JPH1042892A - タンパク質の回収精製法 - Google Patents
タンパク質の回収精製法Info
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- JPH1042892A JPH1042892A JP21810996A JP21810996A JPH1042892A JP H1042892 A JPH1042892 A JP H1042892A JP 21810996 A JP21810996 A JP 21810996A JP 21810996 A JP21810996 A JP 21810996A JP H1042892 A JPH1042892 A JP H1042892A
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- epidermal growth
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）活性を有す
るタンパク質を含有する培養物を、イオン交換体を浮遊
させた流動床カラムに上昇法で供給し、該タンパク質を
イオン交換体に吸着させ、非吸着物を除去した後、イオ
ン交換体を沈降させ、イオン交換体に吸着したタンパク
質を下降法で溶出せしめ、溶出液を分画分子量１０，０
００の濾過膜で濾過し、濾過液を分画分子量５，０００
の濾過膜で濾過して、濃縮画分に該タンパク質を回収せ
しめる。 【効果】 ＥＧＦ遺伝子で形質転換した微生物の培養物
から、高純度のＥＧＦを直接、分離、回収することがで
き、ＥＧＦの工業的大規模製造が可能となる。
るタンパク質を含有する培養物を、イオン交換体を浮遊
させた流動床カラムに上昇法で供給し、該タンパク質を
イオン交換体に吸着させ、非吸着物を除去した後、イオ
ン交換体を沈降させ、イオン交換体に吸着したタンパク
質を下降法で溶出せしめ、溶出液を分画分子量１０，０
００の濾過膜で濾過し、濾過液を分画分子量５，０００
の濾過膜で濾過して、濃縮画分に該タンパク質を回収せ
しめる。 【効果】 ＥＧＦ遺伝子で形質転換した微生物の培養物
から、高純度のＥＧＦを直接、分離、回収することがで
き、ＥＧＦの工業的大規模製造が可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、上皮細胞増殖因子
（Epidermal Growth Factor:ＥＧＦと略す）活性を有す
るタンパク質の回収精製法に関するものであって、さら
に詳細には、本発明は、ＥＧＦ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子で形質転換したバチルス・ブレビス
を培養し、その培養物から菌体外に分泌生産された該タ
ンパク質を回収精製する方法に関するものである。
（Epidermal Growth Factor:ＥＧＦと略す）活性を有す
るタンパク質の回収精製法に関するものであって、さら
に詳細には、本発明は、ＥＧＦ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子で形質転換したバチルス・ブレビス
を培養し、その培養物から菌体外に分泌生産された該タ
ンパク質を回収精製する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び課題】ＥＧＦは、ヒトや馬の尿中やウ
サギ、ラットおよびマウスの顎下腺から単離されてお
り、哺乳動物の体内に存在していることが知られている
（Adv. Metab, Dis., 8, 265(1975))。ヒト上皮細胞増
殖因子（human Epidermal Growth Factor:ｈ−ＥＧＦ）
は、５３個のアミノ酸からなる分子量約６，０００のペ
プチドで、分子内に３ケ所のジスルフィド結合をもち配
列番号１に示されるアミノ酸配列であることが知られて
いる（H.Gregory, Nature, 257, 325 (1975))。
サギ、ラットおよびマウスの顎下腺から単離されてお
り、哺乳動物の体内に存在していることが知られている
（Adv. Metab, Dis., 8, 265(1975))。ヒト上皮細胞増
殖因子（human Epidermal Growth Factor:ｈ−ＥＧＦ）
は、５３個のアミノ酸からなる分子量約６，０００のペ
プチドで、分子内に３ケ所のジスルフィド結合をもち配
列番号１に示されるアミノ酸配列であることが知られて
いる（H.Gregory, Nature, 257, 325 (1975))。
【０００３】ＥＧＦの生理作用として現在までに報告さ
れているものは、細胞増殖作用、胃酸分泌抑制作用、抗
潰瘍作用、消化管粘膜保護作用、ＤＮＡ合成促進作用、
角膜修復作用、カルシウム遊離促進作用、創傷治癒促進
作用、抗炎症作用、鎮痛作用、肝細胞障害抑制作用及び
毛胞退縮作用などがある（日本組織培養学会編、細胞成
長因子、２０頁、朝倉書店、１９８４年）。ＥＧＦは、
このような作用を有することから、創傷治癒薬、抗潰瘍
剤、抗癌剤補助剤などとしての様々な応用が試みられて
いる（BIO INDUSTORY, 8, 275(1991))。
れているものは、細胞増殖作用、胃酸分泌抑制作用、抗
潰瘍作用、消化管粘膜保護作用、ＤＮＡ合成促進作用、
角膜修復作用、カルシウム遊離促進作用、創傷治癒促進
作用、抗炎症作用、鎮痛作用、肝細胞障害抑制作用及び
毛胞退縮作用などがある（日本組織培養学会編、細胞成
長因子、２０頁、朝倉書店、１９８４年）。ＥＧＦは、
このような作用を有することから、創傷治癒薬、抗潰瘍
剤、抗癌剤補助剤などとしての様々な応用が試みられて
いる（BIO INDUSTORY, 8, 275(1991))。
【０００４】このようにＥＧＦについての種々の応用研
究が進められている一方、ＥＧＦを安定して供給できる
ようにＥＧＦの効率的な生産方法についても種々検討が
なされている。バチルス・ブレビスＨＰＤ３１(Bacillu
s brevis HPD31: なおこの菌株はバチルス・ブレビスＨ
１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株であ
る）は、タンパク質を菌体外に分泌生産するという点で
すぐれているだけでなく、しかも、培養液中にタンパク
質分解酵素を生産しないという特性も有するすぐれた菌
株であり（特公平４−７４９９７）、遺伝子組換えの宿
主菌として様々なタンパク質の生産に利用されている。
恵比須らは、このバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を宿主
菌としたｈ−ＥＧＦの分泌生産系を構築し、ｈ−ＥＧＦ
を培地中に約３ｇ／ｌ分泌生産させることに成功してい
る（特開平６−１３３７８２）。また高木らは、ＥＧＦ
活性を有する新規タンパク質を創製し、バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１を用いた培養系においてその高分泌生産
に成功している（特願平８−１２３９７０）。
究が進められている一方、ＥＧＦを安定して供給できる
ようにＥＧＦの効率的な生産方法についても種々検討が
なされている。バチルス・ブレビスＨＰＤ３１(Bacillu
s brevis HPD31: なおこの菌株はバチルス・ブレビスＨ
１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株であ
る）は、タンパク質を菌体外に分泌生産するという点で
すぐれているだけでなく、しかも、培養液中にタンパク
質分解酵素を生産しないという特性も有するすぐれた菌
株であり（特公平４−７４９９７）、遺伝子組換えの宿
主菌として様々なタンパク質の生産に利用されている。
恵比須らは、このバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を宿主
菌としたｈ−ＥＧＦの分泌生産系を構築し、ｈ−ＥＧＦ
を培地中に約３ｇ／ｌ分泌生産させることに成功してい
る（特開平６−１３３７８２）。また高木らは、ＥＧＦ
活性を有する新規タンパク質を創製し、バチルス・ブレ
ビスＨＰＤ３１を用いた培養系においてその高分泌生産
に成功している（特願平８−１２３９７０）。
【０００５】しかし、遺伝子組換え技術を適用し培養物
中に分泌生産されたＥＧＦまたはＥＧＦ活性を有するタ
ンパク質を医薬品などに開発するには、培養物中に混在
している菌体、培地由来の成分や同時に分泌生産される
代謝産物などの不純物を除去し、目的とするＥＧＦ活性
を有するタンパク質のみを回収精製する必要がある。
中に分泌生産されたＥＧＦまたはＥＧＦ活性を有するタ
ンパク質を医薬品などに開発するには、培養物中に混在
している菌体、培地由来の成分や同時に分泌生産される
代謝産物などの不純物を除去し、目的とするＥＧＦ活性
を有するタンパク質のみを回収精製する必要がある。
【０００６】一般的にタンパク質を回収精製する方法と
しては、塩類や各種有機溶媒による分別沈殿法またはこ
れにｐＨ調整を併用する分別沈殿法や、分子の大きさま
たは形状で分画する限外濾過法やゲル濾過法またはイオ
ン結合力や疎水結合力等を利用した各種クロマトグラフ
ィー等がよく用いられている。
しては、塩類や各種有機溶媒による分別沈殿法またはこ
れにｐＨ調整を併用する分別沈殿法や、分子の大きさま
たは形状で分画する限外濾過法やゲル濾過法またはイオ
ン結合力や疎水結合力等を利用した各種クロマトグラフ
ィー等がよく用いられている。
【０００７】特に、クロマトグラフィーは、タンパク質
の回収精製法としては優れた方法であるが、微生物の培
養液などを処理する場合、菌体が含まれているとカラム
が目詰まりを起こすために培養液を直接処理することが
出来ず、前処理として遠心分離や膜濾過によって菌体を
除去する必要がある。この菌体除去のための遠心分離や
膜濾過を工業規模で行うには多大な設備投資が必要であ
り、精製工程が複雑になり、生産コストも高くなるとい
う問題があった。従って培養物中に分泌生産されたＥＧ
Ｆ活性を有するタンパク質を簡便かつ効率的に回収精製
する方法の開発が強く望まれていた。
の回収精製法としては優れた方法であるが、微生物の培
養液などを処理する場合、菌体が含まれているとカラム
が目詰まりを起こすために培養液を直接処理することが
出来ず、前処理として遠心分離や膜濾過によって菌体を
除去する必要がある。この菌体除去のための遠心分離や
膜濾過を工業規模で行うには多大な設備投資が必要であ
り、精製工程が複雑になり、生産コストも高くなるとい
う問題があった。従って培養物中に分泌生産されたＥＧ
Ｆ活性を有するタンパク質を簡便かつ効率的に回収精製
する方法の開発が強く望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＥＧＦ活
性を有するタンパク質を培養物中から効率よく回収精製
する方法について鋭意研究を重ねた。その結果イオン交
換体を用いた流動床クロマトグラフィーを適用すること
により、目的とするタンパク質を簡便に効率よく回収精
製できることを見出し本発明を完成した。
性を有するタンパク質を培養物中から効率よく回収精製
する方法について鋭意研究を重ねた。その結果イオン交
換体を用いた流動床クロマトグラフィーを適用すること
により、目的とするタンパク質を簡便に効率よく回収精
製できることを見出し本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、イオン交換体を浮遊
させた流動床クロマトグラフィーによって、菌体を含ん
だバチルス・ブレビス培養物中からＥＧＦ活性を有する
タンパク質を高回収率、高純度に回収精製でき、かつ、
培養物中に含まれる菌体を除去することのできる回収精
製方法を提供するものである。以下、本発明について詳
しく説明する。
させた流動床クロマトグラフィーによって、菌体を含ん
だバチルス・ブレビス培養物中からＥＧＦ活性を有する
タンパク質を高回収率、高純度に回収精製でき、かつ、
培養物中に含まれる菌体を除去することのできる回収精
製方法を提供するものである。以下、本発明について詳
しく説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の回収精製法は、ＥＧＦ活
性を有するタンパク質を含有するバクテリア、酵母、糸
状菌または動物細胞などの培養物に対して適用でき、特
にＥＧＦ活性を有するタンパク質が細胞外に分泌生産さ
れている前記した種々の培養物に対して有効に適用でき
る。具体的には、前記したようにバチルス・ブレビスＨ
ＰＤ３１はタンパク質を菌体外に分泌生産するので、該
菌株の培養物には本発明の回収精製法が有効に適用でき
る。また本発明方法は、培養物に含まれる菌体も除去す
ることができるので、培養後菌体を含んだままの培養物
を直接処理することが可能である。従って、本発明方法
では従来のクロマトグラフィーのように遠心分離や膜濾
過などの菌体を除去する前処理工程を設ける必要がなく
精製工程が大幅に簡略化できる。
性を有するタンパク質を含有するバクテリア、酵母、糸
状菌または動物細胞などの培養物に対して適用でき、特
にＥＧＦ活性を有するタンパク質が細胞外に分泌生産さ
れている前記した種々の培養物に対して有効に適用でき
る。具体的には、前記したようにバチルス・ブレビスＨ
ＰＤ３１はタンパク質を菌体外に分泌生産するので、該
菌株の培養物には本発明の回収精製法が有効に適用でき
る。また本発明方法は、培養物に含まれる菌体も除去す
ることができるので、培養後菌体を含んだままの培養物
を直接処理することが可能である。従って、本発明方法
では従来のクロマトグラフィーのように遠心分離や膜濾
過などの菌体を除去する前処理工程を設ける必要がなく
精製工程が大幅に簡略化できる。
【００１１】本発明方法を適用し回収精製するタンパク
質は、ＥＧＦと同様の生理活性を有するタンパク質であ
ればよく、具体的には配列番号１のヒトＥＧＦ、配列番
号２のマウスＥＧＦ、配列番号３のブタＥＧＦ、配列番
号４のラットＥＧＦやＥＧＦ活性を有する配列番号５〜
８のタンパク質（特願平８−１２３９７０）などが挙げ
られる。
質は、ＥＧＦと同様の生理活性を有するタンパク質であ
ればよく、具体的には配列番号１のヒトＥＧＦ、配列番
号２のマウスＥＧＦ、配列番号３のブタＥＧＦ、配列番
号４のラットＥＧＦやＥＧＦ活性を有する配列番号５〜
８のタンパク質（特願平８−１２３９７０）などが挙げ
られる。
【００１２】これらのＥＧＦ活性を有するタンパク質の
アミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＥＧＦ生産能を有
する細胞から単離した遺伝子でもよいし、化学的に合成
した遺伝子を用いてもよい。例えば合成遺伝子を用いる
場合はバチルス・ブレビス等の宿主菌において最も容認
されたコドンを採用した遺伝子が好適に使用出来る。
アミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＥＧＦ生産能を有
する細胞から単離した遺伝子でもよいし、化学的に合成
した遺伝子を用いてもよい。例えば合成遺伝子を用いる
場合はバチルス・ブレビス等の宿主菌において最も容認
されたコドンを採用した遺伝子が好適に使用出来る。
【００１３】このＥＧＦ活性を有するタンパク質遺伝子
を保持するバチルス・ブレビスなどの宿主菌の調製は、
公知の方法に従って行えばよく、例えばモレキュラー・
クローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Molecu
lar Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1989) に記載の方法で行えば
よい。
を保持するバチルス・ブレビスなどの宿主菌の調製は、
公知の方法に従って行えばよく、例えばモレキュラー・
クローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Molecu
lar Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1989) に記載の方法で行えば
よい。
【００１４】このようにして得た上記宿主菌その他の形
質転換体は、常法にしたがって培養する。培養後、培養
物中、例えば培養液中にはＥＧＦ活性を有するタンパク
質が分泌生産されているので、これを本発明にしたがっ
て回収精製する。そのために、ＥＧＦ活性を有するタン
パク質を含有する培養物は、菌体等を除去することな
く、先ず、流動床クロマトグラフィーの条件と同じｐＨ
に調整する。ｐＨの調整に用いる酸は、塩酸、硝酸、硫
酸などの酸を用いればよく、アルカリは水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムなどを用いればよい。ｐＨを調整し
た培養物は、１〜２４時間攪拌し、均一な分散系に調製
しておく。こうして調製した培養物を流動床クロマトグ
ラフィーに供する。
質転換体は、常法にしたがって培養する。培養後、培養
物中、例えば培養液中にはＥＧＦ活性を有するタンパク
質が分泌生産されているので、これを本発明にしたがっ
て回収精製する。そのために、ＥＧＦ活性を有するタン
パク質を含有する培養物は、菌体等を除去することな
く、先ず、流動床クロマトグラフィーの条件と同じｐＨ
に調整する。ｐＨの調整に用いる酸は、塩酸、硝酸、硫
酸などの酸を用いればよく、アルカリは水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムなどを用いればよい。ｐＨを調整し
た培養物は、１〜２４時間攪拌し、均一な分散系に調製
しておく。こうして調製した培養物を流動床クロマトグ
ラフィーに供する。
【００１５】流動床クロマトグラフィーで用いるイオン
交換体の骨格（ベースマトリクス）は、シリカゲルなど
の無機化合物、ビニルポリマーなどの合成樹脂やセルロ
ース、デキストラン、アガロースなどの多糖類などが使
用できる。また、安定で均一な吸着流動床を形成するた
めに、イオン交換体粒子の粒径と密度は狭い分布範囲の
ものが好ましい。具体的には、平均粒子直径が２００μ
ｍで１００〜３００μｍの範囲の粒子径分布をもち、平
均粒子密度が１．２ｇ／ｍｌの多孔性の架橋アガロース
をベースマトリクスとしたイオン交換体が好適に使用で
きる。
交換体の骨格（ベースマトリクス）は、シリカゲルなど
の無機化合物、ビニルポリマーなどの合成樹脂やセルロ
ース、デキストラン、アガロースなどの多糖類などが使
用できる。また、安定で均一な吸着流動床を形成するた
めに、イオン交換体粒子の粒径と密度は狭い分布範囲の
ものが好ましい。具体的には、平均粒子直径が２００μ
ｍで１００〜３００μｍの範囲の粒子径分布をもち、平
均粒子密度が１．２ｇ／ｍｌの多孔性の架橋アガロース
をベースマトリクスとしたイオン交換体が好適に使用で
きる。
【００１６】このベースマトリクスに導入するイオン交
換基は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基、スル
ホエチル基などの陽イオン交換基やジエチルアミノエチ
ル基、４級アミノエチル基、４級アンモニウム基などの
陰イオン交換基などを用いることができるが、強イオン
交換基であるスルホプロピル基、スルホエチル基、４級
アミノエチル基、４級アンモニウム基は電荷に対するｐ
Ｈの影響が少なくその交換容量が安定しており、より好
適に使用できる。イオン交換基の選択は、目的とするＥ
ＧＦ活性を有するタンパク質のｐＨ安定性を考慮して行
えばよく、当該タンパク質がその等電点より低いｐＨで
安定であれば陽イオン交換体を使用し、逆の場合には陰
イオン交換体を用いればよい。
換基は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基、スル
ホエチル基などの陽イオン交換基やジエチルアミノエチ
ル基、４級アミノエチル基、４級アンモニウム基などの
陰イオン交換基などを用いることができるが、強イオン
交換基であるスルホプロピル基、スルホエチル基、４級
アミノエチル基、４級アンモニウム基は電荷に対するｐ
Ｈの影響が少なくその交換容量が安定しており、より好
適に使用できる。イオン交換基の選択は、目的とするＥ
ＧＦ活性を有するタンパク質のｐＨ安定性を考慮して行
えばよく、当該タンパク質がその等電点より低いｐＨで
安定であれば陽イオン交換体を使用し、逆の場合には陰
イオン交換体を用いればよい。
【００１７】このイオン交換体を平衡化する緩衝液のｐ
Ｈは、ＥＧＦ活性を有するタンパク質がイオン交換体に
吸着する電荷をもつ範囲に設定すればよいが、陽イオン
交換基を導入したイオン交換体を用いる場合、目的とす
るＥＧＦ活性を有するタンパク質の等電点より低いｐＨ
の緩衝液で平衡化する。逆に陰イオン交換基を導入した
吸着体を用いる場合は、目的とするＥＧＦ活性を有する
タンパク質の等電点より高いｐＨの緩衝液で平衡化す
る。緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液やＴｒ
ｉｓ緩衝液などが使用でき、その濃度は十分に緩衝能を
もち目的とするＥＧＦ活性を有するタンパク質がイオン
交換体に吸着する範囲であればよく、例えば１０ｍＭ〜
１Ｍの濃度の緩衝液を好適に用いることができる。
Ｈは、ＥＧＦ活性を有するタンパク質がイオン交換体に
吸着する電荷をもつ範囲に設定すればよいが、陽イオン
交換基を導入したイオン交換体を用いる場合、目的とす
るＥＧＦ活性を有するタンパク質の等電点より低いｐＨ
の緩衝液で平衡化する。逆に陰イオン交換基を導入した
吸着体を用いる場合は、目的とするＥＧＦ活性を有する
タンパク質の等電点より高いｐＨの緩衝液で平衡化す
る。緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液やＴｒ
ｉｓ緩衝液などが使用でき、その濃度は十分に緩衝能を
もち目的とするＥＧＦ活性を有するタンパク質がイオン
交換体に吸着する範囲であればよく、例えば１０ｍＭ〜
１Ｍの濃度の緩衝液を好適に用いることができる。
【００１８】クロマトグラフィーに用いるカラムサイズ
は、イオン交換体の交換容量と処理する培養物の量によ
って適宜選択すればよい。また、培養物中の粒径の大き
な固型物などを除去するために、ガラスフィルター、ガ
ラスウール、多孔性プラスチックなどのインラインフィ
ルターをカラムの試料供給口に設けてもよい。
は、イオン交換体の交換容量と処理する培養物の量によ
って適宜選択すればよい。また、培養物中の粒径の大き
な固型物などを除去するために、ガラスフィルター、ガ
ラスウール、多孔性プラスチックなどのインラインフィ
ルターをカラムの試料供給口に設けてもよい。
【００１９】このカラムにイオン交換体を封入し、カラ
ム下部から上昇法で緩衝液を送液し、イオン交換体粒子
を浮遊させ流動床の形成及び平衡化を行う。本発明では
前記のように粒径および密度の分布範囲の狭いイオン交
換体を使用するので、上方への送液速度と吸着体の下方
への重力による沈降速度のバランスがとれ、逆混合（バ
ックミキシング）の生じない安定した流動床が形成でき
る。流動床が形成されたら、前記のようにｐＨを調整し
た培養物を、カラム下方から上昇法で供給し、イオン交
換体に目的とするタンパク質を吸着させる。この時、イ
オン交換体に吸着しない夾雑タンパク質や菌体は、カラ
ムを素通りしてカラム外に排出される。
ム下部から上昇法で緩衝液を送液し、イオン交換体粒子
を浮遊させ流動床の形成及び平衡化を行う。本発明では
前記のように粒径および密度の分布範囲の狭いイオン交
換体を使用するので、上方への送液速度と吸着体の下方
への重力による沈降速度のバランスがとれ、逆混合（バ
ックミキシング）の生じない安定した流動床が形成でき
る。流動床が形成されたら、前記のようにｐＨを調整し
た培養物を、カラム下方から上昇法で供給し、イオン交
換体に目的とするタンパク質を吸着させる。この時、イ
オン交換体に吸着しない夾雑タンパク質や菌体は、カラ
ムを素通りしてカラム外に排出される。
【００２０】培養物の供給が終了した後、緩衝液を供給
してわずかにカラム内に残留しているイオン交換体に吸
着しない菌体や培地由来成分、その他の代謝産物などの
不純物を十分に洗い流す。この時用いる緩衝液は、流動
床形成時と同じ緩衝液を用いればよいが、目的タンパク
質がイオン交換体から脱離しない範囲であれば組成の異
なる緩衝液やｐＨの異なる緩衝液を用いてもよい。
してわずかにカラム内に残留しているイオン交換体に吸
着しない菌体や培地由来成分、その他の代謝産物などの
不純物を十分に洗い流す。この時用いる緩衝液は、流動
床形成時と同じ緩衝液を用いればよいが、目的タンパク
質がイオン交換体から脱離しない範囲であれば組成の異
なる緩衝液やｐＨの異なる緩衝液を用いてもよい。
【００２１】洗浄に要する緩衝液量は、カラムサイズに
よって適宜設定すればよいが、例えば直径５ｃｍ、容量
３００ｍｌのカラムでは６．０Ｌの緩衝液を流すことに
より十分な洗浄が得られる。洗浄終了後、送液を停止
し、カラム底部にイオン交換体を沈降させる。イオン交
換体がカラム底部に沈降した後、緩衝液を溶出用の緩衝
液に交換しカラム上方から送液を行う。溶出用の緩衝液
は目的タンパク質の等電点付近のｐＨに調整したもの
や、ＮａＣｌや（ＮＨ4）2ＳＯ4などの塩を一定量含有
させ、イオン強度を高めた緩衝液を用いればイオン交換
体と目的タンパク質との結合力が弱まって目的タンパク
質が溶出される。こうして精製度の高いＥＧＦ活性を有
するタンパク質を得ることができる。
よって適宜設定すればよいが、例えば直径５ｃｍ、容量
３００ｍｌのカラムでは６．０Ｌの緩衝液を流すことに
より十分な洗浄が得られる。洗浄終了後、送液を停止
し、カラム底部にイオン交換体を沈降させる。イオン交
換体がカラム底部に沈降した後、緩衝液を溶出用の緩衝
液に交換しカラム上方から送液を行う。溶出用の緩衝液
は目的タンパク質の等電点付近のｐＨに調整したもの
や、ＮａＣｌや（ＮＨ4）2ＳＯ4などの塩を一定量含有
させ、イオン強度を高めた緩衝液を用いればイオン交換
体と目的タンパク質との結合力が弱まって目的タンパク
質が溶出される。こうして精製度の高いＥＧＦ活性を有
するタンパク質を得ることができる。
【００２２】また、ＥＧＦ活性を有するタンパク質含有
液に含まれる発熱性物質（パイロジェン）一種であるエ
ンドトキシンは、分画分子量１０，０００の限外濾過膜
を用いて除くことができる。限外濾過膜は、スパイラル
タイプ、中空糸タイプ、平板タイプ等どのようなタイプ
の膜を用いてもよい。ＥＧＦ活性を有するタンパク質を
含有する溶液は、ｐＨを３以下に調整しておくとよい。
更に、濃縮が進んだ段階で緩衝液を添加し、残存してい
るＥＧＦ活性を有するタンパク質を濾過液側に回収すれ
ばよい。次に、こうして得たＥＧＦ活性を有するタンパ
ク質含有液に含まれる塩類を分画分子量５，０００の限
外濾過膜を用いて除去する。スパイラルタイプ、中空糸
タイプ、平板タイプ等の限外濾過膜を用い、濃縮が進ん
だ段階でエンドトキシンフリーの水を加えて、塩を除去
する。また、本工程では脱塩と同時にＥＧＦ活性を有す
るタンパク質の濃縮も行う。これにより、液量もコンパ
クトにすることができ、以降凍結乾燥処理によって効率
的に粉末化することができる。このように、本発明の回
収精製法は、菌体を除去する工程を設けることなく、培
養物からＥＧＦ活性を有するタンパク質を高回収率で、
かつ高純度に精製が可能であり、また、パイロジェンや
塩も除去することが可能である。この回収精製法で得た
ＥＧＦ活性を有するタンパク質は、各種の用途に適用す
ることもできるが、さらに高純度である必要がある場合
には、流動床クロマトグラフィーの後に陰イオン交換ク
ロマトグラフィーを行えばよい。陰イオン交換クロマト
グラフィーは、従来公知のジエチルアミノエチル基、４
級アミノエチル基、スルホエチル基などを導入した陰イ
オン交換体を用いればよい。例えば、アガロース系のベ
ースマトリクスに弱陰イオン交換基であるジエチルアミ
ノエチル基を導入したＤＥＡＥ−Sepharose 陰イオン交
換体カラムを、ｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液
で平衡化し、ＥＧＦ活性を有するタンパク質を吸着さ
せ、同じ緩衝液で充分に洗浄した後、ｐＨ７．５の１１
０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液で溶
出させれば、９５％以上の純度にまで精製することがで
きる。
液に含まれる発熱性物質（パイロジェン）一種であるエ
ンドトキシンは、分画分子量１０，０００の限外濾過膜
を用いて除くことができる。限外濾過膜は、スパイラル
タイプ、中空糸タイプ、平板タイプ等どのようなタイプ
の膜を用いてもよい。ＥＧＦ活性を有するタンパク質を
含有する溶液は、ｐＨを３以下に調整しておくとよい。
更に、濃縮が進んだ段階で緩衝液を添加し、残存してい
るＥＧＦ活性を有するタンパク質を濾過液側に回収すれ
ばよい。次に、こうして得たＥＧＦ活性を有するタンパ
ク質含有液に含まれる塩類を分画分子量５，０００の限
外濾過膜を用いて除去する。スパイラルタイプ、中空糸
タイプ、平板タイプ等の限外濾過膜を用い、濃縮が進ん
だ段階でエンドトキシンフリーの水を加えて、塩を除去
する。また、本工程では脱塩と同時にＥＧＦ活性を有す
るタンパク質の濃縮も行う。これにより、液量もコンパ
クトにすることができ、以降凍結乾燥処理によって効率
的に粉末化することができる。このように、本発明の回
収精製法は、菌体を除去する工程を設けることなく、培
養物からＥＧＦ活性を有するタンパク質を高回収率で、
かつ高純度に精製が可能であり、また、パイロジェンや
塩も除去することが可能である。この回収精製法で得た
ＥＧＦ活性を有するタンパク質は、各種の用途に適用す
ることもできるが、さらに高純度である必要がある場合
には、流動床クロマトグラフィーの後に陰イオン交換ク
ロマトグラフィーを行えばよい。陰イオン交換クロマト
グラフィーは、従来公知のジエチルアミノエチル基、４
級アミノエチル基、スルホエチル基などを導入した陰イ
オン交換体を用いればよい。例えば、アガロース系のベ
ースマトリクスに弱陰イオン交換基であるジエチルアミ
ノエチル基を導入したＤＥＡＥ−Sepharose 陰イオン交
換体カラムを、ｐＨ７．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液
で平衡化し、ＥＧＦ活性を有するタンパク質を吸着さ
せ、同じ緩衝液で充分に洗浄した後、ｐＨ７．５の１１
０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液で溶
出させれば、９５％以上の純度にまで精製することがで
きる。
【００２３】また、分画分子量５，０００の限外濾過膜
処理後に逆相クロマトグラフィーを行うことによって
も、さらに高純度のＥＧＦ活性を有するタンパク質を得
ることができる。この逆相クロマトグラフィーは、従来
のシリカゲルベースにオクタデシル基、メチル基、フェ
ニル基などを導入した担体を用いればよい。例えば、シ
リカゲルにオクタデシル基を導入したＣ１８−１２０Ａ
カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ2Ｏ
緩衝液で平衡化し、ＥＧＦ活性を有するタンパク質を吸
着させた後、前記の緩衝液でカラムを充分に洗浄して不
純物を除去する。次に、前記緩衝液と０．１％ ＴＦＡ
／５０％アセトニトリル緩衝液とのグラジエントによっ
て溶出させれば、９５％以上の純度にまで精製すること
ができる。
処理後に逆相クロマトグラフィーを行うことによって
も、さらに高純度のＥＧＦ活性を有するタンパク質を得
ることができる。この逆相クロマトグラフィーは、従来
のシリカゲルベースにオクタデシル基、メチル基、フェ
ニル基などを導入した担体を用いればよい。例えば、シ
リカゲルにオクタデシル基を導入したＣ１８−１２０Ａ
カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ2Ｏ
緩衝液で平衡化し、ＥＧＦ活性を有するタンパク質を吸
着させた後、前記の緩衝液でカラムを充分に洗浄して不
純物を除去する。次に、前記緩衝液と０．１％ ＴＦＡ
／５０％アセトニトリル緩衝液とのグラジエントによっ
て溶出させれば、９５％以上の純度にまで精製すること
ができる。
【００２４】以下、本発明を実施例により更に詳しく説
明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれら
に限定されるものではない。
明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれら
に限定されるものではない。
【００２５】
【実施例１】 ｈ−ＥＧＦまたはＥＧＦ活性を有するタンパク質ＡＣを
コードする遺伝子で形質転換したバチルス・ブレビスを
培養したｈ−ＥＧＦ、タンパク質ＡＣを含む培養物の製
造
コードする遺伝子で形質転換したバチルス・ブレビスを
培養したｈ−ＥＧＦ、タンパク質ＡＣを含む培養物の製
造
【００２６】（１）ｈ−ＥＧＦ ｈ−ＥＧＦのアミノ酸配列をコードする合成遺伝子（BI
O INDUSTRY, 9, 100-107(1991)) を鋳型にし、配列番号
９のprimer５及び配列番号１０のprimer３を使って、常
法によりＰＣＲを行い、約２１０ｂｐのＤＮＡ断片を増
幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｐａＬＩとＰ
ｓｔＩで切断し、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行
い２０５ｂｐ断片を切り出し、電気溶出法（MolecularC
loning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory, 1989）により回収した。バチルス・
ブレビスＨＰ９２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３８２）が保
有するプラスミドｐＨＴ９２６より調製したプラスミド
ｐＨＴ１１０−ＥＧＦ（特開平６−１３３７８２）をＡ
ｐａＬＩとＰｓｔＩで切断後、０．８％アガロース電気
泳動を行い、３．３ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、GENE
CLEAN（Bio 101，USA）にて回収し、先に得た２０５ｂ
ｐのＤＮＡ断片とＴ４リガーゼでライゲーションし、配
列番号１のｈ−ＥＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝
子を保有するプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦを得た。
O INDUSTRY, 9, 100-107(1991)) を鋳型にし、配列番号
９のprimer５及び配列番号１０のprimer３を使って、常
法によりＰＣＲを行い、約２１０ｂｐのＤＮＡ断片を増
幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＡｐａＬＩとＰ
ｓｔＩで切断し、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行
い２０５ｂｐ断片を切り出し、電気溶出法（MolecularC
loning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory, 1989）により回収した。バチルス・
ブレビスＨＰ９２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３８２）が保
有するプラスミドｐＨＴ９２６より調製したプラスミド
ｐＨＴ１１０−ＥＧＦ（特開平６−１３３７８２）をＡ
ｐａＬＩとＰｓｔＩで切断後、０．８％アガロース電気
泳動を行い、３．３ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、GENE
CLEAN（Bio 101，USA）にて回収し、先に得た２０５ｂ
ｐのＤＮＡ断片とＴ４リガーゼでライゲーションし、配
列番号１のｈ−ＥＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝
子を保有するプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦを得た。
【００２７】このプラスミドでバチルス・ブレビスＨＰ
Ｄ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）をエレクトロポレ
ーション法（H.Takagi et al, Agric Biol.Chem., 53 3
099-3100(1989)) によって形質転換した。ここで得られ
たｐＨＴ−ｈＥＧＦを保持するバチルス・ブレビスＨＰ
Ｄ３１を寒天培地にて３０℃で１日培養し、ペプトン４
％、酵母エキス０．５％、グルコース２％、ＭｇＳＯ4
０．０１％、ＦｅＳＯ4 ０．００１％、ＭｎＳＯ4 ０．
０００１％、エリスロマイシン１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ
７．２の培地に一晩３０℃で振とう培養を行ったものを
前培養液とした。３０Ｌジャーファーメンターに前記培
地を１５Ｌ分注した後１２０℃で１５分滅菌し、前培養
液１５０ｍｌ接種し、３０℃、撹拌１２０ｒｐｍ、通気
量１ｖｖｍの条件で３日間培養を行った。培養上清中の
ｈ−ＥＧＦ量をＨＰＬＣ（カラム：Ｃ１８−１００Ａ、
径４ｍｍ×長さ２５０ｍｍ，バッファー：０．１％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ2Ｏ、０．１％ＴＦＡ／５
０％アセトニトリル、リニアグラジエント、検出：ＵＶ
２７６ｎｍ）で分析し、市販ｈ−ＥＧＦ（フナコシ
（株）社製）を標準品として同条件でＨＰＬＣを行った
時のピーク面積と比較して生産量を求めた結果、培養物
中に０．８ｇ／Ｌのｈ−ＥＧＦが生産されていた。
Ｄ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）をエレクトロポレ
ーション法（H.Takagi et al, Agric Biol.Chem., 53 3
099-3100(1989)) によって形質転換した。ここで得られ
たｐＨＴ−ｈＥＧＦを保持するバチルス・ブレビスＨＰ
Ｄ３１を寒天培地にて３０℃で１日培養し、ペプトン４
％、酵母エキス０．５％、グルコース２％、ＭｇＳＯ4
０．０１％、ＦｅＳＯ4 ０．００１％、ＭｎＳＯ4 ０．
０００１％、エリスロマイシン１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ
７．２の培地に一晩３０℃で振とう培養を行ったものを
前培養液とした。３０Ｌジャーファーメンターに前記培
地を１５Ｌ分注した後１２０℃で１５分滅菌し、前培養
液１５０ｍｌ接種し、３０℃、撹拌１２０ｒｐｍ、通気
量１ｖｖｍの条件で３日間培養を行った。培養上清中の
ｈ−ＥＧＦ量をＨＰＬＣ（カラム：Ｃ１８−１００Ａ、
径４ｍｍ×長さ２５０ｍｍ，バッファー：０．１％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ2Ｏ、０．１％ＴＦＡ／５
０％アセトニトリル、リニアグラジエント、検出：ＵＶ
２７６ｎｍ）で分析し、市販ｈ−ＥＧＦ（フナコシ
（株）社製）を標準品として同条件でＨＰＬＣを行った
時のピーク面積と比較して生産量を求めた結果、培養物
中に０．８ｇ／Ｌのｈ−ＥＧＦが生産されていた。
【００２８】（２）タンパク質ＡＣ （１）で得たプラスミドｐＨＴ−ｈＥＧＦより特願平８
−１２３９７０の方法に従ってＥＧＦ活性を有するタン
パク質ＡＣのアミノ酸配列（配列番号７）をコードする
遺伝子を保有するプラスミドｐＨＴ−ＡＣを得た。
（１）と同じ方法でバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を形
質転換し、得られた形質転換体の培養を行った。（１）
と同じ方法でタンパク質ＡＣの生産量を求めた結果、培
養物中に０．７ｇ／Ｌのタンパク質ＡＣが生産されてい
た。
−１２３９７０の方法に従ってＥＧＦ活性を有するタン
パク質ＡＣのアミノ酸配列（配列番号７）をコードする
遺伝子を保有するプラスミドｐＨＴ−ＡＣを得た。
（１）と同じ方法でバチルス・ブレビスＨＰＤ３１を形
質転換し、得られた形質転換体の培養を行った。（１）
と同じ方法でタンパク質ＡＣの生産量を求めた結果、培
養物中に０．７ｇ／Ｌのタンパク質ＡＣが生産されてい
た。
【００２９】
【実施例２】 流動床クロマトグラフィー、１０，０００膜濾過および
５，０００膜濾過によるバチルス・ブレビス培養物から
のｈ−ＥＧＦまたはＥＧＦ活性を有するタンパク質ＡＣ
の回収精製
５，０００膜濾過によるバチルス・ブレビス培養物から
のｈ−ＥＧＦまたはＥＧＦ活性を有するタンパク質ＡＣ
の回収精製
【００３０】（１）ｈ−ＥＧＦ （ａ）STREAMLINE ＳＰイオン交換体（ファルマシア
製、架橋アガロース骨格にスルホプロピル基を導入）を
注入したSTREAMLINE ５０カラム（ファルマシア製：直
径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ（可変式））の下方から２０
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を流速６Ｌ／
ｈで上昇法で６０分間送液し、イオン交換体の平衡化お
よび流動床の形成を行った。
製、架橋アガロース骨格にスルホプロピル基を導入）を
注入したSTREAMLINE ５０カラム（ファルマシア製：直
径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ（可変式））の下方から２０
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を流速６Ｌ／
ｈで上昇法で６０分間送液し、イオン交換体の平衡化お
よび流動床の形成を行った。
【００３１】実施例１−（１）で得たｈ−ＥＧＦを含む
培養物１５Ｌに撹拌しながら１Ｎ塩酸を添加してｐＨを
３．０に調整し、そのまま１２時間撹拌した。撹拌終了
後、培養物を先に調製したカラム下方から上昇法で流速
６Ｌ／ｈで送液し、ｈ−ＥＧＦをイオン交換体に接触、
吸着させた。
培養物１５Ｌに撹拌しながら１Ｎ塩酸を添加してｐＨを
３．０に調整し、そのまま１２時間撹拌した。撹拌終了
後、培養物を先に調製したカラム下方から上昇法で流速
６Ｌ／ｈで送液し、ｈ−ＥＧＦをイオン交換体に接触、
吸着させた。
【００３２】培養物送液終了後、２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ３．０）を流速６Ｌ／ｈで１時間カラム
下方から送液し、培養物由来でカラム内に残留している
バチルス・ブレビス菌体やイオン交換体に吸着しない不
純物を完全にカラム外へ洗い出した。送液を止め、イオ
ン交換体をカラム底部に沈降させ、カラムのベット高調
整のための可動式アダプターを沈降したイオン交換体表
面まで下げ、カラム上方から下降法で２０ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ３．０）を流速４Ｌ／ｈで１０分間
送液し、次に緩衝液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．５）に交換し、流速４Ｌ／ｈで下降法で送液
し、ｈ−ＥＧＦをイオン交換体から脱離、溶出させ、回
収した。回収したｈ−ＥＧＦの回収率および純度を求め
た結果、バチルス・ブレビス培養物からのｈ−ＥＧＦの
回収率は８５％と高収率であり、純度は、本工程だけで
８８％と飛躍的に上げることができた。
ム緩衝液（ｐＨ３．０）を流速６Ｌ／ｈで１時間カラム
下方から送液し、培養物由来でカラム内に残留している
バチルス・ブレビス菌体やイオン交換体に吸着しない不
純物を完全にカラム外へ洗い出した。送液を止め、イオ
ン交換体をカラム底部に沈降させ、カラムのベット高調
整のための可動式アダプターを沈降したイオン交換体表
面まで下げ、カラム上方から下降法で２０ｍＭ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ３．０）を流速４Ｌ／ｈで１０分間
送液し、次に緩衝液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．５）に交換し、流速４Ｌ／ｈで下降法で送液
し、ｈ−ＥＧＦをイオン交換体から脱離、溶出させ、回
収した。回収したｈ−ＥＧＦの回収率および純度を求め
た結果、バチルス・ブレビス培養物からのｈ−ＥＧＦの
回収率は８５％と高収率であり、純度は、本工程だけで
８８％と飛躍的に上げることができた。
【００３３】（ｂ）（ａ）で得たｈ−ＥＧＦ溶液のｐＨ
を６Ｎ塩酸で２．０に調整し、分画分子量１０，０００
の限外濾過膜（ペリコンカセット Ｂｉｏｍａｘ １０
（ミリポア社製））を用いて入口圧２ｂａｒで限外濾過
を行った。５００ｍｌ程度まで濃縮後、残留しているｈ
−ＥＧＦを充分に回収するために、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ２．０）１０Ｌを除除に加えながら濾
過を行い、ｈ−ＥＧＦを回収した。回収したｈ−ＥＧＦ
の純度を求め、またパイロジェンの一種であるエンドト
キシンレベルをリムルス法（日本薬局方解説書第１２版
廣川書店、Ｂ−５６（１９９１））で測定した。ｈ−
ＥＧＦの純度は９０％にまで上昇し、エンドトキシンレ
ベルも１２０ＥＵ／ｍｇ ＥＧＦから２ＥＵ／ｍｇ Ｅ
ＧＦまで減少させることができ、ほぼ完全にエンドトキ
シンを含有しないｈ−ＥＧＦを得ることができた。
を６Ｎ塩酸で２．０に調整し、分画分子量１０，０００
の限外濾過膜（ペリコンカセット Ｂｉｏｍａｘ １０
（ミリポア社製））を用いて入口圧２ｂａｒで限外濾過
を行った。５００ｍｌ程度まで濃縮後、残留しているｈ
−ＥＧＦを充分に回収するために、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ２．０）１０Ｌを除除に加えながら濾
過を行い、ｈ−ＥＧＦを回収した。回収したｈ−ＥＧＦ
の純度を求め、またパイロジェンの一種であるエンドト
キシンレベルをリムルス法（日本薬局方解説書第１２版
廣川書店、Ｂ−５６（１９９１））で測定した。ｈ−
ＥＧＦの純度は９０％にまで上昇し、エンドトキシンレ
ベルも１２０ＥＵ／ｍｇ ＥＧＦから２ＥＵ／ｍｇ Ｅ
ＧＦまで減少させることができ、ほぼ完全にエンドトキ
シンを含有しないｈ−ＥＧＦを得ることができた。
【００３４】（ｃ）次に、分画分子量５，０００の限外
濾過膜（ペリコンカセット Ｂｉｏｍａｘ ５（ミリポ
ア社製））を用いて限外濾過を行った。５００ｍｌ程度
まで濃縮後、残留している塩類を充分に除去するため
に、エンドトキシンフリー水１０Ｌを除除に加えながら
濾過を行った。回収したｈ−ＥＧＦの純度を求めた。ｈ
−ＥＧＦの純度は９２％にまで上昇し、塩を除去するこ
ともできた。
濾過膜（ペリコンカセット Ｂｉｏｍａｘ ５（ミリポ
ア社製））を用いて限外濾過を行った。５００ｍｌ程度
まで濃縮後、残留している塩類を充分に除去するため
に、エンドトキシンフリー水１０Ｌを除除に加えながら
濾過を行った。回収したｈ−ＥＧＦの純度を求めた。ｈ
−ＥＧＦの純度は９２％にまで上昇し、塩を除去するこ
ともできた。
【００３５】（２）タンパク質ＡＣ （１）と同じ条件で、実施例１−（２）で得たタンパク
質ＡＣを含むバチルス・ブレビス培養物１５Ｌからタン
パク質ＡＣの回収精製を行った。純度９２％でエンドト
キシンレベルが１ＥＵ／ｍｇ タンパク質ＡＣ、塩を含
まないタンパク質ＡＣを得た。
質ＡＣを含むバチルス・ブレビス培養物１５Ｌからタン
パク質ＡＣの回収精製を行った。純度９２％でエンドト
キシンレベルが１ＥＵ／ｍｇ タンパク質ＡＣ、塩を含
まないタンパク質ＡＣを得た。
【００３６】
【実施例３】 流動床クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラ
フィー、１０，０００膜濾過および５，０００膜濾過に
よるバチルス・ブレビス培養物からのｈ−ＥＧＦまたは
ＥＧＦ活性を有するタンパク質ＡＣの回収精製
フィー、１０，０００膜濾過および５，０００膜濾過に
よるバチルス・ブレビス培養物からのｈ−ＥＧＦまたは
ＥＧＦ活性を有するタンパク質ＡＣの回収精製
【００３７】（１）ｈ−ＥＧＦ 実施例２−（１）（ａ）で得たｈ−ＥＧＦ含有液のｐＨ
を１０Ｎ水酸化ナトリウムを用いて７．５に調整した。
これを、DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia社製）
陰イオン交換吸着体を充填した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝
液（ｐＨ７．５）２Ｌを送液し平衡化を行ったカラム
（直径５ｃｍ ｘ 長さ３０ｃｍ）に送液しｈ−ＥＧＦを
吸着させた。送液終了後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液
（ｐＨ７．５）１Ｌで洗浄を行い、次に、１１０ｍＭ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．
５）を送液しｈ−ＥＧＦを溶液させ回収した。以降実施
例２−（１）（ｂ）および（ｃ）工程と同じ方法で処理
し、純度９７％のｈ−ＥＧＦを得た。
を１０Ｎ水酸化ナトリウムを用いて７．５に調整した。
これを、DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia社製）
陰イオン交換吸着体を充填した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝
液（ｐＨ７．５）２Ｌを送液し平衡化を行ったカラム
（直径５ｃｍ ｘ 長さ３０ｃｍ）に送液しｈ−ＥＧＦを
吸着させた。送液終了後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液
（ｐＨ７．５）１Ｌで洗浄を行い、次に、１１０ｍＭ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．
５）を送液しｈ−ＥＧＦを溶液させ回収した。以降実施
例２−（１）（ｂ）および（ｃ）工程と同じ方法で処理
し、純度９７％のｈ−ＥＧＦを得た。
【００３８】（２）タンパク質ＡＣ （１）と同じ条件で、実施例２−（２）（ａ）で得たタ
ンパク質ＡＣ含有液をDEAE-Sepharose Fast Flow カラ
ムにてクロマトグラフィーを行った後、実施例２−
（１）（ｂ）および（ｃ）工程と同じ方法で処理し、純
度９６％のタンパク質ＡＣを得た。
ンパク質ＡＣ含有液をDEAE-Sepharose Fast Flow カラ
ムにてクロマトグラフィーを行った後、実施例２−
（１）（ｂ）および（ｃ）工程と同じ方法で処理し、純
度９６％のタンパク質ＡＣを得た。
【００３９】
【実施例４】 流動床クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、
１０，０００膜濾過および５，０００膜濾過によるバチ
ルス・ブレビス培養物からのｈ−ＥＧＦまたはＥＧＦ活
性を有するタンパク質ＡＣの回収精製
１０，０００膜濾過および５，０００膜濾過によるバチ
ルス・ブレビス培養物からのｈ−ＥＧＦまたはＥＧＦ活
性を有するタンパク質ＡＣの回収精製
【００４０】（１）ｈ−ＥＧＦ 実施例２−（１）（ｃ）で得たｈ−ＥＧＦ含有液１０ｍ
ｌを逆相クロマトグラフィーカラム（カラム：Ｃ１８−
１２０Ａ，径１５ｍｍ ｘ 長さ２５０ｍｍ）に送液し、
ｈ−ＥＧＦをカラムに吸着させ、０．１％ ＴＦＡ／Ｈ
2Ｏ 緩衝液１００ｍｌで洗浄後、０．１％ ＴＦＡ／
Ｈ2Ｏ 緩衝液と０．１％ ＴＦＡ／５０％アセトニト
リル 緩衝液 ４０：６０〜６０：４０ のリニアグラジ
エントで溶出させて回収し、純度９８％のｈ−ＥＧＦを
得た。
ｌを逆相クロマトグラフィーカラム（カラム：Ｃ１８−
１２０Ａ，径１５ｍｍ ｘ 長さ２５０ｍｍ）に送液し、
ｈ−ＥＧＦをカラムに吸着させ、０．１％ ＴＦＡ／Ｈ
2Ｏ 緩衝液１００ｍｌで洗浄後、０．１％ ＴＦＡ／
Ｈ2Ｏ 緩衝液と０．１％ ＴＦＡ／５０％アセトニト
リル 緩衝液 ４０：６０〜６０：４０ のリニアグラジ
エントで溶出させて回収し、純度９８％のｈ−ＥＧＦを
得た。
【００４１】（２）タンパク質ＡＣ （１）と同じ条件で、実施例２−（２）（ｃ）で得たタ
ンパク質ＡＣ含有液を逆相クロマトグラフィーを行い、
純度９８％のタンパク質ＡＣを得た。
ンパク質ＡＣ含有液を逆相クロマトグラフィーを行い、
純度９８％のタンパク質ＡＣを得た。
【００４２】
【発明の効果】本発明によって、ｈ−ＥＧＦその他の上
皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質をきわめて効率
的に且つ高純度で得ることができるので、優れた生理活
性を有するｈ−ＥＧＦ等のタンパク質を大量に製造する
ことができる。
皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質をきわめて効率
的に且つ高純度で得ることができるので、優れた生理活
性を有するｈ−ＥＧＦ等のタンパク質を大量に製造する
ことができる。
【００４３】
【配列表】ヒト、マウス、ブタおよびラットのＥＧＦの
アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１〜４に示し、ＥＧＦ
活性を有する４種類のタンパク質のアミノ酸配列をそれ
ぞれ配列５〜８に示す。配列番号９および１０は、ＰＣ
Ｒ用プライマーの塩基配列を示し、それぞれプライマー
５及びプライマー３の塩基配列を示す。下記表１〜１０
に、配列番号１〜１０で示される各配列を示す。
アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１〜４に示し、ＥＧＦ
活性を有する４種類のタンパク質のアミノ酸配列をそれ
ぞれ配列５〜８に示す。配列番号９および１０は、ＰＣ
Ｒ用プライマーの塩基配列を示し、それぞれプライマー
５及びプライマー３の塩基配列を示す。下記表１〜１０
に、配列番号１〜１０で示される各配列を示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
【表４】
【００４８】
【表５】
【００４９】
【表６】
【００５０】
【表７】
【００５１】
【表８】
【００５２】
【表９】
【００５３】
【表１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/09 9282−4Ｂ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:08）
Claims (6)
- 【請求項１】 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク
質を含有する培養物を（ａ）イオン交換体を浮遊させた
流動床カラムに上昇法で供給し、該タンパク質をイオン
交換体に吸着させ、非吸着物を洗浄除去後イオン交換体
を沈降させ、イオン交換体に吸着した該タンパク質を下
降法で溶出せしめる工程、（ｂ）この溶出液を、分画分
子量１０，０００の膜で濾過を行い、濾過画分に該タン
パク質を回収せしめる工程、（ｃ）この濾過液を、分画
分子量５，０００の膜で濾過を行い、濃縮画分に該タン
パク質を回収せしめる工程、で処理することを特徴とす
る上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精製
法。 - 【請求項２】 工程（ａ）の流動床カラムのイオン交換
体が、架橋アガロース骨格にスルホプロピル基を導入し
た陽イオン交換体であることを特徴とする請求項１に記
載の上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精
製法。 - 【請求項３】 工程（ａ）で得た上皮細胞増殖因子活性
を有するタンパク質含有液を、陰イオン交換クロマトグ
ラフィーカラムに供給し、該タンパク質を陰イオン交換
体に吸着させ、非吸着物を洗浄除去後、吸着した該タン
パク質を溶出せしめた後、工程（ｂ）及び工程（ｃ）に
供することを特徴とする請求項１または２に記載の上皮
細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精製法。 - 【請求項４】 工程（ｃ）で得た上皮細胞増殖因子活性
を有するタンパク質含有液を、逆相クロマトグラフィー
カラムに供給し、該タンパク質を担体に吸着させ、非吸
着物を洗浄除去後、吸着した該タンパク質を溶出せしめ
ることを特徴とする請求項１〜３に記載の上皮細胞増殖
因子活性を有するタンパク質の回収精製法。 - 【請求項５】 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク
質を含有する培養物が、バチルス・ブレビス菌体を含む
ことを特徴とする請求項１〜４に記載の上皮細胞増殖因
子活性を有するタンパク質の回収精製法。 - 【請求項６】 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク
質が、配列番号１に示したヒト上皮細胞増殖因子、配列
番号２に示したマウス上皮細胞増殖因子、配列番号３に
示したブタ上皮細胞増殖因子、配列番号４に示したラッ
ト上皮細胞増殖因子または配列番号５〜８に示したタン
パク質の少なくともひとつであることを特徴とする請求
項１〜５に記載の上皮細胞増殖因子活性を有するタンパ
ク質の回収精製法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21810996A JPH1042892A (ja) | 1996-08-01 | 1996-08-01 | タンパク質の回収精製法 |
| AU28698/97A AU716006B2 (en) | 1996-08-01 | 1997-07-17 | Process of recovering and purifying protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21810996A JPH1042892A (ja) | 1996-08-01 | 1996-08-01 | タンパク質の回収精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1042892A true JPH1042892A (ja) | 1998-02-17 |
Family
ID=16714777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21810996A Pending JPH1042892A (ja) | 1996-08-01 | 1996-08-01 | タンパク質の回収精製法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1042892A (ja) |
| AU (1) | AU716006B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002032537A3 (en) * | 2000-10-13 | 2002-07-11 | Lilly Co Eli | Improved method of expanded bed chromatography |
| JP2010106023A (ja) * | 1998-05-06 | 2010-05-13 | Genentech Inc | イオン交換クロマトグラフィによるタンパク質精製 |
-
1996
- 1996-08-01 JP JP21810996A patent/JPH1042892A/ja active Pending
-
1997
- 1997-07-17 AU AU28698/97A patent/AU716006B2/en not_active Ceased
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010106023A (ja) * | 1998-05-06 | 2010-05-13 | Genentech Inc | イオン交換クロマトグラフィによるタンパク質精製 |
| JP2013032365A (ja) * | 1998-05-06 | 2013-02-14 | Genentech Inc | イオン交換クロマトグラフィによるタンパク質精製 |
| WO2002032537A3 (en) * | 2000-10-13 | 2002-07-11 | Lilly Co Eli | Improved method of expanded bed chromatography |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU716006B2 (en) | 2000-02-17 |
| AU2869897A (en) | 1998-02-05 |
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