JPH104968A - Ｄｎａ - Google Patents
ＤｎａInfo
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- JPH104968A JPH104968A JP8161256A JP16125696A JPH104968A JP H104968 A JPH104968 A JP H104968A JP 8161256 A JP8161256 A JP 8161256A JP 16125696 A JP16125696 A JP 16125696A JP H104968 A JPH104968 A JP H104968A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- seq
- vector
- recombinant dna
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ペプチドを大量にかつ経済的に生産するた
めに有用な強力なプロモーター活性を有するＤＮＡを提
供する。 【構成】 配列表の配列番号１または配列番号２で表
わされるＤＮＡ、その一部分、配列表の配列番号１また
は配列番号２で表わされるＤＮＡにハイブリダイズする
ＤＮＡおよびハイブリダイズするＤＮＡの一部分。
めに有用な強力なプロモーター活性を有するＤＮＡを提
供する。 【構成】 配列表の配列番号１または配列番号２で表
わされるＤＮＡ、その一部分、配列表の配列番号１また
は配列番号２で表わされるＤＮＡにハイブリダイズする
ＤＮＡおよびハイブリダイズするＤＮＡの一部分。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子発現用の強い
（転写効率の高い）プロモーター活性を有するＤＮＡに
関する。
（転写効率の高い）プロモーター活性を有するＤＮＡに
関する。
【０００２】
【従来の技術】プロモーターとは、ＤＮＡを鋳型にして
ｍＲＮＡの転写を開始するＤＮＡ上の特定塩基配列とし
て知られている。また、ｍＲＮＡの合成酵素であるＲＮ
Ａポリメラーゼは、プロモーターを認識してｍＲＮＡの
合成をおこなう。プロモーターは転写の効率を決定して
おり、強いプロモーターの下流にある遺伝子のｍＲＮＡ
は大量に合成され、その結果、その遺伝子の遺伝子産物
も大量に生産される。
ｍＲＮＡの転写を開始するＤＮＡ上の特定塩基配列とし
て知られている。また、ｍＲＮＡの合成酵素であるＲＮ
Ａポリメラーゼは、プロモーターを認識してｍＲＮＡの
合成をおこなう。プロモーターは転写の効率を決定して
おり、強いプロモーターの下流にある遺伝子のｍＲＮＡ
は大量に合成され、その結果、その遺伝子の遺伝子産物
も大量に生産される。
【０００３】したがって、遺伝子工学的手法により、ペ
プチドを大量にかつ経済的に生産するには、強力なプロ
モーターを利用する必要がある。
プチドを大量にかつ経済的に生産するには、強力なプロ
モーターを利用する必要がある。
【０００４】現在、強力なプロモーターとして、ラクト
ースオペロンのプロモーター、トリプトファンのプロモ
ーター、ラムダファージのＰL プロモーター、ＳＶ４０
のプロモーター、メタロチオネインのプロモーターおよ
びサイトメガロウイルスのプロモーター等が知られてい
る。
ースオペロンのプロモーター、トリプトファンのプロモ
ーター、ラムダファージのＰL プロモーター、ＳＶ４０
のプロモーター、メタロチオネインのプロモーターおよ
びサイトメガロウイルスのプロモーター等が知られてい
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ペプ
チドを大量にかつ経済的に生産するために有用な強力な
プロモーター活性を有するＤＮＡを提供することであ
る。
チドを大量にかつ経済的に生産するために有用な強力な
プロモーター活性を有するＤＮＡを提供することであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した結果、あるＤＮＡが強力
なプロモーター活性を有することを見いだした。
を解決するために鋭意検討した結果、あるＤＮＡが強力
なプロモーター活性を有することを見いだした。
【０００７】
【発明の実施の形態】すなわち、本発明は次の発明１．
から発明１７．に関する。
から発明１７．に関する。
【０００８】発明１． 配列表の配列番号１で表わされ
るＤＮＡ。
るＤＮＡ。
【０００９】発明２． 配列表の配列番号２で表わされ
るＤＮＡ。
るＤＮＡ。
【００１０】発明３． 配列表の配列番号１または配列
番号２で表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮ
Ａ。
番号２で表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮ
Ａ。
【００１１】発明４． 発明１．〜発明３．のいずれか
１つの発明に記載のＤＮＡの一部分であるＤＮＡ。
１つの発明に記載のＤＮＡの一部分であるＤＮＡ。
【００１２】発明５． プロモーター活性を有する発明
１．〜発明４．のいずれか１つの発明に記載のＤＮＡ。
１．〜発明４．のいずれか１つの発明に記載のＤＮＡ。
【００１３】発明６． 発明１．〜発明５．のいずれか
１つの発明に記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ。
１つの発明に記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ。
【００１４】発明７． 発明６．に記載の組換えＤＮＡ
を含むベクター。
を含むベクター。
【００１５】発明８． プラスミドである発明７．に記
載のベクター。
載のベクター。
【００１６】発明９． 発明７．または発明８．に記載
のベクターにより形質転換された形質転換体。
のベクターにより形質転換された形質転換体。
【００１７】発明１０． 発明１．〜発明５．のいずれ
か１つの発明に記載のＤＮＡと該ＤＮＡの下流に連結さ
れた構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ。
か１つの発明に記載のＤＮＡと該ＤＮＡの下流に連結さ
れた構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ。
【００１８】発明１１． 発明１０．に記載の組換えＤ
ＮＡを含むベクター。
ＮＡを含むベクター。
【００１９】発明１２． プラスミドである発明１１．
に記載のベクター。
に記載のベクター。
【００２０】発明１３． 発明１１．または発明１２．
に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
に記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【００２１】発明１４． 発明１０．に記載の組換えＤ
ＮＡまたは発明１１．もしくは発明１２．に記載のベク
ターにより形質転換された動物。
ＮＡまたは発明１１．もしくは発明１２．に記載のベク
ターにより形質転換された動物。
【００２２】発明１５． 発明１３．に記載の形質転換
体を培養した培養物から構造遺伝子によりコードされる
ペプチドを分離し、採取するペプチドの製造方法。
体を培養した培養物から構造遺伝子によりコードされる
ペプチドを分離し、採取するペプチドの製造方法。
【００２３】発明１６． 発明１．〜発明５．のいずれ
か１つの発明に記載のＤＮＡを含む発現キット。
か１つの発明に記載のＤＮＡを含む発現キット。
【００２４】発明１７． 発明１０．に記載の組換えＤ
ＮＡまたは発明１１．もしくは発明１２．に記載のベク
ターを含む遺伝子治療用組成物。
ＮＡまたは発明１１．もしくは発明１２．に記載のベク
ターを含む遺伝子治療用組成物。
【００２５】以下に、本発明について説明する。
【００２６】本発明の配列表の配列番号１または配列番
号２で表わされるＤＮＡは、ラットの脳の染色体より抽
出されたものである。本発明者らは、このＤＮＡがプロ
モーター活性を有することを見いだした。
号２で表わされるＤＮＡは、ラットの脳の染色体より抽
出されたものである。本発明者らは、このＤＮＡがプロ
モーター活性を有することを見いだした。
【００２７】一般に、新規なＤＮＡが見いだされると、
当業者はそのＤＮＡの一部分または全部をプローブとし
て、ハイブリダイズするＤＮＡを種々のライブラリーを
用いて探索する。配列表の配列番号１または配列番号２
で表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたは
その一部分は、プロモーター活性を有することが予測さ
れる。
当業者はそのＤＮＡの一部分または全部をプローブとし
て、ハイブリダイズするＤＮＡを種々のライブラリーを
用いて探索する。配列表の配列番号１または配列番号２
で表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたは
その一部分は、プロモーター活性を有することが予測さ
れる。
【００２８】したがって、本発明のＤＮＡには、配列表
の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡのみ
ならず、その一部分、配列表の配列番号１または配列番
号２で表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡお
よびハイブリダイズするＤＮＡの一部分も含まれるもの
である。特に、プロモーター活性を有するものは本発明
に含まれる。
の配列番号１または配列番号２で表わされるＤＮＡのみ
ならず、その一部分、配列表の配列番号１または配列番
号２で表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡお
よびハイブリダイズするＤＮＡの一部分も含まれるもの
である。特に、プロモーター活性を有するものは本発明
に含まれる。
【００２９】ハイブリダイズするＤＮＡとは、配列表の
配列番号１もしくは配列番号２で表わされるＤＮＡまた
はその一部分をプローブにして、一般的な条件下で、ハ
イブリダイズするものをいう。ハイブリダイズの条件は
適宜検討すればよいが、例えば、０．７５Ｍ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、
０．２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
０．２％牛血清アルブミン、０．２％ポリビニルピロリ
ドン、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ ４００（ファルマシア社
製）、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、１６時間反
応させるといった条件を挙げることができるが、特にこ
の条件に限定されるべきものではない。
配列番号１もしくは配列番号２で表わされるＤＮＡまた
はその一部分をプローブにして、一般的な条件下で、ハ
イブリダイズするものをいう。ハイブリダイズの条件は
適宜検討すればよいが、例えば、０．７５Ｍ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、
０．２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
０．２％牛血清アルブミン、０．２％ポリビニルピロリ
ドン、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ ４００（ファルマシア社
製）、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃、１６時間反
応させるといった条件を挙げることができるが、特にこ
の条件に限定されるべきものではない。
【００３０】また、本発明においてハイブリダイズする
ＤＮＡとは、配列表の配列番号１または配列番号２で表
わされるＤＮＡの誘導体としても表現することができ
る。すなわち、配列表の配列番号１または配列番号２で
表わされるＤＮＡに対して、少なくとも約７０％の配列
同一性を有するものであり、例えば、ＤＮＡの配列に１
つまたは２つ以上のヌクレオチドが挿入されたもの、Ｄ
ＮＡの配列のどちらかの末端に１つまたは２つ以上のヌ
クレオチドが付加されたもの、ＤＮＡの配列のどちらか
の末端もしくは内部の１つまたは２つ以上のヌクレオチ
ドを欠失させたもの、さらにこれらが組合わさったもの
を挙げることができる。
ＤＮＡとは、配列表の配列番号１または配列番号２で表
わされるＤＮＡの誘導体としても表現することができ
る。すなわち、配列表の配列番号１または配列番号２で
表わされるＤＮＡに対して、少なくとも約７０％の配列
同一性を有するものであり、例えば、ＤＮＡの配列に１
つまたは２つ以上のヌクレオチドが挿入されたもの、Ｄ
ＮＡの配列のどちらかの末端に１つまたは２つ以上のヌ
クレオチドが付加されたもの、ＤＮＡの配列のどちらか
の末端もしくは内部の１つまたは２つ以上のヌクレオチ
ドを欠失させたもの、さらにこれらが組合わさったもの
を挙げることができる。
【００３１】本発明のＤＮＡは、公知の方法によって合
成することにより製造することもできる。
成することにより製造することもできる。
【００３２】本発明の組換えＤＮＡとは、プロモーター
活性を有する本発明のＤＮＡの下流に、発現させたいペ
プチドをコードする構造遺伝子を、構造遺伝子が正しく
転写される方向に連結されているものである。
活性を有する本発明のＤＮＡの下流に、発現させたいペ
プチドをコードする構造遺伝子を、構造遺伝子が正しく
転写される方向に連結されているものである。
【００３３】さらに、本発明における組換えＤＮＡにお
いては、プロモーター活性を有する本発明のＤＮＡの上
流または下流の適当な箇所に、エンハンサーやターミネ
ーター等の転写調節領域を連結することも可能である。
なお、組換えＤＮＡは公知の製造方法により製すること
ができる。
いては、プロモーター活性を有する本発明のＤＮＡの上
流または下流の適当な箇所に、エンハンサーやターミネ
ーター等の転写調節領域を連結することも可能である。
なお、組換えＤＮＡは公知の製造方法により製すること
ができる。
【００３４】プロモーター活性を有する本発明のＤＮＡ
の下流に連結される発現させたいペプチドをコードする
構造遺伝子は、特に限定されるべきものではないが、例
えば、生理活性物質をコードする遺伝子、遺伝子転写の
機能解析に用いられる遺伝子等を挙げることができる。
構造遺伝子の１種または複数をプロモーター活性を有す
る本発明のＤＮＡに連結することができる。
の下流に連結される発現させたいペプチドをコードする
構造遺伝子は、特に限定されるべきものではないが、例
えば、生理活性物質をコードする遺伝子、遺伝子転写の
機能解析に用いられる遺伝子等を挙げることができる。
構造遺伝子の１種または複数をプロモーター活性を有す
る本発明のＤＮＡに連結することができる。
【００３５】生理活性物質をコードする遺伝子として
は、例えば、プロスタグランジン、プロスタサイクリ
ン、トロンボキサン、ロイトコリエン、インターフェロ
ン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔ−ＰＡ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮成
長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞増
殖因子（ＨＧＦ）、心房性利尿ペプチド（ＡＮＰ）およ
びエリスロポエチン等をコードする遺伝子を挙げること
ができるが、特にこれらのものに限定されるべきもので
はない。
は、例えば、プロスタグランジン、プロスタサイクリ
ン、トロンボキサン、ロイトコリエン、インターフェロ
ン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔ−ＰＡ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮成
長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞増
殖因子（ＨＧＦ）、心房性利尿ペプチド（ＡＮＰ）およ
びエリスロポエチン等をコードする遺伝子を挙げること
ができるが、特にこれらのものに限定されるべきもので
はない。
【００３６】遺伝子転写の機能解析に用いられる遺伝子
としては、例えば、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、アルカリフォスファ
ターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびルシ
フェラーゼ遺伝子等を挙げることができるが、特にこれ
らのものに限定されるべきものではない。
としては、例えば、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、アルカリフォスファ
ターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびルシ
フェラーゼ遺伝子等を挙げることができるが、特にこれ
らのものに限定されるべきものではない。
【００３７】発現させたいペプチドを得るためには、組
換えＤＮＡをベクターに導入し、次いで、組換えＤＮＡ
を導入したベクターを用いて、宿主を形質転換すること
になる。宿主としては、例えば、ヒト、ウシ、マウス、
ラット、カイコといった動物の細胞等を挙げることがで
きる。
換えＤＮＡをベクターに導入し、次いで、組換えＤＮＡ
を導入したベクターを用いて、宿主を形質転換すること
になる。宿主としては、例えば、ヒト、ウシ、マウス、
ラット、カイコといった動物の細胞等を挙げることがで
きる。
【００３８】なお、宿主を形質転換するためのベクター
は、宿主−ベクター系を考慮して、選択することが必要
である。例えば、動物細胞用のベクターとしては、特に
限定されるべきものではないが、レトロウイルスやｐＭ
ＡＭ（クローンテック社製）等のプラスミド等を挙げる
ことができる。なお、組換えＤＮＡを導入したベクター
は公知の製造方法により製することができる。
は、宿主−ベクター系を考慮して、選択することが必要
である。例えば、動物細胞用のベクターとしては、特に
限定されるべきものではないが、レトロウイルスやｐＭ
ＡＭ（クローンテック社製）等のプラスミド等を挙げる
ことができる。なお、組換えＤＮＡを導入したベクター
は公知の製造方法により製することができる。
【００３９】組換えＤＮＡを導入したベクターを用い
て、宿主を形質転換することによって、構造遺伝子によ
りコードされる発現させたいペプチドを形質転換体にお
いて発現させることができる。
て、宿主を形質転換することによって、構造遺伝子によ
りコードされる発現させたいペプチドを形質転換体にお
いて発現させることができる。
【００４０】ベクターを用いた宿主の形質転換は公知の
方法により行うことができる。例えば、リン酸カルシウ
ム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔ
ｒａｎ法、プロトプラスト法等（Molecular Cloning,-A
laboratory manual-,secondedition Cold Spring Harb
ar Laboratory Press 1989）を挙げることができるが、
特に限定されるべきものではない。
方法により行うことができる。例えば、リン酸カルシウ
ム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔ
ｒａｎ法、プロトプラスト法等（Molecular Cloning,-A
laboratory manual-,secondedition Cold Spring Harb
ar Laboratory Press 1989）を挙げることができるが、
特に限定されるべきものではない。
【００４１】発現させたいペプチドを得るには、形質転
換体を培地で培養し、培養物からペプチドを単離し、採
取すればよい。発現させたいペプチドを考慮して、培養
方法・条件等は適宜検討すればよいが、培地としては、
例えば、約５〜２０％の牛血清（ＦＣＳ）を添加したＭ
ＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）等を挙げることができる。
換体を培地で培養し、培養物からペプチドを単離し、採
取すればよい。発現させたいペプチドを考慮して、培養
方法・条件等は適宜検討すればよいが、培地としては、
例えば、約５〜２０％の牛血清（ＦＣＳ）を添加したＭ
ＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地
（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）等を挙げることができる。
【００４２】ペプチドの単離・採取方法としては、例え
ばゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、逆相
クロマトグラフィー法およびアフィニティークロマトグ
ラフィー法等を挙げることができるが、特に限定される
べきものではない。
ばゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、逆相
クロマトグラフィー法およびアフィニティークロマトグ
ラフィー法等を挙げることができるが、特に限定される
べきものではない。
【００４３】また、発現させたいペプチドをコードする
構造遺伝子を含む組換えＤＮＡまたはベクターを用い
て、受精卵を形質転換すると、形質転換された動物（ト
ランスジェニックアニマル）を作成することもできる。
形質転換する動物としては、ウシ、ブタ、ヒヒ、マウ
ス、ラット、モルモット、イヌといった動物を挙げるこ
とができる。
構造遺伝子を含む組換えＤＮＡまたはベクターを用い
て、受精卵を形質転換すると、形質転換された動物（ト
ランスジェニックアニマル）を作成することもできる。
形質転換する動物としては、ウシ、ブタ、ヒヒ、マウ
ス、ラット、モルモット、イヌといった動物を挙げるこ
とができる。
【００４４】さらに、本発明のＤＮＡと発現させたいペ
プチドをコードする構造遺伝子を含むベクターは、ヒト
等の遺伝子治療に用いることができる。
プチドをコードする構造遺伝子を含むベクターは、ヒト
等の遺伝子治療に用いることができる。
【００４５】遺伝子治療に適した疾患としては、適用す
るのに適していれば特に限定すべきものではないが、例
えば、遺伝的に特定の生理活性物質がまったく産生され
ない、あるいはその産生が異常に低いレベルにある遺伝
病、腫瘍、がん等を挙げることができる。
るのに適していれば特に限定すべきものではないが、例
えば、遺伝的に特定の生理活性物質がまったく産生され
ない、あるいはその産生が異常に低いレベルにある遺伝
病、腫瘍、がん等を挙げることができる。
【００４６】遺伝的に特定の生理活性物質がまったく産
生されない、またはその産生が異常に低いレベルにある
遺伝病としては、例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損
症、血友病Ａ、血友病Ｂ、フェニルケトン尿症、成長ホ
ルモン欠損症、Ｄｅｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、
オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症およびアン
チトロンビンＩＩＩ欠損症等を挙げることができる。
生されない、またはその産生が異常に低いレベルにある
遺伝病としては、例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損
症、血友病Ａ、血友病Ｂ、フェニルケトン尿症、成長ホ
ルモン欠損症、Ｄｅｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、
オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症およびアン
チトロンビンＩＩＩ欠損症等を挙げることができる。
【００４７】これらの疾患についての遺伝子治療は、遺
伝的に欠損している遺伝子または、がん遺伝子の発現を
抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明の
ＤＮＡの下流に正しく転写される方向に連結した組換え
ＤＮＡをヒト等に投与することにより行われる。投与に
際しては、組換えＤＮＡをベクターやリポソーム、リン
パ球等に導入して行うことが好ましい。
伝的に欠損している遺伝子または、がん遺伝子の発現を
抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明の
ＤＮＡの下流に正しく転写される方向に連結した組換え
ＤＮＡをヒト等に投与することにより行われる。投与に
際しては、組換えＤＮＡをベクターやリポソーム、リン
パ球等に導入して行うことが好ましい。
【００４８】したがって、本発明の遺伝子治療用組成物
とは、組換えＤＮＡ、または組換えＤＮＡを導入したベ
クター、リポソーム、リンパ球等を含有した組成物をい
う。
とは、組換えＤＮＡ、または組換えＤＮＡを導入したベ
クター、リポソーム、リンパ球等を含有した組成物をい
う。
【００４９】なお、本発明の遺伝子治療用組成物をヒト
等に投与する方法としては、経口的または非経口的に投
与する方法が挙げられるが、非経口的に投与するのが好
ましい。また、投与量については、疾患や患者の状態等
を考慮して検討すればよい。
等に投与する方法としては、経口的または非経口的に投
与する方法が挙げられるが、非経口的に投与するのが好
ましい。また、投与量については、疾患や患者の状態等
を考慮して検討すればよい。
【００５０】経口的に投与するための製剤としては、例
えば、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、錠
剤、液剤、ドライシロップ等を挙げることができる。ま
た、非経口的に投与するための製剤としては、例えば、
注射剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、貼付剤等を挙
げることができる。
えば、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、錠
剤、液剤、ドライシロップ等を挙げることができる。ま
た、非経口的に投与するための製剤としては、例えば、
注射剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、貼付剤等を挙
げることができる。
【００５１】またヒト等に投与する際には、薬理学的ま
たは製剤学的に許容し得る添加物を本発明の遺伝子治療
用組成物に添加することができる。
たは製剤学的に許容し得る添加物を本発明の遺伝子治療
用組成物に添加することができる。
【００５２】添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊
剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、等張化剤、ｐＨ調節
剤、安定化剤、着色剤等種々のものを挙げることができ
る。
剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、等張化剤、ｐＨ調節
剤、安定化剤、着色剤等種々のものを挙げることができ
る。
【００５３】次に、本発明を実施例により説明するが、
本発明はこれに限定されるべきものではない。
本発明はこれに限定されるべきものではない。
【００５４】
１．ＤＮＡの調製 Analytical Biochemistry.,219,131(1994)に記載の方法
により８週令のウイスター系ラットの脳から、まず染色
体ＤＮＡを抽出し、これをＭｓｅ Ｉ（ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｍｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）、Ｂａｍ ＨＩ（東洋紡績
社製）の２種類の制限酵素で各々３７℃で２時間ずつ反
応させ、ＤＮＡを低分子化した。低分子化したＤＮＡ断
片をＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（東洋紡績社製）で３７℃で１時間反応させ、末端
を平滑化した。
により８週令のウイスター系ラットの脳から、まず染色
体ＤＮＡを抽出し、これをＭｓｅ Ｉ（ＮｅｗＥｎｇｌ
ａｍｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）、Ｂａｍ ＨＩ（東洋紡績
社製）の２種類の制限酵素で各々３７℃で２時間ずつ反
応させ、ＤＮＡを低分子化した。低分子化したＤＮＡ断
片をＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（東洋紡績社製）で３７℃で１時間反応させ、末端
を平滑化した。
【００５５】２．ベクターＤＮＡの調製 ｐＣＡＴベクター（プロメガ社製）をＰｓｔ Ｉ（東洋
紡績社製）を用い、３７℃で２時間反応させ、ＤＮＡを
切断した。切断したＤＮＡ末端をＫｌｅｎｏｗＦｒａｇ
ｍｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）で３７
℃で１時間反応させ、末端を平滑化した。更に、Ａｌｋ
ａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ７５：宝酒造社製）で６５℃で１時間反応させ、ＤＮ
Ａの５’末端のリン酸を除去した。
紡績社製）を用い、３７℃で２時間反応させ、ＤＮＡを
切断した。切断したＤＮＡ末端をＫｌｅｎｏｗＦｒａｇ
ｍｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）で３７
℃で１時間反応させ、末端を平滑化した。更に、Ａｌｋ
ａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ７５：宝酒造社製）で６５℃で１時間反応させ、ＤＮ
Ａの５’末端のリン酸を除去した。
【００５６】３．ＤＮＡの連結（組換えＤＮＡの構築） 上記１．で調製したＤＮＡと２．で調製したベクターＤ
ＮＡをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用
いて、両ＤＮＡを連結した。すなわち、両ＤＮＡの混合
液１溶に対し、４倍溶のＡ液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕ
ｆｆｅｒ）と１倍溶のＢ液（Ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔ
ｉｏｎ）を加えて、１６℃で１６時間反応させ、組換え
ＤＮＡを含有するベクターを作製した。
ＮＡをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用
いて、両ＤＮＡを連結した。すなわち、両ＤＮＡの混合
液１溶に対し、４倍溶のＡ液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕ
ｆｆｅｒ）と１倍溶のＢ液（Ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔ
ｉｏｎ）を加えて、１６℃で１６時間反応させ、組換え
ＤＮＡを含有するベクターを作製した。
【００５７】４．形質転換体の作製 上記３．で得た組換えＤＮＡを含有するベクターをコン
ピテント細胞（大腸菌：ＤＨ５、ＢＲＬ社製）に導入
し、形質転換を行い、形質転換体を得た。この形質転換
体はアンピシリン耐性を持つものであったので、組換え
ＤＮＡを含有するベクターであることが確認できた。
ピテント細胞（大腸菌：ＤＨ５、ＢＲＬ社製）に導入
し、形質転換を行い、形質転換体を得た。この形質転換
体はアンピシリン耐性を持つものであったので、組換え
ＤＮＡを含有するベクターであることが確認できた。
【００５８】５．プラスミドＤＮＡの抽出 各々の形質転換体から、プラスミドＤＮＡを抽出した。
【００５９】６．プラスミドＤＮＡのマウス繊維芽細胞
（Ｌ細胞）への導入 上記５．で得られたプラスミドＤＮＡ２０μｇをリン酸
カルシウム法により約１０6 細胞のＬ細胞に導入し、３
日間反応させた。このとき、コントロールとして、サイ
トメガロウイルスのプロモーターを有するｐＣＡＴプロ
モーターベクター（プロメガ社製）を用いた。
（Ｌ細胞）への導入 上記５．で得られたプラスミドＤＮＡ２０μｇをリン酸
カルシウム法により約１０6 細胞のＬ細胞に導入し、３
日間反応させた。このとき、コントロールとして、サイ
トメガロウイルスのプロモーターを有するｐＣＡＴプロ
モーターベクター（プロメガ社製）を用いた。
【００６０】７．クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイ 上記６．で作成した細胞をＰＢＳで洗った後、剥がし、
スピッツ試験管で２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し
て細胞を集めた。集めた細胞をｐＨ７．８の１００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液１００μｌに懸濁した。細胞の懸濁
液を凍結−融解（液体窒素−３７℃水槽）−攪拌を３回
繰り返し、細胞を壊した。４℃において、１５０００ｒ
ｐｍで５分間、遠心分離して上清を得た。この溶液の蛋
白質濃度を定量し、シンチレーションカウンター用チュ
ーブに５０μｇの蛋白質に相当する量（最大容量５０μ
ｌ）をとり、１．２５ｍＭのクロラムフェニコール２０
０μｌと１４Ｃ−ブチリルコエンザイムＡ（ＮＥＮ リ
サーチ プロダクツ社製）１０μｌを混合し、エコノフ
ロアー（Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒ）（ＮＥＮ リサーチ
プロダクツ社製）５ｍｌを重層し、室温で３時間反応さ
せた。その後、液体シンチレーションカウンター（ベッ
クマンＬＳ３８０１）にてＣＡＴ活性を測定した。
スフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイ 上記６．で作成した細胞をＰＢＳで洗った後、剥がし、
スピッツ試験管で２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し
て細胞を集めた。集めた細胞をｐＨ７．８の１００ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液１００μｌに懸濁した。細胞の懸濁
液を凍結−融解（液体窒素−３７℃水槽）−攪拌を３回
繰り返し、細胞を壊した。４℃において、１５０００ｒ
ｐｍで５分間、遠心分離して上清を得た。この溶液の蛋
白質濃度を定量し、シンチレーションカウンター用チュ
ーブに５０μｇの蛋白質に相当する量（最大容量５０μ
ｌ）をとり、１．２５ｍＭのクロラムフェニコール２０
０μｌと１４Ｃ−ブチリルコエンザイムＡ（ＮＥＮ リ
サーチ プロダクツ社製）１０μｌを混合し、エコノフ
ロアー（Ｅｃｏｎｏｆｌｕｏｒ）（ＮＥＮ リサーチ
プロダクツ社製）５ｍｌを重層し、室温で３時間反応さ
せた。その後、液体シンチレーションカウンター（ベッ
クマンＬＳ３８０１）にてＣＡＴ活性を測定した。
【００６１】８．結果 多数の組換えＤＮＡを含有するベクターのＣＡＴ活性を
解析したところ、コントロールのサイトメガロウイルス
のプロモーターを挿入したｐＣＡＴプロモーターベクタ
ー（プロメガ社製）と同等のＣＡＴ活性を有するＤＮＡ
（配列表の配列番号１および配列番号２）を含むベクタ
ーを見いだした。結果を図１に示す。なお、配列表の配
列番号１および２は、センスとアンチセンスの関係にあ
る。
解析したところ、コントロールのサイトメガロウイルス
のプロモーターを挿入したｐＣＡＴプロモーターベクタ
ー（プロメガ社製）と同等のＣＡＴ活性を有するＤＮＡ
（配列表の配列番号１および配列番号２）を含むベクタ
ーを見いだした。結果を図１に示す。なお、配列表の配
列番号１および２は、センスとアンチセンスの関係にあ
る。
【００６２】
【発明の効果】本発明のＤＮＡは、強力なプロモーター
活性を有しており、ペプチドを大量にかつ経済的に生産
するために有用である。
活性を有しており、ペプチドを大量にかつ経済的に生産
するために有用である。
【００６３】また、プロモーター活性を有する配列表の
配列番号１および配列番号２で表わされるＤＮＡは、セ
ンスとアンチセンスの関係にあるため、プロモーターと
発現させたいペプチドの構造遺伝子の連結において、転
写の方向に留意せずに、組換えＤＮＡ等の構築を行うこ
とができる。
配列番号１および配列番号２で表わされるＤＮＡは、セ
ンスとアンチセンスの関係にあるため、プロモーターと
発現させたいペプチドの構造遺伝子の連結において、転
写の方向に留意せずに、組換えＤＮＡ等の構築を行うこ
とができる。
【図１】図１は、本発明のプロモーター活性を有するＤ
ＮＡを含有するベクターのＣＡＴ活性を示すものであ
る。
ＮＡを含有するベクターのＣＡＴ活性を示すものであ
る。
配列番号：１ 配列の長さ：２２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：ラッテス ナーベジカス（Rattus nervegicus
） 組織の種類：脳 配列 TAATGGCAGA AAAAGTGAGA TGACACAGAA CCTTCCCCTA ATAAATAAAG ATTTCAAGGA 60 GCCAATCAGT GGGTGAGTAG GAGGGACTTC TGAGTTGGAA AGGGAAAGAG AGGAAGCAGG 120 AGAAACAATA GGTCATTTGG ACCAGAGACA GCATGGAGGC CAAAATGTAG GTAGCAGAGC 180 TGCCCCCTGC CAACCTCCTC CACTCCCCCA ATTCAGGTGG TGGATC 226 配列番号：２ 配列の長さ：２２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：ラッテス ナーベジカス（Rattus nervegicus
） 組織の種類：脳 配列 ＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣ ＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧ ＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧ ＡＧ
ＧＴＴＧＧＣＡＧ ＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣ ＴＧＣＴＡＣＣＴＡＣ ６０ ＡＴＴＴＴＧＧＣＣＴ ＣＣＡＴＧＣＴＧＴＣ ＴＣＴＧＧＴＣＣＡＡ ＡＴ
ＧＡＣＣＴＡＴＴ ＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧ ＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴ １２０ ＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣ ＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧ ＴＣＣＣＴＣＣＴＡＣ ＴＣ
ＡＣＣＣＡＣＴＧ ＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴ ＴＧＡＡＡＴＣＴＴＴ １８０ ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ ＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴ ＧＴＧＴＣＡＴＣＴＣ ＡＣ
ＴＴＴＴＴＣＴＧ ＣＣＡＴＴＡ ２２６
） 組織の種類：脳 配列 TAATGGCAGA AAAAGTGAGA TGACACAGAA CCTTCCCCTA ATAAATAAAG ATTTCAAGGA 60 GCCAATCAGT GGGTGAGTAG GAGGGACTTC TGAGTTGGAA AGGGAAAGAG AGGAAGCAGG 120 AGAAACAATA GGTCATTTGG ACCAGAGACA GCATGGAGGC CAAAATGTAG GTAGCAGAGC 180 TGCCCCCTGC CAACCTCCTC CACTCCCCCA ATTCAGGTGG TGGATC 226 配列番号：２ 配列の長さ：２２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：ラッテス ナーベジカス（Rattus nervegicus
） 組織の種類：脳 配列 ＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣ ＣＴＧＡＡＴＴＧＧＧ ＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧ ＡＧ
ＧＴＴＧＧＣＡＧ ＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣ ＴＧＣＴＡＣＣＴＡＣ ６０ ＡＴＴＴＴＧＧＣＣＴ ＣＣＡＴＧＣＴＧＴＣ ＴＣＴＧＧＴＣＣＡＡ ＡＴ
ＧＡＣＣＴＡＴＴ ＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧ ＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴ １２０ ＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣ ＡＡＣＴＣＡＧＡＡＧ ＴＣＣＣＴＣＣＴＡＣ ＴＣ
ＡＣＣＣＡＣＴＧ ＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴ ＴＧＡＡＡＴＣＴＴＴ １８０ ＡＴＴＴＡＴＴＡＧＧ ＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴ ＧＴＧＴＣＡＴＣＴＣ ＡＣ
ＴＴＴＴＴＣＴＧ ＣＣＡＴＴＡ ２２６
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 38/16 37/04 38/22 37/24 38/46 37/54 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (17)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で表わされるＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】 配列表の配列番号２で表わされるＤＮ
Ａ。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１または配列番号２で
表わされるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項１〜請求項３のいずれか１項に記
載のＤＮＡの一部分であるＤＮＡ。 - 【請求項５】 プロモーター活性を有する請求項１〜請
求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項１〜請求項５のいずれか１項に記
載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項６に記載の組換えＤＮＡを含むベ
クター。 - 【請求項８】 プラスミドである請求項７に記載のベク
ター。 - 【請求項９】 請求項７または請求項８に記載のベクタ
ーにより形質転換された形質転換体。 - 【請求項１０】 請求項１〜請求項５のいずれか１項に
記載のＤＮＡと該ＤＮＡの下流に連結された構造遺伝子
を含む組換えＤＮＡ。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の組換えＤＮＡを含
むベクター。 - 【請求項１２】 プラスミドである請求項１１に記載の
ベクター。 - 【請求項１３】 請求項１１または請求項１２に記載の
ベクターにより形質転換された形質転換体。 - 【請求項１４】 請求項１０に記載の組換えＤＮＡまた
は請求項１１もしくは請求項１２に記載のベクターによ
り形質転換された動物。 - 【請求項１５】 請求項１３に記載の形質転換体を培養
した培養物から構造遺伝子によりコードされるペプチド
を分離し、採取するペプチドの製造方法。 - 【請求項１６】 請求項１〜請求項５のいずれか１項に
記載のＤＮＡを含む発現キット。 - 【請求項１７】 請求項１０に記載の組換えＤＮＡまた
は請求項１１もしくは請求項１２に記載のベクターを含
む遺伝子治療用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16125696A JP3754499B2 (ja) | 1996-06-21 | 1996-06-21 | Ｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16125696A JP3754499B2 (ja) | 1996-06-21 | 1996-06-21 | Ｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH104968A true JPH104968A (ja) | 1998-01-13 |
| JP3754499B2 JP3754499B2 (ja) | 2006-03-15 |
Family
ID=15731641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16125696A Expired - Fee Related JP3754499B2 (ja) | 1996-06-21 | 1996-06-21 | Ｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3754499B2 (ja) |
-
1996
- 1996-06-21 JP JP16125696A patent/JP3754499B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP3754499B2 (ja) | 2006-03-15 |
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