JPH10500951A - コードされた組合せライブラリー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は組合せライブラリーの製法および該方法により調製される組合せライブラリーに関する。また、組合せライブラリーより所望の特性を有する化合物またはフローサイトメトリーを用いた一連の組合せライブラリーの同定方法に関する。さらに、蛍光団標識ビーズを用いる組合せライブラリーのコード方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 コードされた組合せライブラリー 発明の分野 本発明の分野は、種々の組成を有する数多くの生成物が得られる１つまたはそ れ以上のコードされた組合せライブラリーの合成に係わる組合せケミストリーに 関する。本発明はまた、組合せライブラリーのコード法に関する。 発明の背景 種々の生物学的反応を効果的に調節できる新たな化学物質の検索を続行するに あたり、検索を行うための常套手段は、既存の種々の化学物質、例えば天然に存 在する化合物または合成ライブラリーもしくはデータバンクに存する化合物をス クリーニングすることである。既存の化学物質の生物活性は、スクリーニングさ れる化学物質の特定の性質を試験するように企画した検定、例えばその物質の特 定のレセプター部位への結合能を試験するレセプター結合検定にその化学物質を 適用することで測定される。 無作為に選択された数多くの化合物を生物活性に関してスクリーニングするた めの時間および経費を減少させる試みにおいて、リード化合物を発見するための 化合物のライブラリーを得るために数度の開発がなされてきた。分子多様性を化 学的に創製することは、新たなリード構造を検索するうえで主要な手段となって いる。現在、非常に多くの分子的に多様な化合物を化学的に創製する既知の方法 は、一般に、固相合成法を使用し、特にペプチドおよびペプチドライブラリーを 合成し、同定するものである。例えば、以下の先行文献がある：レブル（Ｌebl ）ら、Ｉnt.Ｊ.Ｐept.Ｐrot.Ｒes.，４１，ｐ２０１（１９９３）には、ペプチ ドおよび樹脂間を選択的に切断し得るリンカーを提供することで、樹脂に結合し たままのペプチドがある状態で可溶性形態のペプチドの特定量を樹脂から遊離さ せて検定できる方法が開示されており、これは連続的に行うことができる；ラム （Ｌam）ら、Ｎature，３５４，ｐ８２（１９９１）および（ＷＯ ９２／００ ０９１）には、ポリスチレンまたはポリアクリルアミド樹脂などの固相支持体に 線状ペプチドを合成させる方法が開示されている；ゲイセン（Ｇeysen）ら、Ｊ. Ｉmmunol.Ｍeth.，１０２，ｐ２５９（１９８７）には、ブロック上に、９６ウ ェルマイクロタイタープレートのウェルの配列に対応するように配列した加工ポ リスチレンピンでのペプチド合成を開示している。Ｈoughtenら、Ｎature，３５ ４，ｐ８４（１９９１）およびＷＯ ９２／０９３００では、可溶性ペプチドプ ールに係わる抗体もしくは受容体結合配列のデノボ研究の方法を開示している。 リード生成に関するこれらのすべての方法に伴う主要な障害は、技術的な考察 は別として、リードの品質である。線状ペプチドは、歴史的に、医薬的な目的の ためには比較的粗成なリードとして知られている。とりわけ線状ペプチドを非ペ プチドリードに変換する合理的な方法はない。上記のように、ペプチド受容体に 対する非ペプチドリードを決定するためには、化合物を膨大なデータバンクのス クリーニングに付し、各化合物を個々に試験しなければならない。 広範な有機反応は、樹脂上に固定化した基質上で行うことができるということ が知られている。これらの反応は、当業者に周知であるペプチド合成反応に加え て、ベンジル化ハロゲン化物の求核置換、ハロゲン化、ニトロ化、スルホン化、 酸化、加水分解、酸塩化物形成、フリーデル-クラフツ反応、水素化リチウムア ルミニウムによる還元、金属化、および有機金属化ポリマーと広範な試薬との反 応を包含する。例えば以下の先行文献がある：Ｎ.Ｋ.Ｍathurら、Ｐolymers as Ａids in Ｏrganic Ｃhemistry，Ａcademic Ｐress，Ｎew Ｙork，ｐ．１８（１ ９８０）。加えて、Ｆarrallら、Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.，４１，ｐ．３８７７（１９７ ６）では、樹脂を用いて行ったこれらの反応のいくつかについて実験の詳細を記 載している。 非ペプチド有機化合物、例えばペプチド疑似物質は、ある種の酵素受容体に対 する親和性においてペプチドリガンドに優ることが多い。高い親和性を有する生 物学的リガンドおよび究極的に新規で重要な医薬品を迅速に同定するための効果 的な方法では、生物学的なアクセプター（例えば受容体または酵素）との間で１ またはそれ以上の形態の相互作用、例えば水素結合、塩架橋、π錯形成反応、疎 水効果等を確立することができる種々の構造単位を含有する非ペプチド構造の多 様なライブラリーを迅速に構築し、スクリーニングすることが必要とされる。し かしながら、非ペプチド分子を含有する合成試験化合物のライブラリーの生成お よびスクリーニングに関する研究は、現在、初期の段階にある。この分野に由来 する一例としては、ＥllmanおよびＢuninの、固相支持体でのベンゾジアゼピン 類の組合せ合成に関する研究（Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.，１１４，１０９９７，（１ ９９２）；Ｃhemical and Ｅngineering Ｎews，１９９３年１月１８日，ｐ．３ ３参照）がある。 非ペプチドライブラリーの生成および使用の分野における未解決の問題の鍵は 、有望な生物学的活性を示すライブラリーから選択される分子構造の解明である 。 ペプチドライブラリーを用いて直列に合成した唯一のヌクレオチド配列コード を用い、ライブラリーから選択されるペプチドの構造を明らかにする試みが、Ｂ rennerおよびＬerner（Ｓ.ＢrennerおよびＲ.Ａ.Ｌerner、Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad. Ｓci.ＵＳＡ，１９９２ ８９，５３８１−５３８３）により報告されている。各 ペプチドに付着するコードのヌクレオチド配列はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）を介して増幅可能でなければならない。しかしながら、ヌクレオチド合成技術 は、多くの型の分子ライブラリーの合成に必要な合成技術のすべてと合致するも のではない。さらに、ヌクレオチドとライブラリー中の合成試験化合物を非常に 接近させると、生物検定の間にこれらの分子間で酵素の標的受容体とリガンドと の結合を妨害する相互作用が生じることがあり、このこともこの方法を限定的な ものとしている。ライブラリーのヌクレオチド成分は、生物検定の間、種々の他 の方法に干渉することもある。 Ｋerrら（Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.，１９９３，１１５，２５２０−２５３１）は 、ペプチドコード鎖と同時に非天然アミノ酸残基を含有するペプチドの液相ライ ブラリーを合成することにについて報告した。このライブラリーにおけるペプチ ドリガンドとそのコード鎖は互いに共有結合しており、合成試験化合物および対 応するコードの対を単離および配列決定することができる。しかしながら、上記 のＢrennerおよびＬernerに説明されている核酸コード化ライブラリーについて い えば、コード化ペプチドがスクリーニング検定を妨害することがある。 ＰＣＴ／ＵＳ９３／０９３４５は、所定の二コード系において、多数のタグ（ ｔａｇ）を結合させることによって組合せライブラリーの活性部分を同定する方 法について記載している。 ＰＣＴ／ＨＵ９３／００３０は、ペプチド合成にて用いるための蛍光標識化サ ブライブラリーペプチドキットを記載している。 ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６０７８は、多重配列を用いる組合せライブラリーのコ ード方法について記載している。 公知方法による多くの欠点およびそれらにより未解決の多くの要求が本発明に より処理され、以下にさらに詳しく説明するように、本発明は既知の方法に比べ 多くの利点を提供するものである。 発明の要約 本発明は、１またはそれ以上のコードされた組合せライブラリーを特定の一連 の反応シーケンスより調製し、その化合物を生物活性について試験することから なる、所望の特性を有する化合物の同定方法およびリード構造に不可欠な部分の 同定方法に関与する。 本発明はまた、一連の組合せライブラリーの各組合せライブラリーにおける単 一のレジストリーのコード方法および単一のコードされたレジストリーを有する 組合せライブラリーにも関する。 本発明はさらに、タグを付したビーズを利用することからなる、組合せライブ ラリーのコード方法に関する。 本発明はまた、組合せライブラリーの各々の選択肢のコード方法およびそれに よりコードされた組合せライブラリーに関する。 本発明はまた、それに結合した蛍光標識化アイデンティファイアーを有するビ ーズに関する。 発明の詳細な記載 本明細書で用いる「ビーズ」なる用語は、組合せ合成についての基材を提供す ることができ、フローサイトメトリーによる処理能を有するいずれの固相支持物 質をも意味し、例えば１〜２％架橋ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエ チレングリコールポリスチレン共重合体、好ましくはテンタゲル（Tentagel）１ ０〜１００ミクロン粒子、最も好ましくはテンタゲル１０〜３０ミクロン粒子で ある。 本明細書で用いる「分類する」なる用語は、ビーズをフローサイトメトリーで 共通のタグを付した状態を有する群を形成させることを意味する。 本明細書で用いる「分離」または「分裂」なる用語は、コード化したビーズま たは組合せライブラリーのビーズについて言及する場合、ビーズの混合物を群に 分割し、それにより各群が混合物を、好ましくは全構成要素を統計的に平均に含 有することを意味する。 本明細書で用いる「タグ」なる用語は、特記しない場合、フローサイトメトリ ーにより分類可能な、１つのビーズまたはビーズ群のコード化特性、例えば大き さの差異、材料組成物の差異、フロー特性の差異、単一の蛍光マーカー、好まし くは蛍光標識アイデンティファイアーを意味する。 本明細書で用いる「蛍光標識アイデンティファイアー」または「アイデンティ ファイアー」なる用語は、蛍光団および非蛍光団の添加比率によるか、または多 数、好ましくは２つの、異なる蛍光団を種々の比率で添加することにより、１つ のビーズまたはビーズ群に付着した解読標識を意味する。 本明細書で用いる「強度分別した」なる用語は、蛍光団および非蛍光団を種々 の比率で１つのビーズまたはビーズ群に添加した（本明細書で用いる）アイデン ティファイアーを意味する。 本明細書で用いる「選択肢」なる用語は、（ペプチド化学に限定しない）組合 せ合成における規定の段階の択一的な変更、例えば反応物、試薬、反応条件、お よびそれらの組み合わせを意味する。「段階」なる用語が化合物またはリガンド の連続合成における一工程に対応する場合、化合物またはリガンドは組合せ合成 の最終産生物である。本明細書で用いる「レジストリー」なる用語は、上記で示 す「段階」なる用語と同じ意味である。 本発明の好ましい態様において、一連の組合せライブラリーを調製し、各個々 のライブラリーを実質的に同一の特定の組の反応シーケンスから調製し、そこで は各組合せライブラリー内で単一のレジストリーをコードし、均質なレジストリ ーを有する化合物の混合物に応じて分析する。好ましくは、いずれかのライブラ リーの特定のコードされたレジストリーは、他のライブラリーと異なり、調製さ れたライブラリーの数は単一のライブラリーのレジストリーの数に等しいであろ う。 第１のライブラリー調製についての合成を実施するにあたり、まず始めに多く のビーズ、通常少なくとも１０³個、さらに通常少なくとも１０⁴個、および望ま しくは少なくとも１０⁵個、一般的に少なくとも１０¹⁵個を超過しないで、さら に通常少なくとも１０¹⁰個を超過しないビーズで開始し、ビーズを群に分離し、 ビーズを各群内で同様にタグを付し、各群を、好ましくはアイデンティファイア ーにより単一的にタグを付すか、または一群はタグを付さず、残りの各群は、好 ましくはアイデンティファイアーにより単一的にタグを付す。速やかに同定可能 なビーズ群の数は、最初のレジストリーにおける選択肢数に対応するであろうし 、各群の全体を別の容器に入れる。マイクロタイターウェルプレート、フラスコ 、メリーフィールド合成器等を用いることができる。ビーズは通常、少なくとも 各々１ビーズ、通常は多くのビーズ、一般的には１０００またはそれ以上のビー ズの群に分割し、ライブラリーに関与するレジストリーの全数に依存して１０⁵ またはそれ以上にすることができる。 次に適当な試薬を個々の容器の各々に加えて、段階（または本明細書において 用いる「レジストリー」）においてこれらを加工する。一度反応（複数の反応） が完了すると、ビーズを洗浄して試薬を除去し、次に全ビーズを単一の混合物に まとめ、次いでビーズを次のレジストリーのための選択肢数に応じて分離する。 ビーズの分割過程に続くのは（レジストリー形成のための）合成段階であり、次 いで再度まとめたビーズを、第１の組合せライブラリーが完了するまで繰り返し 行う。 ある例では、同じ反応を２またはそれ以上の容器で行い、その他の選択肢に比 較して特定のレジストリーにおける特定の反応性を有する産生物の比率を増強す ることができる。別の例では、１またはそれ以上のレジストリーに、別に取って おき反応に寄与しなかったビーズの一部を関与させることができ、最終産生物に 関連する可変性を増強できる。別の態様では、一定量を異なる合成経路に供する ことができる。 このように調製したライブラリーは、第１のレジストリーのみの反応シーケン スを同定するタグを付したビーズを含有する。 第１のレジストリーのみの反応シーケンスを同定するタグを付したビーズを含 有する組合せライブラリーは、以下のスキーム１の概要に従って調製できる。 １） 合して分離する。 ２） ＦＭＯＣを脱保護する；ＦＭＯＣ−ＮＨＣＨＲ^B1-BNＣＯ₂Ｈを連結する 。 ３） ライブラリー合成を完了するまで、ＦＭＯＣ−ＮＨＣＨＲ^B1-BNＣＯ₂Ｈ をＦＭＯＣ−ＮＨＣＨＲ^C1-CNＣＯ₂Ｈ，．．．ＦＭＯＣ−ＮＨＣＨＲ^X1-XNＣＯ₂ Ｈと置き換える以外は工程１および２を繰り返す。 ４） フローサイトメトリーによりビーズを分類する。 ５ａ） 分類したビーズの化合物を切断するか、または ５ｂ） 好ましくはバイオパニングまたはフローサイトメトリーにより、直接的 にビーズに結合した化合物を試験する。 スキーム１は、第１のレジストリーのみがコード化された組合せライブラリー の調製の概要を示す。スキーム１で示すように結合した蛍光標識化アイデンティ ファイアーを有するビーズは、試験する化合物の切断を可能にするリンカーで誘 導させる。その後、同様にタグを付したビーズの各群を別の容器に入れ、規定の 反応条件（または本明細書で用いる可変ビルディングブロック）に供して第１の レジストリーを形成する。一度反応を完了すると、ビーズを単一の混合物に合し 、第２のレジストリーの選択肢数に応じて分離し反応させる。ビーズを分割し、 次いで規定の反応条件に供し、次いでビーズを再び合するこの方法は、最初のラ イブラリーを完了するまで繰り返し行う。完全なライブラリーは、次に生物活性 を試験する。均質な最初のレジストリーを有する化合物の混合物の相対活性に関 する情報は、このライブラリーから得られる。 第２のライブラリーの調製についての合成を行う場合、第１のライブラリーで 用いたのと同数のビーズで開始するのが好ましく、上記ビーズは第１のライブラ リーと同様の方法でタグを付すことができる。第２のライブラリーで使用するビ ーズは、最初単一の混合物に合し、次いで第１のレジストリーの選択肢数に応じ て分離する。第２のライブラリーおよびその後のすべてのライブラリーの各レジ ストリーのための合成図式の選択肢は、最初のライブラリーにおける対応するレ ジストリーの合成図式／選択肢と、実質的に同一である。一旦、第２のライブラ リーの最初のレジストリーの反応（複数）が完了すると、ビーズを洗浄して試薬 を除去し、続いて全ビーズを単一の混合物に合し、次に同様にタグを付したビー ズに応じて混合物を群に分類できる。このビーズを合したものは、フローサイト メトリーを用いて分類するのが好ましい。一旦、第１のレジストリーからのビー ズを分類し、同様にタグを付した標識化した各群のビーズを別の容器に入れ、第 １のライブラリーの第２のレジストリーで用いたのと同一の合成スキーム（複数 ）／選択肢（複数）に供する。一度、反応（複数）が完了すると、ビーズを洗浄 して試薬を除去することが望ましく、続いて全ビーズを単一の混合物に合し、次 いでビーズを第１のライブラリーの第３のレジストリーにおける選択数に応じて 分離できる。このビーズの分割工程に続いて、第１のライブラリーの対応するレ ジストリーの合成スキーム（複数）／選択肢（複数）に供し、次いでビーズを再 度合し、これを第２のライブラリーが完了するまで行う。 このように調製したライブラリーは、第２のレジストリーのみの反応シーケン スを同定するタグを付したビーズを含有する。 第２のレジストリーのみの反応シーケンスを同定する、タグを付したビーズを 含有する組合せライブラリーは、以下のスキーム２の概要に従って調製できる。 １） 合して分離する。 ２） ＦＭＯＣ−ＮＨＣＨＲ^A1-ANＣＯ₂Ｈを連結する。 ３） フローサイトメトリーにより、合して分類する。 ４） ＦＭＯＣを脱保護する；ＦＭＯＣ−ＮＨＣＨＲ^B1-BNＣＯ₂Ｈを連結する。 ５） 合して分離する。 ６） ＦＭＯＣ−ＮＨＣＨＲ^B1-BNＣＯ₂ＨをＦＭＯＣ−ＮＨＣＨＲ^C1-CNＣＯ₂Ｈ ,．．．．ＦＭＯＣ−ＮＨＣＨＲ^X1-XNＣＯ₂Ｈで置き換える以外は、合成を完了 するまで工程４および５を繰り返す。 ７） フローサイトメトリーにより、合して分類する。 ８ａ） 分類したビーズの化合物を切断するかまたは、 ８ｂ） ビーズに直接結合した化合物を、好ましくはバイオパニングまたはフロ ーサイトメトリーにより試験する。 スキーム２は第２のレジストリーのみがコードされた組合せライブラリーの調 製の概要を示す。スキーム２で用いられる蛍光標識化アイデンティファイアーを 結合したビーズは最初単一の混合物に合し、次いで第１のライブラリーの第１の レジストリーの選択肢数に応じて群に分離する。続いて各群を別の容器に入れ、 第１のライブラリーの第１のレジストリーと同一の反応条件に供し、第２のライ ブラリーの第１のレジストリーを形成する。一旦、反応（複数）が完了すると、 ビーズを単一の混合物に合し、次いで同様にタグを付したビーズに応じて群に分 類する。このビーズを合したものはフローサイトメトリーを用いて分類するのが 好ましい。同様にタグを付したビーズの各群は別の容器に入れ、第１のライブラ リーの第２のレジストリーと同一の反応条件に供し、第２のライブラリーの第２ のレジストリーを形成する。一旦、反応が完了すると、ビーズを単一の混合物に 合し、次いで第１のライブラリーの第３のレジストリーの選択肢数に応じて分離 し、適宜反応させる。ビーズを分割し続いて第１のライブラリーの対応するレジ ストリーの規定の反応条件に供し、再度合するこの方法は、第２のライブラリー が完了するまで繰り返し行う。ついで、完了したライブラリーを生物活性につい て試験する。均質な第２のレジストリーを有する化合物の混合物の相対活性に関 する情報は、このライブラリーから得られる。 各ライブラリーにおける種々の合成段階の前に分類操作を実施するという条件 で、（所望であれば）上記工程を繰り返し、その後のライブラリーを調製する。 このように調製した組合せライブラリーは単一のレジストリーのみの反応シーケ ンスを同定するタグを付したビーズを含有する。さらに、各組合せライブラリー における同定可能なコード化レジストリーは異なる。 後の組合せライブラリー Ｘ番目のレジストリーがコード化された組合せライブラリーの調製は、「好ま しくはフローサイトメトリーによる、結集および分類」の段階をＸ番目の可変ビ ルディングブロックの組み込みの直前に行うこと以外はスキーム２に記載した方 法と同一の方法で行う。次に完全なライブラリーの生物活性を試験する。均質な Ｘ番目の可変レジストリーを有する化合物の混合物相対活性に関する情報は、こ のライブラリーから得られる。 合成を完了した後、各ライブラリーを別個に生物活性について試験する。 本明細書で用いる「生物活性を試験する」または「望ましい特性を試験する」 なる用語は、以下に示す方法を含む医薬的な活性を試験するいずれの形態も含む 。ライブラリーの化合物は、例えば可溶性受容体検定を用いてバイオパニングに より、ビーズ上で試験でき、活性はフローサイトメトリーにより分析するのが好 ましい。別法として、ライブラリーの内容物をフローサイトメトリーにより分類 し、化合物をビーズ上で試験するか、または分類した化合物を試験の前にビーズ から切断してもよい。 すべての情報を組み合わせた時点で、どの可変ビルディングブロック（複数） が活性に重要であり、どれが重要でないかを示す各組合せライブラリーの母集団 分析が得られる。この種の分析は、活性または不活性の分析によりリード化合物 の不可欠部分を同定する構造活性相関（Ｓtructure Ａctivity Ｒelationship： ＳＡＲ）の研究と同等である。この分析により、特定のリード構造が得られ、（ ペプチド組合せライブラリーの位置的な検査におけるように）さらに多数のリー ド構造が潜在的に得られ、さらなる最適化のための最初の方向づけが即座に示唆 される。 上記のスキームのように調製した３レジストリー−３組合せライブラリーの分 析を、以下の表１に概要を示す。 第１の組合せライブラリーの分析により、可変ビルディングブロックＡのＳＡ Ｒが形成される。第２の組合せライブラリーの分析により、可変ビルディングブ ロックＢのＳＡＲが形成される。第３の組合せライブラリーの分析により、可変 ビルディングブロックＣのＳＡＲが形成される。３個の可変ビルディングブロッ ク（Ａ、ＢおよびＣ）のＳＡＲの分析は所望の反応シーケンスを同定し、多数の リード構造を示唆する。 本発明のさらなる態様において、蛍光標識化アイデンティファイアーを用いる コード化／タグ化組合せライブラリーの好ましい方法を提供する。本明細書で用 いる「蛍光標識化アイデンティファイアー」なる用語は、蛍光団標識化ビーズに 言及する場合、以下のことを意味する： ｉ） 特定のプールにおけるすべてのビーズは同一の蛍光強度を有し、異な るプールでは少なくとも２、好ましくは３またはそれ以上の因子によりいずれか 他のプールとは異なる強度を有するかまたは、 ii） 特定のプールの全ビーズが、同一の比率で蛍光タグの同一の組み合わ せを有するように、多数の、好ましくは２個の異なる蛍光タグを種々の比率で用 い、異なるプールでは： ａ） 同一の蛍光タグだが、いずれか他のプールとは異なる比率で ｂ） 異なる蛍光タグの組みを特定の比率で、または ｃ） ａ）およびｂ）の組み合わせ である。 フローサイトメーターは、２の因子により蛍光強度の異なるビーズを分類でき ることが知られている。フローサイトメトリーおよびフローサイトメトリーを用 いる一般的な方法の原理は、ＧroganおよびＣollins、Ｇuide to Ｆlow Ｃyto− metry Ｍethpds，Ｍarcel Ｄekker，Ｉnc.出版（１９９０）に記載されている。 強度分別蛍光団−標識化ビーズは、種々の量の蛍光団および非蛍光団を有する ビーズのプールを誘導することにより、または単一の反応性蛍光タグの反応時間 を変化させることにより調製できる。加えて、複数、好ましくは２個の蛍光タグ は、種々の比率でビーズのコード化に用いることができる。これは、例えばタグ 化工程（複数）において最初の蛍光タグ（Ａ）および第２の蛍光タグ（Ｂ）の化 学量を、Ａ：Ｂ＝１：１，１：２，２：１，１：４，４：１など種々に変化させ ることにより行うのが好ましい。 本明細書で用いる強度分別蛍光標識化ビーズは、以下のスキーム３および実施 例で概要を示す方法により調製できる。 上記スキーム１から３で用いる様に、Ｒは、蛍光タグＴ¹またはドーピング試 薬Ｄであり、Ｒ'は蛍光タグＴ²またはドーピングＤであり、ＲがＤである場合Ｒ 'はＤではないと規定する。 スキーム３で用いられる様に、ビーズのサンプル、好ましくはテンタゲル１０ 〜３０ミクロン粒子は、一般的な共役反応により、リンカー、好ましくはε−Ｂ oc−ＦＭＯＣリジンで誘導させる。別法として、ワング（Ｗang）リンカーと一 緒に用いられるようなベンジルアルコールリンカー、またはメリーフィールド（ Ｍerrifield）リンカーと一緒に用いられるようなベンジルハロゲン化リンカー 、またはリンク（Ｒink）リンカーと用いられるようなベンズヒドリルアミンリ ンカーは、アルコールのアルキル化、フリーデルクラフツ反応によるアルキル化 もしくはアリール化によるエーテル形成することにより、またはパラジウム媒介 交差共役反応による、または標準的なアミド共役反応によるビアリール形成に より、ビーズに結合できる。スキーム３に用いられるように、単一脱保護工程、 例えば２０％ピペリジン／ＤＭＦを、ＦＭＯＣの除去のために実施する。反応時 間を制限することによりタグ化反応を部分的に完了させ、それにより二機能リン カーの使用を避けることもできる。次にビーズをＮ個のプールに分割する。プー ル１は蛍光団例えばピレンブチル酸で誘導させる。プール２は蛍光団、例えばピ レンブチル酸、および非蛍光団（以下、「ドーピング試薬」という）、例えばブ チル酸、または異なる蛍光団例えばペリレンブチル酸の１：３混合物で誘導させ る。プールＮは蛍光団例えばピレンブチル酸、およびドーピング試薬、例えばブ チル酸、または異なる蛍光団、例えばペリレンブチル酸を１：３^(n-1)の比率で 誘導させる。 これらビーズのプールの各々は、フローサイトメトリーによりその他のビーズ のプールと区別できる。各々のビーズのプールはまた、肉眼で検査することによ り、互いに区別できるが、少しの変異体しかこの方法でコード化できない。さら に、異なる吸収及び放射波長を有する異なる蛍光団、並びに複数の蛍光団は、蛍 光抑制によりコード化でき、さらなる変異体をコード化する。それの比率がアイ デンティファイアーとなる複数の蛍光団の使用すると、同数のタグを用いて同定 できる変異体の数を非常に増加させることができ、ビーズの大きさに依存しない で分析できるなどの種々の利点がある。また、同じ方法を用い、好ましくは少な くとも５０ピコモルのリンカーを有するビーズで開始することにより、蛍光で不 要な分子量を有するライブラリーの構成成分を区別をするために用いることがで きるビーズを調製することができる。 本発明のとりわけ好ましい態様において、単一の組合せライブラリーは、各選 択肢を、タグ、好ましくは蛍光標識アイデンティファイアーを用いてコード化し 、生物活性を試験し、好ましくは最後のプールを混合することなく調製する。 本発明の特に好ましい態様において、以下のスキーム４に記載する「コンバイ ンおよびスピリットのプロトコル」を、コード化されたビーズを好ましくはその ビーズに蛍光標識アイデンティファイアーを結合して合成するのに用いる。「コ ンバインおよびスピリットのプロトコル」は、１または２個の蛍光タグしか含有 しないライブラリーを再合成または同時合成の必要がないという点で優れている 。この本発明の態様は、コード化されたビーズを、組合せライブラリーを実際に 合成する前に大量に調製できるので、実践という観点からみた場合、特に魅力的 である。 さらに本発明の好ましい態様は、蛍光標識アイデンティファイアーによりコー ドされたビーズを用いて調製した組合せライブラリーおよびこのような組合せラ イブラリーにより同定した医薬的に活性な化合物に関する。 さらに本発明の好ましい態様は、各選択肢が蛍光標識アイデンティファイアー によりコードされた組合せライブラリーおよび、このような組合せライブラリー により同定した医薬的に活性な化合物に関する。 さらに本発明の好ましい態様は、蛍光標識アイデンティファイアーによりコー ドされたビーズを用いて調製した組合せライブラリーで、上記ビーズがコンバイ ンおよびスピリットのプロトコルにより得られたもの、およびこのような組合せ ライブラリーにより同定した医薬的に活性な化合物に関する。 さらに本発明の好ましい態様は、各選択肢が蛍光標識アイデンティファイアー によりコードされた組合せライブラリーで、上記ビーズがコンバインおよびスピ リットのプロトコルにより得られたもの、およびこのような組合せライブラリー により同定した医薬的に活性な化合物に関する。 本発明に準じて調製した組合せライブラリーの例を、以下のスキーム４に概要 を示す。 スキーム４は各選択肢が唯一のアイデンティファイアーによりコードされる組 合せライブラリーの調製の概要を示す。スキーム４で用いるように、タグを付し ていないビーズは、（スキーム３で記載するように）第１のアイデンティファイ アーでコードされる。コードされたビーズを、単一の混合物に合し、次に第２の アイデンティファイアーの序数に応じて群に分ける。次いでビーズを第２のアイ デンティファイアーでコードする。（上記のコード化の工程を、望ましいサイズ のコードされたビーズ群が得られるまで繰り返す。）スキーム４に従って、第２ のアイデンティファイアーでコードされたビーズを、単一の混合物に合し、次に 第３のアイデンティファイアーの序数に応じて群に分ける。次いでビーズを第３ のアイデンティファイアーでコードする。 上記の方法に従って調製したコードされたビーズおよび上記の方法は、本発明 の請求の範囲の好ましい態様を表す。 このように調製したビーズは、第３のアイデンティファイアーに応じて、同様 のアイデンティファイアーの別個の均質なプールに保持し、特定の反応条件の第 １の段階（または本明細書で用いるレジストリー）に供する。第１のレジストリ ーの選択肢は、第３のアイデンティファイアーによりコードされる。次いでビー ズを、好ましくはフローサイトメトリーにより、第１のアイデンティファイアー に従って同様のアイデンティファイアーの均質なプールに合し、分類する。この ように得られたビーズを別個のプールに保持し、特定の反応条件の第２の段階に 供する。第２のレジストリーの選択肢は第１のアイデンティファイアーによりコ ードされる。次にビーズを、好ましくはフローサイトメトリーにより、第２のア イデンティファイアーに従って同様のアイデンティファイアーの均質なプールに 合して分類する。こうして得られたビーズは、別個のプールに保持し、特定の反 応条件の第３の段階に供する。第３のレジストリーの選択肢は、第２のアイデン ティファイアーによりコードされる。次にビーズを合し、第４の段階の選択肢数 に応じて群に分け、特定の反応条件の第４の段階に供する。このようにして得ら れたビーズのプールを、これらの別個の群で保持し、生物活性を試験する。第４ のレジストリーの選択肢は別個に保持する。 上記で示すように、これらの群は、各々、好ましくはフローサイトメトリーに より、または個々の群もしくは個々の群のより小さい集合体から化合物を切断す ることにより別個に生物活性を試験し、分析する。活性体の正確な反応歴は、各 々、対応するビーズの唯一のアイデンティファイアーを解読することにより同定 できる。上記のスキームでは、活性化合物が２群で見いだされた場合、次に蛍光 検出により個々のビーズを分析できる。もしＴ_3c、Ｔ_2a、Ｔ_2bがビーズ上に存在 すれば、活性構造の反応歴は：Ｙ₃−Ｚ₂−Ｐ₂−Ｑ₂である。 本明細書で用いる「コンバインおよびスピリットのプロトコル」なる用語は、 上記スキーム４の工程で同様に記載している。コンバインおよびスピリットのプ ロトコルによってコードされたビーズの形成は、スキーム４の工程１〜４に同様 に記載されている。各選択肢がコンバインおよびスピリットのプロトコルにより コードされる組合せライブラリーの形成は、スキーム４の工程１〜７に同様に記 載されている。 当業者であれば、さらに工夫することなく、前の記載に従って、本発明を最大 限利用するであろう。従って、以下の実施例は、単なる例示として、何ら本発明 の範囲を限定するものではないと解釈すべきである。 実施例１ ドーピング法による蛍光強度差によるフローサイトメトリーにより分類できる 蛍光標識化ビーズの調製。方法Ａ ： 二機能リンカー、例えばｅ−Ｂｏｃ−ＦＭＯＣ−Ｌ−リジン（８.４ｇ、６当 量、１８ミリモル、ノヴァバイオケム）、アミド共役試薬、例えばジイソプロピ ルカルボジイミド（２.３ｇ、２.８ｍｌ、６当量、１８ミリモル、アルドリッヒ ）を交差連結ポリスチレンビーズに連結したポリエチレングリコール（テンタゲ ルＭＮＨ₂、粒径１０ミクロン、１５.０ｇ、３ミリモル、ラップポリメーア）に 加え、適当な溶媒、例えばＮ−メチルピロリジン（３００ｍｌ）に懸濁し、一晩 撹拌する。反応物をガラスフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×１００ｍ ｌ）で洗浄する。 次にビーズを２５％ピペリジン／ＤＭＦ（３００ｍｌ）と１５分間撹拌する。 反応物をガラスフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×１００ｍｌ）次いで ＣＨ₂Ｃｌ₂（５×１００ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。方法Ｂ ： 方法Ａで記載するように、リジン誘導ビーズ（５.０ｇ）をＮ−メチルピロリ ジン（１００ｍｌ）に懸濁し、次いで蛍光団例えば１−ピレンブチル酸（１.７ ｇ、６当量、６ミリモル、アルドリッヒ）およびジイソプロピルカルボジイミド （０.７６ｇ、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反 応物をガラスフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いで ＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニ ンヒドリン試験により反応が完了するまで繰り返す。 次にビーズを２５％ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）中２時間撹拌し、Ｂoc 保護基を除去する。反応物をガラスフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５× ３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。 次にビーズをリンカー群、例えば４−（メチルヒドロキシフェニル）酢酸のｔ −ブチルジメチルシリルエーテル（１.３ｇ、６ミリモル）、ジイソプロピルカ ルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍｌ，６ミリモル）と、Ｎ−メチルピロリジ ン（１００ｍｌ）中一晩反応させる。反応物をガラスフリットを通して吸引濾過 し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×１００ｍｌ）で洗浄し、 次いで風乾する。 次にビーズをＴＨＦ（１００ｍｌ）に再懸濁し、脱シリル化試薬、例えばフッ 化テトラブチルアンモニウム（６ｍｌ、１.０Ｍ溶液、６ミリモル、アルドリッ ヒ）／酢酸アンモニウム（０.９２ｇ、１２ミリモル）を用いてシリルエーテル を脱保護し、望ましいベンジルアルコール誘導体を生成する。反応物をガラスフ リットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５× ３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。方法Ｃ ： 方法Ｂで調製したビーズ（５ｇ）を、次にＮ−メチルピロリジン（１００ｍｌ ）に懸濁し、次いで単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−グリン（１.８ｇ、６当量、 ６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９ ４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリッ トを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により 反応が完了するまで繰り返す。方法Ｄ ： 方法Ａで記載するようにリジン誘導のビーズ（５.０ｇ）を、Ｎ−メチルピロ リジン（１００ｍｌ）に懸濁し、次に蛍光団例えば１−ピレンブチル酸（０.４ ３ｇ、１.５当量、１.５ミリモル）およびドーピング試薬、例えばブチル酸（０ .４ｇ、０.４１ｍｌ、４.５当量、４.５ミリモル）を化学量的に１：３、並びに ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え 、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを通して吸引濾過し、ＤＭ Ｆ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾 する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応が完了するまで繰り返す 。 次にビーズを２５％ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）中で２時間撹拌し、Ｂ ｏｃ保護基を除去する。反応物をガラスフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（ ５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する 。 次にビーズをリンカー群、例えば４−（メチルヒドロキシフェニル）酢酸のｔ −ブチルジメチルシリルエーテル（１.３ｇ、６ミリモル）、ジイソプロピルカ ルボジイミド（０.７６ｇ、０．９４ｍｌ，６ミリモル）と、Ｎ−メチルピロリ ジン（１００ｍｌ）中一晩反応させる。反応物をガラスフリットを通して吸引濾 過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×１００ｍｌ）で洗浄し 、次いで風乾する。 次にビーズをＴＨＦ（１００ｍｌ）に再懸濁し、脱シリル化試薬、例えばフッ 化テトラブチルアンモニウム（６ｍｌ、１.０Ｍ溶液、６ミリモル、アルドリッ ヒ）／酢酸アンモニウム（０.９２ｇ、１２ミリモル）を用いてシリルエーテル を脱保護し、望ましいベンジルアルコール誘導体を生成する。反応物をガラスフ リットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５× ３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。方法Ｅ ： 方法Ｄで調製したビーズ（５ｇ）を、次にＮ−メチルピロリジン（１００ｍｌ ）に懸濁し、次いで単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１.９ｇ、６当量 、 ６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９ ４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリッ トを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により 反応が完了するまで繰り返す。方法Ｆ ： 方法Ａで記載するようにリジン誘導のビーズ（５.０ｇ）を、Ｎ−メチルピロ リジン（１００ｍｌ）に懸濁し、次に蛍光団、例えば１−ピレンブチル酸（０. １７３ｇ、０.６当量、０.６ミリモル）およびドーピング試薬、例えばブチル酸 （０.４８ｇ、０.４９ｍｌ、５.４当量、５.４ミリモル）を化学量的に１：９、 並びにジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍｌ、６ミリモル） を加え、次に反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを通して吸引濾 過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ）で洗浄し、 次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応が完了するま で繰り返す。 次にビーズを２５％ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）中で２時間撹拌し、Ｂ ｏｃ保護基を除去する。反応物をガラスフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（ ５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する 。 次にビーズをリンカー群、例えば４−（メチルヒドロキシフェニル）酢酸のｔ −ブチルジメチルシリルエーテル（１.３ｇ、６ミリモル）、ジイソプロピルカ ルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍｌ，６ミリモル）と、Ｎ−メチルピロリジ ン（１００ｍｌ）中一晩反応させる。反応物をガラスフリットを通して吸引濾過 し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×１００ｍｌ）で洗浄し、 次いで風乾する。 次にビーズをＴＨＦ（１００ｍｌ）に再懸濁し、脱シリル化試薬、例えばフッ 化テトラブチルアンモニウム（６ｍｌ、１.０Ｍ溶液、６ミリモル、アルドリッ ヒ）／酢酸アンモニウム（０.９２ｇ、１２ミリモル）を用いてシリルエーテル を脱保護し、望ましいベンジルアルコール誘導体を生成する。反応物をガラスフ リットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５× ３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。方法Ｇ ： 方法Ｆで調製したビーズ（５ｇ）を、次にＮ−メチルピロリジン（１００ｍｌ ）に懸濁し、次いで単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン（２.３ｇ 、６当量、６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７ ６ｇ、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物を ガラスフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃ ｌ₂（５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒド リン試験により反応が完了するまで繰り返す。方法Ｈ ： ついで、方法Ｃ、ＥおよびＧから得られたビーズを合し、三等分する。 プールＨ１を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−グリン（１.８ｇ、６当量、６ミ リモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍ ｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを 通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応 が完了するまで繰り返す。 プールＨ２を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１.９ｇ、６当量、６ ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリット を通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍ ｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反 応が完了するまで繰り返す。 プールＨ３を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン（２.３ｇ、６ 当量、６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ 、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラ スフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（ ５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで空気乾燥する。この方法をカイザーニンヒドリ ン試験により反応が完了するまで繰り返す。方法Ｉ ： 次に方法Ｈで得られたビーズを合し、三等分する。 プールＩ１を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−グリン（１.８ｇ、６当量、６ミ リモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍ ｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを 通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応 が完了するまで繰り返す。 プールＩ２を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１.９ｇ、６当量、６ ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリット を通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍ ｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反 応が完了するまで繰り返す。 プールＩ３を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン（２.３ｇ、６ 当量、６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ 、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラ スフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（ ５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試 験により反応が完了するまで繰り返す。方法Ｊ ： 方法Ｉで得られたビーズを合し、フローサイトメトリーにより蛍光強度の差で 区別した異なるサブライブラリーに分類する。サブライブラリーの構成物は、ト リペプチドの最初のアミノ酸が同一である。 サブライブラリーＪ１は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ、またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、 Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、 Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、 Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅからなる。 サブライブラリーＪ２は、Ａｌａ−Ｘ−Ｘ、またはＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、 Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、 Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、 Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅからなる。 サブライブラリーＪ３は、Ｐｈｅ−Ｘ−Ｘ、またはＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、 Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、 Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、 Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅからなる。方法Ｋ ： 次に方法Ｂ、ＤおよびＦで得られたビーズを合し、三等分する。 プールＫ１を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−グリン（１.８ｇ、６当量、６ミ リモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍ ｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを 通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応 が完了するまで繰り返す。 プールＫ２を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１.９ｇ、６当量、６ ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリット を通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍ ｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反 応が完了するまで繰り返す。 プールＫ３を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン（２.３ｇ、６ 当量、６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ 、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラ スフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（ ５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試 験により反応が完了するまで繰り返す。方法Ｌ ： 次に方法Ｋで得られたビーズを合し、フローサイトメトリーにより蛍光強度で 区別した異なるプールに分類する。 プールＬ１を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−グリン（１.８ｇ、６当量、６ミ リモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍ ｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを 通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応 が完了するまで繰り返す。 プールＬ２を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１.９ｇ、６当量、６ ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリット を通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍ ｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反 応が完了するまで繰り返す。 プールＬ３を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン（２.３ｇ、６ 当量、６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ 、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラ ス フリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５ ×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験 により反応が完了するまで繰り返す。方法Ｍ : 次に方法Ｌで得られたビーズを合し、三等分する。 プールＭ１を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−グリン（１.８ｇ、６当量、６ミ リモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍ ｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを 通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応 が完了するまで繰り返す。 プールＭ２を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１.９ｇ、６当量、６ ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリット を通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍ ｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反 応が完了するまで繰り返す。 プールＭ３を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン（２.３ｇ、６ 当量、６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ 、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラ スフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（ ５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試 験により反応が完了するまで繰り返す。方法Ｎ ： 次に方法Ｍで得られたビーズを合し、フローサイトメトリーにより蛍光強度の 差で区別した、異なるサブライブラリーに分類する。サブライブラリーの構成物 は、トリペプチドの２番目のアミノ酸が同一である。 サブライブラリーＮ１は、Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ、またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、 Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、 Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、 Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅからなる。 サブライブラリーＮ２は、Ｘ−Ａｌａ−Ｘ、またはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、 Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、 Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、 Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅからなる。 サブライブラリーＮ３は、Ｘ−Ｐｈｅ−Ｘ、またはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、 Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、 Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、 Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅからなる。方法Ｏ ： 方法Ｋで記載するように、ビーズ（５.０ｇ）を合し、３等分する。 プールＯ１を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−グリン（１.８ｇ、６当量、６ミ リモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍ ｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを 通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応 が完了するまで繰り返す。 プールＯ２を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１.９ｇ、６当量、６ ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリット を通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍ ｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反 応が完了するまで繰り返す。 プールＯ３を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン（２.３ｇ、６ 当量、６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ 、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物を減圧 下ガラスフリットを通して濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂ （５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン 試験により完了するまで繰り返す。方法Ｐ ： 次に方法Ｏで得られたビーズを合し、三等分する。 プールＰ１を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−グリン（１.８ｇ、６当量、６ミ リモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍ ｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを 通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応 が完了するまで繰り返す。 プールＰ２を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１.９ｇ、６当量、６ ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリット を通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍ ｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反 応が完了するまで繰り返す。 プールＰ３を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン（２.３ｇ、６ 当量、６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ 、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラ スフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（ ５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試 験により反応が完了するまで繰り返す。方法Ｑ ： 次に方法Ｐで得られたビーズを合し、フローサイトメトリーにより蛍光強度で 区別した異なるプールに分類する。 プールＱ１を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−グリン（１.８ｇ、６当量、６ミ リモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ｍ ｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリットを 通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍｌ ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反応 が完了するまで繰り返す。 プールＱ２を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−アラニン（１.９ｇ、６当量、６ ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ、０.９４ ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラスフリット を通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（５×３０ｍ ｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試験により反 応が完了するまで繰り返す。 プールＱ３を単量体、例えばＦＭＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン（２.３ｇ、６ 当量、６ミリモル）と反応させる。ジイソプロピルカルボジイミド（０.７６ｇ 、０.９４ｍｌ、６ミリモル）を加え、反応物を３時間撹拌する。反応物をガラ スフリットを通して吸引濾過し、ＤＭＦ（５×３０ｍｌ）、次いでＣＨ₂Ｃｌ₂（ ５×３０ｍｌ）で洗浄し、次いで風乾する。この方法をカイザーニンヒドリン試 験により反応が完了するまで繰り返す。 方法Ｑで得られたビーズのプールはすでに各構成物のトリペプチドの３番目の アミノ酸が同一であるサブライブラリーに分類されている。 サブライブラリーＱ１は、Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ、またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、 Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、 Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、 Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙからなる。 サブライブラリーＱ２は、Ｘ−Ｘ−Ａｌａ、またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、 Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、 Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、 Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａからなる。 サブライブラリーＱ３は、Ｘ−Ｘ−Ｐｈｅ、またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、 Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、 Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、 Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅからなる。方法Ｒ ： 各サブライブラリーＪ１、Ｊ２、Ｊ３、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｑ１、Ｑ２および Ｑ３は水酸化物もしくは強酸、例えばＨＦで化合物をビーズから切断して生物活 性を試験するかまたは、バイオパニングもしくはフローサイトメトリーにより化 合物をビーズ上で試験する。この試験の結果から、特定のレジストリーまたは位 置における好ましい単量体の集団分析ができる。 実施例２ 異なる波長で最大放射する蛍光団で標識化する方法による、蛍光強度差で、フ ローサイトメトリーにより、分類可能な蛍光団標識化ビーズの調製。方法； ドーピング試薬を２番目の蛍光団、例えばペリレンブチル酸で置き換える以外 は、実施例１の方法を用いる。 本発明の好ましい具体例は前記により説明されるが、本発明はここに開示の説 明そのものに限定されるものではなく、後記する請求の範囲の範疇にあるすべて の修飾する権利を保有していると理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／３８２，５４２ (32)優先日 1995年２月１日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／４１０，４３６ (32)優先日 1995年３月23日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ウェインストック，ジョゼフ アメリカ合衆国19460ペンシルベニア州 フェニックスビル、ポットハウス・ロード 1234番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一連の組合せライブラリーをコードする方法であって、 ａ）特定の一連の反応シーケンスをタグを付したビーズに対して行うことで第 １の組合せライブラリーを調製し、それにより第１のレジストリーの各選択肢を コードし； ｂ）第１のライブラリーと実質的に同じ特定の一連の反応シーケンスより第２ の組合せライブラリーを調製し、ここにタグを付したビーズを第１の反応シーケ ンスの前に合して分離し、該ビーズを第２の反応シーケンスの前に分類し、それ により第２のレジストリーの各選択肢をコードし；および ｃ）分類工程を後の各ライブラリーにおける異なるレジストリーの前に行う以 外、ｂ）の操作に従って後のライブラリーを調製する； ただし、組合せライブラリーシリーズにおけるライブラリーの数はレジストリ ーの数に等しい ことからなることを特徴とする方法。 ２． ａ）個々のライブラリーを実質的に同一の特定の一連の反応シーケンスより調 製し、 ｂ）ライブラリーの数が単一のライブラリーにおけるレジストリーの数に等し く、および ｃ）異なるレジストリーが各ライブラリーにおいてコードされる ことを特徴とする一連の組合せライブラリー。 ３．コードされたレジストリーが、蛍光的にタグが付されている請求項２記載 の一連の組合せライブラリー。 ４．コードされたレジストリーを蛍光標識アイデンティファイアーでコードす る請求項３記載の一連の組合せライブラリー。 ５．請求項４に記載の個々の組合せライブラリー。 ６．所望の特性を有する化合物の同定方法であって、 ａ）請求項１に記載の一連の組合せライブラリーを調製し、 ｂ）各ライブラリーを、所望の特性を有する化合物を同定する検定にて試験し 、および ｃ）各ライブラリーをフローサイトメトリーに付し、それにより公知の反応歴 を受けたことのあるビーズの群を得る ことを特徴とする方法。 ７．蛍光標識アイデンティファイアーでコードされたビーズ。 ８．コンバインおよびスピリットのプロトコルにより調製された請求項７記載 のビーズ。 ９．各選択肢を蛍光標識アイデンティファイアーによりコードした組合せライ ブラリー 10．コンバインおよびスピリットのプロトコルにより調製された請求項９記載 の組合せライブラリー。 11．請求項１０に記載の組合せライブラリーにより同定される医薬上活性な化 合物。 12．特定の一連の反応シーケンスに付す前に、タグを付した固相支持体ビーズ をフローサイトメトリーにより分類することからなる組合せライブラリーの製法 。 13．請求項１２に記載の方法により調製される組合せライブラリー。