JPH10500012A - 溶解素による乳酸バクテリアの培養物を溶解する方法および得られる溶解培養物の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、グラム陽性バクテリア、特に乳酸バクテリアから得られる相同性自己溶解素または非相同性自己溶解素のその場での製造による溶解によって、乳酸バクテリアの培地を溶解する方法、またはそのような培地を含む生産物、例えばチーズに関する。前記自己溶解素をコード化する遺伝子はプロモーターにより制御され、好ましくは食品級成分またはパラメーターにより制御されて、誘発後に向上した溶解を達成し、それにより、発酵中またはその直後に相同性自己溶解素の天然製造水準と比べて向上している全自己溶解素の製造が得られる。本発明の他の用途は、溶解培地を含む生産物の貯蔵期間を向上させるために、損傷性バクテリアまたは病原性バクテリアに対する殺菌剤として自己溶解素を用いて、溶解後に取り除かれるペプチダーゼにより変性されるペプチド混合物を調製することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 溶解素による乳酸バクテリアの培養物を溶解する方法 および得られる溶解培養物の使用 発明の背景および従来技術 本発明は、例えば、チーズ製造のような発酵食品生産物の製造において、溶解 素によって乳酸バクテリアの培養物を溶解する方法またはそのような培養物を含 む生産物に関する。そのような方法は、ＷＯ ９０／００５９９（アグリカルチ ュラル・アンド・フード・リサーチ・カウンシル（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＆ ＦＯＯＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＵＮＣＩＬ：ＡＦＲＣ），ガッソン（Ｍ ．Ｊ．Ｇａｓｓｏｎ），１９９０年１月２５日発行，参考文献１）により知られ ている。その特許明細書によれば、チーズ製造においてバクテリアスターター培 養物を溶解するためにラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）（好ましくは 頭部扁長型）バクテリオファージが用いられた。Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ ｃｔｉｓ ＭＬ３のバクテリオファージφｖＭＬ３の溶解素が例示されている。 特に、例えば、乳清除去、ミリングおよび塩処理に、チーズ生産物またはチーズ 前駆体混合物に溶解素を添加することができる。しか しながら、この溶液は、溶解細胞内容物とチーズ生産物との充分な混合が容易に 得られないという不利益を有する。もう一つの不利益は、食品級（ｆｏｏｄ−ｇ ｒａｄｅ）でない大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞により溶解 素が製造されたということである。宿主細胞の細胞壁がそれ自体溶解素により分 解されない場合、溶解素を分泌するトランスフォームされた宿主が、溶解素によ り溶解され易いバクテリアの繁殖の抑制に有用であり得ることが明示されている 。チーズの風味を向上させるためにトランスフォームされた宿主細胞を添加する ことについては何も述べられておらず、明らかにトランスフォームされた乳酸バ クテリアは述べられていない。 別法として、上記特許明細書において、「添加のタイミングが重要でないよう に溶解素をカプセル封入する。カプセル封入剤はチーズ製造工程が完了した後に 溶解するので、酸性化における役割が完了する前にスターターバクテリアに影響 を与えない。」という示唆が成されている。 この示唆された別法は、（ａ）カプセル封入材料を使用しなければならない、 （ｂ）このカプセル封入材料はチーズ製造工程の終了前に溶解してはならない、 という不利益を有する。さ らに、チーズ製造工程の初期に、例えばチーズスターター培地をミルクに添加す るときにカプセル封入された溶解素を添加すると、約９０％が乳清と一緒に除去 されてしまう。すなわち、必要な有効量の約１０倍を添加しなくてはならず、経 済的に魅力がない。その後のシアマン（Ｃ．Ａ．Ｓｈｅａｒｍａｎ）、ジュリー （Ｋ．Ｊｕｒｙ）およびガッソン（Ｍ．Ｊ．Ｇａｓｓｏｎ）の出版物（１９９２ 年２月版：参考文献２）は、「クローニングされたラクトコッカル（ｌａｃｔｏ ｃｏｃｃａｌ）バクテリオファージφｖＭＬ３溶解素遺伝子を発現する自己溶解 性Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ」を記載した。特に彼らは、「クロー ニングされた溶解素の発現が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａ ｃｔｉｓおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓ菌 株がラクトースを代謝させ、ミルクを凝固させおよび酸を製造する能力を損なわ なかった（データは示されていない）。」と述べた。 溶解素は対数期において発現されないまたは不充分に発現されることが示唆さ れた。溶解素は通常の発酵工程の終了時に生じる静止期においてのみ相当割合の 細胞を溶解するのに充分な量で発現される。この文献は、トランスフォームされ たラクト コッカル菌株の維持が問題となり得ることを示している。３０℃を下回る温度に 維持することは溶解の開始を遅らせるが、３０℃では耐溶解性バクテリアが再度 成長する。別法として、スクロース％が２０％を越えるスクロース培地における 緩衝化が示された。これは、発酵段階が３０℃以上で起こり２０％を越えるスク ロースが許容されないチーズ製造のような発酵の工程においては適当ではないよ うである。 さらに、文献の最後において、静止期における発現が完全には制御されないこ とが示された。さらに、チーズ熟成工程において浸透圧緩衝剤を用いることはお そらく時間的にあまり有効でない。このことは、所望の程度の塩風味を達成する ためにブライン中に浸漬されたゴーダチーズに要求される時間の長さによって示 され得る。このタイプのチーズにおいて、例えば、塩濃度の浸透圧的効果はあま り迅速ではない。チェダーチーズ製造工程は、塩添加工程がより効果的であるの でおそらくより好適であるが、なお、混合工程を必要とするという不利益を有す る。 バクテリオファージ汚染は大規模工業的乳製品発酵工程において主要な問題で あるので、バクテリオファージのような望ま しくない物質により自然に製造される酵素を意味するラクトコッカルバクテリオ ファージ溶解素から生じる溶解素の使用がいずれの文献にも開示された。 ヤング（Ｒ．Ｙｏｕｎｇ）の総説文献（１９９２年版：参考文献４）において 、バクテリオファージ溶解素についての機構および制御の両方の技術の概要が示 されている。特に、４６８〜４７２頁の「ライシス・イン・ファージ・インフェ クションズ・オブ・グラム−ポジティブ・ホスツ（Ｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｐｈａｇ ｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｈｏｓｔｓ） 」の部分において、参考文献１において示された配列と同じであるように思われ るシアマン（Ｓｈｅａｒｍａｎ ｃ．ｓ．）（１９８９年版：参考文献５）によ り発見されたＤＮＡ配列がおそらく正確でなく、推定されるアミノ酸配列が、読 み枠においてフェイズシフトを引き起こす突然変異によって全く異なり得ること が示された。 ワード（Ｗａｒｄ ｃ．ｓ．）の出版物（１９９３年版：参考文献６）におい ても、シアマン（Ｓｈｅａｒｍａｎ）ら（１９８９年版：参考文献５）の配列が おそらく正しくないことが示されている。非常に類似しているファージ溶解素遺 伝子 との比較により、シアマン（Ｓｈｅａｒｍａｎ）ら（参考文献５）の配列におけ るフレームシフトが二つのＤＮＡ配列を一列に並べるのに必要であることが確認 された。さらに、この比較は、シアマン（Ｓｈｅａｒｍａｎ）ら（参考文献５） により開示されたものよりおそらく４５塩基長いＯＲＦにより真ファージ溶解素 （ｒｅａｌ ｐｈａｇｅ ｌｙｓｉｎ）がコードされることを教示している。 プラテュー（Ｃ．Ｐｌａｔｔｅｅｕｗ）およびヴォス（Ｗ．Ｍ．ｄｅ Ｖｏｓ ）（１９９２年版：参考文献３）は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓバ クテリオファージφＵＳ３の溶解性酵素コード化遺伝子ｌｙｔＡのＥｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける発現、特性付けおよび配置を記載した。広範囲の ラクトコッカル菌株に対して活性であるφｖＭＬ３は、既知の溶解酵素への相同 性に欠くことが記載された。バクテリオファージφＵＳ３は、チーズ製造菌株Ｌ ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓＳＫ１１（ＮＩＺＯ）に特異性のバクテリ オファージの研究において確認された。結果は、ＬｙｔＡの推定されたアミノ酸 配列がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａの自己溶解素の配列に 類似しており、バクテリオフ ァージφＵＳ３がリゾーチーム型ムラミダーゼよりもアミダーゼをコード化する ことを示した。上記のことは、異なる生物体からＤＮＡ配列を単離することを望 む当業者が面する困難を示している。配列に関する情報不足および既知の配列間 の相同性の欠如が、異なる生物体から正確なＤＮＡ配列を首尾よく単離すること を全く導きそうもない既知の配列から誘導されたプローブおよびプライマーを利 用する。 ＥＰ−Ａ２−０ ５１０ ９０７（ＡＦＲＣ，ガッソン（Ｍ．Ｊ．Ｇａｓｓｏ ｎ），１９９２年１０月２８日発行，参考文献７）において、食品汚染性または 病原性バクテリアのバクテリオファージまたはその溶解素をそのようなバクテリ アを殺すために用いることが記載された。その例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎ ｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ファージφＬＭ４）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔ ｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ファージφＰ）のバクテリオファージからの溶解素 を含む。適当なバクテリオファージまたはその溶解素を使用しそれにより細胞が 溶解されるか決めることにより、バクテリア汚染の試験を特定のバクテリアにつ いて特異的にすることもできる。すなわち、その欧州特許出願は、食品級の用途 には望ましくない食品汚染 性または病原性バクテリアのファージから得られる溶解素の使用を記載している 。さらに、その特許出願におけるそのような溶解素の使用の目的は、乳酸バクテ リアの自己溶解により食品生産物の風味を向上させることにあるのではないと以 下に記載されている本発明の対象から大きく離れている。 発明の概要 これら従来技術の発展と対照的に、本発明は、「真の自己溶解素」、すなわち グラム陽性食品級バクテリア、好ましくは乳酸バクテリアから得られる溶解素（ すなわち、バクテリオファージから誘導されたまたは誘導することのできる自己 溶解素ではない）の食品生産物の改良のための使用、および食品生産物の調製方 法に関する。チーズの熟成は特に関連のあるプロセスである。特に、本発明は、 それを内部で製造する細胞を溶解することのできる溶解素をコード化するＬａｃ ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓの遺伝子の単離および確認に 基づくものである。通常の発酵工程中、溶解素の量は、溶解素を内部で製造する 細胞の溶解を引き起こすほど多くてはならない。しかしながら、細胞の分離を保 証し、強すぎる細胞壁の形成を防止するために、制限された自己溶解素の製造が 必要で ある。 天然乳酸培地が（充分な）栄養成分の添加なしに成長する場合、対数期の後に 栄養成分の不足故に成長が低下し、菌株は静止期に入る。数日後に飢餓が生じ、 これによりおそらく天然自己溶解素の増加が生じる。その結果、飢餓中に、増加 量の天然自己溶解素が形成され乳酸バクテリアの細胞を溶解する。本件の場合、 発明者は、食品級バクテリアが静止期に入った後できるだけ早く、最少の工程で 、それが含まれる発酵工程において食品級バクテリアの通常の活性を妨害するこ となく、食品級バクテリアを溶解する方法を工夫する問題に直面した。これは、 食品級の地位およびバクテリアの機能（ｉｎｔａｃｔ）を損なわずいかなる所望 の時間においてもその場での食品級バクテリアの制御可能な溶解を達成する、食 品級バクテリアについての組換えＤＮＡ技術により達成された。 この明細書において、以下の微生物の名称の略語を用いる： Ｅ．＝Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｌ．＝Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ，例えばＬ．ｌａｃｔｉｓ Ｍ．＝Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，例えばＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ Ｓ．＝Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，例えばＳ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＳ．ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａ 図面の簡単な説明 ドラフト提示１に属する図の説明文 図１ 再生（ｒｅｎａｔｕｒｉｎｇ）（１２．５％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３の細胞壁加水分解酵素作用 （Ａ）Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ加圧滅菌細胞０．２％（重量／体積）を 含むゲル （Ｂ）Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３からの細胞壁０．２％（重量／体積）を 含むゲル。ＷＰは、乳清系培地およびＧＭ１７においてそれぞれ成長した培地の フラクション；Ｃは、細胞非含有抽出物；Ｓは、上澄みフラクション。加えたサ ンプルの量は、培地の光学濃度により等しくした。標準タンパク質の分子質量を 右側に示し、明細書において記載している溶解バンドの二つのサイズを左側に示 している（全て、キロドルトン（ｋＤａ）で示す。）。 図２ 再生（１２．５％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２ト ランスフォーマントにおける細胞壁加水分解酵素作用。ゲルは０．２％（重量／ 体積）のM．lysodeikticus 加熱滅菌細胞を含んだ。１，２：乳清系培地においてそれぞれ成長したＬ．ｌａ ｃｔｉｓ ＭＧ１３６３の細胞非含有抽出物および上澄み；３は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２の細胞非含有抽出物；４および５は、Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃ ｕｓ加圧滅菌細胞を含むＴＹプレート上に輪を生成する二つの独立したＥ．ｃｏ ｌｉ ＮＭ５２２トランスフォーマントの細胞非含有抽出物。標準タンパク質の 分子質量を右側に（ｋＤａ）で示す。４１および４６ｋＤａのサイズに相当する 二つの溶解バンドを左側に示す。 図３ ｐＡＬ０１に存在するＬ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３の染色体の４１３ ７−ｂｐ Ｓａｕ３Ａ ＤＮＡフラグメントの制限酵素地図。これは、ａｃｍＡ ，ＯＲＦＡおよびＯＲＦＢの位置を示している。Ｔは、ターミネーター；Ｐ_lac は、ｌａｃプロモーターおよびその転写方向；ｄｅｌ．は、ｐＡＬ０２の形成の ために成されるＥｃｏＲＶ欠失。ｐＡＬ０４およびｐＡＬ０３の形成のために用 いられるＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩフラグメントをそれぞれ（ａ）および（ｂ） で示す。２２０７−ｂｐ Ｓａｕ３Ａ−ＳｓｐＩフラグメントの遺伝子的分析は 別のところに示す（ビスト（Ｂｕｉｓｔ）らにより発行される）。 図４ Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３のａｃｍＡ，ＯＲＦＡおよびＯＲＦＢの 一部の推定されたアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。推定されたリゾゾーム 結合部位（ｒｂｓおよび下方ケース（ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ））、−１０および −３５配列（陰影部）、開始コドン（肉太活字）、および停止コドン（アンダー ライン部）を示す。可能な転写ターミネーターを配列上の水平矢印で示す。ＰＣ Ｒ実験において用いられた合成プライマーＰＡＬＡ−４およびＰＡＬＡ−１４を オーバーラインで示す。可能なシグナルペプチド開裂部位は↑により示す。多く の関連制限酵素部位も示す。ａｃｍＡとＯＲＦＡとの間の遺伝子間領域は二重ら せんで示す。 図５ （Ａ．）Ｌ．ｌａｃｔｉｓのＡｃｍＡ、Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓの自己溶解素（参 考文献２）、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅのムラミダーゼ−２ （参考文献６）（両方とも食品級でない）の推定されたアミノ酸配列の配列。三 つのタンパク質の内部繰返し領域にアンダーラインを付している。三つの全ての タンパク質における同一（＊）アミノ酸、ＡｃｍＡに存在しない二つの酵素のＣ −末端におけるＳ．ｆａｅｃａｌｉ ｓの自己溶解素とムラミダーゼ−２との間の同一（＋）アミノ酸、および類似（ ．）アミノ酸を示している。（▲）は、ムラミダーゼ−２におけるシグナルペプ チド開裂部；（陰影および下方ケース）は、推定された膜スパン（ｍｅｍｂｒａ ｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメイン。 （Ｂ．）（Ａ）に示す配列の概略図。太線は、（推定された）シグナル配列。二 本のスラッシュは、ＡｃｍＡおよびムラミダーゼ−２中に存在しないＳ．ｆａｅ ｃａｌｉｓ自己溶解素中の配列を示す。ジョリス（Ｊｏｒｉｓ）（２０）らによ り提案されたコンセンサスによる繰返し配列をボックスで囲む。 図６ ＡｃｍＡのカルボキシ末端繰返しのアミノ酸配列（ボックス内）＋先行（ ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ）および介在配列。ジョリス（Ｊｏｒｉｓ）（２０）らによ り提案されたコンセンサス配列に陰影を付する。（＊）は、同一のアミノ酸；（ ．）は、類似アミノ酸。 図７ ラクトコッカル菌株ＭＧ１３６３（１）；ＩＬ１４０３（２）；１８−１ ６ｓ（３）；ＡＭ１（４）およびＨＰ（５）の染色体ＤＮＡ上に形成されたＰＣ Ｒ生成物。使用したプライマーは図４中に示すＰＡＬＡ−４およびＰＡＬＡ１４ 。Ｍは、分子量マーカー：バクテリオファージＳＰＰＩ ＤＮＡは ＥｃｏＲＩで切断。端部に示す寸法は塩基対基準である。 図８ ｐＩＮＴＡＡを用いるＬ．ｌａｃｔｉｓの染色体ａｃｍＡΔ１突然変異種 の構造の概略表示。黒色棒は、ｐＯＲＩ２８０へのｐＡＬ０９の挿入部；ａｃｍ ＡΔ１は、ａｃｍＡの欠失誘導体；Ｅｍ^rは、抗エリスロマイシン耐性遺伝子； ｌａｃＺは、ラクトコッカルプロモーターＰ₃₂（ｐ）の制御下に発現されるＥ． ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；白抜き四角は、ラクトコッカルプラス ミドｐＷＶ０１の複製起点；１および２は、最初の交差の可能性部；ｘおよびｙ は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ組込み体の二つの種類を区別するためにそれぞれ用いられ るプライマーＰＡＬＡ−１９およびＢＫ０５ＡＬ；ＡおよびＢは、第２の交差の 可能性領域およびそれら生成物ＡおよびＢ。多くの関連制限酵素領域も示す。 図９ 突然変異菌株Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３ ａｃｍＡΔ１のサザンブ ロッティング分析。ＨａｅＩＩＩで消化したＭＧ１３６３（１）、ＭＧ１３６３ ａｃｍＡΔ１−ａ（２）およびＭＧ１３６３ ａｃｍＡΔ１−ｂ（３）の染色 体ＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で分離し、遺伝子スクリーン＋薄膜に移し 、ｐＡＬ０１の４１３７ｂｐ Ｓａｕ３Ａ挿入部に対 してハイブリッド形成した。Ｍは、分子量マーカー：バクテリオファージＳＰＰ Ｉ ＤＮＡはＥｃｏＲＩで切断し、（ｂｐにおける）その部位を左に示す。染色 体ＤＮＡのハイブリッド形成バンドの寸法（ｂｐにおける）を右端に示す。 図１０ 再生（１２．５％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ １３６３（レーン１，４）および欠失突然変異種ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１−ａ （レーン２，５）およびａｃｍＡΔ１−ｂ（レーン３，６）におけるＡｃｍＡ作 用。ゲルはＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ加圧滅菌細胞０．２％（重量／体積 ）を含んでいた。ＧＭ１７中での成長後に細胞非含有抽出物（レーン１，２，３ ）および上澄みフラクション（レーン４，５，６）を適用した。サンプル量を、 培地の光学濃度により等しくした。標準蛋白質の分子質量を右側に示し、成熟Ａ ｃｍＡ（４６）またはその分泌物（４１）の分子質量を左側に示す（全てキロド ルトン）。 図１１ Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３およびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の１ ０００倍での光学顕微鏡写真。いずれの菌株もＧＭ１７中で一晩成長させた。 図１２．Ａ−１／Ａ−２ 図式はｐＡＬ０１の欠失誘導体の構 造を示す。Ａｐ^rは、アンピシリン耐性遺伝子；Ｋｍ^rは、カナマイシン耐性遺伝 子；ｌａｃＺは、α−ｌａｃＺ；ｄｅｌ．は、ｐＡＬ０２中で生じるＥｃｏＲＶ 欠失。幾つかの制限酵素部位を示す。別のサブクローンにおいて得られたｐＡＬ ０１中の２８５０−ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの種々のサブフラグメン トを、種々の方式の陰影により示す。 図１２．Ｂ 図式は組込みプラスミドｐＩＮＴＡＡの構造を示す。Ａｐ^rは、ア ンピシリン耐性遺伝子；黒色棒は、ｐＯＲＩ２８０へのｐＡＬ０９の挿入部；ａ ｃｍＡΔ１（垂直描線）は、ａｃｍＡの欠失誘導体（点線）；Ｅｍ^rは、エリス ロマイシン耐性遺伝子；ｌａｃＺは、ラクトコッカルプロモーターＰ₃₂（ｐ）の 制御下に発現されるＥ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；ｏｒｉ＋は、 ラクトコッカルプラスミドのｐＷＶ０１の複製起点。多くの関連制限酵素部位を 示す。 ドラフト提示２に属する図の説明文 図１３ Ｌ．ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓ菌株ＭＧ１３６３（□）および ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（▲）の６００ｎｍにおける光学濃度を読み取ること により測定した成長。 図１４ （Ａ）．ａｃｍＡのプロモーター領域のヌクレオチド配列。推定されたリゾゾー ム結合部位（ｒｂｓおよび下方ケース（ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ））、−１０およ び−３５配列（陰影部）、開始コドン（肉太活字）、およびＳｓｐＩおよびＳｃ ａＩ制限酵素部位を示す。（Ｂ）．ｐＧＫ１３中における、それ自体のプロモー ターを伴う（ｐＧＫＡＬ１）および伴わない（ｐＧＫＡＬ２）ａｃｍＡのサブク ローニング。Ａｐ^rは、抗アンピシリン遺伝子；Ｅｍ^rは、抗エリスロマイシン遺 伝子；Ｃｍ^rは、抗クロラムフェニコール遺伝子；ＯＲＩ（白抜き四角）は、ラ クトコッカルプラスミドｐＷＶ０１の複製起点；ｒｅｐＡは、プラスミドｐＷＶ ０１の複製タンパク質をコードする遺伝子；ａｃｍＡは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ亜種 ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３のＮ−アセチルムラミダーゼ遺伝子。ａｃｍＡ遺伝子 を含むＳｃａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを点で示し、ａｃｍＡプロモーターを 含むＳｓｐＩ／ＳｃａＩフラグメントを黒で示す。関連制限酵素部位のみを示す 。 図１５ Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ加圧滅菌細胞を含むＧＭ１７プレート 上における、ｐＧＫ１３（１）を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３、ｐＧＫ１ ３（２），ｐＡＬ２（３） またはｐＧＫＡＬ１（４）を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の 輪形成の分析。 図１６ ｐＧＫ１３（▲）を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３およびｐＧＫ１ ３（■）またはｐＧＫＡＬ１（●）を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３ａｃｍ ＡΔ１の６００ｎｍにおいて測定した光学濃度の低下の分析。 図１７ Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３（○）、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３ ｐｅｐＴ（Δ）、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（□）、およびＬ ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３ｐｅｐＴとＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３ａｃｍＡ Δ１との最終対数期混合培地（■）の６００ｎｍにおいて測定した光学濃度の低 下の分析。グラフの最上部の数字はサンプルを培地から採取した時点を示す。 図１８ Ａ． Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ加圧滅菌細胞０．１５％（重量 ／体積）を含んでいる再生ＳＤＳ−１２．５％ ＰＡＧＥにおけるＡｃｍＡ作用 の検出。Ｂ． クマシー染色された１２．５％ＰＡＡゲル上における放出細胞内 タンパク質の分析。Ｃ． 特異的抗体を用いることによる、放出細胞内タンパク 質中におけるＰｅｐＴの検出。上澄みフラクションの サンプルの結果のみを示す。ゲルの最上部に示される数字１〜７は、図１７に示 すサンプルを採取した時点である。標準蛋白質の分子質量を左側に示す（キロド ルトン）。 図１９ ＡｃｍＡの生成が誘発され得る、ｐＡＬ１２の構築の ｔからのプロモーター；Ｅｍ^rは、抗エリスロマイシン遺伝子；Ａｐ^rは、抗アン ピシリン遺伝子；ｌａｃＺは、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；Ｔ は、ｐｒｔＰの転写ターミネーター；ｒｒｏは、Ｒ１−ｔリプレッサー遺伝子； ｔｅｃは、ラムダｃｒｏの幾何的等価物；ＯＲＦ２９’は、ファージＲ１−ｔの ＯＲＦ２９のＮ−末端部；ＯＲＦ２９／ｌａｃＺは、ＯＲＦ２９とｌａｃＺとの 転写融合物；ＳａｃＩフラグメントは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの ｓｒｆＡ遺伝子座のＯＲＦ１の２７１６−ｂｐ ＳａｃＩフラグメント；ａｃｍ Ａは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓのＮ−アセチルムラミダーゼ遺伝子；４２’，４３，４ ４，４５，４６’は、ｐＥＦ＋のＥｃｏＲＩフラグメント上に位置するファージ ＲＩ−ｔのＯＲＦを示す。関連制限酵素部位のみを示す。 図２０ ｐＧＫ１３（□）を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ １３６３、およびｐＩＲ１２（＋），ｐＩＲ１ＰＲ（▲）およびｐＡＬ１２（＊ ）を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２菌株のＯＤ₆₀₀に対するマイトマイシンＣ の効果。ｐＡＬ１２（■）を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２の培地は誘発され なかった。培地を、時間ゼロにおいてマイトマイシンＣ１μｇ／ｍｌで誘発した （点線）。矢印（↓）は、サンプル１ｍｌを採取し、ＡｃｍＡ作用の分析（図２ １）並びにタンパク質およびペプチダーゼ分析（それぞれ図２２および２３）の ために加工した時点を示す。 図２１ ｐＩＲ１２（レーン１，２），ｐＩＲ１ＰＲ（レーン５，６）またはｐ ＡＬ１２（レーン３，４）を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２菌株の自己溶解作 用の再生ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。対数期成長細胞にマイトマイシンＣを添加して から４時間後にサンプル１ｍｌを採取した（図１５参照）。細胞非含有抽出物（ １，３，５）および上澄みフラクション（２，４，６）を、Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉ ｋｔｉｃｕｓ加圧滅菌細胞０．２％（重量／体積）を含むＰＡＡゲル上に載せた 。標準タンパク質（Ｍ）の分子質量を左側に示し、ＡｃｍＡ（４０．３）および ＬｙｔＲ（３０．２）作用による透明（ｃｌｅａｒｉｎｇ）バ ンドを右側に示す（全てキロドルトン（ｋＤａ）で示す）。ＡｃｍＡの分解生成 物により引き起こされる透明バンドは、矢印（←）で示す。 図２２ ｐＩＲ１２（１，２），ｐＡＬ１２（３，４）またはｐＩＲ１ＰＲ（５ ，６）を含む誘発（レーン２，４，６）および非誘発（レーン１，３，５）Ｌ． ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２の培地上澄みにおけるタンパクの放出。レーン９：非誘 発Ｌ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２（ｐＩＲ１２）の細胞非含有抽出物。標準タンパ ク質（Ｍ）の分子質量（ｋＤａ）を左側に示す。 図２３ ラクトコッカルエンドペプチダーゼＰｅｐＯに対して生じたポリクロー ナル抗体を用いる、図−２２に示したゲルのウエスタンブロット分析。矢印頭部 は、エンドペプチダーゼの位置を示す。サンプルの順は図２２におけるのと同じ である。 発明の詳細な説明 本発明の目的は、産業的発酵の終了に一致することが多い静止期に細胞が達し てから数時間後に溶解を得ることにある。本発明による自己溶解素の誘発の向上 は、天然に生じる数日後の向上した溶解に対して、発酵が終了してから数時間以 内に達成される。また、向上した誘発は発酵の終了時に達成することができ、発 酵が細胞の溶解により停止する結果が得られる。この溶解は、停止期が１２時間 経過する前に、好ましくは停止期が４時間経過する前に好適に達成される。 この比較的初期段階において慎重に誘発された多量の溶解素の製造が、特許請 求の範囲で述べられている向上した溶解であ る。従って、この溶解素をコード化する遺伝子は制御可能プロモーター、すなわ ち通常関係しているプロモーター以外プロモーターの制御下にあることが必要で ある。前述したように、通常の細胞成長には少量の構成成分として生成された自 己溶解素の存在が必要である。従って、誘発性遺伝子は、存在する自己溶解性遺 伝子に追加的でなくてはならない。 すなわち、本発明の一つの要旨において、グラム陽性食品級バクテリア、特に 乳酸バクテリアから得られる自己溶解素（すなわちなお細胞壁を溶解することが できるそのような自己溶解素の活性フラグメントまたはバクテリオファージでは ない）のその場での製造を含んでなり、前記自己溶解素またはそのフラグメント をコード化する遺伝子が、通常自己溶解素遺伝子と関係ない制御可能プローター の制御下にあり、相同性自己溶解素の自然の生成水準と比較して向上した合計自 己溶解素の生成量故に前記制御可能プロモーターの誘発後において発酵中または 発酵から直ぐ後に向上した溶解を達成するものである、溶解素により乳酸バクテ リアの培地を溶解する方法が提供される。好ましくは、前記制御可能プロモータ ーは、食品級成分または下記パラメーターを用いることにより制御することがで きる：例 えば、 −酸素誘発性プロモーターを誘発する空気導入、 −イオン強度または水分活性、特に塩誘発性プロモーターを誘発する培地の塩含 量の変化、 −ｐＨ−誘発性プロモーターを誘発する培地のｐＨの変化、または −温度誘発性プロモーターを誘発する乳酸バクテリアの増殖に用いられるより低 いまたは高い温度の適用。自己溶解素遺伝子は、組み込まれるバクテリア菌株に 相同性であってもなくてもよい。特に、組換えＤＮＡ操作に関する法律について は、バクテリアに相同性のＤＮＡが、相同性でない配列の適用よりもずっと早く 認可される。 本発明の方法の利点は、発酵中に細胞が増殖し、例えば乳清が既に除去されて いる場合、制御可能プロモーター存在の結果として溶解素が必要な時にのみ生成 されるので余分な量の溶解素を添加する必要がないことである。このことは、溶 解素をそのものとして導入する方法より費用および人力の点でより経済的である 。さらに、ＷＯ９０／００５９９に開示されている方法により必要とされる溶解 素を最初に単離またはカプセル封入 する必要はない。 本発明の方法のもう一つの利点は、培地を含む生成物を得るための製造方法パ ラメーターによって活性化することのできる適当なプロモーターまたはレギュロ ンの選択によりかなり正確に培地の溶解の時間を制御することができることであ る。 レギュロンはプロモーターおよびオペレーター領域を含み、オペレーター領域 はリプレッサーの作用により活性化または失活し得ることに注目すべきである。 本明細書において、制御可能プロモーターは、リプレッサー−オペレーター相互 作用により発現を制御する制御可能レギュロンも含む。最後に、これは、人の消 費に適している生成物の製造に実際に適用することができる、開発された最初の 食品級システムである。 乳酸バクテリアの培地はそのものとして使用することができるが、そのような 培地を含む生成物の一部を形成することもできる。後者は、乳酸バクテリアの発 酵作用により得ることのできる発酵食品生成物の製造に乳酸バクテリア培地を使 用し、続いて、発酵食品生成物中の乳酸バクテリアを溶解することにより起こる 。特に、発酵食品生成物はチーズ生成物であり得る。好ましい態様において、さ らにチーズ熟成工程が行われ、それ により溶解細胞の除去後に成分の一部がチーズ生成物の組成を変化させる。 本発明のもう一つの要旨において、タンパク質の蛋白分解により得られるペプ チド混合物を、制御可能プロモーターの制御下に、乳酸バクテリア自己溶解素遺 伝子を含む乳酸バクテリアの培地に併せ、次に、乳酸バクテリアが溶解されペプ チダーゼを含む細胞の内容物がペプチド混合物の組成を変化させるような量で自 己溶解素の製造を達成するように前記プロモーターを誘発させるものである、ペ プチド混合物の製造方法が提供される。溶解をペプチド混合物そのものの中で行 う代わりに、まず、本発明の溶解素により乳酸バクテリアの培地を溶解する工程 を実施し、次に、得られた溶解培地を、タンパク質の蛋白分解により得られるペ プチド混合物に添加し、ペプチダーゼを含む細胞の内容物によりペプチド混合物 の組成を変化させることもできる。 ペプチド混合物のための出発材料は、任意のタンパク質またはその混合物であ り得るが、好ましくはタンパク質はミルクタンパクまたは植物タンパクあるいは その両方を含む。 本発明のさらなる要旨によれば、自己溶解素がまず製造され、次に、汚染性バ クテリア、例えば生産物を損ない得る特定の Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、または病原性バクテリア、例えばグラム陽性Ｌ ｉｓｔｅｒｉａ種もしくはグラム陰性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種に対する殺菌剤と して使用されるものである、本発明の方法が提供される。向上した結果を得るた めに、自己溶解素の製造が、天然の製造水準と比べて高められていることが望ま しい。 すなわち、本発明のこの要旨において、本発明の方法により得られる遊離自己 溶解素含有生成物が、消費者用生産物において汚染性バクテリアまたは病原性バ クテリアの増殖が禁止されるまたは成長性が低下するような量で、前記消費者生 成物に組み込まれるものである、消費者の貯蔵期間を向上させる方法も提供され る。この利点は、使用前に自己溶解素の精製が必要ないことである。 そのような消費者用生産物は、食用生産物、化粧用生産物、および繊維、硬質 表面および人の皮膚を清浄化するための生産物を含む。そのような生産物の例は 、パンおよびパン改良剤；バター、マーガリンおよびそれらの低カロリー代替物 ；チーズ；ドレッシングおよびマヨネーズ状生産物；肉生産物；ペプチドを含む 食品成分；シャンプー；人の皮膚を処理するためのクリ ームまたはローション；石鹸および石鹸代替生産物；洗浄用粉末または液体；お よび、食品製造用具および台所用品を洗浄するための生産物であり得る。 本発明のもう一つの要旨は、乳酸バクテリアの溶解素をコード化するヌクレオ チド配列を含む。特に、配列ＩＤ．ＮＯ１によるヌクレオチド配列は、機能的に 等価物としてクレームされている。このヌクレオチド配列の変形、例えば配列Ｉ Ｄ．ＮＯ１によるヌクレオチド配列によりコード化される配列ＩＤ．ＮＯ２によ るアミノ酸配列をコード化する他のヌクレオチド配列もクレームされている。発 現時に、詳細な説明に示されている活性試験を用いて決めることのできる溶解素 の活性を示すような該配列のフラグメントも本発明の範囲に入る。配列ＩＤ．Ｎ Ｏ２によるＮ−末端アミノ酸配列に７０％を越える、好ましくは８０％を越える 、より好ましく９０％を越える相同性を示すＮ−末端アミノ酸配列をコード化し 、および標準的アッセイにより決めることのできるＮ−アセチルムラミダーゼの 溶解活性を示すポリペプチドをコード化する核酸配列も本発明の範囲に入る。さ らに、配列ＩＤ．ＮＯ２による全アミノ酸配列に４０％を越える、好ましくは５ ０％を越える、より好ましく ６０〜１００％の相同性を示す全アミノ酸配列をコード化し、および標準的アッ セイにより決めることのできるＮ−アセチルムラミダーゼの溶解活性を示すポリ ペプチドをコード化する核酸配列も本発明の範囲に入る。特に、アミノ酸水準に おける７５％を越える相同性により特徴付けられる少なくとも三つの直接繰返部 を、アミノ酸配列のＣ−末端部分にさらに含んでいる前記態様のいずれかによる 核酸配列が本発明の範囲に入る。好ましくは、本発明の核酸配列によりコード化 されるアミノ酸配列は、直接繰返部の間にセリン、トレオニンおよびアスパラギ ンに富む介在配列を含む。より詳しくは、本発明の核酸配列は、図５に示される 膜スパンドメインをコード化する部分を含む。前記態様のいずれかによる核酸配 列は、当業者に周知の通常ないし厳しい（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下における 、配列ＩＤ．ＮＯ１および図４による核酸配列に対するハイブリッド化性能によ りさらに特徴付けられる。 溶解素遺伝子を用いて自然に発生するものとは異なり、好ましくは制御可能、 最も好ましくは食品級生物体から誘導されるプロモーターの制御下おける、前記 態様のいずれかによる本発明の配列を含む組換え宿主細胞も含まれる。好適なプ ロモータ ーの例が欧州特許出願ＥＰ−９４２０１３５４１．１およびＥＰ−９４２０１３ ５５．８に提供されている。二つの引用された欧州特許出願に開示されている種 々の態様におけるプロモーター，発現ベクターに関する詳細をここで参考として 組み入れる。特に、乳酸バクテリアのような食品級グラム陽性宿主細胞が宿主細 胞の好適な態様である。本発明による組換え宿主細胞は、また、対数成長期中に 必要な程度の自己溶解素の製造が保証されるようにその天然のプロモーターの制 御下の天然自己溶解素遺伝子を有する。 本発明を、以下に示す二つのドラフト提示によりさらに説明する。ドラフト提示１ モレキュラー・クローニング，ヌクレオチド・シークエンス，アンド・ファン クショナル・アナラシス・オブ・ザ・ジーン・フォア・ザ・メイジャー・ペプチ ドグリカン・ヒドロラーゼ・ジーン・オブ・ラクトコッカス・ラクティス（ＭＯ ＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥ， ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥ ＧＥＮＥ ＦＯＲ ＴＨＥ ＭＡＪＯＲ ＰＥ ＰＴＩＤＯＧＬＹＣＡＮ ＨＹＤＲＯＬＡＳＥ ＧＥＮＥ ＯＦ ＬＡＣＴＯＣ ＯＣＣＵＳ ＬＡＣＴＩＳ） 概要 ペプチドグリカンヒドロラーゼをコード化するＬ．ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍ ｏｒｉｓＭＧ１３６３の遺伝子を、加圧滅菌凍結乾燥Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉ ｃｕｓ細胞を含む培地上において細胞壁溶解活性についてＥ．ｃｏｌｉトランス フォーマントをスクリーニングすることによりｐＵＣ１９中の菌株のゲノムライ ブラリーにおいて確認した。Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３の細胞非含有抽出物 および幾つかのハロ形成Ｅ．ｃｏｌｉトランスフォーマントにおいて、Ｌ．ｌａ ｃｔｉｓまたはＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞壁を含む再生ＳＤＳ−ポリ アクリルアミドゲルにより同様の大きさの溶解バンドを確認した。４６ｋＤａお よび４１ｋＤａの溶解酵素の存在に相当するこれらの透明バンドのうち、４１ｋ Ｄａのバンドは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ培地の上澄みにも存在する。組換えプラスミ ドの一つの欠失分析は、溶解活性を特定する情報が２４２８−ｂｐ ＥｃｏＲＶ −Ｓａｕ３Ａフラグメント内に含まれることを示した。このフラグメントの一部 の配列は、４３７アミノ酸残基 のポリペプチドをコード化することのできる１３１１ｂｐの遺伝子（ａｃｍＡ） を示した。ＡｃｍＡ（４６．５６４Ｄａ）の計算された分子質量は、検出された 溶解活性の一つの分子質量に相当していた。おそらく、５７の位置におけるＡｌ ａ後の開裂により加工される前駆体タンパク質として酵素が合成され、それによ りＬ．ｌａｃｔｉｓの培地上澄み中に存在する溶解活性のサイズに相当する４０ ．２６４Ｄａの成熟タンパク質が製造される。成熟タンパク質のＮ−末端領域は 、Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓの自己溶解素およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒ ａｅの成熟ムラミダーゼ−２のＮ−末端領域に６０％の同一性を示した。後者の 二つの酵素のように、ＡｃｍＡはＣ−末端繰返領域を含む。ＡｃｍＡにおいて、 これら三つの繰返部は、セリン，トレオニン，アスパラギンを非常に多く含む非 相同性介在配列により分離される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出アッセイおよびＰＣＲ 実験を用いることにより、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓおよびＬ．ｌａｃ ｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓの種々の菌株において同一の活性を特定する遺伝子 が示された。置換組換えを用いて、長鎖として成長するａｃｍＡ欠失突然変異種 を構築したが、このことはＡｃｍＡが細胞分離を必要としていることを示す。 導入 バクテリアは、細胞膜のペプチドグリカンを加水分解することのできる酵素で ある幾つかの種類の細胞壁ヒドロラーゼを生成する。それらの開裂特異性によれ ば、酵素は、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（リゾチーム）、Ｎ−アセチルグルコサ ミニダーゼ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ，エンドペプチダ ーゼ、およびトランスグリコシラーゼ（４４）に分類される。細胞壁ヒドロラー ゼは、細胞壁タンオーバー（１１）、細胞分離、遺伝子トランスフォーメーショ ンの能力、べん毛の形成、胞子形成、および幾つかの一般的抗体の溶解作用（検 討のため（３８，５１）を参照）に関与すると考えられる。 スターターバクテリアＬ．ｌａｃｔｉｓの菌株は、チーズ製造における世界的 用途故に非常に経済的に重要である。チーズ熟成中に、バクテリアの自己溶解に より、カゼイン由来ペプチドを消化しチーズ風味の発生に貢献し得る種々のペプ チダーゼのような細胞内蛋白分解酵素が放出されると一般的に考えられている（ ４８）。 自己溶解素の生化学およびラクトコッカス類における自己溶解活性について幾 らかのデータが得られる。すなわち、ムー （Ｍｏｕ）ら（３１）およびニスカサーリ（Ｎｉｓｋａｓａａｒｉ）（３３）は 、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓが、中性ｐＨの培地において対数期中 に最高の自己溶解活性を示すことを示した。これらの著者は、細胞壁および上澄 みフラクション中に存在するＮ−アセチルムラミダーゼを検出することしかでき ず、エンドペプチダーゼまたはグルコサミニダーゼの活性は検出されなかった。 ラクトコッカル自己溶解活性はリポテイコイン酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）およびカルジオリピンにより抑制され、トリプシン（３３）により活 性化された。ムー（Ｍｏｕ）ら（３１）は、対数期Ｌ．ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅ ｍｏｒｉｓ細胞の細胞壁が赤道環において最も容易に自己溶解することも示した 。マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓおよびＬ．ｃｒｅｍ ｏｒｉｓの両方において線維形成が低下した自己溶解素活性と関係することを述 べ、後にラングスルド（Ｌａｎｇｓｒｕｄ）ら（２５）により確認された。これ らのデータは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおける自己溶解活性が細胞分離に関与するこ とを示す。 ラクトコッカル自己溶解素の生化学についてのデータは徐々に現れるが、Ｌ． ｌａｃｔｉｓにおける自己溶解を支配する遺 伝成分については何も知られていない。この報告において、我々は、Ｌ．ｌａｃ ｔｉｓからの主要なペプチドグリカンヒドロラーゼのための遺伝子のクローニン グ、発現および配列を報告する。さらに、自己溶解素の機能をはっきりさせるた めに欠失突然変異種を形成した。 材料および方法 バクテリア菌株、プラスミドおよび成長条件 この研究において用いられる菌株およびプラスミドを表１．１に挙げる。Ｌ． ｌａｃｔｉｓは、静置培地としてＭ１７液（英国ウエストモレシー在ディフコ社 （Ｄｉｆｃｏ）製）または乳清系培地（９）において３０℃には、またはＭ１８ 寒天上において、全てはグルコース０．５％を添加して、成長させた。エリスロ マイシン（独国，ベーリンガーマンハイム有限責任会社製）および５−ブロモ− ４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）（ミ ズーリ州セントルイス在シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．）製）をそれぞれ５μｇおよび０．００８％まで添加した。Ｅ．ｃｏｌｉ をＴＹ（ミシガン州デトロイト在ディフトラボラトリーズ社製）培地において３ ７℃で激しい攪拌下に、 または寒天１．５％（重量／体積）で固化し、アンピシリン（シグマ社製）１０ ０μｇ／ｍｌ、カナマイシン（ベーリンガー社製）５０μｇ／ｍｌまたはエリス ロマイシン（ベーリンガー社製）１００μｇ／ｍｌを必要に応じて含むＴＹ培地 上で成長させた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ） およびＸ−ｇａｌ（いずれもシグマ社製）を、それぞれ１ｍＭおよび０．００２ ％（重量／体積）の濃度で使用した。 一般的ＤＮＡ技術およびトランスフォーメーション 本質的にサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（３９）により記載されている ように分子クローニング技術を実施した。制限酵素、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ） 酵素、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびデオキシヌクレオチ ドをベーリンガーマンハイム社から得、供給者の指示に従って使用した。Ｌ．ｌ ａｃｔｉｓのゲノムＤＮＡを、１つの相違を伴なうリーンハウツ（Ｌｅｅｎｈｏ ｕｔｓ）ら（２８）の方法に従って単離し、リゾチームとともに溶解素溶液中に 懸濁した細胞ペレットを５５℃で１５分間培養（４１）した。Ｅ．ｃｏｌｉおよ びＬ．ｌａｃｔｉｓを、ザバロブスキー（Ｚａｂａｒｏｖｓｋ ｙ）およびウィンベーグ（Ｗｉｎｂｅｒｇ）（５５）により記載されたジーン・ パルサー（ＧＥＮＥ Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオ−ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製 ）およびリーンハウツおよびヴェネマ（Ｖｅｎｅｍａ）（２９）により指示され たハロ（Ｈａｌｏ）およびネス（Ｎｅｓ）（１５）の変法をそれぞれ用いてエレ クトロポレーションによりトランスフォームした。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためのサンプル調製 一晩成長させた後、フィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＰＵ８７２０ ＵＶ／Ｖ ＩＳスキャンニングスペクトロフォトメーター（英国ケンブリッッジ在パイ・ユ ニカム社（Ｐｙｅ Ｕｎｉｃａｍ Ｌｔｄ．）製）において６００ｎｍでＬ．ｌ ａｃｔｉｓ培地の光学濃度を測定した。 培地５ｍｌを遠心分離にかけ、上澄みフラクションを脱イオン水を何回かかえ て透析し、凍結乾燥し、変性緩衝液（２）１ｍｌに溶解した。細胞ペレットを変 性緩衝液１ｍｌに再度懸濁させ、ヴァン・デ・グッヒテ（ｖａｎ ｄｅ Ｇｕｃ ｈｔｅ）ら（４５）により記載されているように細胞非含有抽出物を調製した。 Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の細胞非含有抽出物を、一晩経過培地２ｍｌをペレット化した 後に製造した。サンプルを５分間沸騰させ、負荷する前に遠心分離した。レムリ （Ｌａｅｍｍｌｉ）（２４）により記載されているようにプロティーンＩＩミニ ゲル・システム（Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ Ｍｉｎｉｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ）（カ リフォルニア州リッチモンド在バイオ−ラッド・ラボラトリーズ社製）を用いて ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＡ）ゲル電気泳動を行った。予め添 加しておいた分子量マーカーはバイオ−ラッド社およびファーマシア社（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）（スウェーデンアップサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）在ファーマシアＡ Ｂ）から得た。 ＳＤＳ−ＰＡＡゲルにおける溶解活性の検出 ０．２％（重量／体積）の加圧滅菌し凍結乾燥したＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉ ｃｕｓＡＴＣＣ４６９８細胞（シグマ社 製）またはＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３の細胞壁を含むＳＤＳ−ＰＡＡ１２． ５％（重量／体積）を用いて、溶解活性をその場で検出した。ポトヴィン（Ｐｏ ｔｖｉｎ）ら（３７）の方法を以下の変化を伴って用いて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭ Ｇ１３６３の細胞壁を単離した：ＳＤＳ４％（重量／体積）中に再懸濁後、ヴァ ン・デ・グッヒテ（ｖａｎ ｄｅ Ｇｕｃｈｔｅ）ら（４５）により記載されて いるように破壊した。電気泳動後、３〜５回変化させたトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ ）Ｘ−１００の１％（重量／体積）を含む２５ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ （ｐＨ７）１００ｍｌ中で、ゲルを室温で２４〜４８時間穏やかに振盪して、タ ンパク再生（３７）を行った。溶解活性のバンドを、ＫＯＨ０．０１％（重量／ 体積）中のメチレンブルー（シグマ社製）１％（重量／体積）で着色し、次に脱 イオン水（１７）で色を抜くことにより可視化した。細胞壁を含まないＳＤＳ− ＰＡＡゲルをクマシーブリリアントブルーまたはバイオ−ラッド・シルバー・ス テイン・キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）（バイ オ−ラッド社製）で着色した。 Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓに対する溶解活性についてのＥ．Ｃｏｌｉスク リーニングにおけるＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３の染色体遺伝子ライブラリー の形成 Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３染色体ＤＮＡのライブラリーを、ザバロフスキ ー（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙ）およびアリクメッツ（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ）（５４ ）の従って幾つかの変化を伴って形成した。Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３のゲ ノムＤＮＡを適当な量のＳａｕ３Ａを用いて１５分間消化して、部分的消化物を 得た。染色体消化物の超純粋アガロース（ファーマシア社製）中における電気泳 動に続いて、サイズ４〜１０ｋｂのフラグメントを電気溶離によりゲルから単離 した。ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰで部分的に満たした単離染色体ＤＮＡフラグメン ト、およびＳａｌＩで線状化しｄＴＴＰおよびｄＣＴＰで部分的に満たしたｐＵ Ｃ１９ ＤＮＡを結合し、結合混合物を用いてＥ．ＣｏｌｉＮＭ５２２をエレク トロトランスフォームした。エレクトロポレーション後に、加圧滅菌し凍結乾燥 したＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞０．２％（重量／体積）を含み３７℃ にされたＴＹプレート上に細胞を載せた。２日後、プレートを室温下に置き、コ ロニー周囲の輪が出現するのを毎日 試験した。 分子クローニングおよびＤＮＡ配列 図３において（ａ）および（ｂ）で示す、ｐＡＬ０１の１４６７および１３８ ３ｂｐの二つのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＵＫ２１のＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳａｃＩ部位内にサブクローニングし、得られたプラスミドをそれ ぞれｐＡＬ０４およびｐＡＬ０３と示した（図１２．Ａ−１を参照）。ｐＡＬ０ ４の挿入部を、ユニークＳｐｅＩ部位を用いて二つのフラグメント内にサブクロ ーニングし：ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＡＬ０３を消化しｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩ部位内に６８２−ｂ ｐフラグメントをサブクローニングすることによりｐＡＬ０５を形成し：ｐＡＬ ０４の挿入部の他の部分をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋の同じ部位内に７０ １ｂｐのＳｐｅＩ−ＳａｃＩフラグメントとしてサブクローニングした。このサ ブクローンをｐＡＬ０６と名付けた。ｐＡＬ０３の３５２−ｂｐ ＳｃａＩ−Ｓ ａｃＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋のＳｍａＩおよびＣｌａ Ｉ部位内にＳｃａＩ−ＣｌａＩフラグメントとしてサブクローニングしてｐＡＬ ０７（図 １２．Ａ−２）とした。 種々のサブクローンの挿入部の両鎖を、Ｔ７配列キット（ファーマシア社製） および二重鎖プラスミドテンプレートを用いたジデオキシ鎖終了法（４０）によ り製造者の指示に従って一般的および逆ｐＵＣプライマーを使用して、配列決定 した。配列を合成ＤＮＡプライマにより完結した。アプライド・バイオシステム ズ ３８１Ａ ＤＮＡ シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ ３８１Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）（カリフォルニア州フォスタ ーシティー在アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）製）を用いてプライマーを製造した。得られたＤＮＡヌク レオチドおよびアミノ酸配列を、ＰＣ／ＧＥＮＥ（バージョン６．７）配列分析 プログラム（スイス国ジェネバ在インテリジェネティクス社（ＩｎｔｅｌｌｉＧ ｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）製）を用いて分析した。データベースＳＷＩＳＳＰ ＲＯＴ（公表２７）およびタンパク質およびゲノム配列のＡＴＬＡＳ（１９９４ 年３月）を用いてＦＡＳＴＡプログラム（３５）によりタンパク質相同性リサー チを行った。サザントランスファー、ＤＮＡハイブリッド化およびＰＣＲ アガロースゲル電気泳動の後、チョムチンスキー（Ｃｈｏｍ ｃｚｙｎｓｋｉ）およびカスバ（Ｑｕａｓｂａ）（４）により修正されたサザン プロトコールによりジーン・スクリーン・プラス・メンブレンズ（Ｇｅｎｅ−Ｓ ｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）（マサチューセッツ州ボストン在 ニュー・リサーチ・プロダクツ社（ＮＥＷ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓ）製）にＤＮＡを転移させた。ＥＣＬ標識化および検出システムを用いて製造 者（英国アマーシャム在アマーシャム・インターナショナル社（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））の指示に従ってプローブ標識化およびハイ ブリッド化を行った。 いずれもａｃｍＡ遺伝子内に位置（図４）するＰＡＬＡ−４（５’−ＣＴＴＣ ＡＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴＣＣ）とＰＡＬＡ−１４（５’−ＧＡＴＡＡＡＴＧＡＴ ＴＣＣＡＡＧＣ）との組み合わせプライマー、またはｐＩＮＴＡＡの挿入部の上 流に位置するＰＡＬＡ−１９（５’−ＣＡＡＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＡＣＧ）、お よびｐＯＲＩ２８０の複製起源内に位置するＢＫ０５ＡＬ（５’−ＡＴＴＡＴＴ ＴＧＡＴＴＧＧＡＧＴＴ）（図８においてそれぞれｘおよびｙと表示）を使用し て、染色体ＤＮＡについて、ＳＵＰＥＲ ＴＡＱ ＤＮＡ−ポリメラーゼを用い て製造者（英国ケンブリッジ在ＨＴバイオテクノロジー社（ＨＴ ＢＩＯＴＥＣ ＨＮＯＬＯＧＹ ＬＴＤ．））の指示に従ってＰＣＲ反応を行った。 ａｃｍＡ欠失菌株の形成 リーンハウツ（Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ）およびヴェネマ（Ｖｅｎｅｍａ）（２７ ，２９）により開発された置換組換えシステムを用いて、ａｃｍＡをＬ．ｌａｃ ｔｉｓ ＭＧ１３６３の染色体上に内部欠失を有するａｃｍＡ遺伝子で置換した 。ｐＩＮＴＡＡの形成を示す図式については図１２．Ｂを参照。ｐＡＬ０１をＥ ｃｏＲＩおよびＳｍａｌで切断することにより、ａｃｍＡ内にユニークＳａｃＩ 部位を得た。プラスミドＤＮＡをクレノー酵素で処理し、結合し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５２２をエレクトロトランスフォームするのに用いた。得られたプラスミド ｐＡＬ０８をＳａｃＩおよびＳｐｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処 理し、結合し、Ｅ．ｃｏｌｉＮＭ５２２をエレクトロトランスフォームするのに 用いてプラスミドｐＡＬ０９を得た。ｐＡＬ０９をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶ で消化し、欠失ａｃｍＡ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＯＲ１２８０の ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ部位内にサブクローニン グした。結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＥＣ１０００をエレクトロトランスフ ォームした。ｐＩＮＴＡＡと名付けられる得られた合体プラスミドを用いてＬ． ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３をエレクトロトランスフォームした。リーンハウツ （Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ）およびヴェネマ（Ｖｅｎｅｍａ）（２９）により記載さ れているように第２の交差の選択を行った。 結果 Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３のペプチドグリカンヒドロラーゼ活性の分析 ＧＭ１７または乳清増殖Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３のペプチドグリカン 加水分解活性を、基質としての加圧滅菌し凍結乾燥したＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔ ｉｃｕｓ細胞またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３の単離 細胞壁の存在下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した（図１）。２９〜１１１ｋＤ ａのサイズ範囲のタンパク質に相当する１１の透明バンドを、乳清培地の上澄み フラクションにおいて検出したが、基質として加圧滅菌Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔ ｉｃｕｓ細胞を用いる場合ＧＭ１７培地のこのフラクションにおいて、それらの うち３つのみが検出できた。乳清増殖細胞の上澄みフラクショ ン中で検出された４６ｋＤａバンドを越える三つの活性は、ＧＭ１７中で増殖し た細胞の上澄みフラクションにおいては検出できなかった。Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭ Ｇ１３６３の細胞壁の場合、乳清増殖細胞の上澄みにおいて３つのバンドしか検 出できず、ＧＭ１７培地上澄みにおいては１つのバンドしか検出できなかった。 基質としてＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を用いる場合、二つの培地の細 胞非含有抽出物においては、４１および４６ｋＤａタンパク質に相当する二つの 透明バンドのみが観察された。単離ラクトコッカル細胞壁を含むゲルにおいてよ り小さいバンドのみしか発見されなかった。再生においてｐＨ３〜１０の緩衝ト リトン Ｘ−１００を用いると全ての活性を検出することができたが、ｐＨ７で の再生後に着色条件は最良であった。サンプルを基質なしでＳＤＳ−ＰＡＡゲル 上で処理すると、クマシーブリリアントブルーでの着色およびその後の銀染色の 後、細胞非含有抽出物または上澄みフラクションのいずれにおいても透明バンド に相当するタンパク質バンドは検出されなかった（結果は示されない）。 ペプチドグリカン加水分解活性は、０．２％（重量／体積）の加圧滅菌し凍結 乾燥したＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細 胞を組み入れたＧＭ１７寒天プレート上においても検出された。３０℃での３６ 時間の培養後に、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３のコロニーの周囲に透明される 領域として、細胞壁の加水分解を見ることができた。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペプチドグリカン加水分解活性についてＬ．ｌａｃｔ ｉｓＭＧ１３６３のプロテイナーゼ陽性菌株を試験すると、上澄みフラクション に僅かに小さい透明バンドが存在するだけであった。細胞非含有抽出物における バンドはプロテイナーゼ欠損菌株において見られるものと同じであった（結果は 示されない）。 Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３の主要ペプチドグリカンヒドロラーゼの遺伝子の クローニング ｐＵＣ１９におけるＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３のゲノムライブラリーの平 均挿入部寸法は６ｋｂであった。試験した約８０００のコロニーのうち１３がＭ ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を含むＴＹプレート上に輪（ｈａｌｏ）を形 成した。これらＥ．ｃｏｌｉクローンの細胞非含有抽出物上における再生ＳＤＳ −ＰＡＧＥは、全ての製造された透明バンドが約４６および４１ｋＤａ（図２） であることを示した。Ｅ．ｃｏｌｉ 中に存在する４６ｋＤａバンドはラクトコッカル細胞フラクション中にのみに存 在し、Ｅ．ｃｏｌｉにより製造された４１ｋＤａバンドは細胞非含有抽出物およ びＬ．ｌａｃｔｉｓの上澄みフラクションの両方において観察された。さらに、 陽性Ｅ．ｃｏｌｉクローンの細胞非含有抽出物を分析すると、幾つかの素早く移 動するバンドが見られた。１３のＥ．ｃｏｌｉクローンのｐＵＣ１９における挿 入部の寸法は４．１〜９ｋｂであった。制限酵素分析は、全ての溶解素製造コロ ニーから単離されたプラスミドが４．１ｋｂ Ｓａｕ３Ａ挿入部を有することを 示した。この４．１ｋｂのフラグメントのみを含むクローンは、増殖の問題を示 した。菌株の一晩経過培地は激しく泡立ち、裸眼観察および光学顕微鏡により培 地において細胞の凝集が観察された。さらなる試験のためにこのクローンを選択 し、そのプラスミドをｐＡＬ０１と示した。挿入部の制限地図を図３に示す。Ｌ ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３の染色体ＤＮＡの種々の制限酵素消化物を、プロー ブとしてｐＡＬ０１の４．１ｋｂ Ｓａｕ３Ａ挿入部を用いてサザンハイブリッ ド形成により分析した。このフラグメントの制限地図と相当する染色体ＤＮＡと の比較により判断して組換えは発見されなかった（結果は示さ れない）。 ｐＡＬ０１の５０７ｂｐ ＥｃｏＲＶフラグメントは、透明バンドの損失なし に欠失することができた。Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＡＬ０２）細胞非含有抽出物に存在 する最も分子量の高い活性バンドは４６ｋＤａであり、最小のＳａｕ３Ａ−Ｅｃ ｏＲＶフラグメント（１２０１−ｂｐ）のコード能力は４６ｋＤａのタンパクを コード化するには小さすぎるので、２４３４−ｂｐ ＥｃｏＲＶ−Ｓａｕ３Ａフ ラグメントをサブクローニングし配列決定した。 ペプチドグリカンヒドロラーゼのためのラクトコッカル遺伝子のヌクレオチド配 列 ｐＡＬ０１の二つのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ａ）および（ｂ ）（図３を参照）を、ｐＵＫ２１内にサブクローニングし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔ ＳＫ＋を用いて幾つかのより小さいサブクローンを形成した（図１２．Ａ −１および１２．Ａ−２）。１９３０−ｂｐ ＳｓｐＩ−Ｓａｕ３Ａフラグメン トｐＡＬ０１のヌクレオチド配列が図４および配列ＩＤ．ＮＯ１に示され、１３ １１ｂｐ（ａｃｍＡ）の一つと２８２ｂｐ（ＯＲＦＡ）の一つの二つの完全な開 いた読み枠 （ＯＲＦ）を含むことが示された。ＯＲＦＡの上流に、ＯＲＦＡがオペロンの最 後のＯＲＦであることを示す第３のＯＲＦの一部が発見された。ＯＲＦＡとａｃ ｍＡの両方の前方に、ラクトコッカル１６Ｓ ｒＲＮＡ（３）の３’末端と相補 的な推定リボゾーム結合部位が存在し、それぞれ−９．７および−９．６ｋｃａ ｌ／ｍｏｌのΔＧ°（４３）を有する。また、２３ｂｐの間隔を有する可能な− １０および−３５領域がａｃｍＡの上流に存在する。推定−１０領域の前方に、 今まで分析されたラクトコッカルプロモーター（８）の４０％以上において見つ けられる配列ＴＧＮが存在する。このＯＲＦの下流に、ロー非依存タミネーター （３６）として機能するΔＧ°＝−１６ｋｃａｌ／ｍｏｌの逆繰返しが位置する 。配列決定フラグメントは３６．２％のＧ＋Ｃ含量を有し、それはＬ．ｌａｃｔ ｉｓについて決定されたＧ＋Ｃ含量（３８．６％；（３２））に一致している。 ａｃｍＡおよびＯＲＦＡのコドン使用は、幾つかの配列決定Ｌ．ｌａｃｔｉｓ遺 伝子からヴァン・デ・グッヒテら（４６）により計算されたものに一致する。 推定アミノ酸配列および相同性比較 ａｃｍＡは、推定分子量４６．５６４の４３７アミノ酸のタ ンパク質をコード化する。最初の５７アミノ酸は推定シグナルペプチド（４９） を構成し、膜スパンドメインがこの拡がりのアミノ酸内において確認された（図 ５および配列ＩＤ．ＮＯ３）。この推定シグナルペプチドの開裂により４０．２ ６４Ｄａのタンパク質が得られる。全タンパク質は１０．４５の等電点（ＰＩ） を有する。推定シグナル配列を有さないタンパク質はＰＩが１０．１２であった 。 Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ（６）のムラミダーゼ−２およびＳ． ｆａｅｃａｌｉｓ（２）の自己溶解素に対してＡｃｍＡのＮ−末端部分の高度の 類似性が発見され、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの細突起タ ンパク質ＦｌｇＪ（１９）に対して低度の類似性が観察された。アミノ酸６５と ２２０との間のＳ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒ ａｅの自己溶解素と、ＡｃｍＡとの間に約５６％の同一性が発見された（図５Ａ および配列ＩＤ２）。文献（３１，３３）から得られる生化学データと併せたこ れらのデータから、および以下に示す結果から、我々は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの主 要リゾチーム（Ｎ−アセチルムラミダーゼ）をコード化する遺伝子をクローニン グしたと結論付ける。 従って、遺伝子はａｃｍＡと呼ばれた。 タンパク質のＣ−末端部分において、三つの繰返領域が存在していた。それら の領域は４４アミノ酸の長さであり、セリン、トレオニンおよびアパラギン残基 を非常に多く含む介在配列により分離される。繰返領域間の全類似性は約７５％ （図６）である。ＤＮＡ水準において、相同性は僅か４５％である。ＡｃｍＡの Ｃ−末端部分における繰返領域は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅおよ びＳ．ｆａｅｃａｌｉｓの細胞壁ヒドロラーゼのＣ−末端繰返領域と相同性を有 する。三つの酵素におけるこれらの繰返の機構を図５Ｂにおいて概略的に示す。 ＡｃｍＡのこの部分は、また、ペプチドグリカンヒドロラーゼ活性（５２）を有 することが最近示されたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのタン パク質Ｐ６０に相同性を示す。 ＯＲＦＡは、分子寸法が１１．２８７Ｄａの９４アミノ酸のタンパク質をコー ド化することができた。ＯＲＦＡ生成物は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体（１，７）のｒ ｆａＨ−ｆｒｅ遺伝子間領域における１１．２ｋＤａ仮想タンパク質と６４％（ １９％同一性）の相同性を有する。 他のラクトコッカル菌株におけるａｃｍＡおよびその遺伝子生成物の検出 Ｌ．ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａ ｃｔｉｓ次亜種ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ１８−１６Ｓ、およびＬ．ｌａｃｔ ｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓ菌株ＡＭ１，ＨＰおよびＭＧ１３６３を、ＧＭ１７中 において３６時間増殖させた。細胞非含有抽出物を調製し、基質としてＭ．ｌｙ ｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を用いて再生ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。４ １および４６ｋＤａの寸法に相当する位置における溶解活性の主要バンドを全て の菌株において検出した（結果は示さない）。この結果は、二つの配列プライマ ーＰＡＬＡ−４およびＰＡＬＡ−１４（図４）を用いるＰＣＲにより補足され、 データを図７に示す。全ての菌株の染色体ＤＮＡから、同じ１１３１−ｂｐ Ｄ ＮＡフラグメントが増幅された。これらの結果は、菌株ＡＭ１においてＮ−アセ チルムラミダーゼ（３１）と確認された同じ主要ペプチドグリカンヒドロラーゼ 活性を、全ての菌株が含むことを示している。 染色体ａｃｍＡ欠失突然変異種の形成および分析 ＡｃｍＡの機能を調べるために、置換組換え（２７，２９）によりａｃｍＡの 染色体コピー中に欠失を導入した。内部欠失を有するａｃｍＡ遺伝子（図１２． Ｂ）を運ぶｐＩＮＴＡＡによるＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３のトランスフォー メーション後に、プライマーＰＡＬＡ−１９およびＢＫ０５ＡＬ（図８において それぞれｘおよびｙ）を用いてＰＣＲにより組込み体（Ｅｍ^rおよびβ−ガラク トシダーゼを製造する）を調べた。ｐＩＮＴＡＡの挿入部の部分１を介する組込 みにより２５５０ｂｐのＰＣＲ生成物を得、部分２を介する組込みにより３２４ ７ｂｐのＰＣＲ生成物を得た。得られた組込み体の３／４が部分１を介して組込 みされた（結果は示さない）。これらの組込み体の一つが、さらなる実験のため に使用される。ＧＭ１７中における３０〜３５世代の非選択的増殖の後、組込み プラスミドの切除を行った。Ｘ−ｇａｌおよび０．２％（重量／体積）の加圧滅 菌し凍結乾燥したＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を含むＧＭ１７プレート 上に細胞を載せ、青着色および輪形成の損失についてスクリーニングした。ａｃ ｍＡにおいてＳａｃＩ部位とＳｐｅＩ部位との間に位置するＨａｅＩＩＩ部 位（図８）の損失を示すために、二つのそのようなコロニーの染色体ＤＮＡをサ ザンハイブリッド形成により分析した。予想したように、両方の菌株の染色体中 に、２９４５ｂｐと１５９９ｂｐの二つのフラグメントの代わりに４０５７ｂｐ のフラグメントが存在した（図９）。この結果は、ａｃｍＡがＬ．ｌａｃｔｉｓ において必須の遺伝子ではないことを示している。 乳清系培地またはＧＭ１７中で増殖した二つの欠失突然変異種およびＭＧ１３ ６３の細胞非含有抽出物および上澄みフラクションを、基質として加圧滅菌Ｍ． ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を含む再生ＳＤＳ−ＰＡＡゲル上で分析した。 図１０は、両方の欠失突然変異種において、細胞壁ヒドロラーゼ活性が、ＧＭ１ ７増殖細胞中の上澄みフラクションにおいても細胞非含有抽出物においても存在 しないことを示した。また、乳清系培地中における増殖後に、透明バンドを検出 することができなかった（結果は示さない）。Ｌ．ｌａｃｔｉｓの上澄みフラク ションおよび細胞非含有抽出物中に通常存在する透明バンド（図１参考）の全て がａｃｍＡの不活性化後に消失したという事実は、全てＡｃｍＡから生じたこと を示している。 両方の培地中での一晩の増殖後に、ＭＧ１３６３ａｃｍＡ Δ１の沈殿が観察された。ＭＧ１３６３の細胞およびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１ の細胞を光学顕微鏡により調べた。ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１はＭＧ１３６３と 比べて非常に長い鎖を形成し（図１１参照）たが、そのことは主要なラクトコッ カルペプチドグリカンヒドロラーゼであるＡｃｍＡが細胞分離に必要であること を示している。 先に示したデータは、細胞分離に必要なＮ−アセチルムラミダーゼ（リゾチー ム）である一つの主要なペプチドグリカンヒドロラーゼのみをＬ．ｌａｃｔｉｓ が含むことを決定的に示している。 検討 この報告において、我々は乳酸バクテリアのゲノムの第１のペプチドグリカン ヒドロラーゼのクローニングを示した。遺伝子は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ ａｃｔｉｓの主要なペプチドグリカンヒドロラーゼをコード化する。使用した全 てのＬ．ｌａｃｔｉｓ菌株および実際、今まで試験した全ての菌株においてＰＣ Ｒおよび再生ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて遺伝子が検出された（公表されていない 記録）。ムー（Ｍｏｕ）ら（３１）が細胞壁フラクション中においてムラミダー ゼ活性のみを観察 した菌株ＡＭ１においても遺伝子が検出されたので、我々は、クローニングした 遺伝子が、Ｎ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミン部分との間の結 合を加水分解する酵素であるラクトコッカルＮ−アセチルムラミダーゼをコード 化すると結論付け、そしてそうであった。従って、その遺伝子はａｃｍＡと表さ れた。再生ポリアクリルアミドゲル中の自己溶解活性を検出するための標準化ア ッセイを用いて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ培地の細胞と上澄みフラクションとの両方に おいて、基質としてＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞壁を使用して、幾つか の溶解バンドを発見したが、宿主の細胞壁を用いた場合は僅かなこれらのバンド しか発見されなかった。この結果は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの溶解活性は気質として Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を用いよく検出されることを示す。このこ とは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍまたはＳ．ｆａｅｃａｌｉｓのバクテリア抽出物を分析し たときにレクラーク（Ｌｅｃｌｅｒｃ）ら（２６）によっても観察された。野性 ラクトコッカル菌株およびａｃｍＡ欠失突然変異種の細胞および上澄みフラクシ ョンを比較すると、ＡｃｍＡから生じた前者中に存在する溶解バンドの全てが欠 失突然変異種中において消滅していたこと がわかった。活性バンドの最も小さいものは約２９ｋＤａの分子寸法に相当した ので、ＡｃｍＡの主な部分を活性の大きな損失無く除去することができる。活性 部位は最も高い可能性でＮ−末端に存在する（下記参照）ので、欠失はＣ−末端 繰返領域で生じると考えられる。活性の損失無く細胞壁ヒドロラーゼが分解する ことが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（３４）およびＢａｃ ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（２２，２３，３７）において以前に観察されて いる。ａｃｍＡを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の細胞非含有抽出物において、Ｍ． ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓの細胞壁を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥの再生時に、一 方が４６ｋＤａと他方が４１ｋＤａである二つのバンドおよび幾つかのより小さ いバンドが存在する。Ｌ．ｌａｃｔｉｓの細胞非含有抽出物においても４１ｋＤ ａと４６ｋＤａのバンドが検出されたが、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの上澄みフラクショ ンにおいては二つのうちの小さい方しか発見されなかった。ａｃｍＡは４３７ア ミノ酸のタンパクをコード化し、ＡｃｍＡの計算された分子質量（４６．５６４ Ｄａ）はラクトコッカル細胞非含有抽出物（４６ｋＤａ）中の最も大きい透明バ ンドの大きさ（４６ｋＤａ）に相当する。ＡｃｍＡの推定アミ ノ酸配列のうちで、ヘイン（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）（４９）の規則を用いて５ ７アミノ酸の推定シグナル配列を確認した。グラム陽性バクテリアからの大部分 のシグナルペプチドと対照的に、この推定シグナル配列のｎ−領域は、８〜１２ ではなく１２の帯電アミノ酸残部を有する２９アミノ酸からなる（５０）。これ は、最初の２９アミノ酸内に１１の帯電アミノ酸を有するＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃ ｕｓ ｈｉｒａｅのムラミダーゼ−２のシグナル配列に類似している（６）。５ ７アミノ酸のシグナルペプチドに基づき、熟成ＡｃｍＡの分子質量は４０．２６ ４Ｄａであり、それはＬ．ｌａｃｔｉｓの培地上澄み中の主要な透明バンドの大 きさ（４１ｋＤａ）に相当する。最も高い可能性で、ＡｃｍＡはプレタンパク質 として製造され、分泌体は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ培地の上澄みにおいて見つけられ る４１ｋＤａタンパク質である。４６ｋＤａプレタンパク質は少量で製造される か、または使用されるアッセイにおいて低い活性を有するが、それは活性の相当 するバンドの透明性が常に低いからである。細胞非含有抽出物中に存在する４１ ｋＤａタンパクは、最も高い可能性で、細胞全体になお付着している（Ｃ−末端 繰返領域とともに（以下を参照））酵素である。 ＡｃｍＡの推定アミノ酸配列は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅのムラ ミダーゼ−２（６）およびＳ．ｆａｅｃａｌｉｓの自己溶解素（２）に全体に類 似性を示す。最も高い可能性で活性部位（２）を取り巻く三つのタンパク質のＮ −末端領域において同一性は非常に高かった。この領域内において、Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの細突起タンパク質ＦｌｇＪにも相同性が 発見された（１９）。ＡｃｍＡのＣ−末端部分において、セリン、トレオニンお よびアスパラギン残基を多く含む非相同性配列により分離された三つの繰返領域 が存在していた。ムラミダーゼ−２は、ＡｃｍＡにおけるのと同じ種類の非相同 性配列により分離された６つのそのような繰返領域を有する。繰返中において、 ジョリス（Ｊｏｒｉｓ）らによりコンセンサス配列が仮定された（２０）。相同 性の比較から、ＡｃｍＡ、ムラミダーゼ−２およびＳ．ｆａｅｃａｌｉｓの自己 溶解素が、それぞれ３、６および５のそのようなコンセンサス配列を含むことが 明らかである。三つの細胞壁ヒドロラーゼの全てが、それらのＣ−最末端に繰返 を有する。類似の繰返が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ φＰＺＡリゾ チーム、相同性Ｂａｃｉｌｌｕｓ遺伝子１５リゾチーム、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍ ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ病原関連タンパク 質ｐ６０およびジョリス（Ｊｏｒｉｓ）らによるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａ（２０）において、ならびにアワードウ（Ｈｏｕｒ ｄｏｕ）らによるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓの胞子形成関連τ− Ｄ−グルタミル−（Ｌ）メソ−ジアミノピメリン酸−加水分解ペプチダーゼＩ（ １６）においても検出された。我々は、亜硝酸ヘキサヒム（ｈｅｘａｈｅｍｅ ｎｉｔｒｉｔｅ）リダクターゼ（２１）の嫌気性発現に影響を与えるタンパク質 である、Ｅ．ｃｏｌｉのＤｎｉＲのＮ−末端部分においてもこのコンセンサスを 二度見つけ、その第２の繰返はＡｃｍＡの第１の繰返にいくらかの類似性を示し た。その繰返領域は、基質認識および、したがって細胞壁結合（２０）に関与す ると考えられる。 ａｃｍＡ欠失突然変異種は長鎖として増殖し、一晩の増殖後に培地の沈殿を生 じさせる。この結果は、マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）らにより既に発見さ れ（３０）ラングスルード（Ｌａｎｇｓｒｕｄ）らにより確認された（２５）細 胞分離にＡｃｍＡが関与することを証明している。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏ ｃｙｔｏｇｅｎｅｓのｐ６０タンパク質（５２）およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕ ｓ ｈｉｒａｅのムラミダーゼ−２ （１０）も、細胞分離において本質的役割を有することが発見された。欠失突然 変異種の更なる分析により、ａｃｍＡが、ペプチドグリカンヒドロラーゼをコー ド化する唯一のラクトコッカル遺伝子であるかどうか、またはＬ．ｌａｃｔｉｓ が、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｄａｅ（４２）の場合のように第２のムラ ミダーゼを含むかどうかが明らかになる。Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞 壁を含むＧＭ１７上に欠失突然変異種が置かれたとき輪は存在しなかったが、そ のことは、ここで用いられる再生ＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順において省略されたヒド ロラーゼをＬ．ｌａｃｔｉｓが発現しないことを示している。プロテイナーゼ陽 性Ｌ．ｌａｃｔｉｓ菌株を用いて得られる結果は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ ｉｌｉｓ（１８）において観察されたように、自己溶解素の活性が蛋白分解によ り部分的に制御されることを示している。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ培地の上澄みにおい て活性ゲル中で観察される溶解バンドに相当するＳＤＳ−ＰＡＡゲル中にタンパ ク質を検出することができなかったことは、細胞壁ヒドロラーゼの発現が非常に 低いことを示しており、それは最近に研究の課題となっている。ドラフト提示２ オートリシス・オブ・Ｌ．ラクティス・コーズド・バイ・インデュースド・オー バープロダクション・オブ・ザ・メイジャー・オートライシン・ＡｃｍＡ（ＡＵ ＴＯＬＹＳＩＳ ＯＦ Ｌ．ＬＡＣＴＩＳ ＣＡＵＳＥＤ ＢＹ ＩＮＤＵＣＥ Ｄ ＯＶＥＲＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＴＨＥ ＭＡＪＯＲ ＡＵＴＯＬＹ ＳＩＮ ＡｃｍＡ） 概要 主要自己溶解素遺伝子ａｃｍＡ中の欠失を含む、この菌株の突然変異種および Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓＭＧ１３６３の培 地の増殖分析は、長い静止期増殖中に突然変異種菌株の自己溶解がほとんど起こ らなかったことを示した。これに対して、野性菌株Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６ ３の光学濃度は同じ時期に５０％を越える程度に低下した。補足研究は、ａｃｍ Ａプロモーターが、構造遺伝子の上流の１３８ｂｐ ＳｓｐＩ−ＳｃａＩフラグ メント内に位置することを示した。プラスミドコード化ａｃｍＡ遺伝子を有し、 すなわち野性のものよりも多くのａｃｍＡのコピーを含むａｃｍＡ突然変異種は 、長い静止期増殖中に、野性菌株より高 い程度に溶解した。ａｃｍＡ欠失突然変異種およびトリペプチダーゼ（ｐｅｐＴ ）欠失突然変異種の終期対数期培地を混合することによりＡｃｍＡのＩｎ ｔｒ ａｎｓ作用が示された。ａｃｍＡ欠失菌株により製造されたＰｅｐＴを、混合培 地の培地上澄みにおいて検出したが、これは、ａｃｍＡ突然変異種の溶解が、ｐ ｅｐＴマイナス細胞により分泌されたＡｃｍＡの作用によるものであったことを 示している。それ自体のプロモーターを欠いているラクトコッカル主要自己溶解 素遺伝子が、溶原性バクテリオファージＲＩ−ｔの誘発性プロモーター／オペレ ーター領域の下流に配置されたプラスミドを形成した。このプラスミドを含むＬ ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２の初期対数的増殖培地のマイトマイシンＣによる誘発 後、細胞は、基質としてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ 細胞壁を含む再生ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより示される自己溶解の対 照となり、および細胞内配置タンパク質を放出する。 導入 自己溶解素は、細胞壁のペプチドグリカンを加水分解する死を招く酵素である 。最近、我々は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＭＧ１３６３の主要自己溶 解素ａｃｍＡのクローニングに成功した。ＡｃｍＡは、ペプチドグリカンにおけ るＮ−アセチルムラミル，１，４，−β−Ｎ−アセチルグルコサミン結合を加水 分解するリゾチームに似た酵素（ムラミダーゼ）である。ＡｃｍＡは細胞分離を 必要とすることが示された（２）。 バゲルード（Ｖａｇｅｒｕｄ）ら（２４）およびラングスルード（Ｌａｎｇｓ ｒｕｄ）ら（９）は、グループＮストレプトコッカスの自己溶解を長期間モニタ ーし、試験した菌株間に異なる自己溶解速度が観察された。バゲルード（Ｖａｇ ｅｒｕｄ）ら（２４）は、炭素源としてのグルコースを有する緩衝Ｍ１７培地に おいてラクトコッカスの自己溶解が最高であることを示した。ラングスルード（ Ｌａｎｇｓｒｕｄ）ら（９）は、細胞内配置ラクテートデヒドロゲナーゼの活性 を、自己溶解後に培地上澄み中で検出することができることを示した。 ラクトコッカスの蛋白分解活性は、発酵乳生産物、特にチーズ（１６，２２） における熟成および風味向上に関与する。ラクトコッカスは幾つかの細胞内配置 ペプチダーゼ（１８，２０）を含む。細胞の自発的溶解後にこれらのペプチダー ゼを放出することは、チーズ熟成および風味向上（２９）に含まれると考 えられる。熟成は遅く、従って、工程に費用がかかるが、それは細胞の高められ た溶解およびすなわち細胞内ペプチダーゼの迅速な放出により促進することがで きる。この報告において、我々は、溶原性ラクトコッカルバクテリオファージＲ Ｉ−ｔリプレッサー（１４，２８）により制御され、最近特徴付けられたプロモ ーター／オペレーター領域を用いることにより主要な高められた自己溶解を得る ことができることを示す。 材料および方法 バクテリア菌株、プラスミドおよび増殖条件 この研究で用いた菌株およびプラスミドを表２に挙げる。 （英国ウエストモレシー在ディフコ社製）中３０℃で、または寒天１．５％で固 化したＭ１７ブロス（ｂｒｏｔｈ）上で、いずれの場合もグルコース０．５％を 補足して増殖させた。ＭＧ１３６３およびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の増殖分析 中、両菌株を１^*Ｍ１７上で増殖させた。必要な場合、エリスロマイシン（独国 在ベーリンガー・マンハイム有限責任会社製）５μｇ／ｍｌを添加した。Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを、ＴＹ（ミシガン州デトロイト在ディフコラボラ トリー社製）培 地中３７℃で激しく攪拌しながら、または要すればｍｌ当たりアンピシリン（ミ ズーリ州セントルイス在シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｄａｌ Ｃ ｏ．）製）１００μｇまたはエリスロマイシン１００μｇを含む寒天１．５％（ 重量／体積）で固化したＴＹ培地上で増殖させた。 一般的ＤＮＡ技術およびトランスフォーメーション 分子クローニング技術を本質的にサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らにより 記載されているように行った。制限酵素、クレノー酵素、Ｔ４ ＤＮＡポリメラ ーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびデオキシヌクレオチドを、ベーリンガー・マ ンハイム社から得、供給者の指示に従って使用した。ザバロフスキー（Ｚａｂａ ｒｏｖｓｋｙ）およびウィンベルク（Ｗｉｎｂｅｒｇ）（１０）ならびにホロ（ Ｈｏｌｏ）およびネス（Ｎｅｓ）に記載されているようにして、それぞれリーン ハウツ（Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ）およびベネマ（Ｖｅｎｅｍａ）により示唆された 修正を加えて、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＬ．ｌａｃｔｉｓを、ジーン・パルサー（Ｇ ｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）（カリフォルニア州リッチモンド在バイオ−ラッド ラ ボラトリー社製）を用いて、エレクトロポレーションによりトランスフォームし た。 Ｌ．ｌａｃｔｉｓのプラスミドＤＮＡ単離を、リーンハウツ（Ｌｅｅｎｈｏｕｔ ｓ）およびベネマ（Ｖｅｎｅｍａ）により記載されたようにして、幾分の修正を 加えて行った。Ｌ． 殖させ、溶液Ａ（ムタノライシンを用いない）中で５５℃で１５分間培養を行っ た。 プラスミド生成 ラクトコッカルプラスミドｐＧＫ１３のＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ部位中に、ｐ ＡＬ０１の１９４２−ｂｐ ＳｓｐＩ／ＢａｍＨＩおよび１８０４−ｂｐ Ｓｃ ａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをそれぞれサブクローニングすることによりプラ スミドｐＧＫＡＬ１およびｐＧＫＡＬ２を生成した。結合混合物およびｐＧＫ１ ３をＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１にトランスフォームした。 ａｃｍＡ発現を誘発し得るｐＡＬ１２の生成を図１６に概略的に示す。特記し ない限り、全ての工程はＥ．ｃｏｌｉＭＣ１０００中で行った。ｐＡＬ０１は、 自己溶解素遺伝子（ａｃｍＡ）を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３からの４１ ３７−ｂｐ染色体ＤＮＡフラグメントを含むｐＵＣ１９誘導体である。 ｐＡＬ０１の複数クローニング部位に存在するＳａｃＩ部位を、ＥｃｏＲＩおよ びＳｍａＩで切断することにより除去した。プラスミドをクレノー酵素で処理し 、結合し、Ｅ．ｃｏｌｉＮＭ５２２をエレクトロトランスフォームするために用 いてプラスミドｐＡＬ０８を得た。Ｅ．ｃｏｌｉは完全な（ｉｎｔａｃｔ）ａｃ ｍＡ遺伝子（２）を含む場合、非常にゆっくり成長するので、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（２７）のｓｒｆＡオペロンの第１のＯＲＦから生じる２７ １６−ｂｐ ＳａｃＩフラグメントであるｐＡＬ０８のユニークＳａｃＩ部位内 にクローニングすることによりａｃｍＡを破壊した。これによりｐＡＬ１０を得 た。 プラスミドｐＩＲ１２は、リプレッサー遺伝子（ｒｒｏ）を取り囲む溶原性ラ クトコッカルバクテリオファージＲ１−ｔ、ｒｒｏのプロモーター／オペレータ ー、ｔｅｃ、Ｅ．ｃｏｌｉラムダｃｒｏ遺伝子のトポロジカル等価物、およびＯ ＲＦ２９を含む。マイトマイシンＣをｐＩＲ１２−含有細胞（１４）に添加した ときに、プロモーター／オペレーター領域からの発現が誘発される。ｐＩＲ１２ 中に存在する一つのユニークＳａｃＩ部位を、ファージＲ１−ｔから生じる、ｐ ＥＦ＋（２８）の１７８５−ｂｐ ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩフラグメントにより２ ７５０−ｂｐ ＳａｌＩ／ＸｈｏＩＩフラグメントを置換することにより欠失さ せた。得られるプラスミドｐＩＲ１２ＥＦ中の第２のＳａｃＩ部位を、ＳａｃＩ による消化およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによる処理により除去した。自己結 合（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）後、ｐＩＲ１ＥＦを得た。ｐＩＲ１ＥＦの１ ７６４−ｂｐ ＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩＩフラグメントを、分断ａｃｍＡ遺伝子を 含むｐＡＬ１０の４５２０−ｂｐＳｃａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントにより置換 した。得られるプラスミドｐＡＬ１１を、ＳａｃＩで消化してａｃｍＡを分断し ているフラグメントを除去した。自己結合後、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＬＬ３０２を トランスフォームするために混合物を使用し、プラスミドｐＡＬ１２を得た。 マイトマイシンＣ誘発 Ｌ．ｌａｃｔｉｓの一晩経過培地をＧＭ１７中に１００倍に希釈し、増殖して ６００ｎｍでの光学濃度を０．２とした。培地を二つの部分に分け、一方にマイ トマイシン（シグマ社製）を最終濃度１μｇ／ｍｌとなるように添加し、３０℃ で培養を続けた。フィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＰＵ８７２０ ＵＶ／ＶＩＳ スキャンニングスペクトロフォトメーター（英国 ケンブリッジ在パイ・ユニカム社（Ｐｙｅ Ｕｎｉｃａｍ Ｌｔｄ．）製）にお いて６００ｎｍで光学濃度を測定した。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ＡｃｍＡのｉｎ ｔｒａｎｓ作用の分析のために、培地２ｍｌを遠心分離にか けた。上澄みフラクション１ｍｌを幾つかに分けた脱イオン水により透析し、凍 結乾燥し、変性緩衝液０．５ｍｌ（１）に溶解した。細胞ペレットを変性緩衝液 １ｍｌに再懸濁させ、バン・デ・グッヒテら（２６）により記載されているよう にして細胞非含有抽出物を調製した。サンプルを２分間沸騰させ、負荷する前に 遠心分離にかけた。中間対数期サンプル３０μｌおよび他のサンプル１５μｌを 負荷した。 誘発された溶解を分析するために、サンプル１ｍｌを前述のように処理し、上 澄みおよび細胞フラクションを変性緩衝液０．２μｌに溶解した。適用したサン プルの量は、測定し光学濃度に従って等量化した。プロティーン ＩＩ ミニゲ ルシステム（Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ Ｍｉｎｉｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ）（バイオ −ラッド社製）を用いてレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）（８）に従ってＳＤＳ−ＰＡ ＧＥを実施した。バイオ−ラッド社から得られる低範囲および予め着色した低お よび高範囲 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準を用いた。 ＳＤＳ−ＰＡＡゲル中における溶解活性の検出 ０．１５％（重量／体積）の加圧滅菌し凍結乾燥したＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔ ｉｃｕｓＡＴＣＣ４６９８細胞（シグマ社製）を含むＳＤＳ−ＰＡＡゲル１２． ５％（重量／体積）を用いてその場で溶解活性を検出した。電気泳動後、１％（ 体積／体積）のトリトンＸ−１００を含む２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７） ２００ｍｌ中でゲルを室温にて１４時間、穏やかに振盪してタンパクを再生させ た（１７）。溶解活性のバンドを、０．０１％（重量／体積）ＫＯＨ中の１％（ 重量／体積）メチレンブルー（シグマ社製）で着色し脱イオン水で色を抜くこと により視覚化した。細胞壁を含まないＳＤＳ−ＰＡＡゲルをクマシーブリリアン トブルー（バイオ−ラッド社製）で着色した。 ウエスタンブロッティングおよび免疫検出 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）ら（２３）により記載されて いるようにタンパク質をＢＡ８５ニトロセルロース薄膜（独国ダッセル在シュラ イハー・アンド・シュル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ）製 ）に移した。エンドペプチダーゼ抗原およびトリペプチダーゼ抗原を、 それぞれ、１：８０００に希釈したポリクローナルアンチエンドペプチダーゼ抗 体（１２）および１：４０００に希釈したポリクローナルアンチトリペプチダー ゼ抗体（２０）、ならびにアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗−ウサギ抗体（ ウィスコンシン州マジソン在プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎ）製）を用いて、ウエスタン−ライト・ケミルミネセント・デテクション・ システム・オブ・ＴＲＯＰＩＸ（Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｌｉｇｈｔ Ｃｈｅｍｉｌｕ ｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＴＲＯＰＩＸ ）（マサチューセッツ州ベッドフォード在トロピクス社（ＴＲＯＰＩＸ，Ｉｎｃ ．）製）を製造者に指示に従って使用することにより検出した。 結果 ＡｃｍＡは静止期中におけるＬ．ｌａｃｔｉｓの自己溶解に関与する Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３の一晩経過培地およびそのａｃｍＡ欠失突然変 異種ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（２）を、新鮮な予熱したＭ１７中に２００倍に 希釈した。増殖の最初の９時間および時間毎のサンプル採取中に、不適当な細胞 分離（２） 故に長い線維として成長するＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１の沈降を防止するために 培地を３０℃で穏やかに振盪した。振盪しないさらなる培養中に、サンプルをよ り長い間隔で採取した。図１３は、３２０時間の培養中におけるＭＧ１３６３お よびＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１のＯＤ₆₀₀の変化を示す。野性および突然変異種 の細胞は等しく良好に増殖したが、突然変異種のＯＤ₆₀₀の低下は野性菌株のそ れよりも小さかった。明らかに、主要自己溶解素は細胞分離（２）に要求されて いるのみならず、長期培養時における細胞溶解の原因となるものである。 ａｃｍＡ欠失の補足、およびａｃｍＡプロモーターの局在化 ａｃｍＡ遺伝子のスタートコドンの上流に推定−３５および−１０配列を含む １３８−ｂｐ ＳｓｐＩ／ＳｃａＩフラグメントがこの遺伝子のプロモーターで あるか否かを決めるために、ｐＧＫＡＬ１およびｐＧＫＡＬ２を製造した（図１ ４Ｂ）。ｐＧＫＡＬ１はこの仮定プロモーターフラグメントを含むがｐＧＫＡＬ ２はこの配列を欠く。ｐＧＫ１３を含む菌株Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３およ びｐＧＫ１３、ｐＧＫＡＬ１またはｐＧＫＡＬ２を含む菌株Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭ Ｇ１３６３ａｃｍＡΔ１を、０．２％Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉ ｋ ｔｉｃｕｓ加圧滅菌細胞を含むＧＭ１７プレート上に置き、３０℃で３６時間培 養した。結果は、図３に示され、ｐＧＫＡＬ２を含む細胞の周囲には輪が観察さ れず、ｐＧＫＡＬ１を含む細胞の周囲には大きな輪が存在していることを示して いる。輪は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３により形成されるものよりも大きか った。この結果は、ａｃｍＡの発現に、１３８−ｂｐ ＳｓｐＩ−ＳｃａＩフラ グメントが必要であることを示している。それは、図１４Ａにおいて陰影を付け ている−３５および−１０プロモーター特異性配列（配列ＩＤ．ＮＯ５に相当） を含むからであるという理由の可能性が最も高い。 ａｃｍＡのコピー数の増加により自己溶解が促進される ｐＧＫ１３を含む菌株ＭＧ１３６３およびプラスミドｐＧＫ１３またはｐＧＫ ＡＬ１を含むＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１を、新鮮な培地中に１００倍に希釈した 。対数成長期中に、菌株は等しく迅速に増殖した（図１６参照）。続く７０時間 の培養中に、ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１（ｐＧＫＡＬ１）の光学濃度の低下はＭ Ｇ１３６３（ｐＧＫ１３）よりもずっと高かった。予想された通り、ｐＧＫ１３ を含む欠失突然変異種を用いると同じ増殖期間中にＯＤ₆₀₀の低下はほとんど観 察されなかった。 分泌されたＡｃｍＡはｉｎ ｔｒａｎｓに作用することができる ＭＧ１３６３ａｃｍＡΔ１およびＭＧ１３６３ｐｅｐＴの一晩経過培地を新鮮 な培地中に１００倍に希釈した。増殖の対数期の終了時に、両菌株の等フラクシ ョンを混合し３０℃で培養した。光学濃度を７０時間追跡し、ＡｃｍＡ活性、Ｐ ｅｐＴの存在、および細胞内タンパクの培地への放出を分析するために種々の時 点でサンプルを採取した。混合培地の長い静止期中におけるＯＤ₆₀₀の低下は、 ＭＧ１３６３およびｐｅｐＴ欠失突然変異種の培地の低下に略等しかった（図１ ７参照）が、このことは、自己溶解の程度がこれら三つの培地において略等しい ことを示している。混合培地中の平均鎖長もＭＧ１３６３およびＭＧ１３６３ｐ ｅｐＴの鎖の長さに等しかった。図１８（Ａ，Ｂ，Ｃ）および表３は、ＡｃｍＡ 活性の分析、および細胞および上澄みフラクション中におけるＰｅｐＴの存在を 示し、培地中への細胞内タンパクの放出は図１８Ｂに示されている。これらの結 果から、対照菌株ＭＧ１３６３においてＡｃｍＡが製造され、分泌され、培地が 静止成長期に入ったときから細胞の自己溶解を引き起こすと結論付けることがで きる。自己溶解によ り培地中への細胞内タンパクの放出が生じ（図１８Ｂ）、その１つであるＰｅｐ Ｔが特定の抗体を用いて視覚化された（図１８Ｃ参照）。ＭＧ１３６３ｐｅｐＴ においても、自己溶解およびその後の細胞内タンパクの放出が生じ、予想された ように、上澄みフラクションにおいてはＰｅｐＴが検出されなかった。ＭＧ１３ ６３ａｃｍＡΔ１はＰｅｐＴを製造するが自己溶解は起きず、従って、ＰｅｐＴ または他の細胞内タンパクは放出されない（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。 誘発されたＡｃｍＡの発現 ＡｃｍＡの過剰発現が細胞溶解につながるか否かを試験するために、その天然 のプロモーターを欠くがそれ自体ＲＢＳ（２）を保持するａｃｍＡ遺伝子をｐＩ Ｒ１２（１５）内にクローニングしプラスミドｐＡＬ１２を得た（図１９）。ｐ ＡＬ１２はｒｒｏ、ｔｅｃ、およびＬ．ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓバク テリオファージＲ１−ｔのリプレッサータンパク質Ｒｒｏのプロモーター／オペ レーターを含む。ｔｅｃの下流にクローニングされた遺伝子の発現はＲｒｏリプ レッサー（１５）により表されるが、マイトマイシンＣの添加時に誘発される。 効率的複製を保証するために染色体上にｐＷＶ０１ ｒｅｐＡ遺 伝子のコピーを含むＬ．ｌａｃｔｉｓ亜種ｃｒｅｍｏｒｉｓＬＬ３０２にプラス ミドｐＡＬ１２をトランスフォームした。マイトマイシンＣ（１μｇ／ｍｌ）を 、ｐＧＫ１３を含むＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３、ならびにｐＩＲ１２、ｐＡ Ｌ１２またはｐＩＲ１ＰＲを含むＬ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２に添加したが、そ こにおいてβ−ガラクトシダーゼ、ＡｃｍＡ、およびＬｙｔＰおよびＬｙｔＲが それぞれ発現された。１時間の間隔をおいて、６００ｎｍで光学濃度を測定した 。結果は、図２０に示され、マイトマイシンＣの添加後約２〜３時間で開始し、 菌株ＬＬ３０２（ｐＡＬ１２）の光学濃度が徐々かつ確実に低下することを示し ている。バクテリオファージＲ１−ｔ溶解カセットＬｙｔＰ／ＬｙｔＲを含む菌 株も、ノータ（Ｎａｕｔａ）ら（１４）により示されるように、マイトマイシン Ｃの添加時にＯＤ₆₀₀の明らかな低下を示した。これと対照的に、同じプロモー ター／オペレーターカセットからＥ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼを製造する 菌株ＭＧ１３６３（ｐＧＫ１３）およびＬＬ３０２（ｐＩＲ１２）は、このアッ セイにおいて検出可能な溶解を示さなかった。図２０に示されるデータは、マイ トマイシンＣ１μｇ／ｍｌの添加により細胞の増殖が厳しく抑制 されることを明示している。一緒にすると、図１６に示す結果は、対数的に増殖 しているＬ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２（ｐＡＬ１２）にマイトマイシンＣを添加 することによるＡｃｍＡの過剰生産は細胞の溶解を引き起こすことをはっきり示 している。 用いる条件下において、ＡｃｍＡの製造が実際に誘発されるか否か試験するた めに、マイトマイシンＣの添加から４時間後にサンプルを採取し、細胞非含有お よび上澄みフラクションにおいて溶解活性について再生ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより 検査した。結果は、図２１に示され、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２（ｐＩＲ１２ ）およびＬ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２（ｐＩＲ１ＰＲ）の細胞非含有抽出物と比 較して増加したＡｃｍＡの活性がＬ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２（ｐＡＬ１２）細 胞非含有抽出物中に存在することを示す。定性的に、同じことが三つの菌株の上 澄みフラクションに適用され：Ｌ．ｌａｃｔｉｓＬＬ３０２（ｐＡＬ１２）のみ が、ＡｃｍＡの活性分解生成物（２）であると示された３０ｋＤａのタンパク質 に相当する位置において過剰の透明バンドを形成した。菌株ＬＬ３０２（ｐＩＲ １ＰＲ）の細胞非含有抽出物および上澄みの両方において、ｐＩＲ１ＰＲにより 特定されたファージ溶解素が、菌株の染色体から製 造されたＡｃｍＡの溶解活性分解生成物と共に存在した。我々は、これらのデー タから、ＡｃｍＡの合成がマイトマイシンＣによる誘発時に増加したことを結論 付ける。 ＡｃｍＡ過剰発現の誘発時に培地中に細胞質タンパク質を放出する ＡｃｍＡの製造は明らかに誘発されたが、ＯＤ測定は、自己溶解素の製造の増 加により宿主細胞が溶解するということを決定的には示さなかった。このことを より直接的な方法で試験するために、誘発された培地の上澄みフラクションを、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより細胞内タンパクの存在について検定した。図２２に示す 結果は、非誘発培地においては、一つのタンパクしか存在しないことを示す。最 も高い可能性で、このタンパクは既に述べているＵｓｐ４５（２５）である。誘 発時に、細胞非含有抽出物中のみに通常存在するタンパクは培地に押し出され、 特にＬ．ｌａｃｔｉｓ（ｐＩＲ１ＰＲ）においては、バクテリオファージ溶解素 カセットＬｙｔＰ／ＬｙｔＲが過剰発現される（図１９レーン６）。かなりの程 度に、このことはＬ．ｌａｃｔｉｓ（ｐＡＬ１２）過剰発現ａｃｍＡにも適用さ れる（図２２レーン４）。より少ない程度にＬ．ｌａｃｔｉｓ （ｐＩＲ１２）はタンパクを上澄み中に押し出したが、このことは、先に述べた （１４）ように、マイトマイシンＣの存在および／またはβ−ガラクトシダーゼ の過剰生産が幾分かの溶解を引き起こすことを示している。マイトマイシンＣ誘 発後に細胞質タンパク質が培地中に押し出されたことを確認するために、種々の プラスミドを含む細胞の上澄みについて免疫ブロットを行った。図２０の結果は 、細胞質ラクトコッカルペプチダーゼＰｅｐＯ（１３）に対する抗体が、Ｌ．ｌ ａｃｔｉｓ（ｐＡＬ１２）の上澄みについては強力なシグナルを提供し、Ｌ．ｌ ａｃｔｉｓ（ｐＩＲ１２）の上澄みフラクションについては弱いシグナルしか提 供しなかったことを示す。 検討 長い静止増殖中にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３ａｃｍ ＡΔ１の培地においてほとんど細胞溶解が観察されなかったということは、Ａｃ ｍＡが、細胞分離（２）に加えて、自己溶解の原因となるということを示してい る。この結果は、自己溶解につながる他の主要自己溶解素活性がＬ．ｌａｃｔｉ ｓＭＧ１３６３中に存在しないことも示している。基質としてのＭｉｃｒｏｃｏ ｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉ ｃｕｓ細胞壁を含むＧＭ１７プレート上にＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３ａｃｍ ＡΔ１を載せた場合、３０℃での１週間の培養後においても輪は検出することが できなかった（結果は示さない）が、このことは別の主要自己溶解素が存在して いないことを示す。対照的に、この突然変異種菌株がプラスミドｐＧＫＡＬ１を 含む場合、大きな輪が形成されたが、ｐＧＫＡＬ２を含む場合は輪は形成されな かった。この結果は、ａｃｍＡの上流の１３８−ｂｐ ＳｓｐＩ−ＳｃａＩフラ グメント内にａｃｍＡプロモーターが位置することを示している。突然変異種菌 株がｐＧＫＡＬ１を含む場合、これは野性菌株と比べて光学濃度を大きく低下さ せるが、そのことはＡｃｍＡの高度の発現が、この菌株中により多くの遺伝子の コピーが存在しているので、いっそうの細胞の溶解につながることを示している 。 それ自体のプロモーターを欠き、溶原性ラクトコッカルバクテリオファージＲ Ｉ−ｔのプロモーター／オペレーター領域の下流にあるａｃｍＡ遺伝子をサブク ローニングした。このプラスミドにおいて、ａｃｍＡの発現はマイトマイシンＣ の添加時に誘発することができ、それは、基質としてＭ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉ ｃｕｓ細胞壁を含む変性ＳＤＳ−ＰＡＡゲル中に示 された。誘発から４時間後、ｐＡＬ１２を含むラクトコッカル菌株においてＡｃ ｍＡの増加した発現が観察され、ｐＧＫ１３、ｐＩＲ１２またはｐＩＲ１ＰＲの いずれかを含む菌株においては自然水準の発現が発見された。これらの菌株の増 殖分析は、ＡｃｍＡの過剰生産が細胞の溶解につながることを示した。β−ガラ クトシダーゼを過剰発現する菌株中において細胞の制限された溶解が観察された が、それは使用したマイトマイシンＣの高水準のためかもしれず、ＡｃｍＡを過 剰発現する菌株の培地において光学濃度の大きな低下が観察された。ｐＩＲ１Ｐ Ｒを含む細胞は、ｐＡＬ１２を含む細胞よりも誘発時により容易に溶解した（図 ２０）。他の結論を排除することはできないが、この相違は、ＡｃｍＡよりもＬ ｙｔＲの高度の溶解活性により引き起こされるのかも知れない。増殖分析から、 マイトマイシンＣは細胞の増殖を抑制することが明らかである。このＤＮＡ損傷 物質のその望ましくない副作用を防止するために、システムを温度誘発性にし得 るような研究を温度感受性リプレッサー（Ｒｒｏ）突然変異種の単離に集中した 。ブダペスト条約により、オランダ国バーンのセントラール・ビューロー・フォ ア・シメルクルチャー（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏ ｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）に１９９５年５月１１日に割当番号Ｃ ＢＳ ３２７．９５で寄託されたプラスミドｐＩＲ１４上にプロモーターが存在 している。チーズ熟成中の風味向上に関与し得る細胞内配置ラクトコッカルエン ドペプチダーゼの放出が、このタンパクに対する抗体を用いて示された。誘発時 に溶解する二つの菌株、すなわちＬＬ３０２（ｐＩＲ１ＰＲ）およびＬＬ３０２ （ｐＡＬ１２）の培地上澄みのサンプル中に強力なシグナルが発見された。 静止期における長い培養中に、ａｃｍＡおよびｐｅｐＴマイナス細胞の混合培 地を分析することによりＡｃｍＡのＩｎｔｒａｎｓ作用が示された。ｐｅｐＴマ イナス細胞によるＡｃｍＡの発現および分泌の結果として、ａｃｍＡマイナス細 胞により発現されるＰｅｐＴの培地中への放出が生じることが示された。 これらのデータから、我々は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの主要自己溶解素ＡｃｍＡの 発現を誘発可能にするシステムの開発に成功し、ＡｃｍＡの製造がＬ．ｌａｃｔ ｉｓの溶解につながり同時に細胞内タンパクおよび酵素が培地中に放出されると 結論する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年７月４日 【補正内容】 請求の範囲 １． 食品グレードグラム陽性乳酸バクテリアから得られる相同性もしくは非相 同性自己溶解素またはそのような自己溶解素の活性フラグメントをその場で製造 して、発酵中または静止期において１２時間が経過する前、好ましくは静止期に おいて４時間が経過する前に向上した溶解を達成することを含んでなり、前記自 己溶解素またはそのフラグメントをコードする遺伝子が制御可能プロモーターの 制御下にあり、前記向上した溶解は、相同性自己溶解素の天然産生水準に比べて 向上している全自己溶解素の産生に起因しており、前記制御可能プロモーターの 誘発後、前記制御可能プロモーターは前記自己溶解素をコードする遺伝子と通常 結合しておらず、前記自己溶解素をコードする遺伝子は好ましくは相同性自己溶 解素をコードするものである、溶解素により乳酸バクテリアの培養物を溶解する 方法。 ２． 前記制御可能プロモーターが食品グレード成分またはパラメーターを用い ることにより制御可能である請求項１に記載の方法。 ３． 乳酸バクテリアの培養物がそのような培養物を含む生産 物の一部である請求項１に記載の方法。 ４． 乳酸バクテリアの発酵作用により得られる発酵食品生産物を製造するため に乳酸バクテリア培養物を使用し、続いて発酵食品生産物中の乳酸バクテリアを 溶解する請求項３に記載の方法。 ５． 発酵食品生産物がチーズ生産物である請求項４に記載の方法。 ６． さらにチーズ熟成工程を実施し、それにより溶解細胞の除去後に構成成分 の一部がチーズ生産物の組成を変化させる請求項５に記載の方法。 ７． タンパク質の蛋白分解により得られたペプチド混合物を、制御可能プロモ ーターの制御下に、乳酸バクテリア自己溶解素遺伝子を含む乳酸バクテリアの培 養物と併せ、続いて、乳酸バクテリアが溶解されペプチダーゼを含む細胞の内容 物がペプチド混合物の組成を変化させるような量で自己溶解素の産生を達成する ためにプロモーターを誘発するように請求項１に記載の方法による工程を実施す る、ペプチド混合物を変性させる方法。 ８． タンパク質の蛋白分解により得られたペプチド混合物を、請求項１の方法 により得られた溶解培養物で処理することを含 んでなるペプチド混合物の変性方法。 ９． タンパク質がミルクタンパク質もしくは植物タンパク質またはその両方を 含む請求項７または８に記載の方法。 １０． 自己溶解素をまず産生し、次に、汚染性バクテリアまたは病原性バクテ リアに対する殺菌剤として使用する請求項１に記載の方法。 １１． 請求項１の方法により得られ遊離自己溶解素を含む生産物を、消費者用 生産物中において汚染性バクテリアまたは病原性バクテリアの増殖が抑制される かまたはそれらの生存能力が強度に低下されるような量で消費者用生産物に組み 込む、消費者用生産物の貯蔵期間を向上させる方法。 １２． 消費者用生産物が、食用生産物、化粧用生産物、および線維、硬質表面 および人の皮膚を清浄化するための生産物からなる群より選択される請求項１１ に記載の方法。 １３． 乳酸バクテリアから誘導された溶解素、特にＮ−アセチルムラミダーゼ をコードするヌクレオチド配列。 １４． 乳酸バクテリアから誘導されるものであって、溶解活性を有するポリペ プチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列。 １５． 配列ＩＤ ＮＯ．１による配列または、配列ＩＤ ＮＯ．１によりコー ドされるアミノ酸配列の機能的等価物をコードする変異ヌクレオチド配列である 請求項１３または１４に記載のヌクレオチド配列。 １６． 配列ＩＤ ＮＯ．２によるアミノ酸配列をコードする請求項１３〜１５ のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 １７． 配列ＩＤ ＮＯ．２によるＮ−末端アミノ酸配列に対して７０％を越え る、好ましくは８０％を越える、より好ましくは９０％の同一性を有するＮ−末 端アミノ酸配列をコードし、標準的アッセイにより決めることのできるＮ−アセ チルムラミダーゼの溶解活性を示すポリペプチドをコードするものであって、Ｎ −末端が、該配列のＣ末端部分における繰返し配列の配列Ｎ−末端の一部である 、請求項１３〜１６のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 １８． 配列ＩＤ ＮＯ．２によるＮ−末端アミノ酸配列に対して７０％を越え る、好ましくは８０％を越える、より好ましくは９０％の同一性を有するＮ−末 端アミノ酸配列をコードし、標準的アッセイにより決めることのできるＮ−アセ チルムラミダーゼの溶解活性を示すポリペプチドをコードするものであっ て、Ｎ−末端が、配列ＩＤ ＮＯ．２のアミノ酸６５〜２２０の間の配列の一部 である、請求項１３〜１７のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 １９． 配列ＩＤ ＮＯ．２による全アミノ酸配列に対して４０％を越える、好 ましくは５０％を越える、より好ましくは６０％〜１００％の同一性を有する全 アミノ酸配列をコードし、標準的アッセイにより決めることのできるＮ−アセチ ルムラミダーゼの溶解活性を示すポリペプチドをコードする請求項１３〜１８の いずれかに記載のヌクレオチド配列。 ２０． ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列のＣ−末端部におい て三つの直接繰返しをコードする核酸配列を少なくとも含んでなり、前記直接繰 返しがアミノ酸レベルにおける７５％を越える同一性により特徴付けられ、アミ ノ酸配列が好ましくはセリン、トレオニンおよびアスパラギンに富む介在配列を 直接繰返し間に含むものである、請求項１３〜１９のいずれかに記載のヌクレオ チド配列。 ２１． 図５においてまたは配列ＩＤ ＮＯ．３により示される膜スパンドメイ ンをコードする核酸配列を少なくとも含む請求項１３〜２０のいずれかに記載の ヌクレオチド配列。 ２２． 当業者に周知の通常ないし厳しい条件下に、配列ＩＤ ＮＯ．１および 図４による核酸配列にハイブリッド形成する能力により特徴付けられる請求項１ ３〜２１のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 ２３． ヌクレオチド配列が、好ましくは、溶解素をコードするヌクレオチド配 列と通常結合するプロモーター以外のプロモーターの制御下にあり、前記プロモ ーターが、好ましくは制御可能であり、最も好ましくは食品グレード生物体から 誘導されるものである、請求項１３〜２２のいずれかに記載のヌクレオチド配列 を含んでなる組換えベクター。 ２４． ヌクレオチド配列が、溶解素遺伝子で天然に生じるプロモーター以外の プロモーターの制御下にあり、前記プロモーターが、好ましくは制御可能であり 、最も好ましくは食品グレード生物体から誘導されるものである、請求項１３〜 ２２のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含んでなるかまたは請求項１３〜２ ２のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含む組換えベクターを含んでなる組換 え宿主細胞。 ２５． 乳酸バクテリアのような食品グレードグラム陽性菌である請求項２４に 記載の組換え宿主細胞。 ２６． 対数成長期中に必要とする程度の自己溶解素が産生されるように、天然 プロモーターの制御下の天然自己溶解素遺伝子も有する請求項２４または２５に 記載の組換え宿主細胞。 ２７． 請求項１〜１２のいずれかに記載の方法において自己溶解素を産生する ために、請求項１３〜２２のいずれかに記載のヌクレオチド配列を発現するため に、方法自体は既知である方法における請求項２４〜２６のいずれかに記載の組 換え宿主細胞または請求項２３に記載の組換えベクターの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 9/14 8827−4Ｂ 9/14 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 コク，ヤン オランダ国、エヌ・エル−9714・ハー・エ ル・フロニンゲン、フアン・ハメルストラ ート・34 (72)発明者 レデブール，アート・エム オランダ国、エヌ・エル−3955・エヌ・エ ル・ロツテルダム、モンテイニープレイ ン・８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 食品級グラム陽性バクテリア、特に乳酸バクテリアから得られる相同性自 己溶解素もしくは非相同性自己溶解素、またはそのような自己溶解素、好ましく は相同性自己溶解素の活性フラグメントのその場での製造を含んでなり、前記自 己溶解素またはそのフラグメントをコードする遺伝子が制御可能プロモーターの 制御下にあり、それにより、相同性自己溶解素の天然の製造水準に比べて向上し ている全自己溶解素の製造故に前記制御可能プロモーターの誘発後、発酵中また はその直後に向上した溶解を達成するものであって、前記制御可能プロモーター は前記自己溶解素コード化遺伝子と通常結合しておらず、直後というのは静止期 において１２時間が経過する前、好ましくは静止期において４時間が経過する前 を意味するものである、溶解素により乳酸バクテリアの培地を溶解する方法。 ２． 前記制御可能プロモーターが食品級成分またはパラメーターを用いること により制御可能である請求項１に記載の方法。 ３． 乳酸バクテリアの培地がそのような培地を含む生産物の一部である請求項 １に記載の方法。 ４． 乳酸バクテリアの発酵作用により得られる発酵食品生産物を製造するため に乳酸バクテリア培地を使用し、続いて発酵食品生産物中の乳酸バクテリアを溶 解する請求項３に記載の方法。 ５． 発酵食品生産物がチーズ生産物である請求項４に記載の方法。 ６． さらにチーズ熟成工程を実施し、それにより溶解細胞の除去後に構成成分 の一部がチーズ生産物の組成を変化させる請求項５に記載の方法。 ７． タンパクの蛋白分解により得られたペプチド混合物を、制御可能プロモー ターの制御下に、乳酸バクテリア自己溶解素遺伝子を含む乳酸バクテリアの培地 と併せ、続いて、乳酸バクテリアが溶解されペプチダーゼを含む細胞の内容物が ペプチド混合物の組成を変化させるような量で自己溶解素の製造を達成するよう にプロモーターを誘発するものである、ペプチド混合物を変性させるための請求 項１に記載の方法。 ８． タンパクの蛋白分解により得られたペプチド混合物を、請求項１の方法に より得られた溶解培地で処理することを含んでなるペプチド混合物の変性方法。 ９． タンパクがミルクタンパクもしくは植物タンパクまたは両方を含む請求項 ７または８に記載の方法。 １０． 自己溶解素をまず製造し、次に、損傷性バクテリアまたは病原性バクテ リアに対する殺菌剤として使用する請求項１に記載の方法。 １１． 請求項１の方法により得られ遊離自己溶解素を含む生産物を、消費者用 生産物中において損傷性バクテリアまたは病原性バクテリアの増殖が抑制される かまたはそれらの成長性が強度に低下されるような量で消費者用生産物に組み込 むものである、消費者用生産物の貯蔵期間を向上させる方法。 １２． 消費者用生産物が、食用生産物、化粧用生産物、および線維、硬質表面 および人の皮膚を清浄化するための生産物からなる群より選択される請求項１１ に記載の方法。 １３． 乳酸バクテリアの溶解素、特にＮ−アセチルムラミダーゼをコード化す るヌクレオチド配列。 １４． 溶解活性を有するポリペプチドまたはタンパクをコード化するヌクレオ チド配列、特に請求項１３のヌクレオチド配列であって、配列ＩＤ ＮＯ．１に よるヌクレオチド配列または、配列ＩＤ ＮＯ．１によりコード化されるアミノ 酸配列の 機能的等価物をコード化する変性ヌクレオチド配列。 １５． 配列ＩＤ ＮＯ．２によるアミノ酸配列をコード化する請求項１４に記 載のヌクレオチド配列。 １６． 配列ＩＤ ＮＯ．２によるＮ−末端アミノ酸配列に対して７０％を越え る、好ましくは８０％を越える、より好ましくは９０％の相同性を有するＮ−末 端アミノ酸配列をコード化し、標準的アッセイにより決めることのできるＮ−ア セチルムラミダーゼの溶解活性を示すポリペプチドをコード化する請求項１３〜 １５のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 １７． 配列ＩＤ ＮＯ．２による全アミノ酸配列に対して４０％を越える、好 ましくは５０％を越える、より好ましくは６０％〜１００％の相同性を有する全 アミノ酸配列をコード化し、標準的アッセイにより決めることのできるＮ−アセ チルムラミダーゼの溶解活性を示すポリペプチドをコード化する請求項１３〜１ ６のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 １８． ヌクレオチド配列によりコード化されるアミノ酸配列のＣ−末端部にお いて三つの直接繰返をコード化する核酸配列を少なくとも含んでなり、前記直接 繰返がアミノ酸レベルにおける７５％を越える相同性により特徴付けられ、アミ ノ酸配列 が好ましくはセリン、トレオニンおよびアスパラギンに富む介在配列を直接繰返 間に含むものである、請求項１３〜１７のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 １９． 図５においてまたは配列ＩＤ ＮＯ．３により示される薄膜橋架けドメ インをコード化する核酸配列を少なくとも含む請求項１３〜１８のいずれかに記 載のヌクレオチド配列。 ２０． 当業者に周知の通常ないし厳しい条件下に、配列ＩＤ ＮＯ．１および 図４による核酸配列にハイブリッド形成する性能により特徴付けられる請求項１ ３〜１９のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 ２１． 前記ヌクレオチド配列が、好ましくは、溶解素をコード化するヌクレオ チド配列と通常結合するプロモーター以外のプロモーターの制御下にあり、前記 プロモーターが、好ましくは制御可能であり、最も好ましくは食品級生物体から 誘導されるものである、請求項１３〜２０のいずれかに記載のヌクレオチド配列 を含んでなる組換えベクター。 ２２． 前記ヌクレオチド配列が、溶解素遺伝子で天然に生じるプロモーター以 外のプロモーターの制御下にあり、前記プロモーターが、好ましくは制御可能で あり、最も好ましくは食品 級生物体から誘導されるものである、請求項１３〜２０のいずれかに記載のヌク レオチド配列または請求項２１に記載の組換えベクターを含んでなる組換え宿主 細胞。 ２３． 乳酸バクテリアのような食品級グラム陽性菌である請求項２２に記載の 組換え宿主細胞。 ２４． 対数成長期中に必要とする程度の自己溶解素が製造されるように、天然 プロモーターの制御下の天然自己溶解素遺伝子も有する請求項２２または２３に 記載の組換え宿主細胞。 ２５． 請求項１〜１２のいずれかに記載の方法において自己溶解素を製造する ために請求項１３〜２０のいずれかに記載のヌクレオチド配列を発現するための 既知の方法における請求項２２〜２４のいずれかに記載の組換え宿主細胞または 請求項２１に記載の組換えベクターの使用。