JPH10500492A

JPH10500492A - 高勾配磁気細胞選別による造血樹状細胞の単離

Info

Publication number: JPH10500492A
Application number: JP8527761A
Authority: JP
Inventors: ステファンミルテンティ; ジャーゲンシュミッツ
Original assignee: ミルテニーバイオテクインク
Priority date: 1995-03-15
Filing date: 1996-03-11
Publication date: 1998-01-13
Also published as: CA2190367A1; WO1996028732A1; AU5306496A; EP0760102A1

Abstract

(57)【要約】高純度でかつ機能的に完全な樹状細胞を、コロイド状の超常磁性粒子を用いて細胞群混合物より急速に単離する方法が提供される。樹状細胞は、二段階の高勾配磁気細胞分離を用いて血液またはリンパ液の試料から濃縮される。リンパ球、ナチュラルキラー細胞および単核細胞が、リンパ細胞および骨髄細胞に存在するマーカーに特異的に結合することによって除去される。分離段階において、樹状細胞がＨＧＭＳにより濃縮される。精製された樹状細胞は、インビトロ分析において、または免疫調節治療で、特にナイーブＴ細胞を感作するための抗原提示細胞の起源として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】高勾配磁気細胞選別による造血樹状細胞の単離導入技術分野本発明の技術分野は、造血樹状細胞の単離である。背景抗原提示細胞の機能および同定は、過去より論争の課題となってきた。マクロファージおよび樹状細胞（リンパ指状突起樹状細胞と呼ばれることもある）は、抗原を提示することが現在わかっている。マクロファージは活性化されたＴ細胞およびＢ細胞に対して提示を行う。しかしながらヘルパーＴ細胞の活性化は、樹状細胞による抗原提示に依存する。樹状細胞は、末梢血液中の抗原を選択して処理し、続いてリンパに移動して、最終的にリンパ節の傍皮質Ｔ細胞部で成熟すると考えられている。マクロファージおよび樹状細胞は、全ての成熟段階において、既に活性化されているＴ細胞に抗原を提示することができるが、ナイーブＴ細胞を感作することができるのは成熟樹状細胞だけである。樹状細胞は骨髄の造血幹細胞から誘導される。樹状細胞の前駆体および未成熟の樹状細胞は、血液およびリンパ液中に存在している。組織学的に区別するなら、完全に成熟した樹状細胞は脾臓およびリンパ節に存在している。抗原提示において役割を果たす際、樹状細胞は高濃度のＭＨＣクラスＩタンパク質およびクラスIIタンパク質を発現する。末梢血単核細胞から樹状細胞を単離するための方法がこれまでに数多く開示されている。これらの手法の共通の特徴は、インビトロで１〜２日間、培養を行う必要があることである。この間に樹状細胞は、低いボイヤント強度（bouyant de nsity）と、プラスチックにほとんどまたは全く癒着せず他の細胞から分離しやすいという特徴とを獲得する。最近、新鮮な血液から樹状細胞を単離する手法が発表されている。これらの手法はすべて、Ｔ細胞の除去段階、それに続くフローサイトメトリーによる選別を必要とする。しかしながらＦＡＣＳは高度な技術力を要するため、日常的な利用は妨げられている。ＦＡＣＳ選別は、時間がかかり、コストも高い手法である。ＦＡＣＳ選別はさらに、大量の細胞を選別すること、または同時に多数の試料を選別することが困難であるという欠点を有している。細胞選別についてこれとは別の手法も開示されており、それによると抗体に結合する磁気微粒子が特定の細胞タイプを選別するために用いられる。改良された分離方法によると血液から樹状細胞を選別することができ、それは多数の、および大量の試料について行うことができ、即ちその分離方法にかかる試料は、抗原を提示する樹状細胞の特徴決定および使用に際して多くの利点をもたらす。関連文献培養時間後の樹状細胞の単離については、「Cameron et al．(1992)Science25 7: 383」、「Langhoff et al．(1991)P.N.A.S. 88: 7998」、「Chehimiet al．( 1993)J ．Gen．Viol. 74: 1277」、「Cameron et al．(1992)Clin ．Exp．Immunol . 88: 226」、「Thomas et al．(1993)J ．Immunol. 150: 821」、「Karhumaki e t al，(1993)Clin ．Exp．Immunol. 91: 482」に記載されている。フローサイトメトリー選別法による末梢の血液からの樹状細胞の単離については、「Thomas et al．(1994)J ．Immunol. 153: 4016」、「Ferbas et al．(1994 )J ．Immunol. 152: 4649」、および「O'Dohelrty et al．(1994)Immunology 82: 487」に記載されている。抗原刺激を受けた樹状細胞によるナイーブＴ細胞（naive T cells）の活性化については、「Flamand et al．(1994)Eur ．J．Immunol. 24: 605-610」、「Meh ta-Damani et al．(1994)J ．Immunology 153: 996」、および「Somasse et al． (1992)J ．Exp．Med．175: 15-21」に記述されている。高勾配磁気細胞選別法については、「Miltenyi et al．(1990)Cytometry 11: 231-238」に記述されている。モルディ（Molday）はU.S．4,452,773で、磁性鉄 −デキストラン微粒子の調製について開示しており、生物学的物質への付着に適当な粒子のさまざまな調製方法についても要約している。ＨＧＭＳで用いられるポリマー被膜を施した磁性粒子については、DE 3720844(Miltenyi)および「Milt enyi et al.，米国特許第5,385,707号」に記載されている。超常磁性粒子を調製する方法は、米国特許第4,770,183号に記載されている。発明の概要高純度でかつ機能的に完全な樹状細胞を、コロイド状の超常磁性粒子を用いて混合細胞群より急速に単離する方法が提供される。樹状細胞は、二段階の高勾配磁気細胞分離を用いて血液またはリンパ液の試料から濃縮される。Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および単核細胞が、リンパ細胞および骨髄細胞に存在するマーカーに特異的に結合することによって除去される。分離段階において、樹状細胞がＨＧＭＳにより濃縮される。単離された樹状細胞は、インビトロでサイトカインの存在下で適宜培養される。精製された樹状細胞は、インビトロ分析および免疫調節治療において使用するため、特にナイーブＴ細胞を感作するための、抗原提示細胞の起源として用いることができる。図面の簡単な説明図１Ａ（ｉ）〜１Ｃ（ｉ）は、樹状細胞の分離における、ＨＬＡ−ＤＲ、ならびにＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９の発現についての末梢血単核細胞の同定を示す。図１Ａ（ii）〜１Ｃ（ii）は、分離段階の間に起こる細胞群の横方向および前方向への分散をする。図２Ａおよび２Ｂはそれぞれ、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞が濃縮された単離樹状細胞によるＣＤ４およびＣＤ１１ｃの発現を示す。図２Ｃおよび２Ｄはそれぞれ、未分離の末梢血単核細胞における、およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞が濃縮された単離された樹状細胞におけるＣＤ３３およびＣＤ１１ｂの発現を示す。図３は、インビトロの培養を行った後の単離された末梢血液の樹状細胞の前方向および横方向への分散を示す。図４Ａ（ｉ）〜４Ｃ（ｉ）は、樹状細胞の分離における、ＣＤ４およびＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ１６の発現についての抹消血単核細胞の同定を示す。図４Ａ（ii）〜４Ｃ（ii）は、分離段階の間に起こる細胞群の横方向および前方向への分散を示す。図５は、ＣＤ４陽性細胞を濃縮した単離された樹状細胞によるＨＬＡ−ＤＲの発現を示している。特別な態様の説明造血樹状細胞の分離方法、培養方法、および使用方法を開示する。血液試料が適切な宿主から採取され、そして血液から単核細胞の調製物が作成される。樹状細胞が、混合血液細胞群から、高勾配磁気細胞分離法、または高勾配磁気分離法と低勾配磁気分離法との組み合わせを用いる、非樹状細胞の除去および樹状細胞の濃縮を含む複合法によって濃縮される。血液細胞の懸濁液は、細胞表面抗原に特異的な超常磁性粒子を用いて標識し、続いて磁気カラムへの結合によって選別した。樹状細胞を濃縮するために高勾配の磁気細胞選別法を利用することにより、現在用いられているフローサイトメトリー法に比較していくつかの利点が提供される。本方法では、利用および維持が容易な、安価な試薬および装置が用いられる。複数のカラムを準備することによって多くの試料を同時に処理することができる。自動化された系は、多数の試料、および大容量の試料の処理を容易にするために用いることができる。本方法は、造血樹状細胞およびその前駆体が高度に濃縮された群を提供する。即ち、通常その群の少なくとも約９０％、更に通常その群の約９５％が樹状細胞またはその前駆体である。純度は、さまざまな方法で評価することができる。簡単な方法においては、フローサイトメトリーを、樹状細胞により発現される細胞表面のマーカーに特異的な光検出試薬と共に用いることができる。本方法によって分離された樹状細胞は、クラスＩおよびクラスII ＭＨＣタンパク質、例えばヒトのクラスIIタンパク質であるＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ− ＤＲ、ならびにクラスＩタンパク質であるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃなどを発現することにより特徴づけられる造血細胞である。またこの樹状細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３３、およびほとんどの部分でＣＤ４を発現する。この細胞は、大部分のリンパおよび単細胞特異性の細胞マーカー、例えばＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、およびＣＤ１９の発現を欠如する。血液中に見いだされる樹状細胞の成熟サブセットは、ＣＤ１１ｃ、高濃度のＣＤ３３、およびＣＤ４５ＲＯの発現により特徴付けられ、またナイーブＴ細胞または既に活性化されているＴ細胞を刺激するように抗原を提示することができる。樹状細胞の前駆体は、ＣＤ１１ｃ陰性で、ＣＤ３３を低レベルで発現し、またＣＤ４５ＲＡ陽性であり、インビトロでの培養後成熟細胞に分化する。培養に関しては下記に詳述する。樹状細胞（ＤＣ）という用語は、他の方法で特別にその意味を述べない限り、血液中に見いだされるような成熟細胞および前駆細胞の両方を含むものとする。本明細書で用いられるように、血液試料には、血液、リンパ液、白血球伝達産物（leukophoresis product）、骨髄などの造血性の生物試料が含まれ、またこの用語にはこのような液の誘導体および画分が含まれるものとする。この試料は、何の特別な分離処理も含まない、緩衝液での希釈、濃縮、濾過、またはその他の粗処理のような前処理を行うことができる。血液試料は血管を穿孔することで簡単にどの部位からも採取される。この試料は通常少なくとも約２０ｍｌで、更に通常少なくとも約４０ｍｌであり、最大約５００ｍｌであってもよいが、通常約２５０ｍｌ以上であることはない。この血液はＥＤＴＡ、ヘパリン、または酸 −クエン酸−デキストロース溶液の添加などの、凝集を防止する従来の方法によって処理される。有核細胞の調製物が、試料から調製される。赤血球から有核細胞を分離するいかなる方法も採用することができる。フィコール−パック（Ficoll-Paque）密度勾配または溶出を利用する方法が、文献によく記載されている。代替法として、血液細胞を、成人の赤血球を選択的に溶解する溶液、例えばアンモニウムクロライド−カリウム（ammonium chloride-potassium）、アンモニウムオキサレート（ammonium oxalate）などに再懸濁してもよい。有核末梢血細胞（ＮＰＢＣ）の試料から、非樹状細胞を選択的に除去する。超常磁性粒子に結合する除去試薬は、リンパ球および単核血液細胞に存在し、樹状細胞には低濃度であるかまたは存在しない細胞表面抗原に結合する。特に有用な除去試薬は、細胞表面の抗原に結合する抗体である。完全な抗体を用いることもできるし、または例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、軽鎖または重鎖断片などの断片を用いることもできる。このような抗体は、ポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であってもよく、これらは通常商業的に入手することができるし、または他の手段としては、当業者に知られた手法を用いて容易に製造することもできる。除去処理に用いるべく選択される抗体は、低濃度の非特異的染色性を有するとともに、通常抗原に対して少なくとも約１００μＭの親和性を有するであろう。広範囲の血液細胞型を除去するため、通常は除去試薬の混合物が用いられるであろう。通常、単核末梢血細胞の少なくとも約７５％が複合除去試薬によって結合されるであろう。除去処理に適した抗原は、単核細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞に特異的な抗原である。例えば単核細胞で見いだされるＣＤ１４またはＣＤ１１ｂや、Ｔ細胞で見いだされるＣＤ３、ＮＫ細胞で見いだされるＣＤ１６、およびＢ細胞で見いだされるＣＤ１９である。この他の有用な細胞表面抗原としては、Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ６およびＣＤ７、Ｂの細胞マーカーであるＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４およびＣＤ３７、ＮＫ細胞および好中球のマーカーであるＣＤ１６、またＣＤ５６、ＣＤ５７およびＣＤ９４、並びに顆粒球のマーカーであるＣＤ１５などがある。好ましい態様では、ＣＤ１３、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂに特異的な抗体の混合物が用いられ、そこには任意でＣＤ１６および／またはＣＤ１９が含まれる。他の組合せはＣＤ３、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１６に特異的な抗体群である。除去試薬の抗体は、米国特許第4,452,773号および米国特許第4,230,685号に記載されているようにして調製される超常磁性粒子に結合させる。微粒子は通常直径が約100nm以下であり、通常直径は約10nm以上の大きさである。結合のための厳密な方法は、本発明を実施するにあたってそれほど重要でははく、多くの別法が当業者には知られている。同時係属中の特許出願第08/252,112号に記載されているように、直接結合により抗体を粒子に結合する。なおこれは参照として本明細書に組み入れられる。非直接的な結合はいくつかの方法で行うことができる。除去試薬の抗体を、例えばビオチンのような高親和性の結合系の一成分に結合させ、粒子を例えばアビジンのような他の成分に結合させることができる。また、例えば抗−マウスＩｇや抗−ラットＩｇなどの除去抗体の種特異的抗原決定基を認識する二次抗体を用いることもできる。非直接的な結合方法によれば、種々の除去抗体とともに、例えば抗体、アビジンなどの磁気的に結合した物質を一つ使用することができる。好ましい方法において、同時係属中の特許出願第08/252,112号に記載されているように、超常磁性粒子に結合したハプテンに特異的な二次抗体が用いられる。このハプテン特異的抗体は通常、そのハプテンに対して少なくとも約100μＭの親和性を有する。除去抗体は適当なハプテンに結合する。好ましいハプテンはジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニルなどである。ハプテンを抗体に結合する方法は当業者には既知である。本方法の実施に必要ではないが、例えばフィコエリトリン、ＦＩＴＣ、ロダミン、テキサスレッド、アロフィコシアニンなどの蛍光色素を除去抗体を標識するのに用いることができる。蛍光色素標識は顕微鏡で観察するのに用いることができるし、または除去段階および濃縮段階を行ったあとでその細胞組成物をフローサイトメトリーによって観察するのに用いることもできる。蛍光標識は、磁性粒子と同様に、非直接的結合系で便利に用いることができる。例えばジゴキシゲニン結合除去抗体の混合物は、磁気粒子に結合した抗ジゴキシゲニン抗体と組み合わせ、その後抗ハプテン抗体に対する蛍光色素結合抗体で標識することにより用いることができる。除去試薬の抗体はＮＰＢＣの懸濁液に添加し、有用な細胞表面の抗原に結合するのに十分な時間インキュベートする。このインキュベートは通常、少なくとも約5分間、通常は約30分以下行われる。抗体の磁気的分離の効果が抗体の不足によって制限されないように、反応混合液中には充分な濃度の抗体が存在していることが望ましい。適当な濃度は滴定によって決定する。細胞の分離が行われる培地は、細胞の生存能力を維持する培地であればいかなるものであってもよい。好ましい培地は0.1〜0.5％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水である。種々の培地を商業的に入手することができ、細胞の特徴に応じて用いることができる。これらの培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Me dium／ｄＭＥＭ）、ハンク塩基性塩溶液（Hank's Basic Salt Solution／ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、イスコブ培地（Iscove's medium）、5mMのＥＤＴＡを含有するＰＢＳなどが含まれ、しばしば補足的に仔牛胎児の血清、ＢＳＡ、ＨＳＡなどが含まれる。磁気的に結合した二次抗体が用いられる場合には、細胞懸濁液は洗浄して二次抗体とともにインキュベートする前に上述したように培地に再懸濁してもよい。別の方法では、二次抗体は反応混合液に直接添加することができる。直接的に結合した除去抗体を用いる場合には、細胞懸濁液を直接次の段階で用いてもよいし、または洗浄して培地に再懸濁してもよい。磁気的に標識した細胞懸濁液は、国際公開第90/07380号（WO 90/07380）に記述されているようにカラムまたはチャンバーに入れる。なおこの文献は参照として本明細書に組み入れられる。マトリックスは、密閉された強磁性体球、スチールウール、ワイヤー、磁気的に作用する微細粒子などを含んでいてもよい。マトリックスは、細胞の金属との接触を妨げる不浸透性の被膜で被覆されていてもよい、例えば鉄、スチールなどの強磁性材料を含む。このマトリックスは、分離チャンバー内に十分な磁場勾配を形成することで磁気的に標識された細胞の保持が効果的に行えるように、適切な表面領域を持っていなくてはならない。分離を行うのに必要な容積は経験的に決定することができるが、それは細胞の大きさ、細胞表面抗原の密度、細胞数、抗体親和性などによって変化する。最終的な細胞調製物の純度を最大にするためには、厳密性の異なる二つの系が用いられる。これらの系において、除去段階では高いパーセントの標識された細胞を捕獲し、また濃縮段階では低いパーセントの標識された細胞を捕獲する。このことは、第１分離段階から第２分離段階へと、標識された細胞が移動する可能性を減少している。除去カラムの持つ厳密性は、例えば少なくとも約９５％の標識された細胞が磁場の存在下でそのカラムに保持されることであり、さらに通常は少なくとも約９９％の標識された細胞が保持され、更に好ましくは少なくとも約９９．９％が保持されることである。結合構造、マトリックスの組成、磁場強度、強磁性カラムの大きさおよび流量は、そのカラムに保持される標識された細胞の割合を決定するであろう。厳密性を増加させる要因は、カラムの大きさおよび長さの増大、流速の減少、ならびにマトリックス成分の微細化である。繊維からなるカラムマトリックスは、除去段階に好適である。厳密性の経験的な決定は、結合した細胞および結合していない細胞を分析することによって行うことができる。標識された細胞は、磁場の存在下でマトリックスに結合する。その磁場は一般に少なくとも約１００ｍＴであり、更に一般的には少なくとも約５００ｍＴであって、通常約２Ｔ以上ではなく、更に通常は約１Ｔ以上ではない。磁場の発生源は、永久磁石であってもよいし、電気的な磁石であってもよい。溶出液中に含まれる結合していない細胞は、カラムを通った溶出液として収集する。更に純度を高めるためには、その結合していない細胞を磁気カラムに二度通せばよい。非結合細胞は、樹状有核細胞を選択するために濃縮段階で用いられる。超常磁性粒子に付着した濃縮試薬は、樹状細胞により提示される細胞表面抗原に結合する。特に重要であるのは、ＭＨＣクラスIIタンパク質、例えばＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰに特異的な試薬の使用、または例えば樹状細胞およびその前駆体に特異的なＣＤ４などの樹状細胞に特異的に存在するその他の細胞表面マーカーの使用、または場合によっては、成熟した樹状細胞に特異的なＣＤ１１ｃの使用である。ＣＤ４５ＲＯは成熟した樹状細胞を選択するために用いることができ、またＣＤ４５ＲＡは前駆細胞を選択するために用いることができる。濃縮試薬を選択すると、特定のマーカーの発現の分布に基づいて除去試薬の選択がある程度決定される。除去試薬は、濃縮マーカーを発現する非樹状細胞を特異的に除去できるように選択されるであろう。例えばＣＤ４は、Ｔ細胞および単球によって高度に発現されるため、ＣＤ４選択より前の除去段階には、Ｔ細胞および単球に特異的な試薬が含まれる。ＭＨＣクラスIIタンパク質は、Ｔ細胞では発現しないかまたは低密度でしか発現せず、Ｂ細胞および単球では発現するため、ＨＬＡクラスII選別より前の除去段階にはＢ細胞および単球に特異的な試薬が含まれる。ＨＬＡクラスIIタンパク質に特異的な試薬は、対立遺伝子特異的な試薬、即ちタンパク質の多形的な領域に対する試薬、または保存配列に対する試薬であってもよい。ＨＬＡ−ＤＲαは配列が比較的変化が少ないが、これに対してＨＬＡ− ＤＲβは高度に多形的である。通常試薬は、非常に多くの個体からのＨＬＡタンパク質を認識するように選択される。しかしながら、対立遺伝子特異的な試薬を用いることで特殊なハロタイプを有する樹状細胞を単離することが望ましい。都合の良いことに、濃縮試薬は除去のために用いられるのとは異なる非直接的な結合を介して磁気標識を形成する。この第一の結合反応は、濃縮試薬および除去試薬の両方を組み合わせてもよい。濃縮試薬に特異的な第２段階の磁性体粒子は、除去が完了したあとで添加する。他の方法では、直接的に結合した濃縮試薬を用いることもできる。濃縮試薬、超常磁性粒子、カラム、および緩衝液は除去試薬について記述したのと同様にして調製されるが、濃縮カラムについての厳密性は、除去カラムの厳密性よりは低い程度である。濃縮カラムの厳密性は例えば、少なくとも約５０％の標識された細胞が磁場の存在下でカラムに保持され、通常は少なくとも約８０％の標識された細胞が保持され、そして通常９５％以上は保持されないようなものである。球形のカラムマトリックスは、濃縮段階にとっては好ましい。この細胞は磁気マトリックスに結合する。最初の結合のあとでマトリックスは、何らかの好適な生理的緩衝液を用いて洗浄することによって結合していない細胞を除去することができる。この結合していない細胞は破棄する。結合した細胞は、磁場を取り除くことによって放出されて、好適な緩衝液中に溶出する。この細胞は、その細胞の生存を維持するのに適切な培地中に収集してもよい。さまざまな培地を商業的に入手することができ、細胞の特徴に応じて用いることができる。これらの培地には、ｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ、ＰＢＳ、イスコブ培地などが含まれ、しばしば補足的に仔牛胎児の血清、ＢＳＡ、ＨＳＡなどが含まれる。多くの場合、この分離手法において、初めに除去段階が行なわれ、続いて濃縮段階が行われる。もし濃縮段階が初めに行われるべきであるならば、濃縮された細胞から磁気標識を除去するために、濃縮したあとで追加の段階が必要である。これは好適な方法で行うことができる。この濃縮された細胞群をデキストラナーゼの溶液とともにインキュベートすればよい。この際のデキストラナーゼは、標識された細胞から実質的に全ての微粒子を取り除くのに充分な濃度で存在させる。通常この反応は、少なくとも約１５分間で完了する。続いて除去段階を、デキストラナーゼ処理した細胞を用いて前述したように行うことができる。他の方法では、濃縮段階を初めに行い、そして微粒子の代わりに大きな磁性球体を用いるよう、除去段階を変更してもよい。このような磁性球体を用いることについては前にも述べており、その試薬は商業的に入手できる。濃縮された細胞群を、除去抗体の混合物に結合した直径が約１〜１０μｍの高度に磁性化されているポリマー球体を用いてインキュベートする。続いて、細胞の混合物を磁場にきわめて近接したところに配設する。そのポリマー球体に結合している実質的に全ての細胞は約１分以内に磁石に結合する。それは約５分以上はかからない。結合していない細胞をデカントし、そして利用することができる。除去段階および濃縮段階が完了した後、その細胞は直ちに抗原を提示するため、さらにｃＤＮＡ合成で用いるｍＲＮＡの起源としてＤＣ機能の分析を行うためなどで用いることができる。成熟した細胞および始原細胞とは、成熟段階中の遺伝子発現における違いを検出するため、および成熟した樹状細胞により発現される特異的遺伝子を同定するためにｃＤＮＡを消去して比較することができる。他の方法では、その細胞をインビトロで、更なる成熟を誘導するのに充分な期間、即ち通常は少なくとも約１日間で約７日以上ではない期間だけ、更に通常は約２〜３日間だけ培養してもよい。この樹状細胞は適当な液体状の中性培地中で培養され、その培地は更に、成熟した抗原提示細胞に樹状細胞前駆体の分化を充分に高めることのできる濃度のサイトカイン、またはサイトカインの結合体を含んでいる。細胞は１ｍｌあたり約１０⁴個〜１ｍｌあたり約１０⁶個、通常は約１０⁴個〜１０⁵個の濃度に増殖する。種々の培地を商業的に入手して用いることができ、それにはダルベッコ改変イーグル培地（ｄＭＥＭ）、ハンク塩基性塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、イスコブ培地などが含まれ、しばしば補足的に血清、即ち通常は加熱インキュベートされた正常なヒト血清が、一般的には約５−１５％、好ましくは約１０％の濃度で含まれる。細菌の生育を阻止するための適当な抗体、および他の添加物、例えばピルビン酸（０．１−５ｍＭ）、グルタミン（０．５−５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１−１０×１０^-5Ｍ）を含んでいてもよい。対象となるサイトカインには、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αが含まれる。前駆体、即ちＣＤ１１ｃ陰性樹状細胞の培養物へのＧＭ−ＣＳＦの添加は、とりわけ興味のもたれるところである。用いられる因子は、天然で発生するかまたは合成、例えば組換えて調製されたものでもよいし、ヒトまたは他の種、例えばネズミであってもよいがヒトであることが好ましい。他の方法では、培地で調製された単核細胞はサイトカインの源として用いられる（例えば、O'Doherty et al．(1994)上記、参照）。サイトカインの量は、通常約１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの範囲内である。適切な培養条件は、抗原を提示する能力について得られた細胞を解析することによって経験的に試験することができる。抗原提示活性を検出するさまざまな方法が当業者に知られており、それらは本目的のために利用することができる。例えば、最適条件には及ばない濃度の抗−ＣＤ３で刺激された新生の単離Ｔ細胞を増殖できるようにする細胞の能力を測定することができる（Thomas et al．(199 4)，前記、参照）。ほとんどの場合、抗原を提示する能力の増加は培養後に起こり、しばしばＢ７（ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現が増加することによって達成される。培養の前または後のいずれかの濃縮された樹状細胞群は、インビボまたはインビトロでＴ細胞を刺激する抗原提示細胞として用いることができる。この細胞は、タンパク質抗原またはそのペプチドと結合する。抗原性のペプチドは通常、長さが約６個〜２０個のアミノ酸からなり、更に通常は約１０個〜１８個のアミノ酸からなる。このペプチドは広い範囲のさまざまなタンパク質から誘導される配列を有している。多くの場合、Ｔ細胞抗原決定基、通常は主要抗原決定配列として作用するペプチドを用いることが望ましい。多くの抗原から得られる抗原決定配列が当業者には既知である。別の方法では抗原決定配列は、未変化のＭＨＣタンパク質に結合するペプチドを単離し、配列を決定することによって、または標的配列から一連のペプチドを合成し、次にその異なるペプチドに対するＴ細胞の反応性をアッセイすることによって、または異なるペプチドを持つ一連の結合複合体を生成し、そしてＴ細胞結合体を定量することによって経験的に決定することができる。断片の調製、配列の同定、および最小配列の同定については米国特許第5,019,384号（91年5月28日発行）に詳細に記述されており、この文献は参照として本明細書に引用される。このペプチドは当業者に既知の種々の方法で調製することができる。重要な抗原には、腫瘍細胞抗原、同種異形のＭＨＣ抗原、アレルゲン、例えばＨＩＶ−１、肝炎、ヘルペスウイルス類、脳のウイルス類、呼吸器のウイルス類、ラブドウイルス、ルベオーラ、ポックスウイルス、パラミクソウイルス、麻疹ウイルス、フィロウイルスなどのウイルス類を含む病原性器官のタンパク質が含まれる。関心のある感染抗原にはまた、例えばニューモコッカス（Pneumococcus ）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、バチルス（Bacillus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、メニンゴコッカス（Meningococcus）、ゴノコ（ Gonococcus）、エシェリキア（Eschericia）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonel la）、シゲラ（Shigella）、へモフィラス（Hemophilus）、ヤーシニア（Yersin ia）、リステリア（Listeria）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ビブリオ（Vibrio）、クロストリディア（Clostridia）、クラミジア（Chlamydia ）、ミコバクテリウム（Mycobacterium）、ヘリコバクター（Helicobacter）およびトレポネラ（Treponema）、即ち原生動物の病原体、および類似の細菌などの細菌が含まれる。樹状細胞は、インビトロで、少なくとも約０．１μＭから最大約１ｍＭの濃度の抗原を含む生理学的に受容できる緩衝液に、その細胞を入れることによって抗原で刺激される。ペプチド抗原は通常、完全なタンパク質抗原、または細胞溶解物よりも低い濃度で効果を得ることができる。その細胞は、一般的には３７℃で、抗原がその細胞に結合するのに充分な時間、抗原とともにインキュベートすることができる。ペプチド抗原は通常、少なくとも約１時間、および６時間またはそれ以上の時間インキュベートが行われる。完全なタンパク質抗原では通常、少なくとも約３時間、および約１２時間またはそれ以上の時間インキュベートが行われるであろう。ＤＣ類を刺激する抗原は、その抗原に対するＴ細胞の応答を刺激するために用いることができる。Ｔ細胞は、インビボでの自己増殖した宿主または同種異形の宿主のいずれかであってもよいし、またはインビトロでの培養物であってもよい。インビボで用いる場合、樹状細胞は生理学的に受容できる培地にいれ、皮下注射、静脈内注射、粘膜内投与などの投与法で投与することができる。通常は少なくとも１×１０⁴個の細胞が、好ましくは１×１０⁵個またはそれ以上が投与されるであろう。この細胞は、注射、カテーテル、またはそれに類似のものにより導入することができる。細胞を導入する目的によっては望ましくは、例えばＩＬ− ２およびＩＬ−４などのインターロイキン、これと同様に他のインターロイキン、例えばＧ−、Ｍ−およびＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、例えばγ−インターフェロンなどのインターフェロン、エリスロポエチンなどが因子として用いることもできる。これらの種々の因子の量は、細胞の投与の目的、即ち患者が有する特別な必要性に依存しており、その量は通常、経験的に決定することができる。抗原で刺激した樹状細胞またはその膜成分は、抗原特異的なＴ細胞を得るための免疫吸着剤として用いてもよい。Ｔ細胞の定量は、Ｔ細胞の活性化、例えば自己免疫疾患、移植の拒絶反応、ウイルス感染、細菌および原生動物の感染などを含むＴ細胞の活性化が関連する多くの条件の経過をモニターすることで実施することができる。以下の実施例は例示のために提示されたものであって、これに限定すべく提示されているのではない。実施例実施例１ＨＧＭＳによるＣＤ３^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１６^-、ＣＤ１９^-、ＨＬＡ−ＤＲ⁺樹状細胞の精製材料および方法ヒトＮＰＢＣの調製ＮＰＢＣは、フィコール−ヒパック（Ficoll-Hypaque）（Pharmacia，Uppsala，Sweden）で遠心分離することによって白血球を多く含む被膜形成細胞から得た。遠心分離を行った後に界面の細胞を集めて緩衝液に再懸濁し、３００×ｇで沈降させてから、続いてもう一度再び緩衝液に再懸濁し、２００×ｇで遠心分離して血小板を除去した。標識約２×１０⁸個のＮＰＢＣは、ビオチン化α−ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）、α−ＣＤ１４（２μｇ／ｍｌ）、α−ＣＤ１６（２μｇ／ｍｌ）、α−ＣＤ１９（５μｇ／ｍｌ）、ジゴキシゲニン結合抗−ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（５μｇ／ｍｌ）およびヒトＩｇＧ（１．６ｍｇ／ｍｌ）を用いて容積１ｍｌのＰＢＳ、即ち１％の仔牛血清アルブミン中で８℃で１０分間インキュベートし、続いて二度洗浄した（３００×ｇ）。磁気標識上記に記載したようなビオチン化抗体を用いて標識された細胞は、ストレプトアビジンを結合したコロイド状の超常磁性微粒子を用い、容積１ｍｌ中で８℃でインキュベートした。１５分間たった時点でストレプトアビジン−シクローム（CyChrome）（Pharmingen，San Diego，CA）を添加（２μｇ／ｍｌ）してその細胞を更に８℃で５分間インキュベートした。続いてその細胞を再び洗浄して１ｍｌの緩衝液に再懸濁した。ＨＧＭＳによる細胞の除去磁気的に標識されたＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９陽性細胞を、ＭＡＣＳ永久磁石内に挿入されたＣＳカラム（磁性化できるスチールウールマトリックス）を通過させることにより除去し、「Milt eyi et al．(1992)上記」によって記述されているように本質的に選別した。最適な除去を行うために、ＭＡＣＳカラムの出口に２２Ｇの磁針を用いることによって流速をほぼ３ｍｌ／分に維持した。この細胞を続いて１ｍｌの緩衝液で洗い流した。細胞分離の効果を評価するために、非分離細胞のアリコート、ならびに磁性細胞画分および非磁性細胞画分のアリコートを、FACScanフローサイトメーター（Becton Dickinson，San Jose，CA）を用いて二パラメーターサイトメトリー分析によって分析した。各試料について１０，０００回記録をして、FASCcan リサーチソフトウエア（Becton Dickinson）を用いて分析した。生存細胞は、死滅細胞を特異的に染色するヨー素化プロピジウム（ＰＩ）を用いて、分散、およびヨー素化プロピジウム染色とフィコエリトリン染色との相対比により通過させた。抗−ジゴキシゲニン標識ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９陽性細胞を除去したＮＰＢＣを、コロイド状の超常磁性微粒子に結合した抗−ジゴキシゲニンモノクローナル抗体と共に、１ｍｌの容積中８℃でインキュベートした。１５分経過した後、ＰＥに結合した抗−ジゴキシゲニンモノクローナル抗体を添加し、その細胞を８℃で更に５分間インキュベートした。続いてその細胞を再び洗浄し、０．５ｍｌの緩衝液中に再懸濁した。ＨＧＭＳによる細胞の濃縮磁気的に標識されたＨＬＡ-ＤＲ^*細胞を、MiniMA CS永久磁石内に挿入されたMiniMACSカラム（Miltenyi Biotec GmbH，Bergish Gl adbach,ドイツ）で濃縮した。１ｍｌの容積で約０．３５ｍｌ／分の流速で、陰性細胞をそのカラムから洗い流した。続いてそのカラムを０．５ｍｌの緩衝液を用いてさらに４度洗浄した。最終的に、ＨＬＡ−ＤＲ⁺細胞が、磁石から１ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ中にカラムから溶出された。生存細胞の数は、除去段階および濃縮段階において、ＭＡＣＳカラムを通過させる直前および直後にNeubauerカウンターチャンバーを用いて評価した。死滅細胞は、トリパンブルー染色により排除した。細胞分離の効果を評価するために、非分離細胞のアリコート、ならびに磁気細胞画分および非磁気細胞画分から得られるアリコートをＦＡＣＳｃａｎを用いるフローサイトメトリーによって分析した。対比染色法新たに末梢血から単離された樹状細胞を、α−ＣＤ４−ＦＩＴＣ、α−ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ、α−ＣＤ３３−ＦＩＴＣまたはα−ＨＬＡ−ＤＲのいずれかとともに８℃で１０分間インキュベートした。その後で細胞を一度洗浄し、続いてフローサイトメトリーで分析した。樹状細胞培養樹状細胞を、血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、および５％のＦＣＳを含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地で７０時間培養した。結果選別された群の分析が図１に示されている。ＣＤ３^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１６^- 、ＣＤ１９^-、ＨＬＡ−ＤＲ⁺の表現形質を備えた樹状細胞群が、９５％の純度で単離された。樹状細胞はＣＤ４陽性であった。二つの異なる群が存在しており、ＣＤ１１ｃの発現に基づいて区別することができた。樹状細胞の前駆体がＣＤ１１ｃ陰性であり、成熟した樹状細胞がＣＤ１１ｃ陽性である。新しく単離された樹状細胞は特徴的な樹状形態を欠如しており、リンパ球よりもわずかに高く前方に分散する中間の大きさの細胞の外観を有している。図１Ａ〜１Ｃには、磁気精製方法のフローサイトメトリーによるモニターの結果が示されている。ＣＤ３^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１６^-、ＣＤ１９^-、ＨＬＡ−ＤＲ⁺ ＤＣが、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９陽性細胞の免疫磁気的除去およびそれに続くＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の濃縮によって新しいＮＰＢＣから濃縮した。ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９陽性細胞は、ビオチン化モノクローナル抗体およびストレプトアビジン−結合コロイド状超常磁性微粒子を用いて非直接的に磁性的に標識した。ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞は、ジゴキシゲニンを結合した抗−ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂおよびコロイド状の超常磁性粒子に結合したジゴキシゲニンｍＡｂを用いて非直接的に標識した。細胞は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９についてはストレプトアビジンシクロームを用いて染色し、ＨＬＡ−ＤＲについてはフィコエリトリンに結合した抗−ジゴキシゲニンｍＡｂを用いて染色した。生存細胞は光分散シグナルによって通過させた。樹状細胞のパーセントは、囲まれた細胞の脇に示されている。図１Ａ（ｉ）は、非分離ＮＰＢＣＰＥ抗−ＨＬＡ−ＤＲ染色に対するシクローム抗−ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９染色のドットプロットである。図１Ａ（ii）は、（ｉ）と同じ群から得られる前方向の分散（ＦＳＨ−Ｈ）と横方向の分散（ＳＳＨ−Ｈ）シグナルのドットプロットである。図１Ｂ（ｉ）は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９ポシティブ細胞を磁気的に除去した後でのＮＰＢＣを示している。図１Ｂ（ii）は、（ｉ）と同じ群から得られる前方向と横方向の分散である。図１Ｃ（ｉ）は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ１９陽性細胞を除去した後、およびＨＬＡ−ＤＲ⁺細胞を濃縮した後でのＮＰＢＣを示している。図１Ｃ（ii）は、（ｉ）と同じ群から得られる前方向および横方向の分散である。図２Ａは、ＣＤ４−ＦＩＴＣを用いて対比染色した後でのＣＤ３^-、ＣＤ１４^- 、ＣＤ１６^-、ＣＤ１９^-、ＨＬＡ−ＤＲ⁺樹状細胞のドットプロットである。図２Ｂは、ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣを用いて対比染色した後での（２Ａ）と同じ群を示している。図２Ｃは、非分離の末梢血単核細胞についてのＣＤ３３染色と、（２Ａ）で示された単離された樹状細胞群についてのＣＤ３３染色との比較を示している。非分離細胞の中で、ＣＤ３３が単核細胞上に発現している。樹状細胞の前駆体におけるＣＤ３３の発現は、単核細胞で見られた発現よりも弱く、成熟樹状細胞ではその発現は強い。図２Ｄは、非分離の末梢血単核細胞についてのＣＤ１１ｂ染色と、（２Ａ）で示された単離された樹状細胞群についてのＣＤ１１ｂ染色との比較を示している。非分離の末梢血単核細胞の中で、ＣＤ１１ｂが単球上に高いレベルで発現するが、ＮＫ細胞においての発現量は少ない。樹状細胞の発現はＮＫ細胞に匹敵するが、単核細胞で見られる発現よりは弱い。図３は、７０時間培養したあとでＣＤ３^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１６^-、ＣＤ１９^- 、ＨＬＡ−ＤＲ⁺樹状細胞から発生する分散シグナルのドットプロットである。図１Ｃ（ii）に示されている新しく単離された細胞に比較すると、横方向の分散が有意に増加している。新しく単離された樹状細胞は特徴的な樹状形態を欠如しており、リンパ球よりもわずかに高く前方に分散する中間の大きさの細胞の外観を有している。単純な卵形またはぎざぎざの核を有する丸い細胞と、穏やかにゆがんだ縁および更に複雑なまたは小葉状の核を有する丸くない細胞とを区別することができる。培養を行ったあとで血液のＤＣは、樹状処理がなされたことを表す典型的なＤＣ形態を示す。実施例２ＨＧＭＳによるＣＤ３^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１６^-、ＣＤ４⁺樹状細胞の精製材料および方法は、以下のような違いがあるが本質的には実施例１で記載したとおりである。２×１０⁸個の新しく単離された末梢血液の単核細胞は、ビオチン化したα−ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）、α−ＣＤ１４（２μｇ／ｍｌ）およびα −ＣＤ１６（２μｇ／ｍｌ）、ジゴキシゲニン結合α−ＣＤ４ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ）およびヒトＩｇＧ（１．６ｍｇ／ｍｌ）を用いて容積１ｍｌ中で８℃で１０分間インキュベートし、続いて二度洗浄した（３００×ｇ）。続く免疫磁気的除去段階では、ＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ１６を欠如する細胞を選択した。濃縮段階ではＣＤ４を発現する細胞を選択した。選別した群の分析が図４に示されている。ＣＤ３^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１６^-およびＣＤ４⁺の表現形質を備えた樹状細胞群が、９７％の純度で単離された。図４Ａ〜４Ｃには、磁気精製方法のフローサイトメトリーによるモニターの結果が示されている。ＣＤ３^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１６^-、およびＣＤ４⁺ＤＣは、ＣＤ３、ＣＤ１４、およびＣＤ１６陽性細胞の免疫磁気的除去およびそれに続くＣＤ− ４陽性細胞の濃縮によって新しいＮＰＢＣから濃縮した。ＣＤ３、ＣＤ１４、およびＣＤ１６陽性細胞は、ビオチン化モノクローナル抗体およびストレプトアビジン−結合コロイド状超常磁性微粒子を用いて非直接的に磁性的に標識した。ＣＤ４陽性細胞は、ジゴキシゲニンを結合した抗−ＣＤ４ｍＡｂおよびコロイド状の超常磁性粒子に結合したジゴキシゲニンｍＡｂを用いて非直接的に標識した。細胞は、ＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ１６についてはストレプトアビジンシクロームを用いて染色し、またＣＤ４についてはフィコエリトリンに結合した抗−ジゴキシゲニンｍＡｂを用いて染色した。生存細胞は光分散シグナルによって通過させた。樹状細胞のパーセントは、囲まれた細胞の脇に示されている。図４Ａ（ｉ）は、非分離ＮＰＢＣのＰＥ抗−ＣＤ４染色に対するシクローム抗−ＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ１６染色のドットプロットである。図４Ａ（ii ）は、（ｉ）と同じ群から得られる前方向の分散（ＦＳＨ−Ｈ）および横方向の分散（ＳＳＨ−Ｈ）シグナルのドットプロットである。図４Ｂ（ｉ）は、ＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ１６陽性細胞を磁気的に除去した後でのＮＰＢＣを示している。図４Ｂ（ii）は、（ｉ）と同じ群から得られる前方向および横方向の分散である。図４Ｃ（ｉ）は、ＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ１６陽性細胞を除去し、ＣＤ４⁺細胞を濃縮した後でのＮＰＢＣを示している。図４Ｃ（ii）は、（ｉ）と同じ群から得られる前方向および横方向の分散である。図５は、αＨＬＡ−ＤＲを用いて対比染色した後でのＣＤ３^-、ＣＤ１４^-、ＣＤ１６^-、ＣＤ１９^-、ＣＤ４⁺樹状細胞のドットプロットである。ＣＤ４の発現により単離されたほとんど全ての細胞が、ＨＬＡ−ＤＲを発現している。本発明が血液から造血樹状細胞および樹状細胞の前駆体を分離するための簡単で迅速な方法を提供することが、上述した結果より明らかである。操作の容易性、ならびに試料の数および大きさを大きくする可能性は、従来の方法を越えた意味のある利点を提供する。この細胞は、インビボおよびインビトロでＴ細胞刺激を行うための抗原提示細胞の起源として有用である。またこの細胞は、樹状細胞の生長、分化、および機能を分析するにあたっても有用である。本明細書に引用された刊行物および特許出願はすべて、個々に参照として組み入れられると特別におよび個別に示されていなくても、参照として本明細書に組み入れられる。前述した発明は、明確な理解を助ける目的で説明および例示のために詳細に記述されているが、本発明の開示を参照することにより、添付の請求の範囲の本旨または範囲を逸脱することなく変更および修正を加えることができることは当業者にとって容易に明らかとなるであろう。

Claims

【特許請求の範囲】１．血液試料から造血樹状細胞を濃縮する方法であって、該血液試料から有核細胞の懸濁液を調製し、該有核細胞の懸濁液に、非樹状造血細胞により発現されかつ樹状細胞には存在しない一個またはそれ以上の細胞表面抗原に特異的な磁気的に結合した試薬を添加し、該細胞の懸濁液を磁場の存在下で強磁性マトリックスに通過させ、該非樹状造血細胞により発現されかつ樹状細胞には存在しない一個またはそれ以上の細胞表面抗原を含む細胞が実質的に含まれない除去された試料を提供するために、該強磁性マトリックスに結合しない細胞を収集し、該除去された試料に、樹状細胞により発現される細胞表面抗原に特異的な磁気的に結合した試薬を添加し、該除去された試料を、磁場の存在下で強磁性マトリックスに通過させ、該結合しない細胞を含むマトリックスを洗浄し、造血樹状細胞を含む濃縮された細胞試料を提供するために、磁場の実質的な非存在下で該マトリックスから結合細胞を溶出すること、を含む方法。２．濃縮された細胞試料が、造血樹状細胞を少なくとも９５％含む造血樹状細胞を含む、請求の範囲１に記載の方法。３．樹状細胞により発現される細胞表面抗原が、ＣＤ４またはＨＬＡクラスIIタンパク質である、請求の範囲２に記載の方法。４．ＨＬＡクラスIIタンパク質がＨＬＡ−ＤＲである、請求の範囲３に記載の方法。５．樹状細胞により発現される細胞表面抗原に特異的な磁気的に結合した試薬が、成熟した造血樹状細胞により発現される細胞表面抗原に特異的なものである、請求の範囲２に記載の方法。６．成熟した造血樹状細胞により発現される細胞表面抗原が、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｃまたはＣＤ４５ＲＡである、請求の範囲５に記載の方法。７．樹状細胞により発現される細胞表面抗原に特異的な磁気的に結合した試薬が、造血樹状細胞の前駆体により発現される細胞表面抗原に特異的なものである、請求の範囲２に記載の方法。８．造血樹状細胞の前駆体により発現される細胞表面抗原が、ＣＤ４５ＲＯである、請求の範囲７に記載の方法。９．非樹状造血細胞により発現されかつ樹状細胞には存在しない一個またはそれ以上の細胞表面の抗原が、ＣＤ３、ならびにＣＤ１４およびＣＤ１１ｂのいずれかである、請求の範囲２に記載の方法。１０．非樹状造血細胞により発現されかつ樹状細胞には存在しない一個またはそれ以上の細胞表面抗原が、ＣＤ１６およびＣＤ１９の少なくとも一つをさらに含む、請求の範囲９に記載の方法。１１．抗原提示細胞を濃縮する方法であって、請求項１に記載された造血樹状細胞群を濃縮し、該濃縮された群を液体培養培地に添加し、インビトロで少なくとも１日増殖させることを含む、方法。１２．液体培養培地が、造血樹状細胞の前駆体から成熟樹状細胞への分化を増強するのに十分な濃度のサイトカインＧＭ−ＣＳＦを含む、請求の範囲１１に記載の方法。１３．強磁性マトリックスの二つのカラムと、ＣＤ１４およびＣＤ３に特異的な磁気的に結合された抗体の混合物と、ＣＤ４およびＨＬＡ−ＤＲの少なくとも一つに特異的な磁気的に結合された抗体とを含む、血液から樹状細胞を分離するためのキット。