JPH10500128A - マイコバクテリア感染症に対するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 結核又は癩病のようなマイコバクテリア感染症に対するワクチンとして有用な、マイコバクテリアストレスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原または抗原として有効なそれらの断片をコードするコード配列であって、哺乳動物宿主中でそのコード配列を発現できるプロモーターに機能可能なように結合されたコード配列を含むネイキッド核酸構築物。

Description

【発明の詳細な説明】 マイコバクテリア感染症に対するワクチン 本発明は、結核、癩病のようなマイコバクテリア感染症に対するワクチンに関 する。 結核あるいは癩病に対する防御的な細胞媒介免疫反応がどのようにして獲得さ れ、あるいは発現されるのかということは、古典的な免疫学の中心的な位置にあ ったにもかかわらず、驚くほどわずかのことしか判っていない。なぜカルメット −ゲラン(Calmette-Guerin)桿菌(BCG)の生ワクチンを投与することが、あるヒト の集団に対してのみ非常に防御的なのか、あるいは、生菌BCGとは異なり、死菌B CG又は抗原成分では大量に注射してもアジュバントとともに注射しても動物にほ んの僅かしか防御を与えないのは何故なのかということは判っていない。 癩菌(Mycobacterium leprae)の65 kDa熱ショックタンパク質(MLhsp65)抗原(Me hra et al(1966): Proc．Natl．Acad．Sci．USA; 83，7014-7017)に基づいて代 替的なワクチンを開発しようとする試みにおいて、我々はこの抗原をコードする 発現ベクターを骨髄細胞に安定にトランスフェクトした。このトランスフェクト された骨髄細胞をマウスに注射すると、マウスは結核の原因物質である結核菌(M ycobacterium tuberculosis)に対して抵抗性を示すことが判った。さらに我々は 、MLhsp65 又は癩菌36kDのプロリンリッチ抗原(Thole et al，Infection and Im munity(1990)58，80-87)をコードするDNA をマウスにそのまま注射した。これら のマウスも結核菌による感染に対して抵抗性であることが判った。 これらの知見は広い用途を有している。従って本発明は、マイコバクテリアス トレスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原又は抗原として有効なそれらの断 片をコードするコード配列であって、そのコード配列を哺乳動物宿主細胞中で発 現させることができるプロモーターに機能可能なように結合されたコード配列を 含むネイキッド(naked)核酸構築物の、マイコバクテリア感染症に対するワクチ ンとして使用するための医薬の製造における使用を提供する。 本発明はまた、 −マイコバクテリア感染症に対し、ワクチンとしての使用するためのそのような ネイキッド核酸構築物、 −そのようなネイキッド核酸構築物及び許容できる担体又は希釈剤を含むワクチ ン組成物、 −そのようなネイキッド核酸構築物の有効量を宿主に投与することを含む、マイ コバクテリア感染症に対して哺乳動物宿主にワクチン接種する方法、 −マイコバクテリアストレスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原又は抗原と して有効なそれらの断片をコードするコード配列であって、そのコード配列を骨 髄細胞中で発現させることができるプロモーターに機能可能なように結合された コード配列を含む核酸構築物によりトランスフェクトされた骨髄細胞、 −そのようなトランスフェクトされた骨髄細胞の有効量を宿主に投与することを 含む、マイコバクテリア感染症に対して哺乳動物宿主にワクチン接種する方法、 及び −コード配列が、マイコバクテリアプロリンリッチ抗原又は抗原として有効なそ の断片をコードする、上記のネイキッド核酸構築物も提供するものである。 前記のネイキッド核酸構築物は、マイコバクテリアストレスタンパク質もしく はマイコバクテリアプロリンリッチ抗原又は抗原として有効なそれらの断片をコ ードするコード配列であって、そのコード配列を哺乳動物宿主細胞中で発現させ ることができるプロモーターに機能可能なように結合されたコード配列を含む。 少なくとも１つの別のマイコバクテリアタンパク質又はその断片をコードする核 酸であって、機能可能なようにプロモーターに結合されたものがその構築物に含 まれていてもよい。典型的には、このようにコードされた別のマイコバクテリア タンパク質またはその断片は、抗原タンパク質又はその抗原性断片である。その 別のマイコバクテリアタンパク質またはその断片は、別のマイコバクテリアスト レスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原またはその抗原断片であってもよい 。 前記のネイキッド核酸構築物は、典型的には無細胞でウイルスフリーであり、 典型的には単離形態にあるものであり、精製されていてもよい。構築物はDNA で あることが好ましいが、RNA 又は修飾核酸であってもよい。このような核酸は、 そのバックボーンに修飾を含むことができ、構築物が環状でなく直鎖状である場 合に、5'又は3'のいずれか、あるいは両方の末端における付加であり得る。これ は、核酸が宿主細胞内、例えば構築物の能力を高める筋肉細胞に取り込まれたと きの核酸の寿命を延長するのに役立ち得る。核酸分子に対する公知の修飾として は、メチルホスホネート及びホスホロチオエートバックボーンとすること、及び アクリジンまたはポリリシン鎖を分子の3'及び／または5'末端に付加することが 挙げられる。 本発明の核酸構築物によりコードされるマイコバクテリアストレスタンパク質 は、一般的には、それが由来するマイコバクテリアが環境的なストレス下に置か れたときににその発現が増加するものである。典型的には、マイコバクテリアス トレスタンパク質は熱ショックタンパク質であり、例えばそれが由来する細菌が 高温、例えば42℃以上にさらされたときに発現が実質的に増加するタンパク質で ある。 マイコバクテリアストレスタンパク質は、典型的には、結核菌、癩菌、ウシ結 核菌(Mycobacterium bovis)、トリ結核菌(Mycobacterium avium)又はマイコバク テリウム・バッカエ(Mycobacterium vaccae)から得られる。適当なタンパク質と しては、結核菌、癩菌、ウシ結核菌、トリ結核菌又はマイコバクテリウム・バッ カエの70、65及び10 kDa熱ショックタンパク質が挙げられる。これらのうち、結 核菌、癩菌及びウシ結核菌の65 kDa熱ショックタンパク質が好ましく、癩菌の熱 ショックタンパク質が特に好ましい。 マイコバクテリアプロリンリッチ抗原は、結核菌、癩菌、ウシ結核菌、トリ結 核菌又はマイコバクテリウム・バッカエのプロリンリッチ抗原とすることができ る。適当なプロリンリッチ抗原は、癩菌の36 kDaプロリンリッチ抗原である。 マイコバクテリアストレスタンパク質またはプロリンリッチ抗原の抗原性断片 は、好ましくは最小で５、６、７、８、９、10、15、20、30、40又は50アミノ酸 を含む。断片は10、20、30、40又は50アミノ酸長までのものであってもよい。あ るいは、20又は10までのアミノ酸残基がストレスタンパク質またはプロリンリッ チ抗原のアミノ及び／またはカルボキシ末端から削除されてもよい。 マイコバクテリアストレスタンパク質またはプロリンリッチ抗原の抗原部位は 、標準的な方法を用いて同定することができる。そのような方法は、タンパク質 分解酵素又は化学物質を用いてポリペプチドそのものを断片化し、その後各断片 の 抗体と結合する能力、又は動物もしくは適当なin vitroモデル系中に接種された ときに免疫反応を起こす能力を試験することを含むものとすることができる(Str ohmaier et al，J．Gen．Virol.，1982，59，205-306)。 あるいは、マイコバクテリアストレスタンパク質またはプロリンリッチ抗原を コードするDNA を制限酵素消化または周知の技術により断片化し、発現系に導入 して断片を生成してもよい。このような断片は、通常は細菌起源のポリペプチド であるポリペプチドに融合することができる。得られる断片を、これまでに記載 されているようにして調べる(Spence et al，J．Gen．Virol.，1989，70，2843- 51; Smith et al，Gene，1984，29，263-9)。 もう１つの方法は、完全長ポリペプチドの全配列をカバーする短いペプチド断 片(3〜20アミノ酸長、慣用的には６アミノ酸長)であって、各ペプチドが隣接ペ プチドとオーバーラップするものを化学的に合成することである。このようなオ ーバーラップは１〜10アミノ酸であってよいが、ｎをペプチドの長さとしてn-1 アミノ酸であることが理想的である(Geysen et al，Proc．Natl．Acad．Sci，19 84，81，3998-4002)。その後各ペプチドを、通常はペプチドを最初に何らかの担 体分子に結合させて免疫反応の誘導を容易にすることを除いてこれまでに記載さ れたようにして調べる。 また、特定の性質、例えば免疫学的に重要な部位と関連していると考えられて いる親水性について配列を分析するような、予測的な方法がある(Hopp and Wood s，Ploc，Natl．Acad．Sci.，1981，78，3824-8; Berzofsky，Science，1985，2 29，932-40)。これらの予測については、その後これまでに記載されたような組 換え体ポリペプチドあるいはペプチド法を使用して試験することができる。 マイコバクテリアショックタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原またはそれ らの断片をコードする核酸配列は、典型的には複製可能な発現ベクターに含まれ るものとする。そのような発現ベクターは複製開始起点を含み、該ベクターは細 菌宿主細胞のような宿主細胞中で複製されることができ、また核酸配列の発現の ためのプロモーター、及び任意にプロモーターのレギュレーターを含んでいる。 このようなベクターは、１以上の選択可能マーカー遺伝子、例えば細菌形質転換 体を同定するためにはアンピシリン耐性遺伝子、あるいは哺乳動物細胞形質転換 体を同定するためにはネオマイシン耐性遺伝子を含んでもよい。この核酸構築物 は、任意にプロモーターのためのエンハンサーを含んでもよい。この構築物はま た、機能性タンパク質をコードする核酸に3'において機能可能なように結合した ポリアデニル化シグナルを含んでもよい。この構築物はまた、マイコバクテリア ストレスタンパク質またはその断片をコードする配列に3'においてターミネータ ーを含んでもよい。この構築物はまた、マイコバクテリアストレスタンパク質ま たはその断片をコードする配列に3'において１以上のイントロン又はその他のコ ード配列を含んでもよい。そのような１以上のイントロンは、構築物が投与され る宿主生物からのもの、あるいは別の真核細胞生物からのものとすることができ る。 上記の核酸構築物において、マイコバクテリアストレスタンパク質もしくはプ ロリンリッチ抗原またはその抗原性断片をコードする核酸配列は、その配列を発 現することができるプロモーターに機能可能なように結合されている。「機能可 能なように結合された」とは、プロモーターと、マイコバクテリアストレスタン パク質もしくはプロリンリッチ抗原またはそれらの断片をコードする核酸配列と が、コード配列がプロモーターの制御下に発現し得るような関係にある配置のこ とをいうものである。従って、例えばプロモーターとコード配列との間に5'非コ ード配列のようなエレメントがあってもよい。このようなエレメントは、プロモ ーター配列を得た生物に本来あるものであってもよく、またマイコバクテリアス トレスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原またはそれらの断片を得た生物に 本来あるものであってもよい。あるいは、前記の１以上のエレメントは、プロモ ーター配列を得た生物に本来ないもので、またマイコバクテリアストレスタンパ ク質もしくはプロリンリッチ抗原またはそれらの断片を得た生物にも本来ないも のであってもよい。そのような配列は、プロモーターによるコード配列の正確な 制御を増強し、あるいは阻害しない場合に構築物に含めることができる。 発現ベクターは任意の種類のものであってよい。例えば、ベクターは直鎖状の 形態であってもよく、環状の形態であってもよい。共有結合閉環状(CCC)プラス ミドDNA は直接筋肉細胞に取り込まれ得るが、そのDNA は細胞のゲノムDNA に組 み込まれないことが判っているので、構築物をプラスミドベクターに導入するこ とが好ましい(Ascadi et al，(1991): The New Biologist; 3，71-81)。当業者 であれば、例えばSambrook et al，(Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，1989)により記載されたような遺伝子工学技術により修飾されるような広範に 入手可能なベクターを原料として、マイコバクテリアストレスタンパク質もしく はプロリンリッチ抗原またはそれらの断片をコードする核酸配列を含む適当なベ クターを製造できるであろう。出発材料として２つの適当なベクターがあり、プ ラスミドpCDM8(Invitrogen; Seed and Aruffo，Proc．Natl．Acad．Sci．USA(19 87)84，3365-3369)及びpHMG(Gautier et al，Nucl．Acids Res．(1989)17，8389 )である。 マイコバクテリアストレスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原またはそれ らの断片をコードする配列の発現を生起できる任意のプロモーターを、その配列 に機能可能なように結合することができる。特に適するプロモーターは、哺乳動 物細胞中で発現を生起できるものである。例えば、サイトメガロウイルス(CMV) 即時早期遺伝子プロモーターのような、哺乳動物細胞中で発現されるウイルス遺 伝子からのプロモーターが適している。また、例えばハウスキーピング遺伝子の プロモーターのような、多くの又は全ての哺乳動物で発現される哺乳動物遺伝子 からのプロモーターも適している。例えば、p-ヒドロキシメチル-CoA- レダクタ ーゼ(HMG)プロモーター(Gautier et al(1989))は特に適している。また、マクロ ファージや樹状細胞のような抗原提示哺乳動物細胞で選択的に発現される遺伝子 のプロモーターやその他の調節エレメントも適している。 前記核酸構築物は遺伝子治療に適している。特に、例えば結核菌、癩菌及びウ シ結核菌により起こるマイコバクテリア感染症に対し、ネイキッドDNA による哺 乳動物宿主のワクチン接種に有用である。従って、任意のマイコバクテリア種か らの核酸を含む構築物を調製することができる。いくつかのマイコバクテリアス トレスタンパク質にはある程度の保存が存在することにより、特定の種からの核 酸配列を使用してその種による感染に対してワクチンを接種することは必ずしも 必要でない。例えば、ウシ結核菌の生BCG(カルメット-ゲラン桿菌)細胞は、長い 間ヒト結核菌に対してヒトにワクチン接種するのに使用されてきた。 従って本発明においては、結核菌、癩菌またはウシ結核菌のストレスタンパク 質またはプロリンリッチ抗原をコードする核酸構築物を使用して、マイコバクテ リアのこれらの３つの種のいずれかによる感染症に対してワクチンを接種するこ とができる。例えば本発明者らにより、癩菌65 kDa hspまたは癩菌36 kDaプロリ ンリッチ抗原をコードする構築物が、マウスにおいて結核菌に対して有効なワク チンとして作用することが示された。 本発明の核酸構築物を用いて、一定の範囲の哺乳動物種にマイコバクテリア感 染症に対してワクチン接種することができる。しかし、結核菌に対するヒトのワ クチン接種が特に望ましい。ウシ結核菌に対する家畜、シカのワクチン接種も望 ましい。また、アナグマは家畜に細菌を伝染させ得るので、ウシ結核菌に対して アナグマにワクチン接種することも望ましい。 本発明のネイキッド核酸構築物は、ヒトを含む哺乳動物に任意の適当な経路に より投与することができる。適当な経路としては、経口、並びに皮下、筋肉内、 静脈内及び皮内等の非経口の経路が挙げられる。 好ましい投与経路は、経口投与及び注射であり、典型的には筋肉内又は皮内注 射である。ヒト又は動物患者の骨格筋又は皮膚内へのワクチン組成物の注射が特 に好ましい。本発明のワクチン組成物の別の投与形態は、バイオリスティック又 は「パーティクル・ガン」法である。 本発明のネイキッド核酸構築物はそれのみで患者に投与することができ、また 、リポソーム又はその他のデリバリー分子とともに投与することができる。有効 投与量は、デリバリー分子を使用するか否か、投与経路、ワクチン接種される動 物の大きさ等の多くの因子による。典型的な投与量は、投与あたり0.1 〜1000μ gの核酸構築物、例えば投与あたり50〜75μg 及び100 〜500 μg のような１〜5 00 μg、 50〜500 μg の範囲である。 投与スケジュールは、例えば投与経路、受容体の種、受容体の症状等により変 化するが、複数日、複数週、複数月にわたる単回投与又は複数回投与が考えられ る。単回投与は、典型的には0.1 〜1000μg、例えば100 〜500 μg の核酸を含 むものとし、複数回投与にはそれぞれ0.1 〜1000μg、例えは100 〜500 μg の 核酸を含むものとし、好ましくは筋肉内または皮内注射に適した形態とする。ま た、本発明の構築物を含む単回又は複数回の核酸ペレット例えば100 〜500 μ gのDNA を含むペレットを受容体の筋肉内または皮内に移植することができる。 構築物をバイオリスティック法(biolistic method)により投与する場合は、この 経路の効率が高いため、投与量は一般に上記範囲の下限付近となる。そのような 投与量としては、例えば構築物の0.1 〜１μg のような0.1 〜10μg の範囲であ る。 本発明のネイキッド核酸構築物をそれのみで投与することも可能であるが、医 薬配合物とすることが好ましい。本発明の配合物は、少なくとも１種の活性成分 、即ち本発明の核酸構築物を、１種以上の許容される担体及び任意にその他の治 療成分とともに含む。１種以上の担体は、配合物の他の成分と適合し、その受容 体の心身に有害でないという意味において「許容される」ものでなければならな い。リポソームを使用することができ、適当なリポソームとしては、例えば正に 荷電する脂質(N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモ ニウム(DOTMA))を含むもの、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOP E)を含むもの、３β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステ ロール(Dc-Chol)を含むもの等がある。 非経口投与に適した配合物としては、水性及び非水性の殺菌注射溶液があり、 これらは酸化防止剤、バッファー、細菌増殖阻害剤、殺菌性抗生物質、及び配合 物を意図される受容体の血液と等張にする溶質等を含んでもよい。また、水性及 び非水性の殺菌懸濁物があり、これらは懸濁剤及び増粘剤を含んでもよい。さら にリポソーム、又は前記化合物を血液成分もしくは１以上の器官に向かわせるよ うに設計されたその他の微粒子系がある。配合物は単位投与形態、又は複数投与 容器、例えばシールしたアンプル又はバイアルの形態とすることができ、使用の 直前に注射剤とするために、例えば水のような殺菌液体担体を添加するだけでよ い凍結乾燥状態で保存することもできる。注射溶液及び懸濁液は、これまでに開 示されているような種類の殺菌粉末、顆粒及び錠剤から即座に調製することがで きる。 本発明の配合物は、上記に具体的に挙げた成分の他に、対象としている配合物 の種類に認められた当分野で慣用のその他の物質を含んでもよいことが理解され るべきである。可能な配合物の中では、殺菌された発熱物質を含まない水性及び 非水性の溶液が好ましい。本発明の核酸構築物がリポソームに含まれた配合物も 好ましい。 結核菌、癩菌及びウシ結核菌によるマイコバクテリア感染症に対して有効なワ クチンは、マイコバクテリアストレスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原ま たはそれらの断片をコードする核酸構築物であってそのコード配列を骨髄細胞内 で発現することができるプロモーターに機能可能なように結合されている核酸構 築物をトランスフェクトした骨髄細胞から調製することもできる。 骨髄細胞は任意の適当な方法によりトランスフェクトすることができる。例え ば、核酸構築物を感染性のウイルス粒子、例えばレトロウイルス粒子中にパッケ ージすることができる。これはSilva et al (1992); Microb．Pathogen．12，27 -38)により記載された方法により行うことができる。前記構築物は、エレクトロ ポレーション、リン酸カルシウム沈殿、バイオリスティック法、あるいはネイキ ッド核酸構築物を溶液中で骨髄細胞と接触させることにより導入することもでき る。 骨髄細胞に感染させる前記核酸構築物においては、核酸はDNA であってもRNA であってもよいが、好ましくはDNA である。 骨髄細胞にトランスフェクトする核酸構築物は、適当な種類の任意のものとす ることができる。典型的には、構築物は発現ベクターの形態であり、例えばレト ロウイルス又は本明細書で定義したようなネイキッドDNA 発現ベクターである。 例えば構築物は、広く入手可能なpZipNeo ベクターから、又は例えばpCDM8 もし くはpHMGのような本明細書に記載したようなプラスミドベクターから得たレトロ ウイルスシャトルベクターの形態のものとすることができる。 骨髄細胞にトランスフェクトする構築物は、少なくとも１つの別のマイコバク テリアタンパク質又はその断片をコードするコード配列であって、そのコード配 列を哺乳動物細胞中で発現させることができるプロモーターに機能可能なように 結合したコード配列を含んでいてもよい。典型的には、このようにコードされた 別のマイコバクテリアタンパク質又はその断片は、抗原性タンパク質又はその抗 原性断片である。この別のマイコバクテリアタンパク質又はその断片は、別のマ イコバクテリアストレスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原またはその抗原 性断片であってもよい。 骨髄細胞にトランスフェクトされる構築物は、任意の適当なプロモーターを含 むことができる。特に適するプロモーターは、哺乳動物細胞中で発現を生起でき るものである。例えば、サイトメガロウイルス(CMV)即時早期遺伝子プロモータ ーのような哺乳動物細胞中で発現されるウイルス遺伝子からのプロモーターが適 している。また、例えばハウスキーピング遺伝子のプロモーターのような、多く の又は全ての哺乳動物で発現される哺乳動物遺伝子からのプロモーターも適して いる。例えば、p-ヒドロキシメチル-CoA-レダクターゼ(HMG)プロモーター(Gauti er et al(1989))は特に適している。 前記構築物をトランスフェクトした骨髄細胞は任意の適当な方法により投与す ることができ、例えば非経口的な注射、好ましくは静脈内注射により投与するこ とができる。 前記核酸構築物をトランスフェクトした骨髄細胞の任意の有効な量を受容体に 投与することができる。典型的には、約１ｘ10⁴から約１ｘ10⁸、例えば約10⁵〜1 0⁷、例えば１ｘ10⁶の骨髄細胞が投与される。 受容体に投与されるトランスフェクトされた骨髄細胞は、受容体の免疫系に適 合するものであれば任意のものとすることができる。典型的には、細胞又は組織 の移植についてと同様に、投与された骨髄細胞の主要組織移植抗原は受容体細胞 の主要組織移植抗原と適合する。投与される骨髄細胞は受容個体から得たもので あってもよい。 前記のトランスフェクトされた骨髄細胞はそれ単独で受容体に投与してもよく 、任意の適当な配合物中のものとして投与してもよい。好ましい配合物は受容体 の血液と等張の溶液である。 以下の実施例により本発明を具体的に説明する。添付の図面は以下の通りであ る。 図１は、MLhsp65 核酸を含むレトロウイルスを感染させた骨髄細胞と正常骨髄 細胞との混合物(比1:2)を注射したBalb/cマウスの脾臓細胞から抽出されたDNA のDNA サザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す。 図２は、MLhsp65 核酸を含むレトロウイルスを感染させた骨髄細胞と正常骨髄 細胞との混合物(比1:2)を注射したBalb/cマウスの血液試料から抽出されたタン パク質のウェスタンブロットプロービングの結果を示す。 図３は、MLhsp65 遺伝子を含まないベクターを感染させた骨髄細胞(BMC-Neo) 、MLhsp65 核酸を含むレトロウイルスを感染させた骨髄細胞(BMC-65)及び組換え 体MLhsp65(rhsp65)を注射したマウスについての遅延型過敏症(DTH)試験の結果を 示す。 図４は、図３について挙げたマウスとrMLhsp65により免疫化した別のマウスの 群に結核菌の毒性株を感染させた結果を示す。 図５は、pCDM8ML65 及びpHMGML65のプラスミドマップを示す。 図６は、生理食塩水（生理食塩水）、rMLhsp65及び不完全フロイントアジュバ ント(hsp65IFA)、pCDM8ML65 及びpHMGML65(65 DNA)、癩菌36 kD プロリンリッチ 抗原遺伝子をそれぞれ含むpCDM8 及びpHMG(36 DNA)、並びにウシ結核菌BCG を筋 肉内に注射したBalb/cマウスの肝臓中の生存可能な結核菌の数を示す。 図７は、pCDM8 及びpHMG（対照プラスミドDNA）、ウシ結核菌BCG、癩菌36 kD プロリンリッチ抗原遺伝子をそれぞれ含むpCDM8 及びpHMG(36 kDプラスミドDNA) 、並びにpCDM8ML65 及びpHMGML65(65 kD プラスミドDNA)を注射した、異系交配 したParkesアルビノマウスの脾臓(Sp)、肝臓(Li)及び肺(Lu)中の生存可能な結核 菌の数を示す。 図８は、pCDM8 及びpHMG(対照プラスミドDNA)、ウシ結核菌BCG、癩菌36 kD プ ロリンリッチ抗原遺伝子をそれぞれ含むpCDM8 及びpHMG(36 kDプラスミドDNA)、 並びにpCDM8ML65 及びpHMGML65(65 kD プラスミドDNA)を注射したCBA/BIO マウ スの脾臓(Sp)、肝臓(Li)及び肺(Lu)中の生存可能な結核菌の数を示す。 図９は、非処置Balb/cマウス（天然）、あるいは皮内にpCDM8ML65(65id)、筋 肉内にpCDM8ML65(65im)、皮内にウシ結核菌BCG または皮内にpCDM8（対照プラス ミド）を投与したBalb/cマウスの脾臓(Sp)、肝臓(Li)及び肺(Lu)中の生存可能な 結核菌の数を示す。 実施例１ 骨髄細胞中で発現された癩菌hsp65(MLhsp65)遺伝子による結核に対する防御 骨髄細胞をBalb/cマウスの大腿骨及び脛骨から取り出した。これらの細胞を、 psi-CRE 細胞中の感染性レトロウイルス粒子中にパッケージしたpZIPhsp65 DNA とともにin vitroで培養した(Silva et al(1992); Microb．Pathogen．12，27-3 8)。pZIPhsp65はpZIPML65とも指称され、MLhsp65 遺伝子を含み、Silva et al(1 992)により記載されたものである。感染の高い効率及びウイルスDNA の安定な組 み込みを確保するため、供与体マウスを最初に5-フルオロウラシルで処置した。 高力価のウイルス(５ｘ10⁶/ml)と、細胞のウイルス感染を促進するポリブレン( ４μg/ml）とをin vitroで使用した。その後、ネオマイシンを培養培地に含めて (0.5 mg/ml）２日間感染細胞を選択した。 受容体マウスは７〜８週齢のBalb/cであり、γ−照射(9.5 Gy)することにより その骨髄細胞を破壊した。マウスに直ちに１ｘ10⁶骨髄細胞を静脈内注射した。 これらは、MLhsp65 核酸を含むウイルスを感染させた細胞(BMC-65細胞)と正常骨 髄細胞との混合物(比1:2)か、正常細胞のみ、あるいはマイコバクテリア遺伝子 を持たないベクターを感染させた細胞(BMC-NeO)であった。 受容体動物中におけるマイコバクテリア遺伝子の発現は、DNA とタンパク質を 脾臓細胞及び血液試料からそれぞれ抽出することにより移植後15日に試験した。 図１は、DNA サザンブロットハイブリダイゼーションにより、16〜20のマウスか らの脾臓細胞がMLhsp65 遺伝子を含んでいたことを示している。抽出されたDNA をニトロセルロース上にブロットし、MLhsp65 遺伝子を含む癩菌3.6 Kb EcoRI D NA断片(Silva et al(1992))を使用してハイブリダイゼーションにより検出した 。 マウスの別の群について、MLhsp6S-特異的モノクローナル抗体(CL44)を使用し てウェスタンブロット検出を行い、20のうち14がその末梢血細胞中にMLhsp65 タ ンパク質を保有していることが判明した（図２）。組換え体DNA 由来タンパク質 (rMLhsp65，20ng)及び正常マウスの血液細胞から抽出されたタンパク質（細胞溶 解物）を陽性及び陰性対照として使用した。結合抗体は、アルカリホスファター ゼ抱合ヤギ抗マウスIgにより検出した。 骨髄移植の30日後、別のマウスを遅延型過敏症について調べた(DTH；５μg rM Lhsp65の注射48時間後の足蹠腫脹)。結果を図３に示す。rMLhsp65を投与された ５匹のマウスの全てがDTH 反応を示し、BMC-65を投与された９匹のうち４匹が反 応し、BMC-Neo を投与された９匹は反応しなかった。 移植36日後に、米国のATCCから入手したよく知られた病原性感染株である結核 菌H37Rv の生存可能な５ｘ10⁶をマウスに静脈内感染させた。その３週間後にマ ウスを屠殺し、肝臓中の生存細菌の数を7Hllアガー上のコロニー形成単位として カウントした。別の対照マウスの群を、フロイント不完全アジュバント(IFA; 25 μg)中のrMLhsp65により０日と７日において免疫化し、その後14日に追加免疫し た(アジュバントなしの15μg)。 図４は、BMC-65移植後にDTH 反応を示したマウスは結核菌による感染に対して も抵抗性であったが、反応を示さなかったものは抵抗性ではなかったことを示し ている。rMLhsp65に反応するマウスではより低い程度の保護が見られた。 実施例２ ネイキッド癩菌hsp65 DNA 及び癩菌36 kDaプロリンリッチ抗原DNA の筋肉への 直接の注射による結核に対する防御 MLhsp65 をコードする遺伝子を標準的な方法により２種の真核生物発現ベクタ −pCDM8(Invitrogen; Seed and Aruffo，Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1987)84 ，3365-3369)及びpHMG(Gautier et al，Nucl．AcidsRes．(1989)17，8389)にク ローン化し、pCDM8ML65 及びpHMGML65を形成した（図５）。即ち、MLhsp65遺伝 子を含むDNA 配列を制限エンドヌクレアーゼを用いて大腸菌クローニングベクタ ーpUC8から切り出した(Silva et al(1992))。そしてこの配列をpCDM8 及びpHMG に結合した。pCDM8 及びpHMGは、宿主細胞ゲノムへの組み込みに依存せず、広範 なマウス細胞型中で機能しやすい強力なプロモーターを有する発現ベクターであ る。 上記の構築物を標準的な方法により大腸菌中で増殖させた全調製物から精製し た。正常Balb/c、CBA/BIO または異系交配させたParkesアルビノマウスに、一方 の構築物の50〜75μg を左大腿四頭筋に、他方の構築物の50〜75μg を右大腿四 頭筋に注射した。３〜４か月の間に４〜５対の注射をするまで２〜６週の間隔で 注射を繰り返した。最後の注射の２週間後、マウスに１ｘ10⁶の生存結核菌を腹 腔内感染させた。その６週間後マウスを屠殺し、体内器官中の生存細菌数を7Hll アガー上でのコロニー形成単位としてカウントした。 別の群のマウスに、MLhsp65 の代わりに36kDプロリンリッチ抗原の癩菌遺伝子 (Thole et al，Infection and Immunity(1990)58，80-87)を含むベクターからな るネイキッドDNA を同様に注射した。 36 kD プロリンリッチ抗原を含む２種のネイキッドDNA 構築物を実際に調製し た。1kb EcoR1 断片をpTHL1007(Thole et al(1990))から切り出した。この断片 を、クローニングベクターpSL301のEcoRIポリリンカー(Invitrogen; Brosius，D NA 8，759-777，1989; Brosius，Methods in Enzymology 216，469-483，1992) 中にクローニングした。 0.9 kbのBamHl 断片を得られた構築物から切り出し、pcDNAl/Neo(Invitrogen ，Wang et al，Cell 67，797-805，1991; Spies and DeMars，Nature 351，323- 324，1991; Seykora et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88，2505-2509，1991 ; Attaya et al，Nature 355，647-648，1992)のBamH1 部位にクローン化した。 得られた構築物は、マウスに注射した癩菌の36 kD プロリンリッチ抗原の遺伝子 を含む２種の構築物の１つであった。他方の構築物は、やはり0.9 kb BamH1断片 を切り出し、そしてそれをpHMGのBamH1 部位にクローン化することにより得た。 また、さらに別の群に以下のもの、 −生理食塩水のみを筋肉内に、 −IFA 中のrMLhsp65タンパク質を実施例１と同様に、 −ウシ結核菌BCG（１ｘ10⁶細胞、０日に皮内に）、あるいは −挿入遺伝子を含まない空のベクターを筋肉内に注射した。 結果を図６〜８に示す。図６は、Balb/cマウスがBCG またはMLhsp65 DNA（65D NA）により有意に防御されたことを示している。図６に示した結果の場合、Balb /cマウスの肝臓中の生存細菌の数をカウントした。図７及び８は、CBA/BlO 及び Parkesアルビノマウスの両方が、BCG またはMLhsp65 遺伝子もしくは36 kD プロ リンリッチ抗原遺伝子を含むDNA により実質的に防御されたが、空のベクター（ 対照プラスミドDNA）によっては防御されなかったことを示している。 実施例３ ネイキッドhsp65 DNA の皮膚への直接の注射による結核に対する防御 pCDM8ML65 DNA を上記のようにして製造した。Balb/cマウスに、３週間の間隔 で３回、50〜75 gのネイキッドDNA を尾底部に皮内注射した。別の群のマウスに は、同じ回数で100 〜150μg の同じDNA を筋肉内に注射するか、50〜75μg のp CDMB（ベクターのみ）を皮内注射した。さらに別の対照群のマウスには、生BCG を上記のように皮内に投与するか、処理しなかった（天然）。最後のDNA 注射の ８週間後に、マウスに１ｘ10⁶の生存可能結核菌M37Rv を腹腔内感染させた。そ の４週間後にマウスを屠殺し、体内器官中の生存細菌数を7Hllアガー上でのコロ ニー形成単位としてカウントした。結果を図９に示す。この図においては、皮内 経路でのpCDM8ML65 DNA により有効な防御が与えられたことが示されている。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．マイコバクテリアストレスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原または抗 原として有効なそれらの断片をコードするコード配列であって、哺乳動物宿主細 胞中でそのコード配列を発現できるプロモーターに機能可能なように結合された コード配列を含むネイキッド核酸構築物の、マイコバクテリア感染症に対するワ クチンとして使用するための薬剤の製造における使用。 ２．ネイキッド核酸構築物のコード配列が、マイコバクテリア熱ショックタンパ ク質をコードする請求項１に記載の使用。 ３．ネイキッド核酸構築物のコード配列が、結核菌、癩菌もしくはウシ結核菌の 70 kDa、65 kDa若しくは10 kDa熱ショックタンパク質またはそれらの抗原として 有効な断片をコードする請求項２に記載の使用。 ４．ネイキッド核酸構築物のコード配列が癩菌の65 kDaタンパク質をコードする 請求項３に記載の使用。 ５．ネイキッド核酸構築物のコード配列が、結核菌、癩菌またはウシ結核菌のプ ロリンリッチ抗原をコードする請求項１に記載の使用。 ６．ネイキッド核酸構築物のコード配列が癩菌の36 kDaプロリンリッチ抗原をコ ードする請求項５に記載の使用。 ７．ネイキッド核酸構築物がDNA 構築物である請求項１〜６のいずれかに記載の 使用。 ８．ネイキッド核酸構築物がプラスミドである請求項１〜７のいずれかに記載の 使用。 ９．ネイキッド核酸構築物がRNA 構築物である請求項１〜６のいずれかに記載の 使用。 10．マイコバクテリア感染症に対するワクチンとして使用するための請求項１〜 ９のいずれかに定義されたネイキッド核酸構築物。 11．請求項１〜９のいずれかに定義されたネイキッド核酸構築物及び許容される 担体または希釈剤を含むワクチン組成物。 12．請求項１〜８のいずれかに定義されたネイキッド核酸構築物の有効量を宿主 に投与することを含む、マイコバクテリア感染症に対して哺乳動物宿主にワクチ ン接種する方法。 13．マイコバクテリアストレスタンパク質もしくはプロリンリッチ抗原または抗 原として有効なそれらの断片をコードするコード配列であって、骨髄細胞中でそ のコード配列を発現できるプロモーターに機能可能なように結合されたコード配 列を含む核酸構築物がトランスフェクトされた骨髄細胞。 14．請求項13に定義された骨髄細胞の有効量を宿主に投与することを含む、マイ コバクテリア感染症に対して哺乳動物宿主にワクチン接種する方法。 15．コード配列が、マイコバクテリアプロリンリッチ抗原またはその抗原として 有効な断片をコードする、請求項１またはそれに従属する請求項５〜９のいずれ かに定義されたネイキッド核酸構築物。