JPH10500309A - リボザイムを用いて再狭窄および癌を治療するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断する酵素的核酸分子であって、前記核酸の結合アームは表II、ＸII−ＸＸIVに規定される配列に相補的な配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 リボザイムを用いて再狭窄および癌を治療するための方法および組成物発明の背景 本発明は、再狭窄および癌を治療するための組成物および方法に関する。 以下は、再狭窄の生理学、細胞病理学および治療についての簡単な説明である 。以下の議論は完全なものではなく、本発明を理解するためにのみ提供される。 この概要は、以下に記載される研究のいずれも本発明に対する従来技術であると 認めるものではない。 冠状動脈血管形成術は、心臓疾患の外科的治療の主要なもののひとつである。 この使用は急速に促進されてきており、米国では毎年４５０，０００件が行われ ている。血管形成術の短期成功率は８０−９０％である。しかし、この方法にお ける多くの技術的改良にもかかわらず、術後の動脈の閉塞または再狭窄は依然と して発症している。単血管（ｓｉｎｇｌｅ ｖｅｓｓｅｌ）血管形成術を受けた ３５−４５％の患者は、手術後６か月以内に臨床的に重要な再狭窄を発症する。 多血管（ｍｕｌｔｉｖｅｓｓｅｌ）血管形成術を受けた患者においては再狭窄の 率はさらに高い（５０−６０％）（Ｃａｌｉｆｆ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１ ９９０，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｄｉ ｏｌｏｇｙ，Ｅ．Ｊ．Ｔｏｐｏｌ，ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉ ｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ３６３−３９４）。 組織病理学的研究は、血管形成術後の再狭窄は、内側平滑筋細胞の内膜への移 動およびこれらの新内膜細胞の顕著な過増殖応答により特徴づけられることを示 している（Ｇａｒｒａｔｔ，Ｋ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ａｍ．Ｃ ｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１７，４４２−４２８；Ａｕｓｔｉｎ，Ｇ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，６，３６９ −３７５）。平滑筋細胞の増殖は、傷害に対する非常に激しい応答であろう。あ るいは、動脈硬化性病変中の内膜平滑筋細胞は、すでに活性化されているかまた は「合成」状態にあり（Ｓｊｏｌｕｎｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０６，４０３−４１３）、したがって、増殖の態勢が 整っているのであろう。最近の１つの研究は、冠状動脈病変における活性化平滑 筋細胞の存在とアテローム切除（ａｔｈｅｒｅｃｔｏｍｙ）後の管腔狭化の程度 との間に正の相関関係があることを示した（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ． ，１９９３，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２８，６０８−６１３）。い ずれにしても、血管形成術後の平滑筋細胞増殖を遅延させることにより、内膜肥 厚および再狭窄を予防しうるであろう。 現在のところ、再狭窄の好ましい治療的処置は、ストレプトキナーゼ、ウロキ ナーゼ、または他の血栓溶解化合物（例えば魚油、抗凝固剤、ＡＣＥ（アンギオ テンシン変換酵素）阻害剤、アスピリンおよびコレステロール低下化合物を使用 することである。別の治療法には、内管腔ステントの外科的取り込みがある。薬 理学的副作用（特に抗凝固剤および血小板阻害剤に伴う出血性疾患）の発症は、 現在の治療法の論点である。Ｐｏｐｏｍａ，Ｊ．Ｊ．らは、現在の治療法は、再 狭窄発症率に有意な影響を与えていないことを報告している（Ｃｉｒｃｕｌａｔ ｉｏｎ，８４，１４２６−１４３６，１９９１）。 最近、抗血小板治療の有効性の臨床試験の結果が報告された。冠状動脈血管形 成術を受けた患者は、血小板接着分子ｇｐIIｂ／ｇｐIIIａに対する抗体の１回 ボーラス注射およびそれに続く１２時間の注入を受けた。６か月後、処置を受け た患者は、プラセボを受けた患者より再狭窄の発症が２３％減少した（２７対３ ５％；Ｐ＝０．００１）。 多くの成長因子が平滑筋細胞増殖を誘導することが示されている。インビトロ では血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、強力な平滑筋細胞分裂促進因子であり （Ｒｏｓｓ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７１，１２０７−１２１０）、平滑筋細胞の化学誘因剤である （Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７１，３６６９−３６７２）。インビボでは、 ＰＤＧＦはブタ動脈で異所的に発現され、内膜過形成を誘導する（Ｎａｂｅｌ， Ｅ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１，１ ８２２−１８２９）。さらに、ＰＤＧＦに対する抗体は、動脈損傷後の内膜肥厚 を減少させることが示されている（Ｆｅｒｎｓ，Ｇ．Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．， １９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９−１１３２）。病変における³Ｈ −チミジン取り込みの分析は、抗−ＰＤＧＦ抗体が主として平滑筋細胞の移動を 阻害することを示している。 塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、インビトロでの別の平滑筋細胞分 裂促進因子である（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｅ．Ｒ ．，１９８９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，９，２６９−２７８）。ラ ットのモデルにおいては、抗−ｂＦＧＦ抗体は、バルーンカテーテル傷害の２４ −４８時間後に、内側平滑筋細胞の増殖を阻害する（Ｌｉｄｎｅｒ，Ｖ．ａｎｄ Ｒｅｉｄｙ，Ｍ．Ａ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８８，３７３９−３７４３）。ｂＦＧＦの他に、ヘパリン結合性表皮成 長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９ ９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，９３６−９３９）、インスリン様成長因子Ｉ（ ＩＧＦ−Ｉ）（Ｂａｎｓｋｏｔａ，Ｎ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌ ｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，３，１１８３−１１９０）、およびエンドセリ ン（Ｋｏｍｕｒｏ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ， ２３８，２４９−２５２）が平滑筋細胞増殖を誘導することが示されている。多 くの他の因子（例えば、インターロイキン−１および腫瘍壊死因子−α）が、Ｐ ＤＧＦの発現を誘導することにより間接的に平滑筋細胞増殖に影響するであろう （Ｈａｊｊａｒ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １６６，２３５−２４５；Ｒａｉｎｅｓ，Ｅ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，１９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３９３−３９６）。 インビトロで血清飢餓とした平滑筋細胞に全血清を加えたとき、オンコジンｃ −ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｂが誘導され（Ｋｉｎｄｙ，Ｍ．Ｓ．ａｎ ｄ Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｇ．Ｅ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６１，１２８６５−１２８６８；Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，１９ ９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，４６２５−４６３０）、細胞が増殖 する。アンチセンスオリゴヌクレオチドでｃ−ｍｙｂをブロックすると、細胞が Ｓ相に入ることが妨害される（Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２ ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，４６２５−４６３０）。したがって、ｃ − ｍｙｂは、血清中に存在する多数の成長因子による刺激後のＧ₁からＳへの転移 に必要である。バルーン血管形成術後のラット動脈に適用したとき、ｃ−ｍｙｂ アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボで再狭窄を阻害する（Ｓｉｍｏｎ ｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３５９，６７−７０）。同 様に、オンコジンｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチ ドは、ヒト平滑筋細胞の増殖（Ｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｉｒ ｃｕｌａｔｉｏｎ，８８，１１９０−５）および移動（Ｂｉｒｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６ ５４−８）を阻害する。 Ｏｈｎｏら（１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，７８１）は、ウイルス性チ ミジンキナーゼ酵素の発現（遺伝子治療）と抗ウイルス剤ガンシクロビルでの処 置との組み合わせが、ブタにおいてバルーン血管形成術後の平滑筋細胞の増殖を 阻害したことを示した。 Ｅｐｓｔｅｉｎら（”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｈ ｏｆ ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｆｏ ｒｍｅｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｓｅ ｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”，ＮＴＩＳ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉ ｏｎ １９９２）は、ｃ−ｍｙｃ、ＰＣＮＡまたはサイクリンＢに対するアンチ センスオリゴヌクレオチドの使用について議論している。Ｆｕｎｇら（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５５８０）は、細胞増殖性疾患のための遺伝子治療を記載しており 、ＰＧＲ要素に対するリボザイム構築物の投与について述べている。ｃ−ｍｙｂ の不活性化について述べている。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（ＷＯ９３／０８８４５ ）、Ｃａｌａｂｒｅｔｔａら（Ｗ０９２／２０３４８）およびＧｅｗｉｒｔｚ（ Ｗ０９３／０９７８９）は、メラノーマまたは直腸癌の治療のためのｃ−ｍｙｂ アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび局所投与に関するものである。Ｓｙｔｋ ｏｗｓｋｉ（ＰＣＴ ＷＯ９３／０２６５４）は、赤血球においてアンチセンス オリゴヌクレオチドを使用してｃ−ｍｙｂ遺伝子発現を阻害し、ヘモグロビン合 成を促進することを記載している。ＮａｂｅｌおよびＮａｂｅｌ（米国特許５， ３２８，４７０）は、疾患部位に直接治療薬を送達することによる疾患の治療方 法を記載している。彼らは次のように述べている： 「・・・この方法は、遺伝的に修飾したもしくは正常な細胞または他のベクター システムを用いて、カテーテル法により蛋白質を送達して血管セグメントを分離 することにに基づいている・・・さらに、リボザイムと称される触媒的ＲＮＡは 、ＲＮＡ配列を特異的に切断することができる・・・ＲＮＡ切断を成功させるた めに必要なものには、この構造に隣接する領域に保存的ＲＮＡ配列を有するハン マーヘッド構造が含まれる・・・ＲＮＡ転写産物中の任意のＧＵＧ配列は、リボ ザイムによる切断の標的となりうる・・・血栓症および再狭窄の治療のための、 ｔＰＡ等の蛋白質を発現するベクターを用いる遺伝子転移、血管形成または血管 再生の目的のための成長因子・・・」。 ＳｕｌｌｉｖａｎおよびＤｒａｐｅｒ（国際公開ＷＯ９４／０２５９５）は、 狭窄を治療するためのｃ−ｍｙｂ ＲＮＡに対するリボザイムの使用を記載する 。発明の概要 本発明は、細胞成長応答に必要なｍＲＮＡ種の切断を指示するリボザイムもし くは酵素的ＲＮＡ分子に関する。特に、本発明は、オンコジンｃ−ｍｙｂにより コードされるＲＮＡを切断しうるリボザイムの選択および機能を記載する。この ようなリボザイムを用いて、再狭窄における平滑筋細胞および多くの癌の腫瘍細 胞の過剰増殖を阻害することができる。再狭窄を妨害するためには、多くの異な る成長因子による平滑筋細胞増殖の誘導に必要な標的分子が好ましい。この目的 のために、本発明ではｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｂが有用な標的で ある。 成長および増殖シグナルへの応答に関与する他の転写因子には、ＮＦ−κＢ、 ｏｃｔ−１およびＳＲＦがある。ＮＦ−κＢ蛋白質は細胞の転写を活性化し、細 胞性合成経路の増加を誘導する。休止細胞においては、この蛋白質はその阻害剤 であるＩ−κＢとの複合体として細胞質において見いだされる。Ｉ−κＢ分子の リン酸化により、複合体は解離し、ＮＦ−κＢが放出されて核に運搬され、ここ でＤＮＡに結合して（ＮＦ−κＢ）−応答性遺伝子において転写活性を誘導する 。（ＮＦ−κＢ）−応答性遺伝子の１つはＮＦ−κＢ遺伝子それ自身である。す なわち、阻害的複合体からのＮＦ−κＢ蛋白質の放出は、自動誘導される遺伝子 発現のカスケードをもたらす。ＮＦ−κＢの初期の阻害は、成長および増殖に必 要 な多くの遺伝子、例えばｃ−ｍｙｂの発現を減少させる。 ２つの他の転写因子、ｏｃｔ−１および血清応答因子（ＳＲＦ）が、分裂しつ つある細胞において選択的に発現することが示されている。ｏｃｔ−１およびＳ ＲＦは両方とも培養細胞（例えば平滑筋細胞）において偏在的に発現する。しか し、Ｒ．Ｍａｊａｃｋおよびその同僚は、最近、これらの転写因子は無傷の血管 の平滑筋細胞では発現されないことを示した。組織を分散させて単細胞懸濁液と すると、ｏｃｔ−１およびＳＲＦは両方とも急速に発現される。すなわち、これ らの転写因子は、これらと細胞外マトリックスとの相互作用により制御されてい ると考えられる（Ｗｅｉｓｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓ１８Ａ，２８２；Ｂｅｌｋｎａｐ，Ｊ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓ１８Ａ，２７７ ）。血管形成術中の傷害により、ｏｃｔ−１およびＳＲＦの発現が促進され、平 滑筋細胞の増殖が増加するのであろう。これらの転写因子の発現をブロックする リボザイムによる処置は、再狭窄に関連する平滑筋細胞の増殖を緩和しうる。 上述の研究のいくつかは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが平滑筋細胞の増 殖に必要な因子の発現を効果的に減少させることを示しているが、酵素的ＲＮＡ もしくはリボザイムが平滑筋細胞の増殖を阻害することは示されていない。この ようなリボザイムは、その触媒活性および増加した部位特異性（以下に記載する ）により、アンチセンスオリゴヌクレオチドより強力かつ安全な治療用分子であ る。本発明においては、ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡを切断するリボザイムが記載され る。さらに、本発明は、これらのリボザイムが平滑筋細胞の増殖を阻害しうるこ と、およびリボザイムの触媒活性がその阻害効果に必要であることを示す。当業 者には、記載される例から、平滑筋細胞の増殖に必要な他の標的ｍＲＮＡを切断 する他のリボザイムを容易に設計しうることおよびこれらも本発明の範囲に含ま れることが明らかであろう。 ”阻害”とは、ｃ−ｍｙｂの活性またはｃ−ｍｙｂによりコードされるｍＲＮ Ａのレベルが、核酸の不在下で観察されるものよりも減少し、特にリボザイムに より阻害されること、好ましくはｍＲＮＡの同一の部位に結合しうるがそのＲＮ Ａを切断できない非活性ＲＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより低いことを 意味する。 “酵素的核酸分子”とは、基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相 補性を有し、かつその標的内のＲＮＡを特異的に切断する作用をする酵素的活性 をも有する核酸分子を意味する。すなわち、酵素的核酸分子はＲＮＡを分子間切 断し、このことにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性 は、切断が生ずるのに十分なほど、標的ＲＮＡに酵素的核酸分子をハイブリダイ ズさせるように機能する。１００％の相補性が好ましいが、５０−７５％程度の 低い相補性も本発明において有用である。ｃ−ｍｙｂに“均等な”ＲＮＡとは、 ヒト、ラットおよびブタを含む種々の動物において再狭窄および癌に関連する、 天然に生ずるＲＮＡ分子を包含するものとする。これらの分子は、一般にある種 のリボヌクレオチドを含むが、他のヌクレオチドは２’−ヒドロキシル位もしく は他の位置で、以下に述べる他の成分で置換されていてもよい。 ”相補性”とは、他のＲＮＡ配列と、伝統的なワトソン−クリックまたは他の 非伝統的なタイプの塩基対相互作用（例えば、ホーグステン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅ ｎ）タイプ）のいずれかにより水素結合を形成しうる核酸を意味する。これまで に、天然に生ずる酵素的ＲＮＡの６個の基本的変種が知られている。それぞれは 、生理学的条件下で、トランスでＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒 することができる（したがって、他のＲＮＡ分子も切断しうる）。表Ｉはこれら のリボザイムの性質のいくつかをまとめたものである。一般に、酵素的核酸は、 まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。このような結合は、標的ＲＮＡ を切断させる作用をする分子の酵素的部分に近接して保持された、酵素的核酸の 標的結合部分により行われる。したがって酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡを認識 し、次いで相補的塩基対形成により標的ＲＮＡに結合し、適正な部位にいったん 結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの 戦略的切断は、それがコードする蛋白質の合成を指令する能力を破壊するであろ う。酵素的核酸はそのＲＮＡ標的に結合して切断したのち、そのＲＮＡから離脱 して他の標的を探し、繰り返し新たな標的に結合してこれを切断することができ る。 リボザイムの酵素的性質は、他の手法、例えばアンチセンス法（この場合は核 酸分子が単に核酸標的に結合して、その翻訳を阻止するだけである）より有利で ある。治療的処置を行うのに必要なリボザイムの濃度はアンチセンスオリゴヌク レオチドのものより低いからである。この利点は、リボザイムが酵素的に作用し うることを反映している。すなわち１個のリボザイム分子が多数の標的ＲＮＡ分 子を切断しうる。さらに、リボザイムは特異性の高い阻害剤であり、その阻害の 特異性は標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成のメカニズムのみでなく、標的ＲＮＡ の切断のメカニズムにも依存する。切断部位の近くにおける１つのミスマッチま たは塩基置換は、リボザイムの触媒活性を完全に排除することができる。アンチ センス分子における同様のミスマッチは、それらの作用を妨害しない（Ｗｏｏｌ ｆ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，８９，７３０５−７３０９）。したがって、リボザイムの作用の特 異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより 大きい。 本発明の好ましい態様においては、酵素的核酸分子はハンマーヘッドまたはヘ アピンのモチーフで形成されるが、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン 、またはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に伴う）またはＮｅｕｒｏｓ ｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡのモチーフで形成されてもよい。このようなハンマーヘ ッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ａｉｄｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８，１８３に記載 され；ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＰ０３６０２ ５７，Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，１９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ ２８，４９２９，およびＨａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，２９９に記載され；デルタ肝炎ウイルスモ チーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ，１９９２ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ，３１ １６に記載され；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒ ｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｃｅｌｌ，３５ ８４９に 記載され；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌ ｌｉｎｓ（Ｓｅｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０ Ｃｅｌｌ ６ １，６８５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１ Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８８，８８２６−８８３０； Ｃｏ ｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ，１９９３ Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２ ，２７９５−２７９９）により記載され；グループＩイントロンの例は、Ｃｅｃ ｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９８７，０７１号により記載されている。こ れらの具体的なモチーフは本発明を限定するものではなく、本発明の酵素的核酸 分子において重要なすべては、それが１または２以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に 対して相補的な特異的基質結合部位を有し、かつその基質結合部位内またはその 周囲にその分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであ ることは、当業者には認識されるであろう。 好ましい態様において、本発明は、所望の標的のＲＮＡに対して高い特異性を 示す一群の酵素的切断剤を製造する方法を提供する。酵素的核酸分子は、好まし くは、１つまたはいくつかの酵素的核酸により疾患または病状の特異的治療が与 えられるように、ｃ−ｍｙｂ蛋白質をコードする標的ｍＲＮＡの高度に保存され た配列領域を標的とする。このような酵素的核酸分子は、必要に応じて特定の細 胞に外的に送達することができる。あるいは、リボザイムは、特定の細胞に送達 されるＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができる。 １００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は自動化された方法によっては 困難であり、そのような分子の療法経費は著しい。本発明においては、小型の酵 素的核酸モチーフ（例えばハンマーヘッドまたはヘアピン構造のもの）を外的送 達に用いる。これらの分子の構造が簡単であることは、酵素的核酸がｍＲＮＡ構 造の標的領域内へ侵入する能力を高める。しかし、これらの触媒的ＲＮＡ分子は 、細胞内で真核生物プロモーターから発現させることもできる（例えば、Ｓｃａ ｎｌｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ−Ｓｃｉ． ，ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ，ｅｔ ａｌ． ，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐ ｕｌｉｃ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６６，１４３２−４１； Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５ ５３１−４；ＯＪｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｌ．，ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．， １９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａ ｒ ｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２ ５）。当業者は、適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから、任意のリボザイムを真核 生物細胞中で発現させうることを理解するであろう。このようなリボザイムの活 性は、第２のリボザイムにより一次転写産物からそれらを放出させることにより 増加させることができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２ ３５６９，およびＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５ ９５（これらの内容のすべてを本明細書の一部としてここに引用する）；Ｏｈｋ ａｗａ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓ ｅｒ．２７，１５−６：Ｔａｉｒａ，ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ，ｅｔ ａｌ． ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５， Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６ ９，２５８５６）。 したがって、第１の観点において、本発明は細胞増殖を阻害するリボザイムを 特徴とする。これらの化学的または酵素的に合成されたＲＮＡ分子は、その標的 ｍＲＮＡのアクセス可能な領域に結合する基質結合ドメインを含む。ＲＮＡ分子 はまた、ＲＮＡの切断を触媒するドメインを含む。ＲＮＡ分子は、好ましくはハ ンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムである。結合した際に、リボ ザイムは標的ｍＲＮＡを切断し、翻訳および蛋白質の蓄積を防止する。標的遺伝 子が発現されないため、細胞増殖が阻害される。 好ましい態様においては、酵素的ＲＮＡ分子はｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡを切断し 、平滑筋細胞の増殖を阻害する。このようなリボザイムは冠状動脈血管形成術後 の再狭窄を防止するのに有用である。リボザイムは直接加えることもできるが、 カチオン性脂質とともに複合させるか、リポソーム中に封入するか、または他の 方法により平滑筋細胞に送達することができる。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、 バイオポリマーに取り込ませてまたは取り込ませずに、カテーテル、注入ポンプ またはステントを用いて関連する組織に局所的に投与することができる。同様に 送達されたリボザイムはまた、高いレベルのｃ−ｍｙｂオンコジンに関連するあ る種の癌、特に白血病、神経芽細胞腫、および肺癌、結腸癌および乳癌の増殖を 阻 害するのにも有用である。本明細書に記載される方法を用いて、ｃ−ｍｙｂ、ｃ −ｍｙｃ、ｏｃｔ−１、ＳＲＦ、ＮＦ−κＢ、ＰＤＧＦレセプター、ｂＦＧＦレ セプター、アンギオテンシンIIおよび内皮由来弛緩因子を切断し、このことによ り平滑筋細胞の増殖および／または腫瘍細胞の増殖を阻害する他の酵素的ＲＮＡ 分子を誘導し、上述のように用いることができる。特定の例は、以下の表に記載 される。 このようなリボザイムは、上述の疾患および病状、ならびに細胞もしくは組織 におけるｃ−ｍｙｂ活性のレベルに関連する他のいずれの疾患または病状の防止 にも有用である。”関連する”とは、ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡの阻害、したがって 、蛋白質活性のレベルの減少が、疾患の症状または病状をある程度軽減させるで あろうことを意味する。 リボザイムは直接加えることもできるが、カチオン性脂質とともに複合させる か、リポソーム中に封入するか、または他の方法により標的細胞に送達すること ができる。核酸または核酸複合体は、バイオポリマーに取り込ませてまたは取り 込ませずに、注射、注入ポンプまたはステントを用いて関連する組織にエクスビ ボまたはインビボで局所的に投与することができる。 本発明の別の態様においては、標的分子を切断しｃ−ｍｙｂ活性を阻害するリ ボザイムを、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現 させる。組み換えベクターは、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルス性ベ クターである。リボザイム発現ウイルス性ベクターは、アデノ関連ウイルス、レ トロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスを基に構築することがで きるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、リボザイムを発現しう る組み換えベクターを上述のように送達し、標的細胞中に存在させる。あるいは 、リボザイムを過渡的に発現させるウイルス性ベクターを用いることができる。 このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん 発現すれば、リボザイムは標的ｍＲＮＡを切断する。リボザイム発現ベクターの 送達は、全身投与（例えば静脈内または筋肉内）により、患者から外植した標的 細胞に投与した後に患者に再導入することにより、または所望の標的細胞に導入 するための他の任意の方法により、行うことができる。 ”ベクター”とは、所望の核酸を送達するために用いられる任意の核酸および ／またはウイルスに基づく技術を意味する。 好ましい態様においては、リボザイムは表II、ＸII−ＸＸIVに示される配列に 相補的な結合アームを有する。このようなリボザイムの例は、配列番号１０１− １２９（表III）として、および表ＸII−ＸＸIVに示される。すなわち、相補的 であるとは、結合アームがヒトまたはマウスまたはラットまたはブタのｍＲＮＡ 標的の切断を引き起こしうることを意味する。このようなリボザイムの例は、本 質的に表III、ＸII−ＸＸIVにおいて定義される配列からなる。”本質的に・・ からなる”とは、活性なリボザイムが、標的部位における切断が生ずるように、 例に示されるリボザイムと均等な酵素的中心およびｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡに結合 しうる結合アームを含むことを意味する。そのような切断を妨害しない他の配列 が存在していてもよい。 本発明の別の観点においては、標的分子を切断し、細胞増殖を阻害するリボザ イムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはウイルス性ベクター中に挿入された転写ユニッ トから発現される。好ましくは、リボザイムを発現しうる組み換えベクターを上 述のように局所的に送達し、平滑筋細胞中に過渡的に存在させる。いったん発現 されれば、リボザイムはその標的ｍＲＮＡを切断し、その宿主細胞の増殖を防止 する。組み換えベクターは、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはアデノウイルス ベクターである。しかし、ＲＮＡの発現を指示する他の哺乳動物細胞ベクターを この目的のために使用することができる。 本発明の他の特徴および利点は、以下の本発明の好ましい態様の記載および特 許請求の範囲から明らかであろう。好ましい態様の記載 最初に図面を簡単に説明する。図面： 図１は、当該技術分野において知られているハンマーヘッドリボザイムドメイ ンの図解的描写である。ステムIIは２塩基対以上の長さでありうる。 図２（ａ）は、当該技術分野において知られているハンマーヘッドリボザイム ドメインの図解的描写であり；図２（ｂ）は、Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７， Ｎａｔｕｒｅ，３２７，５９６−６００）により基質および酵素部分に分割され たハンマーヘッドリボザイムの図解的描写であり、図２（ｃ）は、Ｈａｓｅｌｏ ｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５−５９１ ）により２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様の図解的描写であり ；そして図２（ｄ）はＪｅｆｆｒｉｅｓおよびＳｙｍｏｎｓ（１９８９，Ｎｕｃ ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，１３７１−１３７１）により２つの部分に分 割されたハンマーヘッドを示す同様の図解的描写である。 図３は、ヘアピンイボザイムの一般的な構造の図解的描写である。ヘリックス ２（Ｈ２）は少なくとも４塩基対（すなわち、ｎは１、２、３または４）にて提 供され、ヘリックス５は任意に２以上の長さの塩基（好ましくは３−２０塩基、 すなわち、ｍは１−２０またはそれ以上）にて提供されうる。ヘリックス２およ びヘリックス５は１つ以上の塩基により共有結合していてもよい（すなわち、ｒ は１塩基以上）。また、ヘリックス１、４または５を２以上の塩基対により伸長 することにより（例えば、４−２０塩基対）リボザイム構造を安定化してもよく 、好ましくは蛋白質結合部位である。各々の例においては、各ＮおよびＮ’は独 立にいずれかの通常の塩基または修飾塩基であり、そして各ダッシュは潜在的塩 基対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは、糖、塩基またはリン酸部分で修 飾されていてもよい。完全な塩基対形成はヘリックス内において必要ではないが 、これが好ましい。ヘリックス１および４は、幾つかの塩基対が維持される限り 任意の大きさであってよい（すなわち、ｏおよびｐは各々独立に０から任意の数 値、例えば２０である）。必須塩基は構造中において特定の塩基として示される が、当業者は１つまたはそれ以上が顕著な影響なしに化学的に修飾（脱塩基（ａ ｂａｓｉｃ）、塩基、糖および／またはリン酸修飾）または他の塩基により置換 されていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス４は２つの別々の分子か ら、すなわち接続ループを用いずに形成することができる。接続ループが存在す る場合には、これは、塩基、糖またはリン酸が修飾されていてもいなくてもよい リボヌクレオチドでありうる。「ｑ」は２塩基以上である。接続ループは非ヌク レオチドリンカー分子で置換されていてもよい。Ｈは塩基Ａ，Ｕ，またはＣを意 味する。Ｙはピリミジン塩基を意味する。” ”は共有結合を意味する。 図４は、当業界において知られているデルタ肝炎ウイルスリボザイムドメイン の一般的構造の描写である。 図５は、自己切断ＶＳ ＲＮＡリボザイムドメインの一般的構造の描写である 。 図６はＲＮＡｓｅＨアクセス可能性アッセイの図解的描写である。詳しくは、 図６の左側は、標的ＲＮＡ上のアクセス可能な部位に結合した相補的ＤＮＡオリ ゴヌクレオチドの図である。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ａ、Ｂおよび Ｃと表示された広い線により表される。標的ＲＮＡは細いねじれ線により表され る。図６の右側は、切断された標的ＲＮＡから未切断標的ＲＮＡをゲル分離する スキームである。標的ＲＮＡの検出は、全体標識Ｔ７転写産物のオートラジオグ ラフィーによる。各々のレーンに共通のバンドは、未切断標的ＲＮＡを表す；各 々のレーンに独特のバンドは、切断された産物を表す。 図７は、ネズミｃ−ｍｙｂ ＲＮＡのＲＮＡｓｅＨアクセス可能性アッセイの 結果のグラフである。横座標はリボザイム標的部位に相同のＤＮＡオリゴヌクレ オチドの配列の番号である。縦座標は、ＲＮＡｓｅＨにより切断された無傷の転 写産物のパーセンテージを表す。 図８は、ヒトｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡのＲＮＡｓｅＨアクセス可能性アッセイの 結果のグラフである。グラフは図７と同様に表示されている。 図９は、ｃ−ｍｙｂの５７５位を標的とするハンマーヘッドリボザイムの触媒 活性に及ぼす化学的修飾の影響を示す。Ａ）５７５ハンマーヘッドリボザイム− 基質複合体の図解的描写。２’−Ｏ−メチルリボザイムは、５’および３’末端 の５つのヌクレオチド中に２’−Ｏ−メチル置換を含むハンマーヘッド（ＨＨ） リボザイムを表す。２’−Ｏ−メチルＰ＝Ｓリボザイムは、５’および３’末端 の５つのヌクレオチド中に２’−Ｏ−メチルおよびホスホロチオエート置換を含 むハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムを表す。２’−Ｃ−アリル ｉＴ リボザ イムは、５つの位置においてリボース残基を含むハンマーヘッドを表す。残りの ３１のヌクレオチド位置は２’−ヒドロキシル基置換を含み、ここで３０のヌク レオチドは２’−Ｏ−メチル置換を含み、１つのヌクレオチド（Ｕ４）は２’− Ｃ−アリル置換を含む。さらに、このリボザイムの３’末端は、３’−３’結合 反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）Ｔを有する。２’−Ｃ−アリル Ｐ＝Ｓ リボザイム は、２’−Ｃ−アリル ｉＴ リボザイムと同様であるが、次の点において異な る。５’および３’末端の５つのヌクレオチドはホスホロチオエート置換を含み 、リボザイムは３’−末端反転Ｔ修飾を有しない。Ｂ）は、図９Ａに記載される リボザイムが平滑筋細胞の増殖を阻害する能力を示す。 図１０は、２’−Ｃ−アリル Ｐ＝Ｓ ５７５ＨＨリボザイムの濃度が平滑筋 細胞増殖に及ぼす影響を示す。平滑筋細胞増殖の阻害のパーセントのプロットが リボザイム濃度の関数として示される（触媒的に非活性のリボザイムの影響に対 して標準化されている）。 図１１は、平滑筋細胞の増殖に及ぼす２’−Ｃ−アリル Ｐ＝Ｓ ５７５ＨＨ リボザイムおよびホスホロチオエートアンチセンスＤＮＡの影響の比較を示す。 図１２は、ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡ中の部位５４９、５７５および１５３３を標 的とする２’−Ｃ−アリル Ｐ＝Ｓ ＨＨリボザイムにより触媒される平滑筋細 胞増殖の阻害を示す。 図１３は、２’−Ｃ−アリル ５７５ ＨＨリボザイムの触媒活性に及ぼすホ スホロチオエート置換の影響を示す。Ａ）５７５ハンマーヘッドリボザイム−基 質複合体の図解的描写。１０ Ｐ＝Ｓ ５’および３’リボザイムは図９に記載 の２’−Ｃ−アリル Ｐ＝Ｓ リボザイムと同一である。５ Ｐ＝Ｓ ３’リボ ザイムは、３’末端の５つのヌクレオチドのみがホスホロチオエート置換を含む ことを除き、１０ Ｐ＝Ｓ ５’および３’リボザイムと同一である。５ Ｐ＝ Ｓ ループリボザイムは、このリボザイムのループII中の５つのヌクレオチドが ホスホロチオエート置換を含むことを除き、図９に記載の２’−Ｃ−アリル ｉ Ｔ と同様である。５ Ｐ＝Ｓ ５’リボザイムは、５’末端の５つのヌクレオ チドのみがホスホロチオエート置換を含むことを除き、１０ Ｐ＝Ｓ ５’およ び３’リボザイムと同一である。さらに、このリボザイムは３’末端に３’−３ ’結合反転Ｔを含む。Ｂ）図１３Ａに記載のリボザイムが平滑筋細胞の増殖を阻 害する能力を示す。 図１４は、５７５ＨＨリボザイムが有効に平滑筋細胞増殖を阻害するのに必要 な、５’末端におけるホスホロチオエート置換の最小の数を示す。 図１５は、５７５ＨＨリボザイムの基質結合アームの長さの変化が平滑筋細胞 増殖の阻害に及ぼす影響を示す。 図１６は、５７５ＨＨリボザイムコア中のＵ４および／またはＵ７位置におけ る種々の化学的修飾が平滑筋細胞増殖を阻害するリボザイムの能力に及ぼす影響 を示す。 図１７は、活性ｃ−ｍｙｂ ５７５ＨＨリボザイムによるブタ平滑筋細胞増殖 の阻害を示す。 図１８は、活性ｃ−ｍｙｂ ５７５ＨＨリボザイムによるヒト平滑筋細胞増殖 の阻害を示す。 図１９は、ｃ−ｍｙｂ発現および細胞増殖のリボザイム介在性阻害を示す。 図２０は、再狭窄等の疾患を治療するために用いることができる最適ｃ−ｍｙ ｂ ＨＨリボザイムの図解的描写である。 図２１は、２−５Ａ含有核酸によるラット平滑筋細胞の阻害を示す。標的部位 有用なリボザイムの標的はＤｒａｐｅｒら（上掲）、Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上 掲）、ならびにＤｒａｐｅｒら（”Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｆ ｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ”ＰＣＴ／ＵＳ９４／１３１２９、米国特許出願０８／１５２，４８７、１１／ １２／９３出願（これらの全体を本明細書の一部としてここに引用する）に開示 されているようにして決定することができる。本明細書ではこれらの文書で提供 されているガイドラインを繰り返さずに、以下にこれらの方法の特定の例を提供 するが、これらに限定されない。このような標的に対するリボザイムは、これら の出願において記載されているように設計し、そして記載されているように合成 して、インビトロおよびインビボで試験する。このようなリボザイムは本明細書 に記載されたように最適化し、送達することもできる。マウスＲＮＡに対する特 定の例を提供するが、当業者は均等なヒトＲＮＡ標的を以下で記載するようにし て使用しうることを認識するであろう。すなわち、同一の標的を使用することが できるが、ヒトＲＮＡ配列を標的とするのに適する結合アームがリボザイム中に 存在する。このような標的も以下に記載するようにして選択することができる。 コンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して、ヒト、ブタおよびネズミ ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡの配列を、最適なリボザイム標的部位についてスクリーニ ングした。ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム切断部位を同定した。、こ れらの部位は表IIおよびＸII−ＸＸIVに示される。（これらの表中、配列は全て ５’から３’である）。表中、ヌクレオチド塩基位置は、示されるタイプのリボ ザイムにより切断されるべき部位として示される。ネズミ、ブタおよびヒト配列 をスクリーニングし、次にリボザイムを設計することができるが、ヒトを標的と する配列が最も有用である。しかし、ネズミおよびブタを標的とするリボザイム は、ヒトにおいて試験する前にリボザイムの作用の効力を試験するために有用で あろう。表中、ヌクレオチド塩基位置は、示されるタイプのリボザイムにより切 断されるべき部位として示される。 ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイムをこれらが結合しうるように設計し 、コンピューター折りたたみ（Ｊａｅｇｅｒｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ，８６，７７０６）により別々に分析し て、リボザイム配列が適当な二次構造に折りたたまれるかどうかを評価した。結 合アームと触媒コア間に好ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮 から除外する。種々の結合アームの長さを選択して活性を最適にすることができ る。一般に、各アームの少なくとも５塩基が標的ＲＮＡと結合しうるか、さもな くば標的ＲＮＡと相互作用することができる。 この研究に有用な、化学的に合成したリボザイムの配列は、表IIIおよびＸII −ＸＸIVに示される。当業者は、これらの配列が、活性に影響を及ぼすためにリ ボザイムの酵素的部分（結合アームを除くすべて）が変更されているはるかに多 くのそのような配列の代表例にすぎないことを理解するであろう。例えば、表II Iに挙げられるハンマーヘッドリボザイムのステムーループII配列（５’−ＧＧ ＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣ−３’）は、最小で２つの塩基対形成したステム構造を形 成しうる限り、任意の配列を含むように変更（置換、削除、および／または挿入 ）することができる。同様に、表III、ＸIII、ＸVI、ＸIX、ＸＸ、ＸＸIIIおよ びＸＸIVに挙げられるヘアピンリボザイムのステム−ループIV配列（５’−ＣＡ ＣＧＵＵＧＵＧ−３’）は、最小で２つの塩基対形成したステム構造を形成しう る限り、任意の配列を含むように変更（置換、削除、および／または挿入）する ことがで きる。表IIIおよびＸII−ＸＸIVに挙げられるリボザイム配列は、リボヌクレオ チドまたは他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドで形成することができる。そ のようなリボザイムは、表に具体的に記載されるリボザイムと均等である。リボザイム活性の最適化 リボザイム活性は本明細書に記載されているようにして最適化することができ る。これらには、リボザイム結合アーム（ステムＩおよびIII、図２ｃを参照の こと）の長さの変更、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防止する修飾を 有するリボザイムの化学的合成（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国 際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎ ａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９ ２，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ，ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；および Ｒｏｓｓｉ，ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３Ｔ６２，ならびにＵｓｍａｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ ．，米国特許出願０７／８２９，７２９，およびＳｐｒｏａｔ，米国特許５，３ ３４，７１１を参照のこと）が含まれる。これらは酵素ＲＮＡ分子の糖部分に行 うことができる種々の化学修飾、細胞におけるこれらの活性を増強させる修飾お よびステムII塩基の除去によるＲＮＡの合成時間の短縮および化学物質の必要性 の減少を記載している（これらの刊行物のすべてを本明細書の一部としてここに 引用する）。 Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上掲）は、酵素ＲＮＡ分子の一般的な送達方法を記載し ている。リボザイムは、当業者に知られている種々の方法によって細胞に投与す ることができる。例えば、リポソーム中へのカプセル化、イオン浸透療法によっ て、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセルおよび生 物接着性微小球のような他のベヒクル中への取り込みが挙げられるが、これらに 限定されるものではない。適用によっては、リボザイムは、上述のベヒクルとと もにもしくはベヒクルなしで、エクスビボで直接細胞または組織に送達すること ができる。あるいは、ＲＮＡ／ベヒクルの組合せ物は直接注射するかまたはカテ ーテル、注入ポンプもしくはステントを使用して局所的に送達される。別の送達 経路には、静脈、筋肉、皮下、もしくはこれらの組み合わせの注射、エアゾール 吸入、経口（錠剤または丸剤形態）、局所、全身、眼、腹腔内および／または鞘 内送達が含まれるが、これらに限定されるものではない。リボザイム送達および 投与のさらに詳細な説明は、Ｓｕｌｌｉｖａｎら（上掲）およびＤｒａｐｅｒら （上掲）に提供されており、これらを本明細書の一部としてここに引用する。 細胞内に高濃度のリボザイムを蓄積させるもう１つの手段は、リボザイムをコ ードする配列をＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター中に取り込ませることである。 リボザイム配列の転写は、真核細胞ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、ＲＮＡ ポリメラーゼII（ｐｏｌII）またはＲＮＡポリメラーゼIII（ｐｏｌIII）のプロ モーターから行われる。ｐｏｌIIもしくはｐｏｌIIIプロモーターからの転写産 物は、全ての細胞で高レベルで発現される；あるタイプの細胞中のあるｐｏｌII プロモーターのレベルは近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー、サイレ ンサー等）の性質に依存するであろう。原核細胞ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当 な細胞内で発現する限り、原核細胞ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用され る（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａ ｎｇ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７ ２；Ｌｉｅｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。数人の研究者は、このようなプロモ ーターから発現されたリボザイムが哺乳類細胞で機能しうることを示している（ 例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｎｔｉｓｅ ｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９ ９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６ ；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ，２０，４５８１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃ ｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ ．Ａ．，９ ０，８０００−４）。上記のリボザイム転写ユニットは、哺乳類細胞中に導入す るために、種々のベクター中に組み込ませることができる。例えば、プラスミド ＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスまたはアデ ノ関連ウイルスベクター）またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイ ルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられるが、これらに限定されるも のではない 本発明の好ましい態様においては、ｃ−ｍｙｂによりコードされるｍＲＮＡを 切断するリボザイムを発現する転写ユニットを、プラスミドＤＮＡベクターまた はアデノウイルスもしくはアデノ関連ＤＮＡウイルスベクターまたはレトロウイ ルスＲＮＡベクター中に挿入する。ウイルスベクターは、遺伝子を伝達し、過渡 的もしくは長期的に遺伝子を発現させるために用いられている（Ｚａｂｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｃｅｌｌ ７５，２０７；Ｃａｒｔｅｒ，１９９２ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，５３３）。アデノウイルスベクターは 組換えアデノウイルス粒子として送達される。ＤＮＡは、ＲＮＡについて上記で 説明したように、単独でまたはベヒクルと複合体を形成させて送達することがで きる。組み換えアデノウイルスもしくはＡＡＶ粒子は、例えば、インビボでのイ ンキュベーションまたは吸入により、またはエクスビボで細胞もしくは組織に直 接適用することにより、治療部位に局所的に投与される。 別の好ましい態様においては、リボザイムは、適当なリポソームベヒクル中で 、ｃ−ｍｙｂ発現の部位（例えば平滑筋細胞）に投与される。実施例 外的送達されたｃ−ｍｙｂに対するリボザイムが血管平滑筋細胞の増殖を阻害す る能力 以下の実施例は、ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡを切断するリボザイムの選択を示す。 本明細書に記載される方法は、細胞分裂に必要な他のｍＲＮＡ標的を切断するリ ボザイムを誘導化しうるスキームを示す。また、このようなリボザイムをどのよ うにして平滑筋細胞に送達するかの記載も示される。実施例は、リボザイムは、 送達されると培養中で細胞増殖を阻害することを示す。さらに、触媒的に非活性 の変異型リボザイムを細胞に適用した場合には阻害が観察されない。したがって 、 阻害にはリボザイムの触媒活性が必要である。使用した細胞分裂アッセイは、再 狭窄病変における平滑筋細胞の過剰増殖のモデルシステムである。実施例１：ヒトｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡ中の潜在的リボザイム切断部位の同定 コンピューター折りたたみアルゴリズムを使用して、ヒトｃ−ｍｙｂ ｍＲＮ Ａの配列を、アクセス可能な部位についてスクリーニングした。二次折りたたみ 構造を形成せずかつ潜在的ハンマーヘッドリボザイム切断部位を含有するｍＲＮ Ａの領域を同定した。これらの部位を表IIおよびＸII−ＸＸIVに示す。部位は、 Ｗｅｓｔｉｎ，Ｅ．Ｈ．ら（１９９０，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５，１１１７−１１ ２４）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５２１２５）による配列の番号により番号づ けした。配列はより長いｃ−ｍｙｂ ｃＤＮＡ単離物から得られたものであり、 したがって、全長ＲＮＡをよりよく表す。実施例２：ネズミおよびヒトｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡ中のリボザイム切断部位の選 択 コンピューターに基づくＲＮＡ折りたたみアルゴリズムによって予測された部 位がｃ−ｍｙｂ ＲＮＡのアクセス可能な部位に対応するか否かを試験するため に、４１のハンマーヘッド部位を選択して分析した。リボザイム標的部位は、マ ウスおよびヒトｃ−ｍｙｂのｃＤＮＡ配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 Ｘ０２７７４およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５２１２５）を比較することによ り選択し、全体的なヌクレオチド配列ホモロジーに基づいて優先順位をつけた。 ハンマーヘッドリボザイムをそれぞれの標的に結合しうるように設計し（図２Ｃ を参照のこと）、そしてコンピューター折りたたみ（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８６，７７ ０６−７７１０）で個々に分析して、リボザイム配列が適当な二次構造に折りた たまれるかどうかを評価した。結合アームと触媒コア間に好ましくない分子内相 互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下に記載するように、種々の 結合アームの長さを選択して活性を最適化することができる。一般に、各アーム の少なくとも５塩基が標的ＲＮＡと結合できるか、さもなくば標的ＲＮＡと相互 作用することができる。実施例３：ＲＮａｓｅＨ保護によるリボザイム切断部位のスクリーニング ネズミおよびヒトｍＲＮＡを、Ｄｒａｐｅｒら（国際公開ＷＯ９３／２３５６ ９，本明細書の一部としてここに引用する）に一般的に記載されている方法によ り、アクセス可能な切断部位についてスクリーニングした。簡単には、４１の潜 在的ハンマーヘッドリボザイム切断部位を表すＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成 した。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ヒトまたはネズミｃ−ｍｙｂのｃＤＮ ＡクローンからＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写用の基質を生じさせた。標識ＲＮＡ 転写産物は２つの鋳型からインビトロで合成した。オリゴヌクレオチドと標識転 写産物とをアニーリングさせ、ＲＮＡｓｅＨを加え、混合物を３７℃で指定され た時間インキュベートした。反応を停止させ、ＲＮＡを配列決定用ポリアクリル アミドゲルで分離した。切断された基質のパーセントは、ホスファーイメージン グシステムを使用してオートラジオグラフィー定量により決定した。結果を図７ および８に示す。これらのデータから、２０個のハンマーヘッドリボザイム部位 を最もアクセス可能なものとして選択した（表IIIを参照のこと）。実施例４：ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡの有効な切断のためのリボザイムの化学合成およ び精製 ハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムを設計して、ｍＲＮＡメ ッセージ中の種々の部位にアニーリングさせた。結合アームは上記した標的部位 配列と相補的である。リボザイムは化学的に合成した。用いた合成方法は、Ｕｓ ｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７ ８４５およびＳｃａｒｉｎｇｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３に記載される通常のＲＮＡ合成の方法にし たがい、共通の核酸保護基およびカップリング基、例えば、５’末端にジメトキ シトリチルおよび３’末端にホスホルアミダイトを用いた。平均的な段階的カッ プリング収率は＞９８％であった。非活性リボザイムは、Ｇ５の代わりにＵをそ してＡ１４の代わりにＵを使用して合成した（番号は、Ｈｅｒｔｅｌ，ｅｔ ａ ｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，３２５２によ る）。ヘアピンリボザイムを２つの部分で合成し、アニーリングして活性リボザ イムを再構築した（Ｃｈｏｗｒｉｒａ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９２，Ｎｕｃ ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）。リボザイムは また、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ鋳型から合 成した（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８９，Ｍｅｔｈ ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０，５１）。リボザイムは全て、ヌクレアーゼ耐 性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ− メチル、２’−Ｈで修飾することにより安定性を高めるように広範囲に修飾した （総説については、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩ ＢＳ １７、３４を参照のこと）。リボザイムは一般的な方法を使用してゲル電 気泳動で精製するか、または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｕｓｍａ ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎａｌ ｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ Ｒｙｂ ｏｚｙｍｅ，１９９４年５月１８日出願、米国特許出願０８／２４５，７３６； このすべてを本明細書の一部としてここに引用する）で精製し、そして水に再懸 濁した。この研究において用いた化学合成リボザイムの配列は、以下の表IIIに 示される。実施例５：ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡ標的に対応する長い基質ＲＮＡのリボザイム切 断 ネズミｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡを標的とするハンマーヘッド−タイプのリボザイ ムを設計し、合成して、マウスおよびヒトｃ−ｍｙｂ ＲＮＡの両方のインビト ロ転写産物中の２０個の最もアクセス可能な部位における切断活性を試験した。 ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡ中の標的配列およびヌクレオチドの位置を表IIに示す。す べてのハンマーヘッドリボザイムは、７ヌクレオチドの長さの結合アーム（ステ ムＩおよびIII；図２Ｃを参照のこと）を有するように合成した。部位１６３２ および２２３１に対して２つのヘアピンリボザイムを合成した。これらのリボザ イムがネズミおよびヒトＲＮＡの両方を切断する相対的な活性を表IIにまとめる 。リボザイム（１μＭ）を、³²Ｐ標識基質ＲＮＡ（実施例３に記載のように合成 ；約２０ｎＭ）とともに、上述の緩衝液中で３７℃において６０分間インキュベ ートした。無傷のＲＮＡおよび切断産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によ り分離した。切断のパーセンテージは、無傷の基質および切断産物を表すバンド をホスファーイメージャー（登録商標）により定量することにより判定した。 ５個のハンマーヘッドリボザイム（部位５４９，５７５，１５５３，１５９７ および１６３５に対する）および１個のヘアピンリボザイム（部位１６３２に対 する）は非常に活性が高く、ネズミおよびヒトｃ−ｍｙｂ ＲＮＡの両方を６０ 分間で７０％以上切断した。９個のハンマーヘッドリボザイム（部位５５１，６ ３４，９３６，１０８２，１５９７，１７２１，１７２４，１８９５，および１ ９４３に対する）は中程度の活性を有し、ネズミおよびヒトｃ−ｍｙｂ ＲＮＡ の両方を６０分間で５０％以上切断した。これらの活性リボザイムにより切断さ れた部位はすべて、表IIにおいてリボザイム切断にアクセス可能であると予測さ れたものであった。６個のハンマーヘッドリボザイムおよび１個のヘアピンリボ ザイムは、少なくとも１つの基質において低い活性を示した。２種のｃ−ｍｙｂ ＲＮＡの間で観察されたアクセス可能性の相違は、ＲＮＡ構造に対するリボザ イムの作用の感受性を示し、相同な標的配列が存在する場合であってもリボザイ ムが構造的拘束によりそのＲＮＡを切断することができないことを示唆する。こ の特異性のレベルは、細胞中におけるリボザイムの非特異的毒性を最小にする。実施例６：ハンマーヘッドリボザイムが平滑筋細胞増殖を阻害する能力 上述の、ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断したリボザイムを、平滑筋細胞増殖に及ぼ す影響についてアッセイした。ラット血管平滑筋細胞を次のように単離し、培養 した。成人Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから大動脈を切開し、切開顕微 鏡下で結合組織を除去し、血管の１ｍｍ²の切片を内膜側を上にして、ペトリ皿 上の、１０％ＦＢＳ、２％リン酸トリプトースブロス、１％ペニシリン／ストレ プトマイシンおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加した改良イーグル培地（ＭＥ Ｍ）中に置いた。平滑筋細胞を３−４週間でコンフルエントまで移動および成長 させた。これらの初代培養細胞を凍結し、次の代は、３７℃で５％ＣＯ₂中、ダ ルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、およ び添加物（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１ ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸（それぞれのアミノ酸０．１ｍＭ） および２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４）中で成長させた。４から６代経過し た細胞を増殖アッセイに用いた。細胞増殖アッセイのために、ウエルを０．２％ ゼラチンでコーティングし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄することに よ り、２４−ウエル組織培養プレートを調製した。ＲＡＳＭＣをウエルあたり１× １０⁴細胞で１０％ＦＥＳおよび添加物を含むＤＭＥＭ１ｍｌ中に播種し、２４ 時間インキュベートした。この密度で播種したとき、細胞はサブコンフルエント であった。培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄し、０．５％ＦＢＳおよび添加物を 含むＤＭＥＭ中で４８−７２時間インキュベートすることにより、細胞を血清飢 餓状態とした。 他のいくつかのシステムにおいては、カチオン性脂質が培養細胞へのオリゴヌ クレオチドの生体利用可能性を増強することが示されている（Ｂｅｎｎｅｔ，Ｃ ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４１， １０２３−１０３３）。以下の実験の多くにおいては、リボザイムをカチオン性 脂質とともに複合体化させた。カチオン性脂質であるリポフェクタミン（ＤＯＳ ＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチ ル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート）とジ オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との３：１（ｗ／ｗ） 配合物）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。Ｄ ＭＲＩＥ（Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ− ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）はＶＩＣＡＬから入手 した。ＤＭＲＩＥをＣＨＣｌ₃に再懸濁し、１：１モル比でジオレオイルホスフ ァチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と混合した。ＣＨＣｌ₃を蒸発させ、脂 質を水に再懸濁し、１分間ボルテックスし、５分間浴超音波処理した。リボザイ ムおよびカチオン性脂質の混合物は、細胞に加える直前に血清フリーＤＭＥＭ中 で調製した。ＤＭＥＭおよび添加物を室温（約２０−２５℃）まで暖め、カチオ ン性脂質を最終的な所望濃度となるように加え、溶液を軽くボルテックスした。 ＲＮＡオリゴヌクレオチドを最終的な所望濃度となるように加え、溶液を再び軽 くボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。用量応答実験において は、１０分間インキュベーションの後にＲＮＡ／脂質複合体をＤＭＥＭ中で連続 的に希釈した。 血清飢餓状態とした平滑筋細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＮＡ／脂質複合体を 加えた。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。次に培地を除去し、１ ０％ＦＢＳ、添加物および１０μＭブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を含む ＤＭＥＭを加えた。いくつかのウエルにおいては、ＦＢＳを省いて、刺激されな い増殖のベースラインを決定した。プレートを３７℃で２０−２４時間インキュ ベートし、１００％メタノール中０．３％Ｈ₂Ｏ₂で固定し、標準的方法により染 色してＢｒｄＵ取り込みを測定した。この方法においては、増殖してＢｒｄＵを 取り込んだ細胞は茶色に染色され、非増殖細胞は淡紫色に対比染色される。Ｂｒ ｄＵ陽性およびＢｒｄＵ陰性細胞の両方を顕微鏡下で計数した。ウエルあたり合 計３００−６００個の細胞を計数した。以下の実験においては、ＢｒｄＵを取り 込んだ細胞の総数のパーセンテージ（細胞増殖（％））を示す。誤差は２重に試 験したウエルの範囲を示す。次に、細胞増殖値（％）から阻害のパーセントを次 のように計算した： 阻害（％）＝１００−１００（（リボザイム−０％血清）／（対照−０％血清） ） インビトロＲＮＡ切断試験からの最良の５個のリボザイム（部位５４９，５７ ５，１５５３，１５９８，および１６３５に対する）および中間の切断レベルを 有する１個（部位１５９７に対する）を含む６個のハンマーヘッドリボザイム、 および触媒的に非活性の対照を、上述のように合成して精製した。リボザイムは 、カチオン性脂質電荷とアニオン性ＲＮＡ電荷が１：１のモル比となるようにＤ ＭＲＩＥ／ＤＯＰＥと複合体化させて、０．３μＭの濃度で送達した。表IVに示 される結果は、異なる部位に対するリボザイムの効力が非常に大きく異なること を示す。６個のハンマーヘッドリボザイムのうちの５個（部位５４９，５７５， １５５３，１５９７および１５９８に対する）は、有意に平滑筋細胞増殖を阻害 した。対照である、触媒コア配列が変更されているためにｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを 切断できない非活性リボザイムは、ラット平滑筋細胞増殖を阻害することができ なかった。すなわち、これらの５個のハンマーヘッド配列による細胞増殖の阻害 は、これらがｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断する能力によるものであり、いかなるア ンチセンス活性によるものでもない。６番目のリボザイム（部位１６３５に対す る）は、平滑筋細胞中で機能することができない。このリボザイムはインビトロ で非常に効率よくｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断した。この実験においては、１０％ ＦＢ Ｓ（リボザイム添加せず）は６４±１％の増殖を誘導し、０％ＦＢＳはバックグ ラウンドである９±１％の増殖を生じた。実施例７：外的に送達されたｃ−ｍｙｂに対するヘアピンリボザイムが血管平滑 筋細胞増殖を阻害する能力 上述で試験したハンマーヘッドリボザイムに加えて、二股のヘアピンリボザイ ム（Ｃｈｏｗｒｉｒａ，Ｂ．Ｍ．，上掲，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）もまたｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断す ることが同定された。このリボザイムの平滑筋細胞増殖に及ぼす影響を試験した 。リボザイムを、示された用量でリポフェクタミンとともに１：１電荷比で送達 した。この実験においては、１０％ＦＢＳ（リボザイムなし）は８７±１％の増 殖を誘導し、０％ＦＢＳは５±１％の増殖を生じた。用量応答実験の結果を表Ｖ に示す。この実施例においては、対照は、関連のないハンマーヘッドリボザイム であった。関連のない対照リボザイムは、同一の触媒コア配列を含むが、平滑筋 細胞増殖に必要でない細胞性ＲＮＡに対する結合アームを有する。この対照は、 細胞増殖を有意に阻害することができなかった。このことは、これらのリボザイ ムの配列特異性を示す。実験することができた他の対照は、試験リボザイムと同 一のＧ：Ｃ含量を有する触媒的に活性な関連のないリボザイムである。実施例８：リボザイムは用量依存的様式でラット平滑筋細胞の増殖を阻害する 実施例６で観察された増殖の阻害がリボザイムに起因するものであれば、阻害 のレベルは加えられたＲＮＡの用量に比例するはずである。ラット大動脈平滑筋 細胞を、異なる用量の２つのハンマーヘッドリボザイムの存在下で増殖について アッセイした。表VIに示される結果は、部位５７５および５４９でｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断する２つのハンマーヘッドリボザイムが用量依存的様式でＳＭＣ増 殖を阻害したことを示す。リボザイムはカチオン性脂質であるリポフェクタミン とともに１：１の電荷比で送達した。この実験においては、１０％ＦＢＳ（リボ ザイムなし）は９２±１％の増殖を生じ、０％ＦＥＳは６±１％の増殖を生じた 。対照は関連のないｍＲＮＡ標的に対する活性なリボザイムであり、試験した用 量範囲では阻害を示さなかった。対照リボザイムは活性リボザイムと同一の触媒 コア配列を含むが、その結合アーム配列（ステムＩおよびIII；図２ｃ）におい て異 なる。すなわち、平滑筋細胞増殖のリボザイム阻害にはｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡに 対するハンマーヘッドアームの配列特異的結合が必要である。実施例９：異なるカチオン性脂質とｃ−ｍｙｂリボザイムの送達 表VIIの結果は、２つの異なるカチオン性脂質（ＤＭＲＩＥおよびリポフェク タミン）とともに送達された、部位５７５でｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断するハン マーヘッドリボザイムに対するラット平滑筋細胞の応答を示す。いずれの脂質に ついても同様の効力が観察された。１０％ＦＢＳ（リボザイムなし）は７８±２ ％の増殖を誘導し、０％ＦＢＳはバックグラウンドである６±１％の増殖を生じ た。実施例１０：アーム長さの変化がリボザイム活性に及ぼす影響 それぞれのリボザイムの正確なコンフィギュレーションは、結合アーム（ステ ムＩおよびIII；図２Ｃを参照のこと）の長さを変更することにより最適化する ことができる。結合アームの長さは、結合および触媒的切断段階の両方に影響を 有するであろう（Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ，Ｄ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，６９２１−５）。例えば、表VIIIは、ｃ−ｍ ｙｂハンマーヘッド５７５のアーム長さの変種がＳＭＣ増殖を阻害する能力を示 す。この実験において用いた用量（０．１μＭ）は、上述の実験より３倍低いこ とに注目されたい。この濃度においては、７／７アーム変種は比較的低い阻害を 示した。この場合、阻害の程度はアーム長さの増加に伴って増加する。 最適アーム長さは、部位特異的でありうるし、それぞれのリボザイムについて 経験的に決定すべきである。この目的のため、３つの異なる切断部位を標的とす る、７ヌクレオチドの結合アームを有するハンマーヘッドリボザイム（７／７） および１２ヌクレオチドの結合アームを有するリボザイム（１２／１２）を比較 した。 実施例６に記載のように、リボザイムを０．２μＭで、オリゴヌクレオチド対 カチオン性脂質の電荷比１：１でカチオン性脂質ＤＭＲＩＥとともに送達した。 データは以下の表IXに示す。示されるように、１２ヌクレオチド結合アームを有 する３つすべてのリボザイムは平滑筋細胞増殖の増強された阻害を示した。それ ぞれのリボザイムはその触媒的に非活性な対照より高い阻害を示し、ここでもリ ボザイムがｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断するその能力を介して機能していることが 示された。この実験においては、１０％の刺激は５４±２％の細胞増殖をもたら し、刺激されていない細胞は８±０．５％の細胞増殖を示した。実施例１１：リボザイム活性に及ぼすクロロキンの影響 エンドソームを通る高分子の移動に影響を与える多くの物質がＤＮＡの細胞へ の送達の効率を高めることが示されている。これらには、塩化アンモニウム、カ ルボニルシアニドｐ−トリフルオトメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、 クロロキン、モネンシン、コルチシンおよびウイルス粒子（Ｃｏｔｔｅｎ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７ ，４０３３−４０３７；Ｃｏｔｔｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｊ．Ｖｉｒ ｏｌ．，６７，３７７７−３７８５；Ｃｏｔｔｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９ ２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ，８９，６０９４−６０９ ８；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，２１２２−６；Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８ ，８８５０−８８５４；Ｅｇｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．１９８４，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１５５，９−１６；Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，１９９ ３，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９，４４１−７ ；Ｓｅｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，９３３− ４０；Ｚｅｎｋｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９）があるが、これらに限定され るものではない。ＤＮＡはエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、エンド ソーム中でＤＮＡが蓄積されると考えられている（Ａｋｈｔａｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２，１３９−１４４）。すなわち、上述の試薬はエンドソームからのＤＮＡ放出 を促進することによりＤＮＡ発現を促進するのであろう。このような試薬がＲＮ Ａおよびリボザイムの平滑筋細胞への機能的送達を増大させるか否かを判定する ために、平滑筋細胞増殖のリボザイム阻害に及ぼすクロロキンの影響を評価した 。実施例６に記載のように、ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断する１２ヌクレオチド結 合アームを有するリボザイムをラット平滑筋細胞に送達した（０．２μＭリボザ イム ；ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥと１：１電荷比で複合体化）。いくつかの場合において は、細胞の刺激の際に１０μＭクロロキンを添加した。クロロキンの添加は非処 理細胞には影響を及ぼさなかった（クロロキンの存在下または非存在下で１０％ 血清で刺激すると、それぞれ８０．５±１．５％および８３±２％の細胞増殖； クロロキンの存在下または非存在下での非刺激細胞はそれぞれ７±０．５％およ び７±１％の細胞増殖）。以下の表Ｘに示されるように、クロロキンの添加は平 滑筋細胞増殖のリボザイム阻害を２倍から３倍増大させた。実施例１２：ヒト平滑筋細胞増殖に及ぼすハンマーヘッドリボザイムの影響 ヒトｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを部位５４９で切断するハンマーヘッドリボザイムが ヒト大動脈平滑筋細胞増殖を阻害する能力を試験した。このリボザイムのための 結合部位は、マウスとヒトのｃＤＮＡ配列の間で完全に保存されている。ヒト大 動脈平滑筋細胞（ＡＯＳＭＣ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓから入手し、ＳｍＧＭ（Ｃ ｌｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標））で成長させた。５または６代目の細胞をアッセ イに用いた。増殖アッセイの条件は、ラット細胞の場合と同一であるが（実施例 ６を参照のこと）、ただし細胞はＳｍＧＭ中に播種し、０．５％ＦＢＳを含むＳ ｍＢＭ中で飢餓状態とした。部位５４９を切断するリボザイムをカチオン性脂質 ＤＭＲＩＥと１：１の電荷比で複合体化させ、種々の用量で送達した。この実験 においては、１０％ＦＢＳ（リボザイムなし）は５７±７％の増殖を誘導し、誘 導されないバックグラウンドは６±１％の増殖であった。表ＸＩの結果は、ラッ ト平滑筋細胞について見られたものと同様の濃度範囲にわたって阻害が観察され たことを示す。実施例１３：修飾して安定化したリボザイムの直接添加による阻害 部位５７５を切断する、１２ヌクレオチド結合アームを有するハンマーヘッド リボザイムを化学的に合成した（配列番号１２７，表III）。触媒活性に大きく 影響することなく血清中でのリボザイムの安定性を増強することが示されている 化学的に修飾したヌクレオチドをこのリボザイムに取り込ませた。Ｅｃｋｓｔｅ ｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５，Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４４，５６５−５６８，Ｐｉｅｋｅｎ， Ｗ．ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，３１４−３１７，Ｕｓｍ ａｎ， Ｎ．；Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｒ．Ｊ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１７，３３４−３３９，Ｕｓｍａｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．米 国特許出願０７／８２９，７２９，およびＳｐｒｏａｔ，Ｂ．欧州特許出願９２ １１０２９８．４を参照のこと。これらは酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に行うこと ができる種々の化学的修飾を記載する。これらのすべての刊行物を本明細書の一 部としてここに引用する）。用いた修飾は次のとおりである。リボザイムのすべ てのヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル基を含むが、以下の例外がある：Ｕ４およ びＵ７は２’−アミノ置換を含み；Ｇ５、Ａ６、Ｇ８、Ｇ１２、およびＡ１５． １は２’−ＯＨリボヌクレオチドを含む（番号づけは図１にしたがう）。Ｇ５お よびＡ１４が２’−Ｏ−メチルUで置換されている非活性リボザイムを化学的に 合成した。実施例６にしたがって、リボザイムを指示された濃度でラット平滑筋 細胞に添加したが、ただしカチオン性脂質は用いなかった。増殖はＢｒｄＵ取り 込みおよび染色により評価した。表ＸIIは、修飾されたリボザイムが、カチオン 性脂質を添加せずにラット平滑筋細胞の増殖を阻害Ｕうることを示す。この実験 においては、１０％血清は４５±２％の増殖を誘導し、非誘導細胞は２．３±０ ．１％の増殖のバックグラウンドを示した。リボザイム活性の最適化 上述の実施例に記載したように、ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断するリボザイムは 血清に応答する平滑筋細胞の増殖を５０％阻害することができる。この阻害のレ ベルは、リボザイムについて得ることができる最大の効果ではない。それぞれの 用量応答実験において、最高の用量が最大の阻害の程度を生じた。すなわち、細 胞中におけるリボザイム活性の最適化および／またはリボザイムの細胞への送達 の最適化は、阻害の程度を増大させることが予測される。 表VIIIおよびIXは、リボザイム活性を最適化する１つの手段を示す。リボザイ ム結合アーム（ステムＩおよびIII，図２ｃを参照のこと）の長さを変更するこ とにより、リボザイムが平滑筋細胞増殖を阻害する能力は非常に増大する。増加 したアーム長さを有するリボザイムは、１つまたは２つの部分として化学的に合 成することができ（上述およびＭａｍｏｎｅ，米国特許出願０７／８８２，６８ ９，１９９２年５月１１日出願を参照のこと、これを本明細書の一部としてここ に引 用する）、またはインビトロ転写（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．米国特許４，９８７ ，０７１を参照のこと）により合成することができる。血清リボヌクレアーゼに よる分解を防止する修飾を有するリボザイムを化学的に合成する（上述の実施例 １３に記載のように）。２つの部分として合成する場合、フラグメントをライゲ ーションさせるかまたは上述のように並置させる（原出願およびＭａｍｏｎｅ（ 上掲）を参照のこと）。平滑筋細胞増殖に及ぼすリボザイムの影響を、上述の実 施例６および１２に記載のように評価する。ステムＩおよびIIIの長さが標的へ のハイブリダイゼーションおよび触媒速度に影響しうるため、それぞれのリボザ イムのアーム長さを細胞における最大の阻害効果について最適化する。同様に、 安定化リボザイムにおける修飾ヌクレオチドの正確な配列は細胞における活性に 影響しうる。安定化修飾の性質は、細胞における最大の阻害効果について最適化 する。それぞれの場合において、リボザイムがｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断する活 性を、その触媒的に非活性な対照（Ｇ５を２’−ＯメチルＵで、およびＡ１４を ２’−Ｏ−メチルＵで置換）、および関連のないＲＮＡを標的とするリボザイム （適当な修飾を有する同一の触媒活性コア、異なる結合アーム配列）の活性と比 較する。 Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ ａｌ．（上掲）は、酵素的ＲＮＡ分子を送達する一 般的方法を記載する。実施例９に記載されるデータは、異なるカチオン性脂質が 活性なリボザイムをラット平滑筋細胞に送達しうることを示す。これらの実施例 において、リポフェクタミンとともに送達された０．６μＭのリボザイムはＤＭ ＲＩＥとともに送達された０．３μＭのリボザイムと同一の阻害的効果を示した 。すなわち、ＤＭＲＩＥは活性なリボザイムの平滑筋細胞への送達においてリポ フェクタミンの２倍効力が高い。核酸を細胞に送達するために使用しうる多くの 他のカチオン性脂質が当業者に知られている。これらには、例えば、ジオクタデ シルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジオレオリルトリメチルアンモニ ウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プ ロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ− ［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒ ドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）およびＮ−［１−（２，３ −ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシプロピ ルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ−ＨＰ）があるが、これらに限定されるも のではない。実施例９で行った実験と類似の実験を用いて、いずれの脂質がリボ ザイムの平滑筋細胞への最適な送達を与えるかを決定する。他のそのような送達 方法は、当該技術分野において知られており、本発明において用いろことができ る。 実施例１１に記載されるデータは、リボザイム送達および効力が細胞性エンド ソーム代謝を破壊または変更する薬剤により増大しうることを示す。クロロキン がリボザイムが平滑筋細胞増殖を阻害する能力を２倍から３倍増大させることが 示された。実施例１１に記載される実験と類似の実験を行って、リボザイム単体 の送達（実施例１３に記載のように）、または異なるカチオン性脂質（実施例９ に記載のようにおよび上述のように）もしくは他の送達剤（以下に記載のように ）の存在下での送達を増大させるために用いられるクロロキンの最適濃度を決定 することができる。エンドソームを破壊または変更する当業者に知られる他の薬 剤を用いて、同様にリボザイム効果を増大させることができる。これらの薬剤と しては、塩化アンモニウム、カルボニルシアニドｐ−トリフルオロメトキシフェ ニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、クロロキン、モネンシン、コルチシン、両親媒性 ペプチド、ウイルス蛋白質およびウイルス粒子が挙げられるが、これらに限定さ れるものではない。このような化合物を、上述のようにリボザイムとともに用い て、またはリボザイムに化学的に直接コンジュゲートさせて、またはリポソーム に化学的に直接コンジュゲートさせて、またはリボザイムとともにリポソーム粒 子中に取り込ませることができる（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ ａｌ．，上掲，本 明細書の一部としてここに引用する）。 実施例１３に示されるデータは、化学的に安定化したリボザイムを直接添加す ることにより平滑筋細胞の増殖を阻害しうることを示す。 おそらくは、取り込みはアニオン性拡散の細胞膜を横切る受動拡散により媒介 される。この場合、リガンドをリボザイムに直接カップリングさせることにより 効力は非常に増強するであろう。次に、レセプター媒介性取り込みによりリボザ イムを細胞に送達する。このようなコンジュゲート付加物を用いて、リボザイム 切断活性に必要なホスホジエステル結合を変更することなく細胞取り込みを数桁 増加させることができる。 あるいは、当業者に知られる種々の方法を用いてリボザイムを細胞に投与する ことができる。例えば、リポソーム中へのカプセル化、イオン浸透療法または他 のベヒクル（例えばヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル および生物接着性ミクロスフェア）への取り込みが挙げられるが、これらに限定 されるものではない。ＲＮＡ／ベヒクルの組み合わせを、直接注射またはカテー テル、注入ポンプまたはステントを用いて局所的に送達する。送達の別の経路と しては、筋肉内注射、エアロゾル吸入、経口（錠剤または丸薬の形）、局所的、 全身的、眼内、腹腔内、および／または鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）が挙げ られるが、これらに限定されるものではない。リボザイム送達および投与のより 詳細な記述は、Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ ａｌ．（上掲）およびＤｒａｐｅｒ， ｅｔ ａｌ．（上掲）において提供されており、これを本明細書の一部としてこ こに引用する。実施例１４：ホスホロチオエート結合はリボザイムが平滑筋細胞増殖を阻害する 能力を増強する 実施例１３に示されるように、部位５７５でｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断するハ ンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムを修飾して、触媒活性を維持しながらヌクレア ーゼ耐性を与えることができる（Ｕｓｍａｎｅｔ ａｌ．（上掲）も参照のこと ）。細胞において最適な活性を有するリボザイムを同定するために、いくつかの 異なる化学的に修飾されたリボザイムをラット平滑筋細胞増殖の阻害について直 接比較した。用いた化学的に修飾したリボザイムの非限定的例を図９Ａに図示す る。１つのリボザイム（”２’−Ｏ−メチル”と称される）は、それぞれの標的 結合アーム（ステムＩおよびIII）の末端の５つのヌクレオチドを除くすべての 位置にリボヌクレオチド残基を含む。”２’−Ｏ−メチルＰ＝Ｓ”と称されるリ ボザイムはさらに、それぞれの標的結合アームの末端ヌクレオチドの間にさらに ５つのホスホロチオエート結合を含む。”２’−Ｃ−アリルｉＴ”と称されるリ ボザイムは、実施例１３において特定される３０個の２’−Ｏ−メチルヌクレオ チドを含む。リボザイムはまた、Ｕ４位に２’−Ｃ−アリルＵ（Ｕｓｍａｎ ｅ ｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１ ， １６３）を、Ｕ７位に２’−Ｏ−メチルＵを、そして分子の３’末端に３’−３ ’−結合反転チミジン（Ｏｒｔｉｇａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓ ｅｎｓｅ Ｒｅｓ．＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２，１２９；Ｓｅｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，カナダ特許出願２，１０６，８１９）を含む（２’−Ｃ−アリ ルｉＴと称する）。第４のリボザイムは、上述と同一の２’−Ｏ−メチルおよび ２’Ｃ−アリル残基を含み、さらにそれぞれの標的結合アームの末端ヌクレオチ ド間に５つのホスホロチオエート結合を含む（”２’−Ｃ−アリルＰ＝Ｓ”と称 する）。 リボザイムをカチオン性脂質の複合体として平滑筋細胞に送達した（Ｓｕｌｌ ｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（上掲））。この例においては、カチオン性脂質である リボフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を荷電脂質濃度３．６μＭで用いた（ 実施例６および９を参照のこと）。それぞれのリボザイムの活性型対非活性型を 比較して、阻害がリボザイム切断により特異的に媒介されるか否かを判定した。 図９Ｂに示されるように、２’−Ｃ−アリル修飾およびホスホロチオエート結合 を有するように合成されたリボザイムは、平滑筋細胞増殖の増大した阻害を示し た。触媒的に非活性な型のリボザイムは細胞増殖にほとんど影響しなかった。す なわち、観察された阻害にはリボザイムの触媒活性が必要である。これに対し、 安定な２’−Ｏ−メチル−および２’−Ｃ−アリル−修飾触媒コア（２’−Ｏメ チルおよび２’−Ｏ−メチルＰ＝Ｓ）を有しないリボザイムは、最大で中程度の 平滑筋細胞増殖の阻害しか示さなかった。安定なコア化学のみではリボザイム媒 介性阻害を非常に増強させるには十分ではなかった。末端Ｐ＝Ｓ結合のない２’ −Ｃ−アリル−修飾リボザイムは、その非活性リボザイム対照と比較してほとん ど特異的阻害を示さなかった。これらの結果は、ある種の化学的修飾が、外的送 達されたリボザイムがｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断し細胞増殖に影響を与える能力 を非常に増大させることを示す。実施例１５：化学的に修飾されたリボザイムの用量応答 種々の用量の２’−Ｃ−アリルＰ＝Ｓ修飾リボザイムを、上述のようにラット 大動脈平滑筋細胞に送達した。先の実施例に記載のように、活性なリボザイムの 効果を非活性リボザイムの効果と比較することにより、阻害のパーセントを計算 した。図１０に示されるように、細胞増殖を５０％阻害するリボザイム濃度（Ｉ Ｃ₅₀）は約７０ｎＭであった。日によってＩＣ₅₀値は２５と１００ｎＭの間であ った。実施例１６：リボザイムおよびアンチセンスＤＮＡの効果の直接比較 リボザイムは、その触媒活性および切断部位のまわりの厳密な配列的要件のた め、アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも特異的に遺伝子発現を阻害する薬剤 であると考えられる（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ａｄｖ ．ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５，２８９）。この仮説を試験するために、リ ボザイム活性をｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡの同一の部位を標的とするホスホロチオエ ートＤＮＡオリゴヌクレオチドの活性と直接比較した。用いたリボザイムは上述 の実施例１４に記載の２’−Ｃ−アリルＰ＝Ｓ修飾リボザイムであった。このリ ボザイムはｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡの１５ヌクレオチド長さの領域に結合する。し たがって、１５ヌクレオチドのアンチセンスホスホロチオエートＤＮＡ分子を製 造した。同じ１５ヌクレオチドのランダムにスクランブルした配列を有するホス ホロチオエートＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびランダムにスクランブルした標 的結合アーム配列を有する２’−Ｃ−アリルＰ＝Ｓ修飾リボザイムを対照として 合成した（ネズミｃ−ｍｙｂ ｃＤＮＡ配列との比較から、スクランブル対照は ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡのいかなる領域にも結合しないことが予測される）。アン チセンス阻害剤としてはより長いホスホロチオエートＤＮＡオリゴヌクレオチド がしばしば用いられるため（総説としては、Ｗａｇｎｅｒ，１９９４ Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ３７２，３３３を参照のこと）、対称におかれた２５ヌクレオチドのホ スホロチオエートＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそのスクランブ ル配列対照もまた合成した。リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド を、カチオン性脂質であるリボフェクタミンとの複合体としてラット平滑筋細胞 に送達し、続いて血清刺激平滑筋細胞の増殖を測定した。 図１１に示されるように、２’−Ｃ−アリルＰ＝Ｓ修飾リボザイムは、いずれ のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも高い平滑筋細胞の増殖の阻害を示した 。さらに、スクランブルしたアームのリボザイムおよび非活性リボザイム対照は 、いずれのスクランブル配列アンチセンス対照オリゴヌクレオチドよりも低い非 特 異的阻害を示した。実際、２５ヌクレオチドのホスホロチオエート分子が示した 非特異的阻害は、アンチセンス分子の特異的効果を完全にマスクした。ｃ−ｍｙ ｂ ｍＲＮＡの他の部位を標的とするホスホロチオエートＤＮＡについても同様 の結果が得られた。すなわち、ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断するリボザイムは、ホ スホロチオエートアンチセンスＤＮＡ分子より強力かつより特異的な平滑筋細胞 増殖の阻害剤である。実施例１７：ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡの異なる部位を標的とする化学的に修飾した リボザイムは平滑筋細胞増殖を特異的に阻害する 観察された平滑筋細胞増殖の阻害がｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡのリボザイム切断に より媒介されるならば、同一のｍＲＮＡを標的とする他のリボザイムも同一の効 果を有するはずである。ｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡの２つの本質的に異なる部位を標 的とする、２’−Ｃ−アリルＰ＝Ｓ修飾を有する２つの他のリボザイム（部位５ ４９および１５５３；リボザイム配列番号１０２および１１２）を実施例１４に 記載のように合成した。新たな標的配列のそれぞれに対応する非活性リボザイム 対照も合成Ｕた。部位５４９、５７５および１５５３を標的とする化学的修飾リ ボザイムをラット平滑筋細胞に送達し、血清刺激細胞増殖を阻害するその能力を 評価した。部位５４９、５７５および１５５３を標的とする活性なリボザイムに ついて、同等のレベルの阻害が得られた（図１２を参照のこと）。非活性リボザ イムはいずれも細胞増殖を阻害しなかった。ｃ−ｍｙｂに存在しない他のｍＲＮ Ａ配列を標的とする活性なリボザイムまたはスクランブルされたアーム配列を有 するリボザイムも平滑筋細胞の増殖を阻害しなかった（図１２を参照のこと）。 すなわち、細胞増殖の阻害には、アクセス可能なｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡ配列に結 合しうる触媒的に活性なリボザイムが必要であり、かつこの阻害はリボザイム切 断によるｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡレベルの減少によるもののようである。 実施例１８および1９は、効力に必要なホスホロチオエート残基の位置および 最小数を決定するために設計された実験を記載する。実施例１８：リボザイム阻害に及ぼすホスホロチオエート結合の位置の影響 ２’−Ｃ−アリル修飾を有し、かつリボザイム中の種々のヌクレオチド間にホ スホロチオエート結合を有する、ｃ−ｍｙｂの部位５７５を標的とするリボザイ ムを合成した。１つのリボザイムは全部で１０個のホスホロチオエート結合（ス テムＩ中に５個およびステムIII中に５個）を含み、上述の実施例１４−１７に 記載したリボザイムと同一である（図１３Ａにおいて１０Ｐ＝Ｓ５’および３’ と表す）。１つのリボザイムはステムIII中に５個のホスホロチオエート結合の みを有する（図１３Ａにおいて５Ｐ＝Ｓ３’と表す）。別のリボザイムは、ステ ムIIの最後の塩基対とＧＡＡＡループを含む６個のヌクレオチドの間に５個のホ スホロチオエート結合を含む（図１３Ａにおいて５Ｐ＝Ｓループと表す）。第４ のリボザイムは、ステムＩ中に５個のホスホロチオエート結合を含む（図１３Ａ において５Ｐ＝Ｓ５’と表す）。後者の２つのリボザイムはまた、リボザイムを ３’エキソヌクレアーゼから保護するために３’末端において３’−３’チミジ ンを含むように合成した（Ｏｒｔｉｇａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉ ｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２，１２９；Ｓｅｌｉｇｅ ｒ ｅｔ ａｌ．，カナダ特許出願２，１０６，８１９）。これらの４つの異な るリボザイムの構造を図１３Ａに図示する。非活性リボザイム対照をそれぞれの リボザイムについて合成した。活性および非活性リボザイムをＲＮＡ／リポフェ クタミン複合体としてラット平滑筋細胞に適用し、細胞増殖に及ぼすこれらの影 響を測定した。 図１３Ｂを参照すると、ステムＩ中に５個のホスホロチオエート結合および３ ’反転チミジンを有するリボザイムは平滑筋細胞増殖を阻害し、合計１０個のホ スホロチオエート結合を有する親リボザイムも阻害した。他のいずれのリボザイ ムも、活性と非活性対照との間に有意な相違を示さなかった。したがって、３’ 反転Ｔは、ステムIII内の５個のホスホロチオエート結合を有効に置き換えるこ とができる。ループ位置中のホスホロチオエート結合は平滑筋細胞増殖の非特異 的阻害をもたらし、一方、ステムＩ中のホスホロチオエート結合は細胞における 増大した効力に必要である。さらに、これらの結果は、外的３’−エキソヌクレ アーゼ分解からの保護を維持しつつ、毒性を最小にし、化学合成を容易にするた めに、ｉＴなどの３’−末端修飾がリボザイム中に含まれるホスホロチオエート の量を最小化するのに望ましいことを示唆する。実施例１９：ステムＩ中のホスホロチオエート結合の最小化 リボザイム中のホスホロチオエート結合が少ないほど化学合成の複雑性および コストが減少する。さらに、ホスホロチオエートＤＮＡ分子は、細胞機能に対し ていくつかの望ましくない非特異的な影響を有することが知られている（総説と しては、Ｗａｇｎｅｒ（上掲）を参照のこと）。これらのＲＮＡ分子中のホスホ ロチオエート結合を減少させればその特性が増強されることが予測される。ｃ− ｍｙｂを標的とする一連のリボザイムを合成して、ステムＩ中のいくつのホスホ ロチオエート結合が最適リボザイム活性に必要であるかを決定した。リボザイム は、ステム１中に、第１と第２ヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合から 始まり３’方向にのびるように、５，４，３，２，または１個のホスホロチオエ ート結合を含有した。それぞれのリボザイムは、上述したように、２’−Ｏ−メ チル修飾、Ｕ４ ２’−Ｃ−アリルヌクレオチドおよび、３’末端に反転Ｔヌク レオチドを含有した。これらのリボザイムのそれぞれの活性を、１０個のホスホ ロチオエート結合（ステムＩおよびIIIにそれぞれ５個）を有するリボザイム（ 図１４において１０Ｐ＝Ｓと称される）の活性と比較した。活性および非活性リ ボザイムをリポフェクタミンとの複合体としてラット平滑筋細胞に適用し、平滑 筋細胞増殖に及ぼすこれらの影響を２つの別々の実験において測定した。結果は 図１４に図示する。１０、５および４個のホスホロチオエート結合を有するリボ ザイムは同等の効力を示した。４個より少ないホスホロチオエート結合を有する リボザイムもまた効力を示したが、平滑筋細胞増殖の阻害のレベルは中程度に減 少した。実施例２０：ステムＩおよびIIIの長さの変更 ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを５７５位で切断するリボザイムを種々のアーム長さで合 成した。それぞれのリボザイムは、上述のように、５’末端に４個のホスホロチ オエート結合、２’−Ｏメチルおよび２’−Ｃ−アリル修飾および３’末端に反 転チミジンヌクレオチドを含有した。図１５は、これらのリボザイムのラット平 滑筋細胞増殖に及ぼす影響を示す。リボザイムは１００ｎＭでカチオン性脂質と ともに送達した。６／６，７／７および５／１０アームを有するリボザイム（こ こでｘ／ｙは、ステムＩ中のヌクレオチド／ステムIII中のヌクレオチドを示す ；図２を参照のこと）はすべて同等の効力を示した。図１５に示されるように、 よ り短い結合アームを有するリボザイムと比較した場合、より長いアーム長さを有 するリボザイムはより非特異的な阻害を示す傾向にあった（より長い結合アーム を有する非活性リボザイム対照は平滑筋細胞増殖を阻害した）。これらのデータ から、６／６，７／７，５／１０，１０／５，８／８および１０／１０ヌクレオ チドアームを有するリボザイムはすべて特異的に平滑筋細胞増殖を阻害したこと が明らかであるが、最適の阻害は６／６，７／７および５／１０ヌクレオチドア ームについて観察された。実施例２１：異なる修飾ヌクレオチドを有するリボザイムは平滑筋細胞増殖を阻 害する ステムＩおよびIIIの両方に７個のヌクレオチド、５’末端に４個のホスホロ チオエート残基および３’末端に３’−３’反転チミジンを含むリボザイムを、 ＨＨリボザイムのコア中のＵ４およびＵ７位に種々の修飾ヌクレオチドを有する ように合成した。修飾した触媒コア化学のすべてがリボザイム活性を保持し、血 清ヌクレアーゼに対する増加した安定性を示した（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４（上掲））。Ｕ４ ２’−Ｃ−アリルと称されるリボザイムは、Ｕ４位 に２’−Ｃ−アリルウリジンを、Ｕ７位に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む 。Ｕ４，Ｕ７ ２’−アミノと称されるリボザイムは、Ｕ４およびＵ７の両方に ２’−アミノヌクレオチドを含む。Ｕ４ ２’−フルオロと称されるリボザイム は、Ｕ４に２’−フルオロ修飾ヌクレオチドを、Ｕ７に２’−Ｏ−メチルを含む 。Ｕ４ ６−メチルと称されるリボザイムは、Ｕ４に６−メチルウリジンヌクレ オチドを、Ｕ７に２’−Ｏ−メチルを含む。Ｕ４デオキシ脱塩基と称されるリボ ザイムはデオキシリボース部分を含み、Ｕ４で塩基を欠失しており（Ｂｅｉｇｅ ｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈ ｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ４，１７１５）、Ｕ７に２’−Ｏ−メチルを含む。化学 的に修飾されたリボザイムのそれぞれの活性および非活性化合物を、上述のよう にリポフェクタミンを用いてラット平滑筋細胞に適用した。図１６に図示される ように、ヌクレアーゼに安定な化学的に修飾されたリボザイムはすべて、ラット 平滑筋細胞増殖の有意な阻害を示した。すなわち、平滑筋細胞におけるリボザイ ム活性の要件は、エンドヌクレアーゼ分解を最小化するために修飾した触媒的コ ア、およ びエキソヌクレアーゼ分解を防止する５’および３’末端における修飾であるよ うである。 本発明において記載される化学的修飾は、非限定的例を意味するものであり、 当業者は、リボザイムのヌクレアーゼ安定性を増強するために標準的技術を用い て他の修飾（塩基、糖、およびホスフェート修飾）を容易に生成しうること、し たがって、これらも本発明の範囲内に含まれることを認識するであろう。実施例２２：ブタ平滑筋細胞増殖のリボザイム阻害 一般的に用いられるバルーン血管形成術後の内膜過形成の動物モデルのうち、 ブタモデルがヒトの疾患を最も予測しうるものであると考えられている（Ｓｔｅ ｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．５７，１０５；Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，７８１；Ｂａｒｉｎｇａ ，１９９４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，７３８）。したがって、本発明者らは、 ｃ−ｍｙｂリボザイムがブタの平滑筋細胞増殖を阻害する能力を評価しようとし た。ユカタンブタ平滑筋細胞（ＹＳＭ）はＤｒ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｎａｂｅ ｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎ ｔｅｒ）から入手し、ダルベッコ改良イーグル培地で上述のように成長させた（ 実施例６を参照のこと）。ＹＳＭ細胞を０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で７２ 時間飢餓状態とした。活性および非活性リボザイム（５’末端に４個のホスホロ チオエート結合、２’−Ｃ−アリル修飾コア、および３’末端に３’−３’反転 チミジン）を、上述の実施例に記載のようにＲＮＡ／リポフェクタミン（登録商 標）複合体として適用した。血清で増殖を刺激し、ＢｒｄＵ取り込みにより評価 した。図１７は、７５ｎＭ程度の低い用量のリボザイムがブタ平滑筋細胞増殖を ６０％も阻害しうることを示す。ブタ平滑筋細胞増殖の有意かつ再現性のある阻 害を得るためには、上述の実施例においてラット細胞の阻害に必要であることが 示されたものと同一の化学修飾のリボザイム（２’修飾，安定なコア，５’ホス ホロチオエート結合および３’反転チミジン）が必要である。実施例２３：ヒト平滑筋細胞増殖のリボザイム阻害 実施例１２においては、ｃ−ｍｙｂの部位５４９に対する最小に修飾されたリ ボザイムがヒト平滑筋細胞の増殖を有意に阻害しうることが示された。上述で特 徴づけられた、ｃ−ｍｙｂの部位５７５を標的とする２’−Ｃ−アリルおよびホ スホロチオエート修飾リボザイムをヒト平滑筋細胞にＲＮＡ／リポフェクタミン （登録商標）複合体として適用した。非活性リボザイムおよび非活性のスクラン ブルアームリボザイムを対照として適用した。２００ｎＭでは、活性なリボザイ ムはヒト平滑筋増殖を７５％以上阻害し、一方非活性リボザイムは増殖を３８％ しか阻害しなかった。スクランブル結合アーム配列を有するリボザイムは阻害で きなかった。１００ｎＭでは、活性なリボザイムは依然として有意な阻害を示し たが、非活性およびスクランブル対照のいずれも細胞増殖を阻害しなかった（図 １８を参照のこと）。すなわち、これらの研究で同定された活性なリボザイムは 、ヒト平滑筋細胞増殖の有意な阻害を媒介し、これが再狭窄および／または血管 疾患の新規な治療薬であることを示す。実施例２４：ｃ−ｍｙｂリボザイムのインビボでの血管への送達 ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを部位５７５で切断するリボザイムを２つの部分として合 成し（Ｍａｍｏｎｅ，上掲）、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて内部５’末端 を³³Ｐで標識し、２つのフラグメントをＲＮＡリガーゼでライゲーションした。 得られたＲＮＡは内部³³Ｐ標識を有する無傷のリボザイムであった。この内部標 識リボザイムを、記載されるようにラットのバルーン傷害頸動脈に送達した（Ｓ ｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５９，６７）。ラット を麻酔し、頸動脈を外科的に暴露させた。外頸動脈を切開し、２Ｆフォガーティ バルーンカテーテルを挿入し、頸動脈に向けた。傷害は、バルーンの繰り返し（ ３回）の膨張および収縮により行った。傷害を有する領域を結紮により単離し、 外頸動脈にカニューレを挿入した。リボザイム単独（２つのラット血管）または リボザイム／リポフェクタミン（登録商標）複合体（２つのラット血管）を、力 ニューレを通して傷害を有する血管に適用し、血管中に２０分間おいた。適用後 、結紮を除去することにより血流を５分間回復させ、血管を回収して、以下に記 載のように処理した。 半分の血管を液体窒素で凍結し、微細粉末に破砕し、標準的プロトコールを用 いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲルに適用し 、電気泳動に供した。ゲルのオートラジオグラフィにより³³Ｐ標識を検出し、そ れ ぞれのバンドの放射活性の量をホスファーイメージングシステムにより定量した 。同一のゲルに流した標識したリボザイム対照との直接比較により、抽出された 無傷のリボザイムの量を計算した。無傷で送達されたリボザイムのパーセンテー ジは、無傷リボザイム対照と共に移動する標識のパーセンテージを定量すること により見積もった。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でリボザイムを送達した後、³³ Ｐ標識の３％がラット血管から回収され、標識の９０％以上が無傷リボザイムの 形で存在した。ＲＮＡ／リポフェクタミン複合体でリボザイムを送達した後、³³ ｐ標識の１０から１１％がラット血管から回収され、標識の２０から９０％が無 傷リボザイムの形で存在した。無傷リボザイムの有意な取り込みは、修飾リボザ イムの動脈壁への局所送達が実施可能であることを示す。 それぞれの血管の残りの半分をＰＢＳ緩衝２％グルタルアルデヒド中で固定し 、切片化してスライド上におき、エマルジョンで被覆した。４日間オートラジオ グラフィを行った後、エマルジョンを現像し、標準的技術により切片をヘマトキ シリンおよびエオシンで染色した（Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上 掲））。切片を調べた結果、リボザイムの適用後、大部分のグレインが内側平滑 筋細胞上に存在することが示された。下層の外膜でもある程度の³³Ｐ標識が検出 された。リボザイムをリポフェクタミンとともにまたはなしで送達した場合、同 様の密度および分布のグレインが観察された。これらのデータは、リボザイムが 傷害を有する血管壁に侵入することができ、平滑筋細胞中で近くに並置されてい るかまたは下層の内側平滑筋細胞中に存在することを示す。すなわち、血管疾患 の治療のために、治療的リボザイムを血管に局所的に送達することができる。 同様の実験をブタ腸骨大腿骨血管で行った。バルーン傷害の後、上述のように³³ Ｐで内部標識したリボザイムをダブルバルーンカテーテル装置で送達した（Ｎ ａｂｅｌ ａｎｄ Ｎａｂｅｌ，上掲；Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４（上 掲））。２０分後、バルーンを収縮させることにより血流を回復させた。さらに １時間後に血管を回収し、または外科的傷害を縫合して１日後に血管を回収した 。回収した血管を切片化し、オートラジオグラフィおよび染色に供した。送達の １時間後、大部分の³³Ｐ標識を培地中、上層または平滑筋細胞内で検出すること ができた。血管の管腔表面および外膜組織中でもある程度の標識が検出された。 送 達の１日後でも、残りの内側平滑筋細胞に付随するグレインが検出された。リポ フェクタミン（登録商標）とともにまたはなしで送達されたリボザイムの間には 、密度または分布の大きな相違は観察されなかった。これらのデータは、臨床的 にヒト血管疾患に関連のあある大動物モデルにおいて、傷害を有する血管の平滑 筋細胞にリボザイムを局所的に送達しうることを示す。実施例２５：ラット平滑筋細胞におけるｃ−ｍｙｂ ＲＮＡレベルのリボザイム 媒介性減少 リボザイムが哺乳動物細胞においてｃ−ｍｙｂ ＲＮＡの切断を触媒するか否 かを決定するために、本発明者らは、高感度の定量的競合ポリメラーセ連鎖反応 （ＱＣＰＣＲ）を用いて、触媒的に活性または非活性のリボザイムのいずれかで 処理したラット平滑筋細胞におけるｃ−ｍｙｂ ＲＮＡのレベルをアッセイした 。 ラット平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）を上述のようにリボザイムで処理した。４時 間のリボザイム処理の後、細胞を１０％血清（ＢｒｄＵの存在または不在下）で 刺激した。２４時間後、細胞を回収してさらなる分析を行った。ＢｒｄＵで処理 した細胞は、上述のように増殖についてアッセイした。ＢｒｄＵで処理していな い細胞はＱＣＰＣＲアッセイに用いた。 以下は、ＲＡＳＭＣからのｃ−ｍｙｂ ｍＲＮＡのレベルを、構成遺伝子であ るＧＡＰＤＨで標準化して定量するために用いたＱＣＰＣＲ技術の簡単な記載で ある。この方法は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｂｌｏｏｄ ７９：１６９２，１９９ ２）により用いられた。簡単には、グアニジウムイソチオシアネート技術（Ｃｈ ｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２：１５６，１９８７））を用いてＲＡＳＭＣから全Ｒ ＮＡを単離した。欠失競合剤および対照野生型ＲＮＡを構築するために、ラット ｃ−ｍｙｂメッセージのｃＤＮＡクローン（ｐｃ８ｍｙｂと称される）を用いた 。競合ＲＮＡは５０塩基の欠失を含み、野生型細胞ＲＮＡより小さく、ヌクレオ チド４２８からヌクレオチド７５３までのびる。 構成遺伝子であるＧＡＰＤＨ（ＲＡＳＭＣにより構成的に発現される）をＱＣ ＰＣＲアッセイの内部対照として用いた。ＧＡＰＤＨの欠失競合剤および野生型 対照は、ｃ−ｍｙｂについてのものと同様に作成した。ＧＡＰＤＨ含有プラスミ ド（ｐＴｒｉ−ＧＡＰＤＨ）はＡｍｂｉｏｎから購入した。ＧＡＰＤＨ競合剤は また、５０塩基を欠失する欠失変異体である。ＧＡＰＤＨ競合剤を用いて、それ ぞれの標本におけるこの構成遺伝子の量を定量して、細胞性ＲＮＡの一体性およ びＲＮＡ単離の効率を確認した。ｃ−ｍｙｂ発現のレベルのすべての定量は、同 一の細胞標本におけるＧＡＰＤＨ発現のレベルで標準化した。 図１９を参照すると、安定化した触媒的に活性な５７５ＨＨリボザイムで処理 したＲＡＳＭＣはよく増殖しなかった。触媒的に非活性な５７５ＨＨリボザイム による細胞増殖の２５％の阻害と比較したとき、ＲＡＳＭＣ増殖は７０％以上阻 害された。ＲＡＳＭＣ増殖の阻害のレベルは、ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡのレベルの７ ０％以上の減少と非常によく相関していた。このことは、平滑筋細胞増殖の阻害 がＲＡＳＭＣにおけるリボザイムによるｃ−ｍｙｂ ＲＮＡの切断に直接媒介さ れていることを示す。 図２０は、本発明者らが現在考えている最適なリボザイムコンフギュレーショ ンを示す。実施例２６：２−５Ａアンチセンスキメラによる平滑筋細胞増殖の阻害 ”２−５Ａアンチセンスキメラ”とは、５’リン酸化２’−５’結合アデニレ ート残基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。これらのキメラは 配列特異的様式で標的ＲＮＡに結合し、細胞の２−５Ａ−依存性リボヌクレアー ゼを活性化し、これは次に標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ ｅｔ ａ ｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１３ ００）。 末端５’ホスフェートを有する２’−５’アデノシンを含むＲＮＡはＲＮＡｓ ｅＬを活性化することが示されている（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９ ９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１３００）。末 端ホスフェートはＲＮＡｓｅＬの有効な活性化に必要である。ｃ−ｍｙｂの部位 ５７５を標的とし、５’末端に２−５Ａ部分を有し、末端５’ホスフェートを有 するかまたは有しないリボザイムを合成した。リボザイム−２−５Ａキメラをリ ポフェクタミンとともに複合体化し、上述のようにラット大動脈平滑筋細胞（Ｒ ＡＳＭＣ）でアッセイした。 図２１に示されるように、末端ホスフェートが存在しないとき、活性リボザイ ム［５７５非活性Ｒｚ＋非活性（Ａ）４］は２−５Ａ修飾を有しない正常な活性 リボザイム（５７５活性Ｒｚ）と同様に機能する。５’ホスフェート−２−５Ａ を有する非活性リボザイムコア［５７５非活性Ｒｚ＋活性Ｐ（Ａ）４］は対照と 比較して有意な阻害を示すが、活性リボザイムと比較して著しく低い活性を有す る。活性リボザイムコアおよび５’ホスフェート含有２−５Ａの両方を含む分子 ［５７５活性Ｒｚ＋活性Ｐ（Ａ）４］は、いずれかのメカニズムにより個々に得 られたものよりもさらに高い阻害を示し、平滑筋細胞増殖をベースラインレベル （０％ＦＢＳ）まで阻害した。すなわち、リボザイムおよび２−５Ａアンチセン スキメラは、一緒にＲＡＳＭＣ増殖の阻害において相加的効果を示した。ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断するリボザイムの再狭窄の治療への使用 上述の議論は、例示として、平滑筋細胞増殖を阻害するリボザイムをいかにし て直接、または発現ベクターを用いて血管に送達するかを示すものである。好ま しくは、ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断するリボザイムは冠状動脈血管形成術のとき に血管に送達する。手術中の局所的送達は、ダブルバルーンカテーテル、多孔性 バルーンカテーテル、ポリマーで被覆したバルーンカテーテル（Ｒｉｅｓｓｅｎ ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ’４ ，７４９−７５８）、または生物ポリマーステント（Ｓｌｅｐｉａｎ ａｎｄ Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，米国特許５，２１３，５８０）を用いて行うことができる 。上述の実施例においては、血清中に存在する成長因子に応答する培養平滑筋細 胞の増殖のおよそ半分を阻害しうるリボザイムが同定された。対応する内膜肥厚 の５０％（またはそれよりさらに低い）の減少は、冠状動脈血管形成術を受ける 患者の成果を著しく改善するであろう。ｃ−ｍｙｂを標的とするリボザイムの癌治療への使用 ｃ−ｍｙｂオンコジンの過剰発現は、多くの癌、例えば白血病、神経芽細胞腫 および肺癌、直腸癌および乳癌において報告されている（Ｔｏｒｅｌｌｉ，Ｇ． ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４７，５２６６−５２６ ９；Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３ ３，２０３−２０６；Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｓｃ ｉｅ ｎｃｅ，２２４，２５６−２６２；Ｔｈｉｅｌｅ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１ ９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８，１６７７−１６８３；Ｇｒｉｆｆ ｉｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ Ｂａｙｌｉｎ，Ｓ．Ｂ．，１９８５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ．，４５，２７２−２７５；Ａｌｉｔａｌｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，１９８ ４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４５３４−４５３ ８）。すなわち、ｃ−ｍｙｂ発現の阻害は多くの癌の細胞増殖を減少させる。実 際に、組織培養においては、結腸腺癌、神経外胚葉および骨髄性白血病の細胞株 をアンチセンスｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチドで処理すると、これらの増殖が阻 害される（Ｍｅｌａｎｉ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ．，５１，２８９７−２９０１；Ｒａｓｃｈｅｌｌａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．， １９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，４２２１−４２２６；Ａｎｆｏｓｓ ｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８６，３３７９−３３８３）。さらに、慢性骨髄性白血病および急性骨 髄性白血病患者からの骨髄細胞は、ｃ−ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチド に対して様々に感受性である（Ｃａｌａｂｒｅｔｔａ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１ ９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，２３５１−２ ３５５）。Ｒａｔａｊｃｚａｋら（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１１８２３−１１８２７）は、ヒト白血病細胞を有する マウスをｃ−ｍｙｂアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理して、その生存率を 有意に長くし、腫瘍の負荷を減少させた。すなわち、組織培養およびインビボで の白血病細胞中におけるｃ−ｍｙｂ発現の減少は、それらの増殖可能性を減少さ せることができる。 上述の研究は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが癌細胞におけるｃ−ｍｙｂ の発現を有効に減少させ、それらが増殖し広がる能力を減少させうることを示し たが、本発明は、酵素的ＲＮＡもしくはリボザイムがｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断 しうることを記載する。このようなリボザイムは、触媒活性および増加した部位 特異性を有しており（上述を参照のこと）、癌ならびに再狭窄の治療において、 アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも強力かつ安全な治療的分子であるようで ある。本発明においては、リボザイムが平滑筋細胞増殖を阻害することが示され ている。当業者には、記載される実施例から、同じリボザイムを同様の様式で癌 細胞に送達して、その増殖を遮断しうることが明らかであろう。 好ましい態様においては、急性骨髄性白血病または慢性骨髄性白血病を患う患 者からの自己骨髄をｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断するリボザイムで処置する。リボ ザイムを、０．１から５０μＭで、リボザイムとカチオン性脂質との複合体を形 成してまたは形成せずに、リポソームまたは別の送達剤中にカプセル化するかま たはせずに、自己骨髄細胞にエクスビボで送達する。数日後、患者骨髄における 白血病細胞の増殖能力が減少するであろう。患者の内在性骨髄細胞を化学もしく は放射線処理することにより枯渇化させ、エクスビボ処理した細胞でその骨髄を 再構成する。このような、白血病患者の自己骨髄再構成治療においては、疾患の 再発は移植した骨髄中に存在する白血病細胞の増殖に起因しうる。ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断するリボザイムで処置することにより白血病細胞の増殖能力を有意 に減少させれば、白血病再発の危険性が減少するであろう。診断における使用 本発明のリボザイムは、疾患細胞内の遺伝子浮動および突然変異を試験するか または細胞中のｃ−ｍｙｂ ＲＮＡの存在を検出するための診断手段として使用 することができる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係によ って、標的ＲＮＡの塩基対形成および三次元構造を変化させる分子領域での突然 変異の検出が可能になる。本発明に記載される多数のリボザイムを使用すること により、インビトロでのならびに細胞および組織中でのＲＮＡ構造および機能に 重要なヌクレオチド変化をマップにすることができる。リボザイムによる標的Ｒ ＮＡの切断を使用して遺伝子発現を阻害し、そして疾病進行における特定の遺伝 子産物の（本質的な）役割を特定することができる。このようにして、他の遺伝 子標的を疾病の重要な媒介物として特定することができる。これらの実験は、組 合せ治療法（例えば、種々の遺伝子を標的とする多数のリボザイム、既知の小分 子阻害剤と結合させたリボザイム、あるいはリボザイムおよび／または他の化学 的もしくは生物学的分子の組合せによる断続的治療）を可能にすることにより疾 病進行のより良好な治療につながるであろう。本発明のリボザイムの他のインビ トロ使用は当該技術分野で知られており、そしてそれらにはｃ−ｍｙｂ関連状態 と関係のあるｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。このようなＲＮＡは、リボザイ ムで処置した後の切断生成物の存在を標準的な方法論を使用して測定することに より検出される。 特定の実施例では、野生型または突然変異型の標的ＲＮＡのみを切断しうるリ ボザイムをアッセイに使用する。最初のリボザイムを用いて試料中に存在する野 生型ＲＮＡを同定し、そして２番目のリボザイムを用いて試料中の突然変異ＲＮ Ａを同定する。反応の対照として、野生型と突然変異ＲＮＡの両方の合成基質を 両リボザイムで切断して、反応におけるリボザイムの相対的な効率および「非標 的」ＲＮＡ種の切断の不存在を証明する。合成基質から得られる切断生成物は、 試料集団中の野生型および突然変異ＲＮＡの分析用のサイズマーカーを生成する ためにも役立つであろう。すなわち、それぞれの分析には２つのリボザイム、２ つの基質および１つの未知試料が必要でありこれらを組み合わせて６つの反応を 行う。切断生成物の存在は、それぞれのＲＮＡの全長および切断フラグメントを ポリアクリルアミドケルの１つのレーンで分析できるようにＲＮＡｓｅ保護アッ セイを使用して測定する。標的細胞における突然変異ＲＮＡの発現および所望の 表現型の変化の推定上の危険性を見抜くためには結果を定量することが絶対的に 必要というわけではない。ｍＲＮＡの蛋白質産生物が表現型（すなわち、ｃ−ｍ ｙｂ）の生成に関係しているようなｍＲＮＡの発現は危険性の確立に適切である 。類似した特異的活性のプローブを両転写物用に使用する場合には、ＲＮＡレベ ルの質的比較が適切でありそして初期診断費用を軽減するであろう。ＲＮＡレベ ルを質的に比較しようと量的に比較しようと、突然変異型対野生型の比が高けれ ば高いほどより高い危険性と相関関係があろう。 他の態様も以下の特許請求の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＲ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ 48/00 ＡＤＵ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9359−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 9/00 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＲ //(Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者 マクスウィゲン，ジェームズ アメリカ合衆国コロラド州80301，ボウル ダー，フランクリン・ドライブ 4866 (72)発明者 ジャーヴィス，テール アメリカ合衆国コロラド州80301，ボウル ダー，スマグラー・プレイス 3720

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡを切断する酵素的核酸分子であって、前記核酸の結合 アームが表II、ＸII−ＸＸIVに規定される配列に相補的な配列を含むことを特徴 とする核酸分子。 ２． ｃ−ｆｏｓ、ｏｃｔ−１、ＳＲＦ、ＰＤＧＦレセプター、ｂＦＧＦレセプ ター、アンギオテンシンII、およびエンドセリン由来弛緩因子をコードるす遺伝 子から選択される遺伝子から生成するＲＮＡを切断する酵素的核酸分子。 ３． 前記核酸分子がハンマーヘッドモチーフのものである、請求項１または２ に記載の酵素的核酸分子。 ４． 前記核酸分子がヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、ＶＳ核酸、グループＩイ ントロンまたはＲＮＡｓｅＰ核酸モチーフのものである、請求項１または２に記 載の酵素的核酸分子。 ５． 前記核酸が前記ｍＲＮＡに相補的な１２から１００塩基を含む、請求項３ または４に記載の酵素的核酸分子。 ６． 前記核酸が前記ｍＲＮＡに相補的な１４から２４塩基を含む、請求項５記 載の酵素的核酸分子。 ７． 本質的に、表III、ＸII−ＸＸIVに掲げられる配列の群より選択される任 意の配列からなる酵素的核酸分子。 ８． 請求項１または２に記載の酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞。 ９． 前記細胞がヒト細胞である請求項８記載の細胞。 １０． 請求項１または２に記載の１つの酵素的核酸分子または多数の酵素的分 子をコードする核酸を、哺乳動物細胞中においてその酵素的ＲＮＡ分子の発現が 可能な様式で含む発現ベクター。 １１． 請求項１０記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。 １２． 前記細胞がヒト細胞である請求項１３記載の細胞。 １３． 請求項１または２に記載の酵素的核酸分子またはｃ−ｍｙｂ遺伝子から 生成するＲＮＡを切断する酵素的核酸分子を投与することにより狭窄状態を治療 する方法。 １４． 患者に請求項１０記載の発現ベクターを投与することにより狭窄状態を 治療する方法。 １５． 前記患者がヒトである、請求項１３または１４に記載の方法。 １６． 患者または患者の細胞に請求項１または２に記載の酵素的核酸分子を投 与することにより癌を治療する方法。 １７． 患者または患者の細胞に請求項１０記載の発現ベクターを投与すること により癌を治療する方法。 １８． 前記患者がヒトである、請求項１６または１７に記載の方法。 １９． 酵素的核酸を、クロロキン、塩化アンモニウム、カルボニルシアニドｐ −トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、モネンシン、コルチ シン、両親媒性ペプチド、ウイルス蛋白質およびウイルス粒子からなる群より選 択される化学物質と混合することにより前記酵素的核酸を投与する方法。 ２０． 前記核酸が少なくとも５個のリボース残基を含み、前記核酸が６個の５ ’末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含み、 前記核酸が前記核酸の４位において２’−Ｃ−アリル修飾を含み、前記核酸が少 なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前記核酸が３’−末端修飾 を含む、請求項３記載の酵素的核酸。 ２１． 前記核酸が前記３’−末端において３’−３’結合反転リボース部分を 含む、請求項２０記載の酵素的核酸。 ２２． 前記核酸が少なくとも５個のリボース残基を含み、前記核酸が６個の５ ’末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含み、 前記核酸が前記核酸の４位および／または７位において２’−アミノ修飾を含み 、前記核酸が少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前記核酸が その３’−末端に３’−３’結合反転リボースまたはチミジン部分を含む、請求 項３記載の酵素的核酸。 ２３． 前記核酸が少なくとも５個のリボース残基を含み、前記核酸が６個の５ ’末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含み、 前記核酸が前記核酸分子の４位および／または７位において非ヌクレオチド置換 を含み、前記核酸が少なくとも１０個の２’−Ｏメチル修飾を含み、かつ前記核 酸がその３’末端において３’−３’結合反転リボースまたはチミジン部分を含 む、請求項３記載の酵素的核酸。 ２４． 前記核酸が少なくとも５個のリボース残基を含み、前記核酸が６個の５ ’末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含み、 前記核酸が前記核酸分子の４位および／または７位において６−メチルウリジン 置換を含み、前記核酸が少なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ 前記核酸がその３’末端において３’−３’結合反転リボースまたはチミジン部 分を含む、請求項３記載の酵素的核酸。 ２５． 前記核酸が少なくとも５個のリボース残基を含み、前記核酸が６個の５ ’末端ヌクレオチドの少なくとも３個においてホスホロチオエート結合を含み、 前記核酸が前記核酸の４位において２’−Ｃ−アリル修飾を含み、前記核酸が少 なくとも１０個の２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ前記核酸がその３’末端に おいて２’−３’結合反転リボースまたはチミジン部分を含む、請求項３記載の 酵素的核酸。 ２６． 少なくとも５個の連続する塩基においてｃ−ｍｙｂに対する相補性を有 し、５’−ホスフェートを有する２’−５’−結合アデニレート残基を含むオリ ゴヌクレオチド。 ２７． ｃ＝ｍｙｂ ＲＮＡに対して酵素的活性を有する請求項２６記載のオリ ゴヌクレオチド。 ２８． ｃ−ｍｙｂ ＲＮＡとハイブリッドを形成しうる少なくとも２０塩基を 含む、請求項２６記載のオリゴヌクレオチド。