JPH10500008A - 乾燥プロトロンビン時間アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の改良検査製品は、血液又は血漿を塗布するのに好適な検査製品におおわれた乾燥トロンボプラスチン配合物、サンプルの吸い上げ及び分布を助長する凝固中性剤、及びサンプル塗布と検査製品内での凝固の始まりとの間に経過した時間を検知するメカニズムを有する。改良トロンボプラスチンは、検査サンプルで再水和する間、プロトロンビン時間反応に対して高感受性及び高特異性を維持するように選択される。トロンボプラスチンは、水性媒体で組織因子−脂質トロンボプラスチン複合体の溶解を助長する脂質フラクションを用いて、純粋な組織因子配合物を再脂質化することにより合成で調製されるのが好ましい。最も好ましい態様として、トロンボプラスチンは、組換えＤＮＡ合成化ヒト組織因子を用いて調製される。

Description

【発明の詳細な説明】 乾燥プロトロンビン時間アッセイ 発明の背景1．発明の分野 本発明は一般に、プロトロンビン時間血液凝固検査に関し、特に乾燥試薬プロ トロンビン時間検査製品、及び血液又は血漿の存在下の乾燥トロンボプラスチン の再水和によるプロトロンビン時間検査法に関する。 外科手術を行う患者の出血感受性（bleeding susceptibility）を決定するこ と、及び血塊予防のための抗凝血療法を行う患者をモニターすることを含めて、 さまざまな目的のために血液凝固検査は行われる。種々の凝固検査が現在用いら れている。最もポピュラーなものの１つとして、『プロトロンビン時間（ＰＴ） 』検査があり、これは検査を行う血液サンプル中のトロンボプラスチンによるプ ロテアーゼVII因子の活性による外因性凝固経路の誘発に依存している。 外因性凝固経路は、トロンビンの生成という結果を生じ、このトロンビンはフ ィブリノーゲンからフィブリンへの転換を触媒化するタンパク分解酵素である。 このような転換は、凝血メカニズムにおいて本質的な作用である。 ここで、このような血液凝固検査は、一般的に臨床実験室に限定される作業を 伴い、複雑でありがちである。このような一点集中の検査は、外科患者には十分 であるが、抗凝血療法をモニターするのに規則的に医院又はクリニックに通院す るのは、より許容できない。よって、簡便で、実用的な家庭用凝固モニター検査 の必要性が生じてくる。 家庭用血液検査の成功により、その他の化学物質、例えばコレステロール及び グルコースに対して工夫がなされている。家庭用の最も好適な装置の中には、予 混合された検査成分をすべて含む乾燥試薬検査装置があり、長期間の保管に好適 な乾燥した形態で保存されている。これらの乾燥試薬検査装置には、検査片及び 小さなプラスチック容器などが含まれている。 乾燥試薬アッセイは、典型的には液相アッセイより正確さに欠ける。これは、 ２者間の形態上の相違によるものである。液相アッセイは、反応が生じる容器の 壁で形成される非常に単純かつ均一な反応ゾーンを有する。一方、乾燥試薬アッ セイは、乾燥反応化学物質と支持マトリクスとの表面により形成される複雑な反 応ゾーンを有している。典型的には、乾燥試薬支持マトリクスは、多孔膜である か又はキャピラリーギャップチャンバー（capillary gap chamber）であり、液 相アッセイで典型的に用いられる反応キュベットより高い表面積／体積比を有し ている。よって、乾燥試薬アッセイに入れる検査サンプルは、さまざまな方法で アッセイ成分と相互作用する、非常に多くの機会を得て、正確さの損失となる。 乾燥試薬アッセイの正確さが非常に低ければ、この検査は実用的な臨床応用に本 質的に無意味になるであろう。 検査の正確さは、分散係数によって最もうまく表現される。これは、同じサン プルを非常に多く検査して得られた検査結果を、オーバーオールの検査シグナル の大きさで割った、分散の比率である。複数の検査実験における分散が、オーバ ーオールの検査シグナルと比較して大きいとき、この検査は正確さに欠けている 。逆に、検査結果の分散が、オーバーオールの検査シグナルと比較して小さいと き、この検査は正確さに富んでいる。よって、検査の正確さを向上するのに２つ の方法がある。第１の方法は、シグナルの大きさを維持して検査結果の分散を減 少させる方法であり、第２の方法は、分散を本質的に定常に維持しつつシグナル の大きさを増大させる方法である。しばしば、検査シグナルの大きさを増大させ る第２の方法が、正確さを向上させるのに最も実用的な方法である。 血液及び血漿は、凝血プロセスを調節するセリンプロテアーゼの科（family） を含んでいる。これらのセリンプロテアーゼは、凝固『因子』と呼ばれており、 典型的にはローマ数字で示されており（因子が酵素活性状態であるならばａの添 字が付いている）、正確に調節された増幅カスケードで作用して組織が損傷した 部位で血塊を形成する。これらの血塊は、損傷部位で止血するように作用する。 この血液凝固の特定のモードを、『外因性』凝固経路という。 通常の組織は、組織因子と呼ばれる、グリコプロテインで区切られる膜を含ん でおり、組織が損傷すると作用する。外因性凝固プロセスは、この組織因子が凝 固因子VII及び／又はVII(a)と複合体を形成するときに始まる。次に、この組織 因子−因子VII(a)複合体は因子Ｘを活性化し、補因子（co-factor）Ｖと共に、 不活性プロトロンビンプロテアーゼを活性トロンビン酵素に転換する。その後ト ロンビン は、フィブリノーゲンをフィブリンに転換し、実際の血塊を形成する。このプロ セスは、『組織因子及びヘモスタシス（Tissue Factor and Hemostasis）』、Y. Nemerson，Blood 71(1)，1-8頁（1988年）に詳細に説明してあり、これらの開示 内容すべてが参考として本明細書に含まれる。本明細書での術語は、ネメルソン に追随する。プロトロビン時間検査は、この凝固経路を開始するトロンボプラス チンと呼ばれる組織抽出物を用いて、インビトロで凝固経路を剌激する。 従来のＰＴアッセイは通常、アセトン乾燥脳組織の水性抽出物から精製したト ロンボプラスチンを使用していた。この原抽出物（crude extract）は多くの成 分を含んでいる。通常のトロンボプラスチンの有効成分は、因子VII反応性分子 複合体の特性が不完全である混合物であり、各々は『組織因子』タンパク質と抽 出後に存在する脳脂質の混合物との相互作用により形成されている。一方、合成 組換えトロンボプラスチン（ｒ−ＤＮＡトロンボプラスチン）は、比較的簡単で 、精製組換え組織因子タンパク、及び精製人工脂質群（lipid population）で形 成された、特性を明確にした複合体からなる。 液相アッセイにおいて、異なるトロンボプラスチン配合物により、異なるプロ トロンビン時間を有する血液サンプル間の識別力を向上させるか又は減少させる 。より大きな識別力を有するトロンボプラスチンは、『感受性がよい』と呼ばれ る。トロンボプラスチン配合物の液相感受性は、国際感受性指標（internationa l sensitivity index）、即ちＩＳＩを用いることによって段階付けされる。こ のＩＳＩ値は、問題となるトロンボプラスチンのロットに観測されるプロトロン ビン時間と、トロンボプラスチンの標準化ロットに観測されるプロトロンビン時 間（ＩＳＩ値が１を有すると標準的に定められる）とを、対数スケールでプロッ トすることにより見出される。ＩＳＩ値は、得られた線の傾きであり、参照トロ ンボプラスチンのＩＳＩを掛ける。 測定尺度自身は多少直観的でない。感受性のよいトロンボプラスチンは、典型 的には1.0近辺の低いＩＳＩ数を有し、感受性の悪いトロンボプラスチンのロッ トは、典型的には２〜３近辺の高いＩＳＩ数を有する。ロット間差の分子レベル での説明は、現在完全にはなされていない。 プロトロンビン時間アッセイの場合、高い正確性が臨床的には非常に重要であ る。分散の簡素化（severity）に依存して、国際標準化比率（International No rmalized Ratio）（ＩＮＲ）2.5は、不明確な検査で、ＩＮＲ 2.0又は3.0を有す るものとして報告されるであろう。そのような不明確さにより、異なる臨床決定 をもたらすであろう。ＩＮＲ 2.0という結果を得たのであれば、物理学者は抗凝 固投与量を増加するように決定するであろうし、ＩＮＲ 3.0という結果を得たの であれば、抗凝固投与量を減少するように決定するであろう。ＩＮＲ 2.5という 『間違った』検査結果が、抗凝固投与量を全く調節しない決定を生じるので、双 方の決定は、良好になろうとしている患者に著しい衝撃を与えるであろうし、間 違いが多いであろう。 これらの臨床の問題のため、乾燥試薬プロトロビン時間アッセイの正確さを向 上させる方法が、この分野でかなり重要である。2．背景技術の説明 組換えＤＮＡ技術で製造したトロンボプラスチン及び組織因子は、米国特許第 5,110,730号及び同第4,966,852号に記載されている。液相アッセイのための高感 受性を有するトロンボプラスチンの調製方法は、米国特許第5,270,451号及び同 第4,416,812号に記載されている。プロトロビン時間検査での組換え組織因子の 使用は、トリポジ（A．Tripodi）、アービニ（A．Arbini）、シャンタランクル （V．Chantarangkul）、マニッチ（P．Mannucci）、“Recombinant Tissue Fact oras Substitute for Conventional Thromboplastin in the Prothrombin Time Test”、Thrombosis and Haemostasis 67(1)巻、41〜45頁（1992年）に記載され ている。トロンボプラスチンの型間の感受性の相違を説明する国際標準化比率（ ＩＮＲ）は、カークウッド（T．Kirkwood）、“Calibration of Reference Thro mboplastins and Standardization of the Prothrombin Time Ratio”、Thromb ．Haemostasis 49(3)巻、238-244頁（1983年）、及び“Requirements for Throm boplastins and Plasma used to Control Oral Anticoagulant Therapy”、WHO Expert Committee on Biological Standardization，33rd Report，WHO Tech Re p．Ser 1983; 687:81-105に記載されている。組織因子がプロトロンビン時間凝 固カスケードで因子VIIaを活性化するメカニズムは、カーシュナスワミー（S．K irshnaswamy）、“The Interaction of Human Factor Vlla with Tissue Factor”、The Journal of Biological Chemistry 267(33)巻、23696-23706頁（ 1992年）に記載されており、これらの開示内容は参考として本明細書に含まれる 。 乾燥トロンボプラスチンを有する検査片を用いる乾燥試薬プロトロンビン時間 検査は、共に係属中の出願、出願番号07/874,667号及び同08/003,791号に記載さ れており、これらの開示内容すべてが本明細書に参考として含まれる。 発明の概要 本発明にしたがって、乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイを行うための改良 検査製品及び方法は、高精製で、特性を明確にしたトロンボプラスチン配合物を 使用する。このようなトロンボプラスチン配合物は、検査サンプル中の凝固因子 VII(a)の活性に高程度で感受性及び特異性を維持するように選択される一方、ト ロンボプラスチンは乾燥状態から水和状態に転換する。組換えＤＮＡ技術で調製 した人工再脂質化（relipidating）組織因子で調製したトロンボプラスチンであ る（以下、『組換えトロンボプラスチン』という）のが、特に有用で良い。 驚くべきことに、液相ＩＳＩ値とほとんど同じ値を有するトロンボプラスチン 配合物を乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイに組み込んだとき、ＩＳＩ値を著 しく異なるものにできることを見出した。精製天然トロンボプラスチンを用いて 、この効果は、周辺臨床利用での乾燥試薬プロトロンビン時間検査において結果 として得られる。一方、組換えトロンボプラスチンがこの効果により耐性を示す ことがわかった。組換えトロンボプラスチンは、液相及び乾燥試薬検査の双方に おいてほとんど同じ感受性（ＩＳＩ）を有し、かつ優秀な臨床利用性を有する乾 燥試薬プロトロンビン時間アッセイをもたらす。 この相違点の説明として、トロンボプラスチン反応の生化学から生じるものが あげられる。組織因子及びトロンボプラスチンの活性は、組織因子タンパクとそ の周囲の脂質群（lipid population）との相関により大いに影響を受ける。溶液 中の組織因子タンパクそれ自身は、本質的に不活性である。このタンパクは、活 性化するには脂質マトリクス内でなければならない。脂質及び脂質タンパクは、 単層、ミセル、及び２重層の形態での規則的な集合体として水相に存在する。こ れらの集合体は、疎水性の脂質構成物間の相互作用、及びその周囲の水性マトリ クスに大いに依存する構造を有する。この効果のより完全な議論が、デービッド ・ローン（J．David Rawn）、Biochemistry、第９章219-232頁“The structure of biological membranes”（Neil Patterson Publishers，North Carolina）に なされており、この開示内容は本明細書に参考として含まれる。 液相プロトロビン時間アッセイにおいて、精製天然トロンボプラスチン及び組 換えトロンボプラスチンの双方は、液相で平衡に存在するであろう。特に、トロ ンボプラスチンの組織因子部分及び脂質因子部分は、比較的安定なミセル分布で あり、比較的矛盾のない状態でサンプル（因子VII）と相互作用する。一方、乾 燥試薬アッセイにおいて、トロンボプラスチンは、サンプルで再水和する間、多 くの劇的な構造再配列を経験する。特に、トロンボプラスチンの脂質及びタンパ ク成分は、イオン性相互作用が支配しており、疎水性効果が存在しない乾燥相間 から、疎水性相互作用が著しい液相に転移しなければならない。これらの２層間 内で、多くの短命の遷移状態が形成される。これらの遷移状態は短命であるが、 それら自体独特の特性を有する。水を乾燥洗浄剤に添加すると、同様な遷移が観 察される。即ち、溶液は、最終的に『清澄な』安定相に落ちつく前に、『濁った 』中間相を通過する。 液相ＰＴアッセイと乾燥試薬ＰＴアッセイとのキーとなる相違点は、凝固検査 サンプルの因子VII(a)成分が、液相検査では中間体トロンボプラスチン遷移状態 に暴露されておらず、よってそれらの影響を受けない点である。その一方、乾燥 試薬プロトロンビン時間検査において、凝固検査サンプルの因子VII(a)成分は、 これらの中間体状態に暴露されている。 従来の液相ＰＴアッセイと乾燥試薬ＰＴアッセイとの第２の相違点は、乾燥試 薬検査製品が典型的には、可溶性ポリマー又はタンパク剤を１種以上含んでいる 点である。これらは、液体アッセイでの検査化学薬品に関していわゆる不活性で ある（プロトロビン時間検査に対して凝固『中性』である）が、乾燥試薬検査を 適切に作用させる役割を有している。このような薬剤を用いて、液体サンプルの 乾燥試薬キャリヤへの吸い上げ（uptake）を調節し、検査成分の拡散を制御し、 乾燥試薬検査化学物質の溶解を助長するか、又は乾燥試薬検査成分の長期貯蔵安 定性を助長することができる。そのような薬剤として、単純なポリマー、例えば ヒドロキシルプロピルセルロース、ガントレズ（gantrez）、ポリビニルアルコ ール、及びポリエチレングリコールなどがあげられる。タンパク質、例えばウシ 血清アルブミンなども用いる。グルコースのような糖、トレハロース、スターチ 又はデキストランのようなポリサッカライドも、これらの目的で用いられる。ト リトンX-100（登録商標Triton X-100）などのような洗浄剤も用いられる。 そのような凝固『中性』薬剤は適切な乾燥試薬検査作用に必要であるが、再水 和プロセスの間、トロンボプラスチンの構造状態に影響を与えることができる。 特に、そのような薬剤は、再水和プロセスの間、トロンボプラスチン感受性（凝 固因子VII(a)との相互作用能）に負の方向に衝撃を与えることができる。不幸な ことに、精製天然トロンボプラスチンについて、初期の再水和後に数分間形成さ れる中間遷移状態のいくつかは、異常な感受性を示す機能的なトロンボプラスチ ンとしてのプロトロンビン時間サンプルであるようである。これは、乾燥試薬ア ッセイの臨床的な利用を減少させる。 しかし、予期せぬことに、組換えトロンボプラスチンを使用する乾燥試薬プロ トロンビン時間アッセイが異常にうまく作用することがわかった。ｒ−ＤＮＡト ロンボプラスチンをベースとする乾燥試薬アッセイは、従来のトロンボプラスチ ンを用いて典型的に得られる感受性における特有の変化を示さない。結果として 、これらのアッセイは、内部サンプル分散を増加させずに、異なるプロトロビン 時間でのサンプル間の向上した識別力をもたらす。これにより、アッセイの正確 さが増大する。 組換えトロンボプラスチンを使用するプロトロンビン時間アッセイの向上した 性能は、ｒ−ＤＮＡ試薬の純粋な特性に直接関連するようである。精製天然トロ ンボプラスチンの複合体組成物は、再水和の際に生じる非常に多くの中間遷移状 態を生じる。一方、比較的単純で、特性が明確となっている、組換えトロンボプ ラスチンの組成物は、再水和の際、ほとんど中間遷移状態とならない。結果とし て、異常な感受性を有するトロンボプラスチンの中間遷移形態をもたらす確率が 減少する。 また、トロンボプラスチンは、乾燥及び液体状態の相転移を行うものとして概 説されている。より純粋で、より均一な出発材料（組換えトロンボプラスチン） は典型的に、純粋さが欠け、均一でない材料（従来のトロンボプラスチン）より 、一層鋭く、よりはっきりした相転移を行うであろう。 トロンボプラスチンが再水和されるとき、異常な中間遷移状態を生じる物質が ない乾燥トロンボプラスチン、特に、脳抽出物から精製したトロンボプラスチン に見出されるそのような異常なトロンボプラスチン遷移状態物質がない乾燥トロ ンボプラスチンをプロトロンビン時間検査に用いたとき、検査サンプルがより小 さなさまざまな中間トロンボプラスチン遷移状態に暴露され、初期『不活性』無 水和トロンボプラスチンとその後の活性で完全に水和したトロンボプラスチンと の間でより鋭い遷移が生じるという、ともかく、驚くべき、信じがたい結果が得 られる。双方の効果は好ましく、かつ双方の効果により異なるプロトロンビン時 間値を有するサンプル間で、より大きな識別力を有する乾燥試薬プロトロンビン 時間アッセイをもたらす。このような検査を、正確さを増大させて行う。 図面の簡単な説明 図１は、液相プロトロンビン時間アッセイの感受性における異なるトロンボプ ラスチンによる効果を示す。ＩＳＩ感受性指標が1.2〜3.0である、３つの通常の トロンボプラスチンを、『Ｘ』軸に示す。また、ＩＳＩ感受性指標が0.92である 組換えトロンボプラスチンも示している。グラフの『Ｙ』軸は、アッセイの相対 感受性を示し、レベルII制御血漿とレベルI制御血漿とで得られたプロトロンビ ン時間差を秒で表している。ｒ−ＤＮＡトロンボプラスチンの感受性は、通常の トロンボプラスチンの挙動から外挿した曲線となる。 図２は、乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイにおける異なるトロンボプラス チン配合物による効果を示す。ＩＳＩ感受性指標が1.2〜3.0である、３つの通常 のトロンボプラスチンを、『Ｘ』軸に示す。また、ＩＳＩ感受性指標が0.92であ る組換えトロンボプラスチンも示している。グラフの『Ｙ』軸は、アッセイの相 対感受性を示し、レベルII制御血漿とレベルＩ制御血漿とで得られたプロトロン ビン時間差を秒で表している。組換えトロンボプラスチンの感受性が、通常のト ロンボプラスチンの挙動から外挿した曲線からはずれていることに注意を要する 。 図３は、反応キュベット内の凍結乾燥トロンボプラスチンからなる、乾燥試薬 プロトロンビン時間アッセイの感受性における、異なるトロンボプラスチン配合 物による効果を示す。ＩＳＩ感受性指標が1.2〜3.0である、３つの通常のトロン ボプラスチンを、『Ｘ』軸に示す。また、ＩＳＩ感受性指標が0.92である組換え トロンボプラスチンも示している。グラフの『Ｙ』軸は、アッセイの相対感受性 を示し、レベルII制御血漿とレベルＩ制御血漿とで得られたプロトロンビン時間 差を秒で表している。組換えトロンボプラスチンの感受性が、通常のトロンボプ ラスチンの挙動から外挿した曲線上にあることに注意を要する。 図４は、液相プロトロンビン時間アッセイと、乾燥試薬プロトロンビン時間検 査片アッセイとの感受性における、異なるトロンボプラスチン配合物による効果 を直接比較している。『Ｘ』軸には、液相アッセイにおいて、３つの通常のトロ ンボプラスチン及び１つの組換えトロンボプラスチンを用いる、レベルＩ制御と レベルII制御との間のＰＴ時間差を示している。『Ｙ』軸は、同じトロンボプラ スチンを用いる、乾燥試薬検査片アッセイにおける、レベルＩ制御とレベルII制 御との間のＰＴ時間差を示している。再度、組換えトロンボプラスチンの感受性 が、通常のトロンボプラスチンの挙動から外挿した曲線からはずれていることに 注意を要する。 図５は、液相プロトロンビン時間アッセイと、単純化乾燥試薬プロトロンビン 時間アッセイとの感受性における、異なるトロンボプラスチン配合物による効果 を直接比較している。『Ｘ』軸には、液相アッセイにおいて、３つの通常のトロ ンボプラスチン及び１つの組換えトロンボプラスチンを用いる、レベルＩ制御と レベルII制御との間のＰＴ時間差を示している。『Ｙ』軸は、同じトロンボプラ スチンを用いる、単純化乾燥試薬アッセイにおける、レベルＩ制御とレベルII制 御との間のＰＴ時間差を示している。再度、単純化乾燥試薬アッセイに対する、 組換えトロンボプラスチンの感受性が、通常のトロンボプラスチンの挙動から外 挿した曲線上にあることに注意を要する。 特定の態様の説明 本発明の改良検査製品は、未希釈化血液又は血漿を塗布するのに好適な検査製 品に固定した乾燥合成トロンボプラスチン配合物を有する。検査製品は通常、サ ンプルの吸い上げ（uptake）及び分散を助長するのに用いる乾燥凝固中性剤も含 んでおり、サンプル塗布と、検査製品内での凝固の開始との間で経過する時間を 検知する検知メカニズムで使用することができる。 トロンボプラスチンが検査サンプルで再水和される間、乾燥合成トロンボプラ スチンは、プロトロンビン時間反応についての高感受性及び高特異性を維持する ように選択される。特に、トロンボプラスチンを再水和するとき、異常な中間遷 移状態を引き起こす物質を実質的に存在しておらず、より特に、脳抽出物から精 製したトロンボプラスチンに見出される異常作用トロンボプラスチン遷移状態物 質を存在していない。水性媒体での組織因子−脂質トロンボプラスチン複合体の 溶解を促進する脂質フラクションを用いて、純粋組織因子配合物の再脂質化（re lipidation）により、トロンボプラスチンを調製するのが好ましい。最も好まし い態様としては、組換えＤＮＡ合成ヒト組織因子を用いて、トロンボプラスチン を調製する。例示の乾燥合成トロンボプラスチンは、バクスターヘルスケア社（ Baxter Healthcare Corporation，Dade Davision，Miami，Florida）から購入可 能なイノヴィン（Innovin商標）トロンボプラスチンのような再脂質化（relipid ated）組換えヒト組織因子である。 固相は、非吸水又は吸水構造であってもよい。非吸水構造は典型的には、検査 する血液又は血漿サンプルを受け入れる、不連続キャピラリー流通経路を有する 非透過性構造であろう。乾燥トロンボプラスチン及び任意に含めてもよい凝固天 然剤を、キャピラリー流通経路の壁にコートし、それにより、サンプルがキャピ ラリー作用で吸い上げられると、トロンボプラスチンが再水和される。 吸水構造は、液体を吸収でき、所望のアッセイを行うのに必要な試薬を乾燥形 態で含むことができる材料からなっていてもよい。紙、メチルセルロース、及び 多孔性ポリマー等を含む、広範な吸水マトリクス材料を用いることができる。小 さなサンプルを分析する好ましい態様として、吸水マトリクスは、血液細胞、特 に赤血球（赤血球）を排除するが血液血漿及びタンパクを侵入させる孔の寸法を 有する、親水性（吸水性）、非膨潤ポリマー性マトリクス材料からなる多孔性膜 構造であろう。膜は、ミクロン（μｍ）オーダーの幅を有する曲がりくねった網 目状チャネルからなる発泡状構造を有する単一の、連続ポリマー性材料からなる 。曲がりくねった網目状チャネルは、チャネルの空隙により占められる『孔体積 』 が全膜体積のかなりのパーセンテージ、典型的には10％以上で、『密に充填され 』ている。すべての反応化学、及び次のシグナル発生が孔体積で生じるので、強 いシグナルを得るのに高い孔体積が望ましい。平均チャネル長が長いと、反応化 学が生じる膜のゾーンと、膜の表面上にある過剰のサンプルとの間で増大した隔 離をもたらす傾向にあるので、（核孔（nucleopore）膜で得られる短くて直接の 孔のような）直線状で直接的な孔より、曲がりくねった網目状チャネルが望まし い。これにより、適用するサンプルの体積変化に対して、系を感受性の少ないも のとすることができる。 多孔質膜構造は、多孔質マトリクスの内部に入っている血漿の凝固を引き起こ し、血液の凝固能の指標としての検知信号をもたらすのに必要な試薬を組み込む ことになるであろう。多孔質膜のポリマー性マトリクス材料が誘発される凝固経 路と実質的に相互作用がないことは、本発明にとって特に重要である。特に、ポ リマー性マトリクス材料は、表面効果、相互作用、及び初期化経路の凝固又は不 活性成分を誘発するであろう人工物からフリーであるべきである。凝固経路の意 図しない初期化は、間違った正の決定をもたらし、酵素不活性は、間違った負の 決定をもたらすであろう。よって、ポリマー性マトリクス材料は、膜内に発生す る凝固反応での効果を推進しないか又は減衰させることが重要である。膜が凝固 検査での使用に許容できるか否かを決定するのに用いる基準が、共に係属中の出 願、出願番号07/874,667号に詳細に記載してあり、この開示内容すべてが参考と して本明細書に含まれる。血液凝固アッセイを行うのに特に好ましいポリマー性 マトリクス材料は、フィルトライト−メンテック社（Filterite-Memtec，9690 D eeveco Road，Suite 7，Timonium，Maryland 21093,カタログ番号BTS-25）から 購入可能な0.45μｍ非対称ポリスルホン膜材料である。 凝固中性剤は、液体サンプルが固相に吸い上げられるのを増大する一方、測定 したプロトロンビン時間に効果をほとんど又は全く示さないように選択される。 好適な薬剤には、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質；ヒドロキシルプロピ ルセルロース、ガントレズ、ポリビニルアルコール、及びポリエチレングリコー ルのようなポリマー；グルコース及びトレハロースのような糖類；スターチ及び デキストランのようなポリサッカライド；及びポリオキシエチレンエーテルのよ うな界面活性剤が挙げられる。 膜をさらに加工して検査片にする。この検査片は、膜のサンプル塗布面側に、 典型的にはギャップにより離れた、空間的に離隔した電極の形態のカバー構造、 及び膜のその反対側に透明片支持体を有する。 使用の際、サンプルを膜のサンプル塗布面に塗布するとき、37℃にする検査片 保持ステージを備え、かつ電極間の抵抗降下をモニターするのに付いている手段 を備えた蛍光検知器内に検査片を置く。その後、蛍光検知器は、膜の下方面上に 観察される蛍光について一連の蛍光測定を行う。そのような検査製品及び検知器 を作る、より詳細な基準は、共に係属中の出願、出願番号08/003,771号に詳細に 記載してあり、この開示内容すべてが参考として本明細書に含まれる。 トロンボプラスチン配合物は、存在又は不存在に関して、もしくは機能検査で 異常作用中間トロンボプラスチン遷移状態物質に関して検査することができる。 これを行うために、トロンボプラスチンのサンプルを水溶液に溶解し、異なる外 因性凝固経路活性（プロトロンビン時間）を有する、因子VII／VII(a)を含む血 液又は血漿を用いて、トロンボプラスチンの完全に水和化挙動を液相プロトロン ビン時間検査で特徴づけ。次に、問題となるトロンボプラスチン配合物の水和化 サンプルを乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイに組み込む。それには、１種以 上の凝固中性剤をさらに含んでおり、乾燥試薬アッセイの作用を助長する。乾燥 試薬アッセイでの水和化トロンボプラスチンサンプルの挙動を、異なる外因性凝 固経路活性を有する、因子VII／VII(a)含有血液又は血漿サンプルでそれを再水 和することにより、評価する。異なるプロトロンビン時間のサンプル間で不連続 とする乾燥試薬アッセイの能力が、液相プロトロンビン時間アッセイに比較して 減ずるならば、トロンボプラスチンサンプルが、異常作用中間トロンボプラスチ ン遷移状態物質を有するとみなされる。実験 トロンビン基質：Boc-Val-Pro-OH及びTos-Gly-Pro-OHをバケム・バイオサイエ ンス（Bachem Bioscience，Philadelphia，PA）から購入した。マンゲルら（Man gel，et al．（米国特許第4,557,862号及び同第4,640,893号））の方法にしたが って、Boc-Val-Pro-OH及びTos-Gly-Pro-OHをそれぞれローダミン110に結合 させることにより、（Boc-Val-Pro-Arg）₂-ローダミン110及び（Tos-Gly-Pro-Ar g）₂-ローダミン110を調製した。 膜：非対称ポリスルホン膜を、メンテック社（Memtec Corporation，Timmoniu m，MD）から得た。 トロンボプラスチン：デード（Dade）トロンボプラスチンＣ、Ｃプラス、ＩＳ 、及びイノヴィン（Innovin）（組換えＤＮＡ源から調製したヒトトロンボプラ スチン）をバクスターヘルスケア社（Baxter Healthcare Corporation，Miami， Florida）から得た。 制御血漿：市販入手可能な制御血漿を、シグマ（Sigma）から得た。これらは 、C-7916レベルＩ凝固制御（活性化部分的トロンボプラスチン時間及び通常限界 内のプロトロンビン時間）、C-8916レベルII凝固制御（活性化部分的トロンボプ ラスチン時間及びプロトロンビン時間に対する穏やかに上昇した値）、及びシグ マC-9916レベルIII凝固制御（活性化部分的トロンボプラスチン時間及びプロト ロンビン時間に対する厳しく上昇した値）であった。 用いたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、シグマA3294、プロテアーゼ−フリ ーフラクションＶパウダーであった。 膜調製：特記しない限り、試薬溶液、即ち『ディップス（“dips”）』は、0. 1M HEPES pH7.4、10mM CaCl₂、20mg/Mlシグマプロテアーゼフリーウシ血清アル ブミン、87-89%加水分解ポリビニルアルコール50mg/Ml（MW13,000-23,000,Aldri ch Chemical Company）、40%標準溶液の等価物を得るために調製した凍結乾燥ト ロンボプラスチン、及び蛍光トロンビン基質2x10^-4Mからなっていた。溶解を促 進するために、ローダミン-110ベースの蛍光トロンビン基質を50%イソプロパノ ールの10Xストック溶液に予溶解した。典型的には、まずＢＳＡ及びＰＶＡ成分 を溶解することにより、溶液を製造した。これら生物学的に活性な成分に対して 可能な限りダメージを与えないために、トロンボプラスチン及びトロンビン基質 を最後に添加した。 膜の片面（大きな孔、透過側）を試薬ディップ表面に約５秒間優しく接触させ ることにより、膜をコートした。過剰物を優しく拭い、その後、コートした膜を 、機械的対流式オーブン内で50℃で15分間、即座に空気乾燥した。その後、乾燥 し た膜を使用するまで、室温又は４℃でシリカゲル乾燥剤を備える密封した容器に 入れて保存した。 測定基礎研究の間、蒸発を防止するために、３Ｍ 415両面テープを用いて、調 製した膜を１ｍｍ厚のアルミホイルでカバーした10ｍｍ厚の透明スチレン上に置 いた。サンプルを透明スチレン層側から観た。 測定器：乾燥試薬プロトロンビン時間膜を、25ナノメーター帯幅を有する550 ナノメーターのフィルターを備えた装置で観察した。試料を、25ナノメーター帯 幅を有する550ナノメーターのフィルターを通したタングステンランプで照明し た。この装置は、加熱試薬ステージをさらに有し、アッセイの間、膜を37℃に保 持した。 装置双方は、ジーメンス（Siemens）BPW-34Bフォトディテクターを用いた。フ ォトディテクターからの出力をアンプで増幅し、12ビットアナログデジタル変換 器で編集し、ＩＢＭコンパチブルパーソナルコンピュータに記録した。 参照装置：参照プロトロンビン時間値をＭＬＡエレクトラ（Electra）750凝固 メーターを用いて得た。 実施例１：液体及び乾燥試薬プロトロンビン時間検査における異なるトロンボ プラスチン型の効果。この実験において、ＩＳＩ評価点が1.2〜2.9の３つの通常 のトロンボプラスチン、及びＩＳＩ評価点が0.92の１つの組換えトロンボプラス チンを用いて、プロトロンビン時間検査を行った。トロンボプラスチンを少量に 分け、１つ目を液相プロトロンビン時間アッセイを行うのに用い、２つ目を乾燥 プロトロンビン時間検査片を調製するのに用いた。その後、プロトロンビン時間 反応を、これらの検査片を用いて行った。用いたトロンボプラスチンを表１に示 す。 その後、液相アッセイ及び乾燥試薬アッセイの双方を、シグマレベルＩ凝固制 御（公称ＩＮＲが1.0）とシグマレベルII凝固制御（公称ＩＮＲが約3.0）とで テストした。液相アッセイを、検査管型反応キュベットでの濁度変化をモニター することにより光学的に血餅形成を測定するＭＬＡエレクトラ750装置で行った 。 共に係属中の出願、出願番号第08/003,771号に記載されているように、サーモ スタット制御の光学的蛍光測定で乾燥試薬アッセイを行った。その他の実験（示 していない）は、サンプルの初期塗布と、標準化蛍光強度が最大値（時間０での 蛍光強度をゼロとし、最大蛍光の蛍光強度を１とする）の10％を最初に越えた時 間との間で経過した時間、Time_10%Max又は（Ｔ_10%）とする、その時間が、古典 的な、液相、プロトロンビン時間値と本質的に等価である結果を得たことを示し ている。言及しない限り、乾燥試薬のすべての結果は、このＴ_10%値をベースと している。 液相及び乾燥試薬プロトロンビン時間検査で得られた、制御レベルIIとレベル Ｉプロトロンビン時間値との差を、その後、トロンボプラスチン試薬の公称液相 ＩＳＩ評価値に対してプロットした。液相の結果を図１に示し、乾燥試薬の結果 を図２に示す。見ればわかるように、液相プロトロンビン時間の結果は、古典的 なＩＳＩ感受性計算に追従している。ＩＳＩが2.9から0.92に減少すると、（よ り感受性がよくなり）、レベルIIとレベルＩとのプロトロンビン時間値を区別す る試薬系の能力が連続的に増大する。通常のトロンボプラスチンで得られた感受 性曲線を、ＩＳＩ値0.92に外挿すると、組換えトロンボプラスチンはほとんど正 確にこの曲線と合致する。 一方、乾燥試薬の結果は全く異なっている。液相の結果と比較して、通常のト ロンボプラスチンがＩＳＩ 1.2〜2.9の間で変化するとき、試薬の感受性におい てほんの少しの増加しか存在しない。通常のトロンボプラスチンで得られた感受 性曲線をＩＳＩ値0.92に外挿すると、組換えトロンボプラスチンは予期した挙動 から鋭い偏差を示す。通常のトロンボプラスチン活性の外挿をベースとして、予 期したもの以上の感受性である。 実施例２：単純化乾燥試薬アッセイにおける異なるトロンボプラスチン型の効 果。理想の挙動からの乾燥状態でのトロンボプラスチンの偏差が、すべて再水和 効果によるものであるのか、又は乾燥トロンボプラスチンとその他の乾燥試薬検 査成分との間の相互作用によるのかを決定するために、この実験を行った。 これを行うのに、凍結乾燥トロンボプラスチンのサンプルを、再水和せずに、 かつ乾燥試薬プロトロビン時間検査で典型的に用いられるその他の検査化学物質 （ウシ血清アルブミン、ポリビニルアルコール等）に暴露させずに、ＭＬＡエレ クトラ 750反応キュベットに直接置いた。これら凍結乾燥トロンボプラスチンパ ウダーを、制御Ｉ及び制御II血漿で直接再水和し、希釈して、トロンボプラスチ ンが通常の液相形態で用いると通常得られるであろう有効な濃度を達成した。サ ンプルの存在下で再水和したトロンボプラスチンで得られたプロトロンビン時間 値を、その後測定した。結果を図３に示す。 単純化乾燥試薬アッセイにおいて、レベルIIとレベルＩプロトロンビン時間値 を区別するのに試薬系の能力が連続的に増加することが、この結果からわかる。 通常のトロンボプラスチンで得られた感受性曲線をＩＳＩ値0.92に外挿すると、 組換えトロンボプラスチンはこの曲線にほとんど正確に合致している。 この結果は、通常のトロンボプラスチンと、乾燥試薬片に通常組込まれている その他の化学物質又は片マトリクスそれ自身との間で生じる相互作用が、この乾 燥試薬アッセイでの通常のトロンボプラスチンの比較的低い性能に依ることを示 唆している。 実施例３：異なる型のトロンボプラスチンを用いて得られた乾燥試薬アッセイ と液相アッセイとの速度論における直接比較。 トロンボプラスチンの型による差異を直接観測できるかを見るために、実施例 １及び実施例２を繰り返した。このとき、液相アッセイでのレベルＩ及びレベル II制御血漿間のプロトロンビン時間速度論での差を、乾燥試薬検査片プロトロン ビン時間アッセイで得られた同じ差、及び実施例２で用いた単純化乾燥試薬プロ トロンビン時間アッセイで得られた同じ差と直接比較した。乾燥検査片アッセイ を液相アッセイと直接比較して得られた結果を図４に示す。また、単純化乾燥試 薬アッセイと液相アッセイとを直接比較して得られた結果を図５に示す。 この結果は初期の発見を確信させる。乾燥検査片アッセイでの、通常のトロン ボプラスチンで得られた感受性曲線をＩＳＩ値0.92に外挿すると、組換えトロン ボプラスチンは予期した挙動から鋭い偏差を示す。通常のトロンボプラスチン活 性をベースとした、予期したもの以上の感受性である。 同様に、単純化乾燥試薬アッセイでの、通常のトロンボプラスチンで得られた 感受性曲線を、ＩＳＩ値0.92に外挿すると、組換えトロンボプラスチンは、この 曲線にほぼ正確に合致する。 これらの結果は再度、通常のトロンボプラスチンと、乾燥試薬片に通常組込ま れているその他の化学物質又は片マトリクスそれ自身との間に生じる相互作用が 、この乾燥試薬アッセイでの通常のトロンボプラスチンの比較的低い性能に依る ことを示唆している。 実施例４：乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイの正確性におけるトロンボプ ラスチンの異なる型の効果。この実験で、試薬片を製造し、シグマレベルＩ及び レベルIIの制御血漿で10回検査した。これらのアッセイから得られた、予想ＩＮ Ｒ値を、その後次の式を用いて算出した。 ＩＮＲ＝（Time_10%Max／Time_ref）^ISI 式中、Time_10%Maxは、レベルII制御血漿で蛍光強度がその最大レベルの10％に最 初に達成するのに要した時間（このアッセイにおける古典的なＰＴ時間に密接に 対応する）であり、Time_refは、通常レベルＩ制御血漿で蛍光強度がその最大レ ベルの10％に達成するのに要した時間（このアッセイにおける制御ＰＴ時間に密 接に対応する）であり、ＩＳＩ値は、既知のＩＮＲ値を有する参照血漿に対する 特定の片のロットの性能を適正に算出するのに選択される。 ４つの片のロットで得られたＩＮＲ結果の変数係数（ＣＶ）を以下に示す。こ れは、制御II血漿を10回用いて得た。効果がアウトライアーによって歪まないか を見るために、各々のサンプルから最も極端なアウトライアーを無視して、ＣＶ 値を再度計算した。これを表２に示す。 組換えトロンボプラスチンの液相ＩＳＩの評価値は、Dade IS配合物の液相Ｉ ＳＩの評価値とほとんど同じであるが、組換えトロンボプラスチンを用いる乾燥 試薬アッセイは、通常のトロンボプラスチンを用いた乾燥試薬アッセイと比較し て、著しく正確であったということに注意を要する。 実施例５：臨床検査において、乾燥試薬プロトロンビン時間検査片で得られた 、正確さにおける、トロンボプラスチンの異なる型の効果。この実験において、 Dade Innovin（商標）組換えトロンボプラスチン、又はDade C通常トロンボプラ スチンをそれぞれ用いて、プロトロンビン時間検査片の２つのバッチを先述のよ うに製造した。その後、これらの片を、25人の患者の臨床検査に用いた。各々の トロンボプラスチン配合物について、各々の患者から２回のサンプルを行い、各 々の繰り返しのサンプル間の一致を算出した。組換えトロンボプラスチン試薬に 対して、２つの繰り返し間のＲ²相関係数は、0.965であった。それに対して、通 常のトロンボプラスチン配合物を用いて得られた２つの繰り返し間のＲ²相関係 数は、たったの0.663であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シャーマ サーメアー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94086 サニーヴェイル ノース マチル ダ アベニュー イー３−260 (72)発明者 メイアー ベンジャミン ジー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 95070 サラトガ フルーツヴェール ア ベニュー 15020

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．固相マトリクス、固相マトリクス上又は固相マトリクス内に固定した乾燥ト ロンビンプラスチン、及び固相マトリクスと液体サンプルとの接触の際にトロン ボプラスチンの再水和を助長する凝固中性剤を含有する乾燥試薬プロトロンビン 時間アッセイを行うための検査製品であって、トロンボプラスチンを液体サンプ ルで再水和するとき、トロンボプラスチンが、異常作用中間遷移状態を生じる脳 抽出物から精製したトロンボプラスチンに見出される物質を実質的に含んでいな い、乾燥試薬プロトロンビン時間アッセイを行うための検査製品。 ２．乾燥トロンボプラスチンが、再脂質化組換え組織因子である請求項１記載の 検査製品。 ３．凝固中性剤が、アルブミン、水溶性ポリマー、及び表面活性剤からなる群か ら選択される請求項１記載の検査製品。 ４．透過膜と、膜に浸透させた乾燥トロンボプラスチンと、膜内に浸透させた基 質とを有する検査片であって、透過膜が側面に塗布面と指示面を有し、トロンボ プラスチン−初期化及びVII因子又はVIIａ仲介凝固経路による妨害が実質的に存 在しない透過膜であり、液体サンプル吸い上げ及び膜への分布を助長する凝固中 性剤を有する透過膜であり、乾燥トロンボプラスチンが、トロンボンプラスチン を液体サンプルで再水和するとき、異常な中間遷移状態を生じる脳抽出物から精 製したトロンボプラスチンに見出される物質を実質的に含んでおらず、かつ基質 が、凝固経路成分による基質の活性化の結果として指示面上に検知信号をもたら すように、凝固因子VII又はVIIａ含有サンプルが膜の塗布面に塗布されており、 凝固経路の成分による活性の際に検知信号をもたらす、検査片。 ５．乾燥トロンボプラスチンが、再脂質化組換え組織因子である請求項４記載の 検査片。 ６．凝固中性剤が、アルブミン、水溶性ポリマー、及び表面活性剤からなる群か ら選択される請求項４記載の検査片。 ７．血液又は血漿を固相マトリクスに塗布して、乾燥トロンボプラスチンと接触 させて、検知可能な反応を初期化するタイプの改良プロトロンビン時間アッセ イであって、該改良が、マトリクス内に凝固中性剤を配置し、トロンボンプラス チンを液体サンプルで再水和するとき、異常作用中間遷移状態を生じる脳抽出物 から精製したトロンボプラスチンに見出される物質を実質的に含んでいない乾燥 トロンボプラスチンと接触させる工程にある改良プロトロンビン時間アッセイ。 ８．乾燥トロンボプラスチンが、再脂質化組換え組織因子である請求項７記載の 改良プロトロンビン時間アッセイ。 ９．凝固中性剤が、アルブミン、水溶性ポリマー、及び表面活性剤からなる群か ら選択される請求項７記載の改良プロトロンビン時間アッセイ。