために、プラスミ
ドｐＥＴ−ｐｏｌからＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を切り
出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし
た。すなわちｐＥＴ−ｐｏｌを制限酵素、ＸｂａＩとＢ
ａｍＨＩ（東洋紡製）で切断し、約２．３ｋｂのＫＯＤ
ポリメラーゼ遺伝子を切り出した。次にこのＤＮＡ断片
をライゲーションキット（東洋紡製 Ligation high) を
用いて、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）と連結した。次に、
市販のコンピテントセル（東洋紡製 competent high JM
109)を用いて形質転換を行った。１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含んだＬＢ寒天培地（１％バクトトリプト
ン、０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナ
トリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）で３５℃で１６
時間培養し、得られたコロニーからプラスミドを調製し
た。さらに、部分塩基配列を確認してＫＯＤポリメラー
ゼ遺伝子を含むプラスミドｐＫＯＤ１を得た。

【００４９】参考例３改変型遺伝子（ＤＡ）の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（ＤＡ）の精製参考例２で得られたプラスミドｐＫＯＤ１を用いて、配
列表２に記載のＫＯＤポリメラーゼの１４１番目のアス
パラギン酸をアラニンに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子を持つプラスミドを作製した（ｐＫＯ
ＤＤＡ）。作製はカメレオン site-directed mutagenes
isキット（ストラタジーン社製）を用いた。方法は取扱
説明書に準じて行った。選択プライマーとしては配列番
号４に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは
配列番号７に記載のプライマーを用いた。なお、変異体
の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミド
で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＪＭ１０９（ｐＫＯ
ＤＤＡ）を得た。

【００５０】滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含んだＴＢ培地（MolecularCloning、ｐ．Ａ．２
に記載）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注し
た。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含んだ５０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、
０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリ
ウム、ギブコ社製）で３０℃、１６時間培養した大腸菌
ＪＭ１０９（ｐＫＯＤＤＡ）（５００ｍｌ坂口フラスコ
使用）を接種し、３５℃で１２時間通気攪拌培養した。
培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００ｍｌの
破砕緩衝液（10mMTris-HCl(pH8.0), 80mM KCl, 5mM 2-
メルカプトエタノール、1mM EDTA) に懸濁後、超音波処
理によって菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細
胞破砕液を８５℃にて３０分処理した後、遠心分離にて
不溶性画分を除去した。さらにポリエチレンイミンを用
いた除核酸処理、硫安分画、ヘパリンセファロースクロ
マトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（50mM Tris-
HCl (pH8.0), 50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイト
ール、0.1% Tween20, 0.1%ノニデットP40, 50%グリセリ
ン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ
Ａ）を得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測
定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合に
は、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行った。

【００５１】（試薬）Ａ：４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１６ｍＭ塩化マグネシウム１５ｍＭジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌＢＳＡＢ：２μｇ／μｌ活性化仔牛胸腺ＤＮＡＣ：１．５ｍＭｄＮＴＰ（２５０cpm/pmol〔³Ｈ〕ｄＴＴＰ）Ｄ：２０％トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）Ｅ：１μｇ／μｌキャリアーＤＮＡ

【００５２】（方法）Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各
５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブ
に加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７
５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μ
ｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間
氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ
／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分
洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーション
カウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへ
のヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単
位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチ
ドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。

【００５３】参考例４変異体（ＥＡ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの精製参考例３と同様の方法にて、配列表２に記載のＫＯＤポ
リメラーゼの１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置
換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプ
ラスミドを作製した（ｐＫＯＤＥＡ）。選択プライマー
としては配列番号５に記載のプライマーを使用した。変
異プライマーは配列番号８に記載のプライマーを用い
た。更に参考例３同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮ
Ａポリメラ−ゼ（ＥＡ）を得た。

【００５４】参考例５変異体（ＤＥＡ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼの精製参考例３と同様の方法にて配列表２に記載のＫＯＤポリ
メラーゼの１４１番目のアスパラギン酸及び１４３番目
のグルタミン酸をアラニンに置換した改変型耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミドを作製した（ｐ
ＫＯＤＤＥＡ）。選択プライマーとしては配列番号４に
記載のプライマーを使用した。変異プライマーは配列番
号６に記載のプライマーを用いた。更に参考例３と同様
の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＤＥ
Ａ）を得た。

【００５５】参考例６変異体（ＮＤ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの精製参考例３と同様の方法にて、配列表２に記載のＫＯＤポ
リメラーゼの２１０番目のアスパラギンをアスパラギン
酸に置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を
持つプラスミドを作製した（ｐＫＯＤＮＤ）。選択プラ
イマーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用し
た。変異プライマーは配列番号９に記載のプライマーを
用いた。更に参考例３と同様の精製方法にて改変型耐熱
性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＮＤ）を得た。

【００５６】参考例７変異体（ＹＦ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの精製参考例３と同様の方法にて配列表２に記載のＫＯＤポリ
メラーゼの３１１番目のチロシンをフェニルアラニンに
置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つ
プラスミドを作製した（ｐＫＯＤＹＦ）。選択プライマ
ーとしては配列番号４に記載のプライマーを使用した。
変異プライマーは配列番号１０に記載のプライマーを用
いた。更に参考例３と同様の精製方法にて改変型耐熱性
ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＹＦ）を得た。

【００５７】参考例８改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ
活性の確認上記参考例３〜７で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ（ＤＡ、ＥＡ、ＤＥＡ、ＮＤおよびＹＦ）のエキ
ソヌクレアーゼ活性を以下の方法にて測定した。対照と
して、天然型のＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）を用い
た。５０μｌの反応液（120mM Tris-HCl(pH8.8 at 25
℃), 10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム，1mM MgCl₂,
0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 μg トリチウムラ
ベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンチュ
ーブにに分注し、ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ２５単
位、５０単位、１００単位加えた。なお、天然型のＫＯ
Ｄポリメラーゼは０．２５単位、０．５単位、１単位用
いた。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反
応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡ
を５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％
ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合した。
氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間
遠心し沈殿を分離した。上清１００μｌの放射活性を液
体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計
測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定し
た。図１に各ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性と
ＤＮＡの分解率を示した。この結果では改変型耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（ＤＥＡ、ＤＡ、ＥＡ）の３種類のポ
リメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性が検出できなかっ
た。また、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＤ）は
天然型のＫＯＤポリメラーゼの約０．１％、改変型耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ（ＹＦ）は約０．０１％のエキソ
ヌクレアーゼ活性を示した。

【００５８】参考例９熱安定性の確認参考例３〜７で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ（ＤＡ、ＥＡ、ＤＥＡ、ＮＤおよびＹＦ）の熱安定性
を以下の方法にて測定した。精製した改変型ＤＮＡポリ
メラーゼ５単位を１００μｌの緩衝液（20mMTris-HCl
pH8.8 at 25 ℃、10mM塩化カリウム，10mM 硫酸アンモ
ニウム，2mM 硫酸マグネシウム, 0.1% Triton X-100,
0.1mg/ml BSA, 5mM 2- メルカプトエタノール）に混合
し、９５℃でプレインキュベートとした。この混合液か
ら経時的に試料を採取し、参考例３記載の方法にてポリ
メラーゼ活性を測定した。比較として、Ｔａｑポリメラ
ーゼ（東洋紡製）およびび天然型ＫＯＤポリメラーゼ
（東洋紡製）も同様の操作を行った。図２に示したよう
に、いずれの改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼも天然型
ＫＯＤポリメラーゼと同様に、９５℃、６時間の処理で
６０％以上の残存活性を示した。それに対してＴａｑポ
リメラーゼは１５％以下の残存活性であった。

【００５９】参考例１０ＤＮＡ合成速度測定参考例３〜７で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ（ＤＡ、ＥＡ、ＤＥＡ、ＮＤおよびＹＦ）のＤＮＡ合
成速度を以下の方法で測定した。精製した改変型ＤＮＡ
ポリメラーゼ１単位を１０μｌの反応液(20mM Tris-HCl
(pH7.5), 8mM塩化マグネシウム, 7.5mM ジチオスレイト
ール, 100 μg/ml BSA, 0.1mM dNTP, 0.2 μCi [α-
³²P]dCTP)で０．２μｇの配列番号１５のプライマーを
アニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５
℃で２０秒、４０秒、６０秒間反応させた。反応停止は
等量の反応停止液（50mM 水酸化ナトリウム，10mM EDT
A, 5%フィコール, 0.05% ブロモフェノールブルー) を
加えることにより行った。比較としてＴａｑポリメラー
ゼ（東洋紡製）および天然型のＫＯＤポリメラーゼ（東
洋紡製）も同様の操作を行った。

【００６０】上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリ
アガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥さ
せオートラジオグラフィーを行った。ＤＮＡサイズマー
カーとしてはラベルしたλ/HindIIIを用いた。このマー
カーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを
測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求めた。その
結果、いずれの改変型ポリメラーゼも天然型のＫＯＤポ
リメラーゼと同様に、約１２０塩基／秒の合成速度を有
していた。それに対してＴａｑポリメラーゼは約６０塩
基／秒の合成速度であった。

【００６１】参考例１１改変型遺伝子（ＩＮ）の作製および改変型耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼの精製参考例２で得られたプラスミドｐＫＯＤ１を用いて、Ｋ
ＯＤポリメラーゼのＥＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂
ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₂のイソロイシンをアスパラ
ギンに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
をもつプラスミドを作製した（ｐＫＯＤＩＮ）。作製は
カメレオンsite-directed mutagenesis キット（ストラ
タジーン社製）を用いた。方法は取扱説明書に準じて行
った。選択プライマーとしては配列番号14に記載のプラ
イマーを使用した。変異プライマーは配列番号15に記載
のプライマーを用いた。なお、変異体の確認は塩基配列
の解読で行った。得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換し、ＪＭ１０９（ｐＫＯＤＩＮ）を得た。

【００６２】滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含んだＴＢ培地（MolecularCloning、ｐ．Ａ．２
に記載）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注し
た。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを
含んだ５０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、
０．５％イーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリ
ウム、ギブコ社製）で３０℃、１６時間培養した大腸菌
ＪＭ１０９（ｐＫＯＤＩＮ）（５００ｍｌ坂口フラスコ
使用）を接種し、３５℃で１２時間通気攪拌培養した。
培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００ｍｌの
破砕緩衝液（10mMTris-HCl(pH8.0), 80mM KCl, 5mM 2-
メルカプトエタノール、1mM EDTA) に懸濁後、超音波処
理によって菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細
胞破砕液を８５℃にて３０分処理した後、遠心分離にて
不溶性画分を除去した。さらにポリエチレンイミンを用
いた除核酸処理、硫安分画、ヘパリンセファロースクロ
マトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris-H
Cl(pH8.0), 50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトー
ル、0.1% Tween20, 0.1%ノニデットP40, 50%グリセリ
ン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｉ
Ｎ）を得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測
定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合に
は、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行った。

【００６３】（試薬）Ａ：４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１６ｍＭ塩化マグネシウム１５ｍＭジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌＢＳＡＢ：２μｇ／μｌ活性化仔牛胸腺ＤＮＡＣ：１．５ｍＭｄＮＴＰ（２５０cpm/pmol〔³Ｈ〕ｄＴＴＰＤ：２０％トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）Ｅ：１μｇ／μｌキャリアーＤＮＡ

【００６４】（方法）Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各
５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブ
に加えて攪拌混合後、上記熱処理液５μｌを加えて７５
℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μ
ｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後さらに１０分間氷
冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／
Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗
浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカ
ウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへの
ヌクレオチドの取り込みを測定した酵素活性の１単位は
この条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを
酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。

【００６５】参考例１２変異体（ＩＥ）遺伝子の作製および改変型耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼの精製参考例１１と同様の方法にて、ＫＯＤポリメラーゼのＥ
ＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのう
ち、Ｘ₂のイソロイシンをグルタミン酸に置換した耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩ
Ｅ）。選択プライマーとしては配列番号14に記載のプラ
イマーを使用した。変異プライマーは配列番号16に記載
のプライマーを用いた。更に、参考例１１と同様の精製
方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＥ）を得
た。

【００６６】参考例１３変異体（ＩＱ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの精製参考例１１と同様の方法にて、ＫＯＤポリメラーゼのＥ
ＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのう
ち、Ｘ₂のイソロイシンをグルタミンに置換した耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩ
Ｑ）。選択プライマーとしては配列番号14に記載のプラ
イマーを使用した。変異プライマーは配列番号17に記載
のプライマーを用いた。更に、参考例１１と同様の精製
方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＱ）を得
た。

【００６７】参考例１４変異体（ＩＤ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの精製参考例１１と同様の方法にて、ＫＯＤポリメラーゼのＥ
ＸＯ１領域に存在するＸ₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのう
ち、Ｘ₂のイソロイシンをアスパラギン酸に置換した耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製した（ｐＫＯＤＩ
Ｄ）。選択プライマーとしては配列番号14に記載のプラ
イマーを使用した。変異プライマーは配列番号18に記載
のプライマーを用いた。更に、参考例１１と同様の精製
方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＩＤ）を得
た。

【００６８】参考例１５変異体（ＴＶ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの精製参考例１１と同様の方法にてＥＸ０１領域に存在するＸ
₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₃のチロシンをバリ
ンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を作製し
た（ｐＫＯＤＴＶ））。選択プライマーとしては配列番
号14に記載のプライマーを使用した。変異プライマーは
配列番号19に記載のプライマーを用いた。更に、参考例
１１と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ
−ゼ（ＴＶ）を得た。

【００６９】参考例１６変異体（ＩＫ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの精製参考例１１と同様の方法にてＥＸＯ１領域に存在するＸ
₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのＸのうち、Ｘ₂のイソロイシ
ンをリジンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
を作製した（ｐＫＯＤＩＫ）。選択プライマーとしては
配列番号14に記載のプライマーを使用した。変異プライ
マーは配列番号21に記載のプライマーを用いた。更に、
参考例１１と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラ−ゼ（ＩＫ）を得た。

【００７０】参考例１７変異体（ＩＲ）遺伝子の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼの精製参考例１１と同様の方法にてＥＸＯ１領域に存在するＸ
₁ＤＸ₂ＥＸ₃モチーフのＸのうち、Ｘ₂のイソロイシ
ンをアルギニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子を作製した（ｐＫＯＤＩＲ）。選択プライマーとし
ては配列番号14に記載のプライマーを使用した。変異プ
ライマーは配列番号20に記載のプライマーを用いた。更
に、参考例１１と同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮ
Ａポリメラ−ゼ（ＩＲ）を得た。

【００７１】参考例１８改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ
活性の確認上記参考例１１〜１７で得られた改変型耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（ＩＮ、ＩＥ、ＩＱ、ＩＤ、ＹＶ、ＩＫおよ
びＩＲ）のエキソヌクレアーゼ活性を以下の方法にて測
定した。対照として、天然型のＫＯＤポリメラーゼ（東
洋紡製）を用いた。５０μｌの反応液（120mM Tris-HCl
(pH8.8 at 25℃), 10mM KCl, 6mM 硫酸アンモニウム,
1mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5μg ト
リチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエ
ッペンチューブにに分注し、上記ＤＮＡポリメラーゼを
それぞれ０．５ユニット、１ユニット、１．５ユニット
加えて、７５℃で１０分間反応させた。氷冷によって反
応を停止し、次にキャリアーとして０．１％のＢＳＡを
５０ｍｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、2%ピロ
リン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合した。氷上
で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心
し沈殿を分離した。上清１００μｌの放射活性を液体シ
ンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測
し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定し
た。

【００７２】図５に各ＤＮＡポリメラーゼのポリメラー
ゼ活性とＤＮＡの分解率を示した。更に天然型のＫＯＤ
ポリメラーゼとのエキソヌクレアーゼ活性の比を図６に
示した。このように本発明によれば様々な強さの３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼが得られることを示した。天然型のＫＯＤポリ
メラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対し
て、ＩＮは約９５％、ＩＥは約７６％、ＩＱは約６４
％、ＩＤは約５２％、ＴＶは約４８％、ＩＫは約３０
％、ＩＲは約０％の同活性を有していた。

【００７３】参考例１１改変型ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲでのＤＮＡ合成の正
確性の測定天然型のＫＯＤポリメラーゼ、改変型耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼＩＥ、ＩＤ、ＩＫ、ＩＲおよびＴａｑポリメラ
ーゼについて、ＰＣＲでのＤＮＡ合成の正確性を以下の
方法にて測定した。プラスミドｐＵＲ２８８（Current
Protocols in Molecular Biology 1.5.6に記載）を制限
酵素ＳｃａＩで切断した。このプラスミドを１ｎｇ用い
てＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液につい
てアガロースゲル電気泳動を行い、約5.３kbのターゲッ
トの増幅を確認した。残りの反応液をフェノール／クロ
ロホルム処理し、次にエタノール沈殿を行った。沈殿を
乾燥後５０μｌのＨｉｇｈバッファー（50mM Tris-HCl
(pH7.5),100mM NaCl,10mM MgCl₂, 1mM DTT)に溶解し
た。さらに制限酵素ＳｃａＩ（東洋紡製）を１０ユニッ
ト加えて、３７℃で１６時間反応させた。アガロースゲ
ル電気泳動にて目的の増幅産物を分離し、その部分のア
ガロースを切り出した。このアガロースからジーンクリ
ーン２（BIO101社製）を用いてＤＮＡを精製した。精製
したＤＮＡ１０ｎｇを１０μｌになるようにＴＥバッフ
ァー（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA) で希釈し、ラ
イゲーションキット（東洋紡製Ｌｉｇａｔｉｏｎｈ
ｉｇｈ）の反応液１０μｌを加えて１６℃で３０分間反
応した。次に市販のコンピーテントセル（東洋紡製 co
mpetent high JM109) を用いて形質転換を行った。

【００７４】１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭ
のイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（IPTG、ナカラ
イテスク社製）、０．７％の５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ
（ナカライテスク社製））を含んだＬＢ寒天培地（１％
バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、
０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ギブコ社製）
で３５℃で１６時間培養し、コロニーをカウントした。
ｐＵＲ２８８にはｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダー
ゼ）が存在する。従って、ＰＣＲ中のＤＮＡ合成が正確
に行われた場合、上記寒天培地では青いコロニーを形成
する。逆にＤＮＡ合成中に誤りが起こり、ｌａｃＺ遺伝
子のコードするβ−ガラクトシダーゼ活性が低下あるい
は欠失した場合、薄い青色ないしは白色のコロニーを形
成する。この薄い青コロニーと白コロニーを変異コロニ
ーとして、各酵素を用いた場合の変異率（％）を表１に
示した。

【００７５】

【表１】

【００７６】表１から明らかなように、本発明で得られ
た改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＥ、ＩＤ、ＩＫ、
ＩＲは、天然型のＫＯＤポリメラーゼには劣るものの、
Ｔａｑポリメラーゼより変異率が低く、すなわちＤＮＡ
合成の正確性が高かった。

【００７７】実施例１ＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いたＰＣＲ（ヒトゲノ
ム）改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＡ、ＥＡ、ＤＥ
Ａ、ＮＤ、ＹＦ）と天然型ＫＯＤポリメラーゼの混合物
を用いてＰＣＲを行った。５０ｍｌの反応液（120mM Tr
is-HCl(pH8.8 at 25℃), 10mM KCl, 6mM硫酸アンモニウ
ム、1mM MgCl_2, 0.2mM dNTP, 0.1% Triton X-100, 0.00
1% BSA, 30ngのヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡ（クローン
テック社製）、１０ピコモルの配列表１１、１２記載の
プライマー）にＮＤを２．５単位、ＫＯＤポリメラーゼ
を０．０５単位加えてＰＣＲ反応を行った。サーマルサ
イクラーはパーキンエルマー社製のモデルＰＪ２０００
を用いた。また反応条件は９４℃、３０秒→６８℃、３
分を３０サイクル行った。比較として改変型耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ（ＮＤ）、Ｔａｑポリメラーゼ（東洋紡
製）、市販のＤＮＡポリメラーゼ混合物（ＥｘＴａｑ
（宝酒造社製）およびアドバンテージＴｔｈ（クローン
テック社製）も同様にして、ＰＣＲ反応を行った。ただ
し、反応液組成は市販品に添付されている緩衝液を用
い、ゲノムＤＮＡ及びプライマーは全て上記と同量用い
た。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロースゲ
ル電気泳動を行い、約４ｋｂのターゲットの増幅を確認
した。図３にアガロースゲル電気泳動の結果を示した。
この結果、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＤ）と
天然型ＫＯＤポリメラーゼの混合物を用いて、ＰＣＲを
行った場合、市販のポリメラーゼ混合物に比べて良好な
増幅であった。

【００７８】

【発明の効果】本発明では、３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性とポリメラーゼ活性の両方を使用することによ
り、増幅可能な鋳型核酸の長さを大きく増大させること
ができる。また、熱安定性やＤＮＡ合成速度がほぼ同じ
であって、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のみが異
なる２種以上のＤＮＡポリメラーゼの混合物を用いるこ
とにより、増幅効率の優れた核酸増幅を行うことができ
る。

【００７９】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：5342 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic ＤＮＡ起源：超好熱始原菌株名：ＫＯＤ１配列の特徴１５６−５１６５ＰＣＤＳ１３７４−２４５３介在配列２７０８−４３１６介在配列配列 GCTTGAGGGC CTGCGGTTAT GGGACGTTGC AGTTTGCGCC TACTCAAAGA TGCCGGTTTT 60 ATAACGGAGA AAAATGGGGA GCTATTACGA TCTCTCCTTG ATGTGGGGTT TACAATAAAG 120 CCTGGATTGT TCTACAAGAT TATGGGGGAT GAAAG ATG ATC CTC GAC ACT GAC 173 Met Ile Leu Asp Thr Asp 1 5 TAC ATA ACC GAG GAT GGA AAG CCT GTC ATA AGA ATT TTC AAG AAG GAA 221 Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile Arg Ile Phe Lys Lys Glu 10 15 20 AAC GGC GAG TTT AAG ATT GAG TAC GAC CGG ACT TTT GAA CCC TAC TTC 269 Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg Thr Phe Glu Pro Tyr Phe 25 30 35 TAC GCC CTC CTG AAG GAC GAT TCT GCC ATT GAG GAA GTC AAG AAG ATA 317 Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile Glu Glu Val Lys Lys Ile 40 45 50 ACC GCC GAG AGG CAC GGG ACG GTT GTA ACG GTT AAG CGG GTT GAA AAG 365 Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr Val Lys Arg Val Glu Lys 55 60 65 70 GTT CAG AAG AAG TTC CTC GGG AGA CCA GTT GAG GTC TGG AAA CTC TAC 413 Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Trp Lys Leu Tyr 75 80 85 TTT ACT CAT CCG CAG GAC GTC CCA GCG ATA AGG GAC AAG ATA CGA GAG 461 Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile Arg Asp Lys Ile Arg Glu 90 95 100 CAT GGA GCA GTT ATT GAC ATC TAC GAG TAC GAC ATA CCC TTC GCC AAG 509 His Gly Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys 105 110 115 CGC TAC CTC ATA GAC AAG GGA TTA GTG CCA ATG GAA GGC GAC GAG GAG 557 Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu 120 125 130 CTG AAA ATG CTC GCC TTC GAC ATT GAA ACT CTC TAC CAT GAG GGC GAG 605 Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu 135 140 145 150 GAG TTC GCC GAG GGG CCA ATC CTT ATG ATA AGC TAC GCC GAC GAG GAA 653 Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu 155 160 165 GGG GCC AGG GTG ATA ACT TGG AAG AAC GTG GAT CTC CCC TAC GTT GAC 701 Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val Asp Leu Pro Tyr Val Asp 170 175 180 GTC GTC TCG ACG GAG AGG GAG ATG ATA AAG CGC TTC CTC CGT GTT GTG 749 Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg Val Val 185 190 195 AAG GAG AAA GAC CCG GAC GTT CTC ATA ACC TAC AAC GGC GAC AAC TTC 797 Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe 200 205 210 GAC TTC GCC TAT CTG AAA AAG CGC TGT GAA AAG CTC GGA ATA AAC TTC 845 Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu Lys Leu Gly Ile Asn Phe 215 220 225 230 GCC CTC GGA AGG GAT GGA AGC GAG CCG AAG ATT CAG AGG ATG GGC GAC 893 Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys Ile Gln Arg Met Gly Asp 235 240 245 AGG TTT GCC GTC GAA GTG AAG GGA CGG ATA CAC TTC GAT CTC TAT CCT 941 Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr Pro 250 255 260 GTG ATA AGA CGG ACG ATA AAC CTG CCC ACA TAC ACG CTT GAG GCC GTT 989 Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val 265 270 275 TAT GAA GCC GTC TTC GGT CAG CCG AAG GAG AAG GTT TAC GCT GAG GAA 1037 Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Glu Glu 280 285 290 ATA ACA CCA GCC TGG GAA ACC GGC GAG AAC CTT GAG AGA GTC GCC CGC 1085 Ile Thr Pro Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn Leu Glu Arg Val Ala Arg 295 300 305 310 TAC TCG ATG GAA GAT GCG AAG GTC ACA TAC GAG CTT GGG AAG GAG TTC 1133 Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe 315 320 325 CTT CCG ATG GAG GCC CAG CTT TCT CGC TTA ATC GGC CAG TCC CTC TGG 1181 Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu Ile Gly Gln Ser Leu Trp 330 335 340 GAC GTC TCC CGC TCC AGC ACT GGC AAC CTC GTT GAG TGG TTC CTC CTC 1229 Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu Leu 345 350 355 AGG AAG GCC TAT GAG AGG AAT GAG CTG GCC CCG AAC AAG CCC GAT GAA 1277 Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro Asp Glu 360 365 370 AAG GAG CTG GCC AGA AGA CGG CAG AGC TAT GAA GGA GGC TAT GTA AAA 1325 Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr Glu Gly Gly Tyr Val Lys 375 380 385 390 GAG CCC GAG AGA GGG TTG TGG GAG AAC ATA GTG TAC CTA GAT TTT AGA 1373 Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile Val Tyr Leu Asp Phe Arg 395 400 405 TGC CAT CCA GCC GAT ACG AAG GTT GTC GTC AAG GGG AAG GGG ATT ATA 1421 Cys His Pro Ala Asp Thr Lys Val Val Val Lys Gly Lys Gly Ile Ile 410 415 420 AAC ATC AGC GAG GTT CAG GAA GGT GAC TAT GTC CTT GGG ATT GAC GGC 1469 Asn Ile Ser Glu Val Gln Glu Gly Asp Tyr Val Leu Gly Ile Asp Gly 425 430 435 TGG CAG AGA GTT AGA AAA GTA TGG GAA TAC GAC TAC AAA GGG GAG CTT 1517 Trp Gln Arg Val Arg Lys Val Trp Glu Tyr Asp Tyr Lys Gly Glu Leu 440 445 450 GTA AAC ATA AAC GGG TTA AAG TGT ACG CCC AAT CAT AAG CTT CCC GTT 1565 Val Asn Ile Asn Gly Leu Lys Cys Thr Pro Asn His Lys Leu Pro Val 455 460 465 470 GTT ACA AAG AAC GAA CGA CAA ACG AGA ATA AGA GAC AGT CTT GCT AAG 1613 Val Thr Lys Asn Glu Arg Gln Thr Arg Ile Arg Asp Ser Leu Ala Lys 475 480 485 TCT TTC CTT ACT AAA AAA GTT AAG GGC AAG ATA ATA ACC ACT CCC CTT 1661 Ser Phe Leu Thr Lys Lys Val Lys Gly Lys Ile Ile Thr Thr Pro Leu 490 495 500 TTC TAT GAA ATA GGC AGA GCG ACA AGT GAG AAT ATT CCA GAA GAA GAG 1709 Phe Tyr Glu Ile Gly Arg Ala Thr Ser Glu Asn Ile Pro Glu Glu Glu 505 510 515 GTT CTC AAG GGA GAG CTC GCT GGC ATA CTA TTG GCT GAA GGA ACG CTC 1757 Val Leu Lys Gly Glu Leu Ala Gly Ile Leu Leu Ala Glu Gly Thr Leu 520 525 530 TTG AGG AAA GAC GTT GAA TAC TTT GAT TCA TCC CGC AAA AAA CGG AGG 1805 Leu Arg Lys Asp Val Glu Tyr Phe Asp Ser Ser Arg Lys Lys Arg Arg 535 540 545 550 ATT TCA CAC CAG TAT CGT GTT GAG ATA ACC ATT GGG AAA GAC GAG GAG 1853 Ile Ser His Gln Tyr Arg Val Glu Ile Thr Ile Gly Lys Asp Glu Glu 555 560 565 GAG TTT AGG GAT CGT ATC ACA TAC ATT TTT GAG CGT TTG TTT GGG ATT 1901 Glu Phe Arg Asp Arg Ile Thr Tyr Ile Phe Glu Arg Leu Phe Gly Ile 570 575 580 ACT CCA AGC ATC TCG GAG AAG AAA GGA ACT AAC GCA GTA ACA CTC AAA 1949 Thr Pro Ser Ile Ser Glu Lys Lys Gly Thr Asn Ala Val Thr Leu Lys 585 590 595 GTT GCG AAG AAG AAT GTT TAT CTT AAA GTC AAG GAA ATT ATG GAC AAC 1997 Val Ala Lys Lys Asn Val Tyr Leu Lys Val Lys Glu Ile Met Asp Asn 600 605 610 ATA GAG TCC CTA CAT GCC CCC TCG GTT CTC AGG GGA TTC TTC GAA GGC 2045 Ile Glu Ser Leu His Ala Pro Ser Val Leu Arg Gly Phe Phe Glu Gly 615 620 625 630 GAC GGT TCA GTA AAC AGG GTT AGG AGG AGT ATT GTT GCA ACC CAG GGT 2093 Asp Gly Ser Val Asn Arg Val Arg Arg Ser Ile Val Ala Thr Gln Gly 635 640 645 ACA AAG AAC GAG TGG AAG ATT AAA CTG GTG TCA AAA CTG CTC TCC CAG 2141 Thr Lys Asn Glu Trp Lys Ile Lys Leu Val Ser Lys Leu Leu Ser Gln 650 655 660 CTT GGT ATC CCT CAT CAA ACG TAC ACG TAT CAG TAT CAG GAA AAT GGG 2189 Leu Gly Ile Pro His Gln Thr Tyr Thr Tyr Gln Tyr Gln Glu Asn Gly 665 670 675 AAA GAT CGG AGC AGG TAT ATA CTG GAG ATA ACT GGA AAG GAC GGA TTG 2237 Lys Asp Arg Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Ile Thr Gly Lys Asp Gly Leu 680 685 690 ATA CTG TTC CAA ACA CTC ATT GGA TTC ATC AGT GAA AGA AAG AAC GCT 2285 Ile Leu Phe Gln Thr Leu Ile Gly Phe Ile Ser Glu Arg Lys Asn Ala 695 700 705 710 CTG CTT AAT AAG GCA ATA TCT CAG AGG GAA ATG AAC AAC TTG GAA AAC 2333 Leu Leu Asn Lys Ala Ile Ser Gln Arg Glu Met Asn Asn Leu Glu Asn 715 720 725 AAT GGA TTT TAC AGG CTC AGT GAA TTC AAT GTC AGC ACG GAA TAC TAT 2381 Asn Gly Phe Tyr Arg Leu Ser Glu Phe Asn Val Ser Thr Glu Tyr Tyr 730 735 740 GAG GGC AAG GTC TAT GAC TTA ACT CTT GAA GGA ACT CCC TAC TAC TTT 2429 Glu Gly Lys Val Tyr Asp Leu Thr Leu Glu Gly Thr Pro Tyr Tyr Phe 745 750 755 GCC AAT GGC ATA TTG ACC CAT AAC TCC CTG TAC CCC TCA ATC ATC ATC 2477 Ala Asn Gly Ile Leu Thr His Asn Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile 760 765 770 ACC CAC AAC GTC TCG CCG GAT ACG CTC AAC AGA GAA GGA TGC AAG GAA 2525 Thr His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu 775 780 785 790 TAT GAC GTT GCC CCA CAG GTC GGC CAC CGC TTC TGC AAG GAC TTC CCA 2573 Tyr Asp Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro 795 800 805 GGA TTT ATC CCG AGC CTG CTT GGA GAC CTC CTA GAG GAG AGG CAG AAG 2621 Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys 810 815 820 ATA AAG AAG AAG ATG AAG GCC ACG ATT GAC CCG ATC GAG AGG AAG CTC 2669 Ile Lys Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu 825 830 835 CTC GAT TAC AGG CAG AGG GCC ATC AAG ATC CTG GCA AAC AGC ATC CTA 2717 Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Ile Leu 840 845 850 CCC GAG GAA TGG CTT CCA GTC CTC GAG GAA GGG GAG GTT CAC TTC GTC 2765 Pro Glu Glu Trp Leu Pro Val Leu Glu Glu Gly Glu Val His Phe Val 855 860 865 870 AGG ATT GGA GAG CTC ATA GAC CGG ATG ATG GAG GAA AAT GCT GGG AAA 2813 Arg Ile Gly Glu Leu Ile Asp Arg Met Met Glu Glu Asn Ala Gly Lys 875 880 885 GTA AAG AGA GAG GGC GAG ACG GAA GTG CTT GAG GTC AGT GGG CTT GAA 2861 Val Lys Arg Glu Gly Glu Thr Glu Val Leu Glu Val Ser Gly Leu Glu 890 895 900 GTC CCG TCC TTT AAC AGG AGA ACT AAC AAG GCC GAG CTC AAG AGA GTA 2909 Val Pro Ser Phe Asn Arg Arg Thr Asn Lys Ala Glu Leu Lys Arg Val 905 910 915 AAG GCC CTG ATT AGG CAC GAT TAT TCT GGC AAG GTC TAC ACC ATC AGA 2957 Lys Ala Leu Ile Arg His Asp Tyr Ser Gly Lys Val Tyr Thr Ile Arg 920 925 930 CTG AAG TCG GGG AGG AGA ATA AAG ATA ACC TCT GGC CAC AGC CTC TTC 3005 Leu Lys Ser Gly Arg Arg Ile Lys Ile Thr Ser Gly His Ser Leu Phe 935 940 945 950 TCT GTG AGA AAC GGG GAG CTC GTT GAA GTT ACG GGC GAT GAA CTA AAG 3053 Ser Val Arg Asn Gly Glu Leu Val Glu Val Thr Gly Asp Glu Leu Lys 955 960 965 CCA GGT GAC CTC GTT GCA GTC CCG CGG AGA TTG GAG CTT CCT GAG AGA 3101 Pro Gly Asp Leu Val Ala Val Pro Arg Arg Leu Glu Leu Pro Glu Arg 970 975 980 AAC CAC GTG CTG AAC CTC GTT GAA CTG CTC CTT GGA ACG CCA GAA GAA 3149 Asn His Val Leu Asn Leu Val Glu Leu Leu Leu Gly Thr Pro Glu Glu 985 990 995 GAA ACT TTG GAC ATC GTC ATG ACG ATC CCA GTC AAG GGT AAG AAG AAC 3197 Glu Thr Leu Asp Ile Val Met Thr Ile Pro Val Lys Gly Lys Lys Asn 1000 1005 1010 TTC TTT AAA GGG ATG CTC AGG ACT TTG CGC TGG ATT TTC GGA GAG GAA 3245 Phe Phe Lys Gly Met Leu Arg Thr Leu Arg Trp Ile Phe Gly Glu Glu 1015 1020 1025 1030 AAG AGG CCC AGA ACC GCG AGA CGC TAT CTC AGG CAC CTT GAG GAT CTG 3293 Lys Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Tyr Leu Arg His Leu Glu Asp Leu 1035 1040 1045 GGC TAT GTC CGG CTT AAG AAG ATC GGC TAC GAA GTC CTC GAC TGG GAC 3341 Gly Tyr Val Arg Leu Lys Lys Ile Gly Tyr Glu Val Leu Asp Trp Asp 1050 1055 1060 TCA CTT AAG AAC TAC AGA AGG CTC TAC GAG GCG CTT GTC GAG AAC GTC 3389 Ser Leu Lys Asn Tyr Arg Arg Leu Tyr Glu Ala Leu Val Glu Asn Val 1065 1070 1075 AGA TAC AAC GGC AAC AAG AGG GAG TAC CTC GTT GAA TTC AAT TCC ATC 3437 Arg Tyr Asn Gly Asn Lys Arg Glu Tyr Leu Val Glu Phe Asn Ser Ile 1080 1085 1090 CGG GAT GCA GTT GGC ATA ATG CCC CTA AAA GAG CTG AAG GAG TGG AAG 3485 Arg Asp Ala Val Gly Ile Met Pro Leu Lys Glu Leu Lys Glu Trp Lys 1095 1100 1105 1110 ATC GGC ACG CTG AAC GGC TTC AGA ATG AGA AAG CTC ATT GAA GTG GAC 3533 Ile Gly Thr Leu Asn Gly Phe Arg Met Arg Lys Leu Ile Glu Val Asp 1115 1120 1125 GAG TCG TTA GCA AAG CTC CTC GGC TAC TAC GTG AGC GAG GGC TAT GCA 3581 Glu Ser Leu Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Tyr Val Ser Glu Gly Tyr Ala 1130 1135 1140 AGA AAG CAG AGG AAT CCC AAA AAC GGC TGG AGC TAC AGC GTG AAG CTC 3629 Arg Lys Gln Arg Asn Pro Lys Asn Gly Trp Ser Tyr Ser Val Lys Leu 1145 1150 1155 TAC AAC GAA GAC CCT GAA GTG CTG GAC GAT ATG GAG AGA CTC GCC AGC 3677 Tyr Asn Glu Asp Pro Glu Val Leu Asp Asp Met Glu Arg Leu Ala Ser 1160 1165 1170 AGG TTT TTC GGG AAG GTG AGG CGG GGC AGG AAC TAC GTT GAG ATA CCG 3725 Arg Phe Phe Gly Lys Val Arg Arg Gly Arg Asn Tyr Val Glu Ile Pro 1175 1180 1185 1190 AAG AAG ATC GGC TAC CTG CTC TTT GAG AAC ATG TGC GGT GTC CTA GCG 3773 Lys Lys Ile Gly Tyr Leu Leu Phe Glu Asn Met Cys Gly Val Leu Ala 1195 1200 1205 GAG AAC AAG AGG ATT CCC GAG TTC GTC TTC ACG TCC CCG AAA GGG GTT 3821 Glu Asn Lys Arg Ile Pro Glu Phe Val Phe Thr Ser Pro Lys Gly Val 1210 1215 1220 CGG CTG GCC TTC CTT GAG GGG TAC TCA TCG GCG ATG GCG ACG TCC ACC 3869 Arg Leu Ala Phe Leu Glu Gly Tyr Ser Ser Ala Met Ala Thr Ser Thr 1225 1230 1235 GAA CAA GAG ACT CAG GCT CTC AAC GAA AAG CGA GCT TTA GCG AAC CAG 3917 Glu Gln Glu Thr Gln Ala Leu Asn Glu Lys Arg Ala Leu Ala Asn Gln 1240 1245 1250 CTC GTC CTC CTC TTG AAC TCG GTG GGG GTC TCT GCT GTA AAA CTT GGG 3965 Leu Val Leu Leu Leu Asn Ser Val Gly Val Ser Ala Val Lys Leu Gly 1255 1260 1265 1270 CAC GAC AGC GGC GTT TAC AGG GTC TAT ATA AAC GAG GAG CTC CCG TTC 4013 His Asp Ser Gly Val Tyr Arg Val Tyr Ile Asn Glu Glu Leu Pro Phe 1275 1280 1285 GTA AAG CTG GAC AAG AAA AAG AAC GCC TAC TAC TCA CAC GTG ATC CCC 4061 Val Lys Leu Asp Lys Lys Lys Asn Ala Tyr Tyr Ser His Val Ile Pro 1290 1295 1300 AAG GAA GTC CTG AGC GAG GTC TTT GGG AAG GTT TTC CAG AAA AAC GTC 4109 Lys Glu Val Leu Ser Glu Val Phe Gly Lys Val Phe Gln Lys Asn Val 1305 1310 1315 AGT CCT CAG ACC TTC AGG AAG ATG GTC GAG GAC GGA AGA CTC GAT CCC 4157 Ser Pro Gln Thr Phe Arg Lys Met Val Glu Asp Gly Arg Leu Asp Pro 1320 1325 1330 GAA AAG GCC CAG AGG CTC TCC TGG CTC ATT GAG GGG GAC GTA GTG CTC 4205 Glu Lys Ala Gln Arg Leu Ser Trp Leu Ile Glu Gly Asp Val Val Leu 1335 1340 1345 1350 GAC CGC GTT GAG TCC GTT GAT GTG GAA GAC TAC GAT GGT TAT GTC TAT 4253 Asp Arg Val Glu Ser Val Asp Val Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Val Tyr 1355 1360 1365 GAC CTG AGC GTC GAG GAC AAC GAG AAC TTC CTC GTT GGC TTT GGG TTG 4301 Asp Leu Ser Val Glu Asp Asn Glu Asn Phe Leu Val Gly Phe Gly Leu 1370 1375 1380 GTC TAT GCT CAC AAC AGC TAC TAC GGT TAC TAC GGC TAT GCA AGG GCG 4349 Val Tyr Ala His Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala 1385 1390 1395 CGC TGG TAC TGC AAG GAG TGT GCA GAG AGC GTA ACG GCC TGG GGA AGG 4397 Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg 1400 1405 1410 GAG TAC ATA ACG ATG ACC ATC AAG GAG ATA GAG GAA AAG TAC GGC TTT 4445 Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile Glu Glu Lys Tyr Gly Phe 1415 1420 1425 1430 AAG GTA ATC TAC AGC GAC ACC GAC GGA TTT TTT GCC ACA ATA CCT GGA 4493 Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe Phe Ala Thr Ile Pro Gly 1435 1440 1445 GCC GAT GCT GAA ACC GTC AAA AAG AAG GCT ATG GAG TTC CTC AAC TAT 4541 Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala Met Glu Phe Leu Asn Tyr 1450 1455 1460 ATC AAC GCC AAA CTT CCG GGC GCG CTT GAG CTC GAG TAC GAG GGC TTC 4589 Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe 1465 1470 1475 TAC AAA CGC GGC TTC TTC GTC ACG AAG AAG AAG TAT GCG GTG ATA GAC 4637 Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Val Ile Asp 1480 1485 1490 GAG GAA GGC AAG ATA ACA ACG CGC GGA CTT GAG ATT GTG AGG CGT GAC 4685 Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp 1495 1500 1505 1510 TGG AGC GAG ATA GCG AAA GAG ACG CAG GCG AGG GTT CTT GAA GCT TTG 4733 Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu Ala Leu 1515 1520 1525 CTA AAG GAC GGT GAC GTC GAG AAG GCC GTG AGG ATA GTC AAA GAA GTT 4781 Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val Arg Ile Val Lys Glu Val 1530 1535 1540 ACC GAA AAG CTG AGC AAG TAC GAG GTT CCG CCG GAG AAG CTG GTG ATC 4829 Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys Leu Val Ile 1545 1550 1555 CAC GAG CAG ATA ACG AGG GAT TTA AAG GAC TAC AAG GCA ACC GGT CCC 4877 His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Lys Ala Thr Gly Pro 1560 1565 1570 CAC GTT GCC GTT GCC AAG AGG TTG GCC GCG AGA GGA GTC AAA ATA CGC 4925 His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala Arg Gly Val Lys Ile Arg 1575 1580 1585 1590 CCT GGA ACG GTG ATA AGC TAC ATC GTG CTC AAG GGC TCT GGG AGG ATA 4973 Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu Lys Gly Ser Gly Arg Ile 1595 1600 1605 GGC GAC AGG GCG ATA CCG TTC GAC GAG TTC GAC CCG ACG AAG CAC AAG 5021 Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe Asp Pro Thr Lys His Lys 1610 1615 1620 TAC GAC GCC GAG TAC TAC ATT GAG AAC CAG GTT CTC CCA GCC GTT GAG 5069 Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Glu 1625 1630 1635 AGA ATT CTG AGA GCC TTC GGT TAC CGC AAG GAA GAC CTG CGC TAC CAG 5117 Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln 1640 1645 1650 AAG ACG AGA CAG GTT GGT TTG AGT GCT TGG CTG AAG CCG AAG GGA ACT 5165 Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp Leu Lys Pro Lys Gly Thr 1655 1660 1665 1670 TGACCTTTCC ATTTGTTTTC CAGCGGATAA CCCTTTAACT TCCCTTTCAA AAACTCCCTT 5225 TAGGGAAAGA CCATGAAGAT AGAAATCCGG CGGCGCCCGG TTAAATACGC TAGGATAGAA 5285 GTGAAGCCAG ACGGCAGGGT AGTCGTCACT GCCCCGAGGG TTCAACGTTG AGAAGTT 5342

【００８０】配列番号：2 配列の長さ：774 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr 50 55 60 Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Gly Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Pro Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr 370 375 380 Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Met Glu Phe Leu Asn Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val 625 630 635 640 Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Gly Thr 770

【００８１】配列番号：3 配列の長さ：2325 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic ＤＮＡ配列 ATGATCCTCG ACACTGACTA CATAACCGAG GATGGAAAGC CTGTCATAAG AATTTTCAAG 60 AAGGAAAACG GCGAGTTTAA GATTGAGTAC GACCGGACTT TTGAACCCTA CTTCTACGCC 120 CTCCTGAAGG ACGATTCTGC CATTGAGGAA GTCAAGAAGA TAACCGCCGA GAGGCACGGG 180 ACGGTTGTAA CGGTTAAGCG GGTTGAAAAG GTTCAGAAGA AGTTCCTCGG GAGACCAGTT 240 GAGGTCTGGA AACTCTACTT TACTCATCCG CAGGACGTCC CAGCGATAAG GGACAAGATA 300 CGAGAGCATG GAGCAGTTAT TGACATCTAC GAGTACGACA TACCCTTCGC CAAGCGCTAC 360 CTCATAGACA AGGGATTAGT GCCAATGGAA GGCGACGAGG AGCTGAAAAT GCTCGCCTTC 420 GACATTCAAA CTCTCTACCA TGAGGGCGAG GAGTTCGCCG AGGGGCCAAT CCTTATGATA 480 AGCTACGCCG ACGAGGAAGG GGCCAGGGTG ATAACTTGGA AGAACGTGGA TCTCCCCTAC 540 GTTGACGTCG TCTCGACGGA GAGGGAGATG ATAAAGCGCT TCCTCCGTGT TGTGAAGGAG 600 AAAGACCCGG ACGTTCTCAT AACCTACAAC GGCGACAACT TCGACTTCGC CTATCTGAAA 660 AAGCGCTGTG AAAAGCTCGG AATAAACTTC GCCCTCGGAA GGGATGGAAG CGAGCCGAAG 720 ATTCAGAGGA TGGGCGACAG GTTTGCCGTC GAAGTGAAGG GACGGATACA CTTCGATCTC 780 TATCCTGTGA TAAGACGGAC GATAAACCTG CCCACATACA CGCTTGAGGC CGTTTATGAA 840 GCCGTCTTCG GTCAGCCGAA GGAGAAGGTT TACGCTGAGG AAATAACACC AGCCTGGGAA 900 ACCGGCGAGA ACCTTGAGAG AGTCGCCCGC TACTCGATGG AAGATGCGAA GGTCACATAC 960 GAGCTTGGGA AGGAGTTCCT TCCGATGGAG GCCCAGCTTT CTCGCTTAAT CGGCCAGTCC 1020 CTCTGGGACG TCTCCCGCTC CAGCACTGGC AACCTCGTTG AGTGGTTCCT CCTCAGGAAG 1080 GCCTATGAGA GGAATGAGCT GGCCCCGAAC AAGCCCGATG AAAAGGAGCT GGCCAGAAGA 1140 CGGCAGAGCT ATGAAGGAGG CTATGTAAAA GAGCCCGAGA GAGGGTTGTG GGAGAACATA 1200 GTGTACCTAG ATTTTAGATC CCTGTACCCC TCAATCATCA TCACCCACAA CGTCTCGCCG 1260 GATACGCTCA ACAGAGAAGG ATGCAAGGAA TATGACGTTG CCCCACAGGT CGGCCACCGC 1320 TTCTGCAAGG ACTTCCCAGG ATTTATCCCG AGCCTGCTTG GAGACCTCCT AGAGGAGAGG 1380 CAGAAGATAA AGAAGAAGAT GAAGGCCACG ATTGACCCGA TCGAGAGGAA GCTCCTCGAT 1440 TACAGGCAGA GGGCCATCAA GATCCTGGCA AACAGCTACT ACGGTTACTA CGGCTATGCA 1500 AGGGCGCGCT GGTACTGCAA GGAGTGTGCA GAGAGCGTAA CGGCCTGGGG AAGGGAGTAC 1560 ATAACGATGA CCATCAAGGA GATAGAGGAA AAGTACGGCT TTAAGGTAAT CTACAGCGAC 1620 ACCGACGGAT TTTTTGCCAC AATACCTGGA GCCGATGCTG AAACCGTCAA AAAGAAGGCT 1680 ATGGAGTTCC TCAACTATAT CAACGCCAAA CTTCCGGGCG CGCTTGAGCT CGAGTACGAG 1740 GGCTTCTACA AACGCGGCTT CTTCGTCACG AAGAAGAAGT ATGCGGTGAT AGACGAGGAA 1800 GGCAAGATAA CAACGCGCGG ACTTGAGATT GTGAGGCGTG ACTGGAGCGA GATAGCGAAA 1860 GAGACGCAGG CGAGGGTTCT TGAAGCTTTG CTAAAGGACG GTGACGTCGA GAAGGCCGTG 1920 AGGATAGTCA AAGAAGTTAC CGAAAAGCTG AGCAAGTACG AGGTTCCGCC GGAGAAGCTG 1980 GTGATCCACG AGCAGATAAC GAGGGATTTA AAGGACTACA AGGCAACCGG TCCCCACGTT 2040 GCCGTTGCCA AGAGGTTGGC CGCGAGAGGA GTCAAAATAC GCCCTGGAAC GGTGATAAGC 2100 TACATCGTGC TCAAGGGCTC TGGGAGGATA GGCGACAGGG CGATACCGTT CGACGAGTTC 2160 GACCCGACGA AGCACAAGTA CGACGCCGAG TACTACATTG AGAACCAGGT TCTCCCAGCC 2220 GTTGAGAGAA TTCTGAGAGC CTTCGGTTAC CGCAAGGAAG ACCTGCGCTA CCAGAAGACG 2280 AGACAGGTTG GTTTGAGTGC TTGGCTGAAG CCGAAGGGAA CTTGA 2325

【００８２】配列番号：4 配列の長さ：24 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CTTTTGCTCA GATCTTCTTT CCTG 24

【００８３】配列番号：5 配列の長さ:36 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CAGGAAAGAA GATCTGAGCA AAAG 24

【００８４】配列番号：6 配列の長さ:36 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CTGAAAATGC TCGCCTTCGC GATTGCAACT CTCTAC 36

【００８５】配列番号：7 配列の長さ:33 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CTGAAAATGC TCGCCTTCGC GATTGAAACT CTCT 34

【００８６】配列番号：8 配列の長さ:30 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GCCCTCGTGG TAGAGAGTTG CAATGTCGAA 30

【００８７】配列番号：9 配列の長さ:32 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CGGACGTACT GATAACGTAC GACGGTGACA AC 32

【００８８】配列番号：10 配列の長さ:33 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CCTTGAGAGA GTCGCGCGCT TCTCGATGGA AGA 33

【００８９】配列番号：11 配列の長さ:35 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TGGCTAGCCA AGGAACCACC AGTTGATTAG CAGAG 35

【００９０】配列番号：12 配列の長さ:35 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ATAAGAGGTC CCAAGACTTA GTACCTGAAG GGTGA 36

【００９１】配列番号：13 配列の長さ:24 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：1本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24

【００９２】配列番号：14 配列の長さ：24 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ CTTTTGCTCA GATCTTCTTT CCTG 24

【００９３】配列番号：15 配列の長さ:36 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ AGCTGAAAAT GCTAGCCTTC GACAATGAAA CTCTCT 36

【００９４】配列番号：16 配列の長さ:36 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ AGCTGAAAAT GCTAGCCTTC GACGAAGAAA CTCTCT 36

【００９５】配列番号：17 配列の長さ:33 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ GAAAATGCTC GCCTTTGATC AAGAAACTCT CTA 33

【００９６】配列番号：18 配列の長さ:36 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ AGCTGAAAAT GCTAGCCTTC GACGATGAAA CTCTCT 36

【００９７】配列番号：19 配列の長さ:30 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ CGCCTTCGAC ATTGAAGTAC TCTACCATGA 30

【００９８】配列番号：20 配列の長さ:36 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ AGCTGAAAAT GCTAGCCTTC GACAGAGAAA CTCTCT 36

【００９９】配列番号：21 配列の長さ:36 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ AGCTGAAAAT GCTAGCCTTC GACAAAGAAA CTCTCT 36

【０１００】配列番号：22 配列の長さ:35 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ AAAAAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTAC 35

【０１０１】配列番号：23 配列の長さ:34 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ AAAAAGTACT CAACCAAGTC ATTCVTGAGA ATAGT 34

【図面の簡単な説明】

【図１】改変型ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性
とＤＮＡ分解率を示す図である。

【図２】改変型ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を示す図
である。

【図３】ＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いたＰＣＲ（ヒ
トゲノム）の結果を示す図である。

【図４】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのエキソ（ＥＸＯ）
領域のアミノ酸配列を示す図である。

【図５】改変型ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性
とＤＮＡ分解率を示す図である。

【図６】天然型ＫＯＤポリメラーゼとのエキソヌクレア
ーゼ活性の比率を示す図である。

【手続補正書】

【提出日】平成８年９月２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】ＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いたＰＣＲ
（ヒトゲノム）の結果を示す電気泳動の写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者川上文清福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者川村良久福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者高木昌宏大阪府吹田市青山台１−３Ｃ−58−207 (72)発明者今中忠行大阪府吹田市藤白台２丁目28番11号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】改変前の３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、０〜
５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（第１ＤＮＡポリ
メラーゼ）および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたは改変前の３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼに比べて、１００〜６％である３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する改変された耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（第２ＤＮＡポリメラーゼ）を含み、第１Ｄ
ＮＡポリメラーゼおよび第２ＤＮＡポリメラーゼが、少
なくとも３０塩基／秒であるＤＮＡ合成速度、ｐＨ８．
８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６
０％以上の残存活性を保持することができる熱安定性を
有することを特徴とする核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ
組成物。
【請求項２】第２ＤＮＡポリメラーゼの活性が、第１
ＤＮＡポリメラーゼの活性よりも小さい請求項１項記載
の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項３】第１ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位につ
き、第２ＤＮＡポリメラーゼが０．０２〜０．１単位で
ある請求項１記載の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成
物。
【請求項４】第１ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性が、改変前の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に比べて、
約１％以下に低下したものである請求項１項記載のＤＮ
Ａポリメラーゼ組成物。
【請求項５】第１ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化学
的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで
ある請求項１項記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。
【請求項６】第１ＤＮＡポリメラーゼが下記理化学的
性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
る請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１
４１、１４２、１４３、２１０および３１１番目のアミ
ノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換したアミノ
酸配列
【請求項７】第１ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化学
的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで
ある請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２の第１４１番目のアスパラギ
ン酸をアラニンに、第１４２番目のイソロイシンをアル
ギニンに、第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに、
第１４１番目のアスパラギン酸と第１４３番目のグルタ
ミン酸をアラニンに、第２１０番目のアスパラギンをア
スパラギン酸に、第３１１番目のチロシンをフェニルア
ラニンに置換したアミノ酸配列
【請求項８】第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２
の第１４１番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤＮＡ
ポリメラーゼ組成物。
【請求項９】第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２
の第１４２番目のイソロイシンをアルギニンに置換した
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤＮＡ
ポリメラーゼ組成物。
【請求項１０】第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤＮＡ
ポリメラーゼ組成物。
【請求項１１】第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第１４１番目のアスパラギン酸と第１４３番目のグ
ルタミン酸をアラニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼである請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項１２】第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置
換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載の
ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項１３】第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第３１１番目のチロシンをフェニルアラニンに置換
した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤ
ＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項１４】第２ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化
学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
である請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列
【請求項１５】第２ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化
学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
である請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
１００〜６％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列のエキ
ソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ₁Ｄ
Ｘ₂ＥＸ₃モチーフのうち、Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃の少
なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミ
ノ酸配列
【請求項１６】第２ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化
学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
である請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
１００〜６％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。アミノ酸配列：配列番号２の第１４０、１４２および１
４４番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸
配列
【請求項１７】第２ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化
学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
である請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
１００〜６％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２の第１４２番目のイソロイシ
ンをアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グ
ルタミンまたはリジンに置換したアミノ酸配列または第
１４４番目のスレオニンンをバリンに置換したアミノ酸
配列
【請求項１８】第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第１４２番目のイソロイシンをアスパラギン酸に置
換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載の
ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項１９】第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第１４２番目のイソロイシンをグルタミン酸に置換
した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤ
ＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項２０】第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第１４２番目のイソロイシンをアスパラギンに置換
した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤ
ＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項２１】第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第１４２番目のイソロイシンをグルタミンに置換し
た耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤＮ
Ａポリメラーゼ組成物。
【請求項２２】第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第１４２番目のイソロイシンをリジンに置換した耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤＮＡポ
リメラーゼ組成物。
【請求項２３】第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第１４２番目のイソロイシンをアルギニンに置換し
た耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤＮ
Ａポリメラーゼ組成物。
【請求項２４】第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号
２の第１４４番目のスレオニンをバリンに置換した耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１記載のＤＮＡポリ
メラーゼ組成物。
【請求項２５】下記第１ＤＮＡポリメラーゼおよび下
記第２ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸
増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物。第１ＤＮＡポリメラーゼ：作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２の第１４１番目のアスパラギ
ン酸をアラニンに、第１４２番目のイソロイシンをアル
ギニンに、第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに、
第１４１番目のアスパラギン酸と第１４３番目のグルタ
ミン酸をアラニンに、第２１０番目のアスパラギンをア
スパラギン酸に、第３１１番目のチロシンをフェニルア
ラニンに置換したアミノ酸配列第２ＤＮＡポリメラーゼ：作用：ＤＮＡ合成活性を有し、３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも１２０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列または作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、
１００〜３０％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を有する。ＤＮＡ合成速度：少なくとも１２０塩基／秒熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５
℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持するこ
とができる。至適温度：約７５℃ 分子量：８８〜９０ＫＤａアミノ酸配列：配列番号２の第１４２番目のイソロイシ
ンをアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グ
ルタミンまたはリジンに置換したアミノ酸配列または第
１４４番目のスレオニンをバリンに置換したアミノ酸配
列
【請求項２６】ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮ
ＴＰおよび請求項１〜２５のいずれか１項記載の核酸増
幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物を含む試薬を反応させ
て、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を
合成することを特徴とする核酸増幅法。
【請求項２７】プライマーが２種のオリゴヌクレオチ
ドであって、１方は他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成
物に相補的である請求項２６記載の核酸増幅法。
【請求項２８】加熱および冷却を繰り返す請求項２６
記載の核酸増幅法。
【請求項２９】請求項１〜２５項のいずれか１項記載
の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物、２価イオン、
１価イオン、プライマー、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む
核酸増幅用試薬。
【請求項３０】請求項１〜２５項のいずれか１項記載
の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物、マグネシウム
イオンおよびアンモニウムイオンおよび／またはカリウ
ムイオン、１方のプライマーが他方のプライマーのＤＮ
Ａ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴ
Ｐ、ＢＳＡおよび非イオン界面活性剤および緩衝液を含
む核酸増幅用試薬。