JPH10501224A - 補体枯渇化および血圧低下のためのオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 霊長類において血圧を低下させ、血管拡張を刺激し、補体を枯渇させる方法が開示される。これら方法は、霊長類にオリゴヌクレオチドを投与し、ついで血圧または補体活性の低下を測定することを含む。投与するオリゴヌクレオチドは、長さが２〜５０ヌクレオチドであり、少なくとも一つのホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を有する。

Description

【発明の詳細な説明】補体枯渇化および血圧低下のためのオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの使 用 発明の背景 本発明は、インビボ補体活性化に対する合成オリゴヌクレオチドの作用および その結果に関する。さらに詳しくは、本発明は、合成オリゴヌクレオチドを用い て補体を枯渇させる方法に関し、該合成オリゴヌクレオチドは血圧を低下させ、 血管拡張を誘起するであろう。 補体系は、約２０の異なる血漿酵素、酵素前駆体、調節タンパク質、および細 胞溶解しうるタンパク質からなる一連のカスケードであり、外来細胞に応答した 正常な免疫系および個体自体の細胞に応答した異常な免疫系に関与している。こ れらタンパク質はすべて通常、血漿中、および毛細血管から組織空間中に漏れで た血管タンパク質中に存在する。酵素前駆体は通常、不活性であるが、２つの別 々の経路：すなわち、補体成分Ｃ１、Ｃ４およびＣ２を利用した古典的経路；お よび因子Ｄ、Ｃ３およびＢによる別経路で活性化されうる。両活性化とも成分Ｃ ３の開裂および活性化へと導く。Ｃ３から分かれたフラグメントＣ３ｂは最終的 な補体成分Ｃ５−Ｃ９の活性化に必要である。これら成分は膜攻撃複合体を形成 し、該複合体は細胞膜中に導入されると外来細胞の浸透圧的溶解をもたらすし、 自己免疫状態の場合には作用を受けた生体自体の細胞の溶解を引き起こす。 補体カスケードの活性化は細胞溶解を導くのみならず、オプソニン作用および マクロファージおよび好中球による細菌の食作用、侵入生物の凝集、ある種のウ イルスの中和、Ｃ５ａによって引き起こされる好中球およびマクロファージの化 学走性、好塩基球およびマスト細胞の活性化、および炎症をも導く(ギトン(Ｇuy ton)、Ｔextbook of Ｍedical Ｐhysiology、ソーダーズ(Ｗ．Ｂ．Ｓauders Ｃo .)、フィラデルフィア(１９９１)３７４〜３８４頁)。フラグメントＣ３ａ、Ｃ ４ａ、およびＣ５ａ(Ｃ３、Ｃ４およびＣ５から酵素的に分かれたもの)によりマ スト細胞および好塩基球が活性化され、ついでヒスタミン放出が起こる。好中球 の辺縁化、 血液濃縮(hemocentration)、および血管作用性ペプチドの放出もまた、補体経路 の迅速な活性化の後に起こることが報告されている(アーノート(Ａrnaout)ら、( １９８５)Ｎ，Ｅng．Ｊ．Ｍed．３１２：４５７〜４６２)。 補体の溶解作用および他の作用はまた、慢性関節リウマチなとの種々の自己免 疫疾患を含む多くの疾患状態にも関与している。慢性関節リウマチは、慢性の多 系疾患であり、その通常の臨床的所見は、滑液細胞の増殖およびその後のパンヌ ス形成、軟骨の破壊、骨の糜爛、および最終的に関節の変形および関節機能の喪 失を導く末梢関節の持続性の炎症性滑膜炎である。この疾患は、米国およびヨー ロッパの人口の約１％、日本の人口の０.２〜０.４％に罹患しており、女性は男 性に比べて罹患割合が約３倍である。 治療法としては炎症プロセスを制御するためのサリチル酸および他の非ステロ イド抗炎症剤、簡単な鎮痛剤、および低投与量のグルココルチコイドが挙げられ るが、これらのいずれも慢性関節リウマチの進行を阻止することに成功していな い(リプスキー(Ｌipsky)、Ｈarrison's Ｐrinciples of Ｉnternal Ｍedicine( 第１１版)(ブラウンバルト(Ｂraunwald)ら編)マックグロー−ヒル・ブック、ニ ューヨーク、ニューヨーク(１９８７)１４２３〜１４２８頁)。金化合物、Ｄ− ペニシラミン、グルココルチコイド、細胞毒性免疫抑制剤、および抗マラリア剤 などの多くの異なる疾患緩和剤が単独、および非ステロイド抗炎症剤と組み合わ せて鎮痛および抗炎症作用のために用いられている(リプスキー、上掲)。しかし ながら、これまでに使用されている薬剤は若干毒性があり、ある薬剤が他の薬剤 に対して一貫して有利であることは示されていない。さらに、これらの薬剤はい ずれも該疾患の経過を変えることも示されていない。それゆえ、慢性関節リウマ チの兆候を緩和するばかりでなく、該疾患を阻止する治療法の必要性が存在する 。 ある種の補体は強力な血管拡張剤であり、血圧および高血圧症などの関連する 疾患に影響を及ぼしうる。 高血圧症は多くの先進国において普遍的な健康問題である。高血圧症を有する 多くの患者は早死しており、最も共通する死因は心臓疾患、発作および腎不全で ある。治療は一般に、ストレスからの解消、食事制限、体重減少、規則的な有酸 素運動を含む薬によらない治療的介入、および利尿剤、抗アドレナリン剤、血管 拡張剤、カルシウムチャネルブロッカー、およびアンジオテンシン変換酵素(Ａ ＣＥ)阻害剤などの抗高血圧症剤の投与からなる(ゴードン・ウイリアムズ(Ｇord on Ｗilliams)、Ｈarrison's Ｐrinciples of Ｉnternal Ｍedicine、第１３版( イッセルバッヒャー(Ｉsselbacher)ら編)(１９９４)マックグロー−ヒル、ニュ ーヨーク、１１１６〜１１３１頁)。 補体系の成分を、たとえば補体−感受性自己免疫疾患や血圧関連疾患を治療す るに際して、破壊的な使用に仕向けることを可能にする該系の制御手段を開発す る必要がある。 補体系および種々の補体成分の欠如または過剰産生の結果引き起こされる疾患 を研究するため、種々の動物モデルが用いられている。これらモデルは、コブラ 毒の投与によって調製されており、該投与は補体の枯渇を導く。しかしながら、 該毒には補体系と相互作用する成分以外の成分をも含む。それゆえ、その結果得 られる動物の応答は、必ずしも補体相互作用性の成分の存在のみによるものでは ない。 従って、疾患状態が補体枯渇因子との相互作用によってのみ引き起こされた一 層良好な補体枯渇動物モデルが必要である。発明の要約 ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドの 迅速な丸塊(bolus)注入が受容者の霊長類において補体の枯渇を導くことがわか った。この補体の枯渇は、受容者の霊長類の好中球および全白血球数を一過的に 減少させながら、血圧を下げることがわかった。これら驚くべき知見は本発明を 開発するのに利用され、本発明は霊長類において補体を枯渇する方法、血圧を低 下させる方法、および血管拡張を刺激する方法を包含する。 これら方法はいずれも、少なくとも一つの非架橋性ホスホジエステルインター ヌクレオチド結合において酸素原子の一つが硫黄で置換されたオリゴヌクレオチ ドホスホロチオエート（「ＰＳ−オリゴヌクレオチド」）の投与を含む。本発明の 幾つかの観点において、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートインターヌク レオチド結合のみを有する。 本明細書において「オリゴヌクレオチド」なる語は、一方のヌクレオチドの５ '末端と他方のヌクレオチドの３'末端とが共有結合した２またはそれ以上のヌク レオチドを包含することを意味する。本発明の方法において有用なオリゴヌクレ オチドは、長さが２〜５０ヌクレオチドであり、６〜５０ヌクレオチドを有する オリコヌクレオチドが一層好ましく、２０〜３３ヌクレオチドの長さであるのが 幾つかの態様において最も好ましい。本発明の他の態様において、オリゴヌクレ オチドは少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドまたは少なくとも一つのリ ボヌクレオチドを有する。さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドはキメ ラである、すなわち分子中のいずれかの位置または順序にてデオキシリボヌクレ オチドおよびリボヌクレオチドの両者の組み合わせを有する。 本発明の幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは修飾される。本明細書 において「修飾されたオリゴヌクレオチド」なる語は、ヌクレオチドの少なくと も２つが合成結合、すなわち一方のヌクレオチドの５'末端と他方のヌクレオチ ドの３'末端との間のホスホジエステル結合以外の結合であって５'ヌクレオチド リン酸が幾つかの化学基で置換されたものにより共有結合されたオリゴヌクレオ チドとして用いる。好ましい合成結合としては、ホスホロチオエートに加えて、 アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、 ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、リン酸エステル、カルバメート、カ ーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、２−Ｏ−メチル、カルボ キシメチルエステルなどの結合が挙げられる。これらの結合はオリゴヌクレオチ ド構造中のどこに存在していてもよく、１種類を越える結合が単一のオリゴヌク レオチド中に存在してもよい(すなわち、ハイブリッドオリゴヌクレオチド)。 「修飾されたオリゴヌクレオチド」なる語はまた、修飾された塩基および／ま たは糖を有するオリゴヌクレオチドをも包含する。たとえば、３',５'−置換さ れたオリゴヌクレオチドは、その３'位および５'位の両方で水酸基以外の化学基 (その３'位において)およびリン酸基以外の化学基(その５'位において)に結合し た糖を有する修飾されたオリゴヌクレオチドである。修飾されたオリゴヌクレオ チドはまた、キャッピングされた種であってもよい。加えて、分子中のヌクレオ チド当たり一つの非架橋性酸素原子に置換を有する酸化されていないまたは部分 的に酸化されたオリゴヌクレオチドもまた修飾されたオリゴヌクレオチドと考え られる。また、修飾されたオリゴヌクレオチドに包含されると考えられるものと して、その３'および／または５'末端にヌクレアーゼ耐性を付与するかさばった 置換基を有するオリゴヌクレオチド、および／またはヒトの介入なしにはインビ ボで認められない種々の他の構造上の修飾を有するオリゴヌクレオチドもまた修 飾されたものと考えられる。 自己安定化されるオリゴヌクレオチドもまた、本発明の方法において有用な修 飾されたオリゴヌクレオチドと考えられる(タング(Ｔang)ら(１９９３)Ｎucleic Ａcids Ｒes.２１：２７２９〜２７３５)。これらオリゴヌクレオチドは、２つ の領域：すなわち標的ハイブリダイズ領域；および自己安定化オリゴヌクレオチ ド内に存在する核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する自己相補的 領域を含む。 好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、丸塊静脈内注入とし て１時間当たり受容者１キログラム当たり約３０〜１２０ミリグラム(ｍｇ／ｋ ｇ／時)のオリゴヌクレオチドの一定の速度にて投与する。幾つかの方法におい て、本発明のオリゴヌクレオチドは約３０ｍｇ／ｋｇ／時の一定の速度にて投与 し、一方、他の場合には約４０ｍｇ／ｋｇ／時にて投与する。本発明のさらに他 の方法は約５〜２０ｍｇ／ｋｇオリゴヌクレオチドを１０分かけて投与すること を要し、他の方法では約８０ｍｇ／ｋｇを１２０分かけて投与する必要がある。 血圧を低下させ血管拡張を引き起こす方法において、受容者である霊長類の血 圧は該オリゴヌクレオチドの投与後に測定する。好ましい態様において、血圧は 投与１５〜３５分後に測定する。 補体を枯渇させる方法において、受容者である霊長類から採取した血液試料中 の補体活性を該オリゴヌクレオチドの投与後に測定する。好ましい態様において 、補体活性は投与１０〜６０分後に測定する。図面の簡単な説明 本発明の上記および他の目的、その種々の特性、並びに本発明それ自体は、下 記記載を添付の図面とともに読んだときに一層完全に理解されるであろう。添付 の図面において： 図１は、時間０から開始して１０分かけてＰＳ−オリゴヌクレオチドを静脈内 投与した後の動物の平均動脈血圧のプロフィールであり； 図２は、時間０から開始して１２０分かけてＰＳ−オリゴヌクレオチドを静脈 内投与した後の動物の平均動脈血圧のプロフィールであり； 図３Ａは、１０分かけて食塩水を単回投与した後のサルの心拍数(■)および平 均動脈血圧(◆)を示すグラフであり； 図３Ｂは、１０分かけてＰＳ−オリゴヌクレオチドを０.５ｍｇ／ｋｇ哺乳動 物にて単回投与した後のサルの心拍数(■)および平均動脈血圧(◆)を示すグラフ であり； 図３Ｃは、１０分かけてＰＳ−オリゴヌクレオチドを１ｍｇ／ｋｇ哺乳動物に て単回投与した後のサルの心拍数(■)および平均動脈血圧(◆)を示すグラフであ り； 図３Ｄは、１０分かけてＰＳ−オリゴヌクレオチドを２ｍｇ／ｋｇ哺乳動物に て単回投与した後のサルの心拍数(■)および平均動脈血圧(◆)を示すグラフであ り； 図３Ｅは、１０分かけてＧＧ−オリゴヌクレオチドを５ｍｇ／ｋｇ哺乳動物に て単回投与した後のサルの心拍数(■)および平均動脈血圧(◆)を示すグラフであ り； 図３Ｆは、１０分かけてＰＳ−オリゴヌクレオチドを１０ｍｇ／ｋｇ哺乳動物 にて単回投与した後のサルの心拍数(■)および平均動脈血圧(◆)を示すグラフで あり； 図３Ｇは、１０分かけてＰＳ−オリゴヌクレオチドを２０ｍｇ／ｋｇ哺乳動物 にて単回投与した後のサルの心拍数(■)および平均動脈血圧(◆)を示すグラフで あり； 図４は、種々の投与量のＰＳ−オリゴヌクレオチドを１０分かけて静脈内投与 した後の動物における補体(ＣＨ５０)活性のレベルを示すグラフであり； 図５は、種々の投与量のＰＳ−オリゴヌクレオチドを１０分かけて静脈内投与 した後の動物における補体(Ｃ５ａ)活性のレベルを示すグラフであり； 図６Ａは、種々の濃度のＰＳ−オリゴヌクレオチドを投与した後のヒト血清中 の補体(ＣＨ５０)活性のレベルを示すグラフであり； 図６Ｂは、種々の濃度のＰＳ−オリゴヌクレオチドを投与した後の動物からの 血清中の補体(ＣＨ５０)活性のレベルを示すグラフである。好ましい態様の詳細な説明 以下の記載は本発明のある種の好ましい態様をさらに説明するためのものであ って、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書中に引用 した特許および科学的文献は、当業者に利用できる知見を確立するものである。 本明細書中に引用する発行された米国特許第および許された出願および参照文献 は参照のため本明細書中に引用する。 本発明は霊長類において補体を枯渇させる方法を提供するものであり、該方法 は、たとえば、補体を欠如した動物モデルを産生するうえで有用である。かかる 動物モデルは、種々のタイプの免疫および他の応答において補体の役割を調べる のに大きな価値を有する。補体を枯渇させる方法はまた、炎症を遅延または抑制 するうえで、および慢性関節リウマチなどの種々の自己免疫疾患の溶解作用を減 少させるうえでも有用である。本発明はまた、霊長類において血圧を低下させ、 血管拡張を引き起こさせる方法をも提供する。かかる方法は、先進国に共通する 疾患である急性の高血圧症を治療するうえで有用である。 本発明において、補体の枯渇、血圧の低下、および血管拡張は、ホスホジエス テル結合の少なくとも一つの非架橋性酸素原子において酸素原子の一つが硫黄で 置換されたオリゴヌクレオチドホスホロチオエート(ＰＳ−オリゴヌクレオチド) を投与することにより達成される。 ＰＳ−オリゴヌクレオチドは酵素的分解に対して耐性を示し、アンチセンスオ リゴヌクレオチドベースの開発において広範に研究されている（たとえば、ザメ クニク(Ｚamecnik)、Ｐrospects for Ａntisense Ｎucleic Ａcid Ｔherapy of Ｃancer and ＡＩＤＳ、ウイックストローム(Ｗickstrom,Ｅ.)編、ウイリー−リ ス、ニューヨーク、ニューヨーク、Ｖol.１、１９９１参照)。たとえば、ＰＳ− オリゴヌクレオチドは、種々のインビトロモデル系において、抗ウイルス剤とし て(たとえば、アグラワル(Ａgrawal)(１９９２)Ｔrends Ｂiotech.１０：１５２ 〜１５８参照)、抗癌剤として(たとえば、ラタジュザク(Ｒatajczak)ら、(１９ ９１)Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)８９：１１８２３〜１１８２７；バ イエバー(Ｂayever)(１９９３)Ａntisense Ｒes．Ｄev．３：３８３参照)、およ び抗寄生虫剤として(たとえば、ラパポート(Ｒappaport)ら、(１９９３)Ｐroc． Ｎatl．Ａcad．Ｓci．(ＵＳＡ)８９：８５７７〜８５８０参照)用いられている 。加えて、ＰＳ−オリゴヌクレオチドは多くの細胞遺伝子標的の発現を制御する のに用いられている(たとえば、スタイン(Ｓtein)ら、(１９９３)Ｓcience２６ １：１００４)。 本発明の方法に用いるＰＳ−オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチ ド、リボヌクレオチド、またはその両者からなり、一方のヌクレオチドの３'末 端と他方のヌクレオチドの５'末端とが共有結合されたものである。これらオリ ゴヌクレオチドは長さが少なくとも６ヌクレオチドであるが、好ましくは１０〜 ５０ヌクレオチドの長さであり、最も一般的には２０〜３３ｍｅｒである。 幾つかの有用なＰＳ−オリゴヌクレオチドは、分子中のいずれか２つの隣接す るヌクレオチド間に位置する一つのホスホロチオエート結合を有する。他のＰＳ −オリゴヌクレオチトは、分子中に分散した、または隣接して位置したヌクレオ チド間に１を越えるホスホロチオエート結合を有する。さらの他のものはホスホ ロチオエート結合のみを有する。 本発明の方法に有用なオリゴヌクレオチドはまた、本発明の方法において機能 する能力を損なうことなく幾つかの仕方で修飾することができる。たとえば、オ リゴヌクレオチドは少なくとも一つのホスホロチオエート結合に加えて、一方の ヌクレオチドの５'末端と他方のヌクレオチドの３'末端との間にホスホロチオエ ートインターヌクレオチド結合以外のインターヌクレオチド結合を含んでいてよ い。そのような結合において、５'ヌクレオチドの硫黄(ホスホロチオエートの場 合)は幾つかの数の化学基で置換されている。そのような化学基の例としては、 アルキルホスホネートホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホ スホルアミデート、リン酸エステル、カーボネート、アセトアミド、カルボキシ メチルエステル、カーボネート、およびリン酸トリエステルが挙げられる。 他の修飾としては、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端に位置し、コレ ステリルまたはジアミン化合物(アミノ基と末端リボース、デオキシリボースと の間の炭素残基数は種々である)などのインターヌクレオシドリン酸結合の分子 への付加、および開裂するか、または反対側の鎖もしくは結合酵素もしくは他の タンパク質に架橋するリン酸修飾が挙げられる。そのような修飾されたオリゴヌ クレオチドの例としては、修飾された塩基および／または糖（たとえば、リボー スの代わりのアラビノース)を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ、たとえば 、３'位および５'位の両方においてヒドロキシル基以外の化学基(その３'位にて )またはリン酸基以外の化学基(その５'位にて)に結合した糖を有する３',５'− 置換されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。他の修飾されたオリゴヌクレオチ ドは、その３'および／または５'末端にてヌクレアーゼ耐性を付与するかさばっ た置換基でキャッピングされているか、またはヌクレオチド当たり一つの非架橋 性の酸素原子に置換基を有する。そのような修飾はインターヌクレオシド結合の 幾つかまたは全部にあってもよいし、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端また は両方の末端および／または分子の内部にあってよい。 さらに他の有用なオリゴヌクレオチドは、タング(Ｔang)らによって記載され た(Ｎucleic Ａcids Ｒes.(１９９３)２１：２７２９〜２７３５)自己安定化さ れた(self-stabilized)ものを含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、標的ハ イブリダイジング領域、および該自己安定化オリゴヌクレオチド内の核酸配列に 相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する自己相補的領域を有する。 これら修飾されていないオリゴヌクレオチドおよび修飾されたオリゴヌクレオ チドの調製は、当該技術分野でよく知られている(アグラワルら(１９９２)Ｔren dsＢiotechnol.１０：１５２〜１５８において概説されている)。たとえば、ヌ ク レオチドは、ホスホルアミデート、Ｈ−ホスホネート化学、またはメチルホスホ ルアミデート化学などの当該技術分野で認められた技術を用いて共有結合させる ことができる(たとえば、ウールマン(Ｕhlmann)ら(１９９０)Ｃhem．Ｒev．９０ ：５４３〜５８４；アグラワルら(１９８７)Ｔetrahedron Ｌett.２８：(３１) ：３５３９〜３５４２；カルサーズ(Ｃaruthers)ら(１９８７)Ｍeth．Ｅnzymol ．１５４：２８７〜３１３；米国特許第５,１４９,７９８号参照)。オリゴマー 性のホスホロチオエートアナログは、メトキシホスホルアミダイト化学(たとえ ば、アグラワルら(１９８８)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)８５：７０７９ 〜７０８３参照)またはＨ−ホスホネート化学(たとえば、フレーラー(Ｆroehler )(１９８６)Ｔetrahedron Ｌett.２７：５５７５〜５５７８参照)などの当該技 術分野でよく知られた方法を用いて調製できる。バーゴット(Ｂergot)らによっ て記載された合成法(Ｊ.Ｃhromatog.(１９９２)５５９：３５〜４２)もまた用い ることができる。 本研究に使用するのに有用なオリゴヌクレオチドの例としては、下記表１に列 記するものおよび配列表の配列番号１〜６に示すものが挙げられる。 しかしながら、これらオリゴヌクレオチドの投与によって引き起こされる作用 は配列特異的なものではないので、他の有用なオリゴヌクレオチドはいかなるヌ クレオチド配列を有していてもよい。「ＧＧ」オリゴヌクレオチド(配列番号１) はＨＩＶ−１のｇａｇ開始コドンに相補的である(アグラワルおよびタング(１９ ９２)Ａntisense Ｒes.Ｄev.２：２６１)。他の５つのオリゴヌクレオチドは、 長さが２０〜３３ヌクレオチドのホスホロチオエートである。試験した２５mer は、４²⁴２５merランダム配列(２５merランダム)の混合物であった。２５merラ ンダムは、各カップリングのための合成の間にＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を用 いることにより合成した。 本発明の方法において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの上記ＰＳ− オリゴヌクレオチドを生理学的に許容しうる担体とともに含む治療学的調合物の 形態にて患者に静脈内注射により投与する。 本明細書において用いる「生理学的に許容しうる担体」としては、あらゆる溶 媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤な どが挙げられる。そのような媒体および剤を薬理学的に活性な物質に用いること は当該技術分野でよく知られている。通常の媒体または剤が該活性成分と両立し ない場合を除いて、それを治療組成物に用いることを想定できる。補助的な活性 成分を該組成物中に配合することもできる。 注射用に適した医薬剤型としては、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射溶 液または分散液を即座に調製するための滅菌粉末が挙げられる。あらゆる場合に おいて剤型は滅菌する必要がある。該剤型は製造および貯蔵の条件下で安定なも のでなければならず、細菌や真菌などの混入微生物の作用から保護されていなけ ればならない。担体は溶媒または分散媒体であってよい。微生物の作用に対する 保護は、種々の抗菌剤や抗真菌剤により行うことができる。注射用治療剤の吸収 を遅延させることは、吸収を遅延させる剤の組成物を用いることにより行うこと ができる。 治療学的調合物は一つの丸塊にて静脈内注射し、これを必要に応じて種々の時 間間隔にて繰り返すことができる。注射の速度は、投与するオリゴヌクレオチド の量に依存し、１時間当たり、受容者の体重１ｋｇ当たり３０〜１２０ｍｇが許 容できる範囲である。たとえば、５〜２０ｍｇ／ｋｇを１０分かけて、または８ ０ｍｇ／ｋｇを１２０分かけて丸塊投与すると、血圧の低下、血管拡張、および 補体の枯渇という結果となる。 本発明の幾つかの方法において、霊長類をオリゴヌクレオチドで処置した後に その血圧を測定し、血圧の低下を確認する。このことは、血圧測定のいかなる知 られた方法を用いても行うことができる。たとえば、血圧の測定は、大腿動脈中 にカテーテルを挿入することによって、または血圧ゲージで体外モニタリングす ることによって行うことができる。オリゴヌクレオチドを霊長類に投与後１５〜 ３５分で血圧の最大の低下がみられるのて、この時間がかかる処置をとるに際し て好ましい。 本発明の他の方法において、霊長類の血液または血清中の補体活性をオリゴヌ クレオチドで処置後に測定し、補体活性の減少を確認する。このことは、補体成 分の活性をアッセイするためのいかなる知られた方法を用いても行うことができ る。たとえば、補体ＣＨ５０の測定は、カバット(Ｋabat)らによって記載されて いるように(Ｅxpt．Ｉmmunochem.(１９６１)チャールズ・トーマス(Ｃharles Ｃ ．Ｔhomas)、ニューヨーク)、ヒツジ赤血球の補体依存性溶解により行うことが でき、一方、Ｃ５ａはラジオイムノアッセイにより測定することができる。オリ ゴヌクレオチドを霊長類に投与後１０〜６０分で補体の最大の枯渇がみられるの で、この時間がかかる処置をとるに際して好ましい。 ＰＳ−オリゴヌクレオチドはマウス(アグラワル、Ｐrospects for Ａntisense Ｎucleic Ａcid Ｔherapy for Ｃancer and ＡＩＤＳ、リス(Ｗ．Ｌiss)、ニュ ーヨーク(１９９１)１４３頁)およびラットにおいて充分に寛容されることがわ かっている。しかしながら、サルでは血行動態的毒性がある種の環境下で観察さ れている。ＰＳ−オリゴヌクレオチドを大動脈に直接丸塊投与した後にアカゲザ ル(Ｒhesus monkey)で低血圧および死亡したという最近の報告がある(コーニッ シュ(Ｃornish)(１９９３)Ｐharm．Ｃomm．３：３２９〜３２７)。本発明は、種 々の長さおよび配列のＰＳ−オリゴヌクレオチドを霊長類に投与したときの効果 を示すものである。 一つの研究において、ＧＧオリゴヌクレオチド(配列番号１)を霊長類に１０分 の間隔で０(食塩水)または１.２５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与したときに、平均 動脈血圧(図１)または心拍数において検出しうる効果は認められなかった。一方 、 ５ｍｇ／ｋｇの１０分間注入は注入時間の終わりまでに平均血圧の一過性の上昇 をもたらし(図１)、その後、一層遅延した血圧の低下をもたらした。２０ｍｇ／ ｋｇの投与量のＧＧを１０分かけて投与したときも同様の一過性の血圧の上昇を もたらし、その後、一層顕著かつ遅延した血圧の低下をもたらした。 これら投与量のオリゴヌクレオチドを１０分かけて注入したときに観察された 効果とは対照的に、１２０分かけて注入した５または２０ｍｇ／ｋｇでは、いず れの場合も臨床的に意味のある仕方で血圧に影響を及ぼすことはなかった(図２) 。８０ｍｇ／ｋｇを１２０分かけて注入した場合のみが、血圧に対して有意の効 果が観察された。血圧がわずかに一過性に上昇した後に血圧が低下することは、 ５ｍｇ／ｋｇを１０分かけて投与した後に観察された場合と同様の変化を伴って 観察された。 一般に心拍数の変化は血圧において観察される変化と逆であった。血圧変化を 示した各動物からの心電図を拍動毎に注意深く評価しても、オリゴヌクレオチド の直接的な心臓効果を示す有意の心電図変化は明らかとならなかった。さらに、 死亡したサルの心臓組織の肉眼的観察および顕微鏡による観察からは、心臓毒性 の証拠が明らかにはならなかった。 ０.５、１、および２ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドを１０分の一層短い注 入時間で投与しても、血圧(図３Ａ−図３Ｃ)または心拍数に対して臨床的に有意 の効果がなかった。対照的に、５、１０、および２０ｍｇ／ｋｇの注入では、血 圧が上昇した後、一層遅延し顕著な血圧の低下が観察された(図３Ｄ−図３Ｆ)。 血圧の変化は、心拍数の逆の変化を伴っていた。 血液学的パラメーターは、ＧＧの２ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の投与量での注 入時間の間およびそれ以後において比較的一定のままであった(表２Ａ−２Ｃ)。 唯一の変化は、頻繁な血液サンプリングによるわずかな徐々のヘマトクリット 値の低下であった。５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の投与量では、幾つかの一貫し た変化が血液学的値において観察された。たとえば、全白血球(ＷＢＣ)の顕著な 増加が注入終了前に開始して認められ、４０分までにベースラインを越えるとこ ろまで回復した。好中球も同時に殆ど０までの顕著な減少を示し、その後回復し て増加したが、血小板数には殆ど変化は認められなかった。 また、ヘマトクリット値のベースラインを越える増加も殆どの動物で４０〜６ ０分までに認められた。血清補体ＣＨ５０(全補体活性の概括的な測定)の濃度は 、１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の投与量で処置開始の５分以内に減少が始まっ た(図４)。図４において、血液試料を投与の１０分前に採取し、投与２分、５分 、１０分、２０分、４０分、６０分および２５時間後にＣＨ５０補体レベルを分 析した。補体のＣ５ａ開裂生成物は、５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の投与量にて 注入した２分後以内に顕著な減少が始まった。投与量が大きいほど、Ｃ５ａの減 少の出現は早くなった(図５)。２ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下の投与量では、変化 は観察されなかった。 ＰＳ−オリゴヌクレオチドでヒトおよびサル血清を処置し、ついで補体活性を 測定した場合にも同様の結果が認められた(図６Ａおよび６Ｂ)。さらに、ヒト血 清(図６Ａ)はサル血清(図６Ｂ)と同じ仕方で応答し、霊長類における補体系が類 似しておりＰＳ−オリゴヌクレオチド投与に対して同様の仕方で応答することを 示していた。 要約すると、オリゴヌクレオチドの静脈内投与によって引き起こされる低血圧 は、明らかに投与量および注入速度に依存している。それゆえ、用量−応答曲線 は、オリゴヌクレオチド注入の速度を減少させることによって右側に顕著にシフ トさせることができる。８０ｍｇ／ｋｇの投与量を１０分かけて投与すると(ま たは３０ｍｇ／ｋｇ／時)、５ｍｇ／ｋｇの投与量を１０分かけて投与(または３ ０ｍｇ／ｋｇ／時)した場合と同様の血圧応答を引き起こす。血行動態に対する オリゴヌクレオチドの効果は、末梢血管の変化によってもたらされると思われる 。なぜなら、心臓には直接的な作用の証拠が存在しないからである。 血圧の変化には、全補体活性およびＣ５ａ開裂産物の出現の減少した補体活性 化を伴うかまたは先行される。加えて、補体経路の迅速な活性化の後に記載され ている末梢全ＷＢＣおよび好中球数および血液濃度(hemoconcentration)の減少 が存在する(アーノート(Ａrnaout)ら(１９８５)Ｎ．Ｅngl．Ｊ．Ｍed．３１２： ４５７)。それゆえ、オリゴヌクレオチドの静脈内投与に伴って認められた血行 動態的変化は、補体活性化および内生の血管活性物質に対する作用により引き起 こされたものである。 これら血行動態的作用は、明らかに特定のサイズやヌクレオチド配列を有する オリゴヌクレオチドの投与に限られるものではない。なぜなら、他のＰＳ−オリ ゴヌクレオチド(２０−mer(配列番号２)、２７−mer(配列番号４)、３３−mer( 配列番号５)、および２５−merランダム配列)の静脈内注入の１０分後にも血圧 の同様の低下が得られたからである。 以下の実施例は本発明を製造および実施するための好ましい態様を説明するも のであって、本発明の範囲を限定することを意味するものではない。なぜなら、 別の方法を用いて同様の結果を得ることも可能だからである。 実施例 １．オリゴヌクレオチドの合成 ＧＧおよび他のオリゴヌクレオチドを、１ミリモルのスケールで９−シアノエ チルホスホルアミダイト化学を用いて自動合成により合成した(パドマプリヤ(Ｐ admapriya)ら(１９９４)Ａntisense Ｒes．＆ Ｄev.(印刷中))。粗製のオリゴヌ クレオチドの精製を逆相液体クロマトグラフィーにより行い、ついで脱トリチル 化および沈澱を行った。沈澱したオリゴヌクレオチドを水に再懸濁させ、５ｃｍ ＩＤ×３０ｃｍのカラムに詰めたＤowes−５ ＯＴＭ(Ｎａ＋形：Ｄowes−５０ ×２−２００イオン交換樹脂(アルドリッチ、ミルウォーキー、ウイスコンシン) に通し、最終的にＳephadex^TmＧ−１５(シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミ ズーリ)を使用して脱塩した。精製したＧＧ(Ｎａ＠形)を０.０２μ滅菌濾紙に通 し、ついで凍結乾燥させた。完全長のＰＳ−オリゴヌクレオチドのパーセントは ８７％またはそれ以上であり(キャピラリーゲル電気泳動およびイオン交 換ＨＰＬＣによって確認されたように)、該生成物は９９％がＤＮＡであった(Ａ₂₆₀ ／質量比に基づく)。³¹Ｐ ＮＭＲ分析により該生成物の９９％以上がホスホ ロチオエートであることが確認された。 配列番号１、３、５および６のオリゴヌクレオチド、ならびに２５−merの４_{2 4} 配列の混合物(２５−merランダム)を調製した。該２５−merランダムの合成に は、各カップリングのための合成の間にＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を使用する ことにより行った(リスツィビッツ(Ｌisziewicz)ら、(１９９３)Ｐroc．Ｎatl． Ａcad．Ｓci.(ＵＳＡ)９０：３８６０)。 ２．インビボ実験 Ａ．動物 ４６頭のアカゲザル(マカカ・ムラッタ(Ｍacaca mulatta))(オス２６頭および メス２０頭)を実験の少なくとも７日前に実験室の条件に馴化させた。実験の際 には、その体重は実験Ａでは２.２０〜３.７６ｋｇに、実験Ｂでは４.０６〜８. ８８ｋｇの範囲に分布した。 Ｂ．心臓血管モニタリング 実験の当日、各動物をケタミンＨＣｌ(１０ｍｇ／ｋｇ)およびジアゼパム(０ ．５ｍｇ／ｋｇ)で軽く鎮静させた。心臓血管記録手続の間はずっと、持続的に ケタミンを静脈点滴して外科手術レベルの麻酔状態を起こして維持した。中心動 脈(血)圧を記録するため、カテーテルを大腿動脈に挿入し、動物に持続的な心電 図記録のための器具を装着させた。 Ｃ．ＰＳ−オリゴヌクレオチドの投与 ＧＧ(配列番号１)または他のＰＳ−オリゴヌクレオチドを通常の食塩水に溶か し、プログラム可能な注入ポンプを使用して撓側皮静脈カテーテルを介して静脈 内に注入した。すべての場合において、ＧＧの濃度は０.４２ml／分の速度で送 達することを可能にするようなものであった。 実験Ａにおいて、ＧＧを１０分間の注入時間で、４頭のサルに各々、０(食塩 水のみ)、１.２５、５および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、１２０分間の注 入時間で、４頭のサルに各々０、５、２０、８０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した 。 実験Ｂにおいて、ＧＧを１０分間の注入時間で、２頭のサルに各々、０、０． ５、１、２、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。 動脈血サンプルをＧＧ注入の１０分前、および１０分間の注入の開始２、５、 １０、２０、４０および６０分後、並びに２４(＋／−４)時間後に採取した。血 液学的値をシエラ・ネバダ・ラボラトリーズ(Ｓierra Ｎevada Ｌaboratories)( レノ(Ｒeno)、ネバダ)により決定した。補体ＣＨ５０およびＣ５ａの決定に血清 を使用した。補体ＣＨ５０の測定は、カバトらによって記載されたように(Ｅxpt ．Ｉmmunochem.(１９６１)チャールズ・トーマス、ニューヨーク)ヒツジ赤血球 の補体依存性の溶解により行った。Ｃ５ａはラジオイムノアッセイによって測定 した(アマシャムＰＬＣ、英国)。 ３．インビトロ実験 ヒトまたはサルの血液からの５０mlの血清を等量の食塩水または１ｔｉｇ／ｍ ｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの ＰＳ−オリゴヌクレオチドを含有する食塩水とともに３７℃で３０分間インキュ ベートした。補体(ＣＨ５０)活性の測定を、カバトらによって記載されたように (Ｅxperimenttal Ｉmmunochemistry(１９６１)チャールズ・トーマス、ニューヨ ーク)ヒツジ赤血球の補体依存性の溶解により行った。その結果を図６Ａおよび ６Ｂに示す。均等物 当業者は、上記の特定の物質および方法に均等な多くのものについても常套手 段、実験で確認できるであろう。そのような均等物も本発明の範囲に含まれ、以 下の特許請求の範囲でカバーされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．(ａ)霊長類にオリゴヌクレオチドを投与し、その際、該オリゴヌクレオチ ドは長さが２〜５０ヌクレオチドであり、少なくとも一つのホスホロチオエート インターヌクレオチド結合を有し、ついで (ｂ)該霊長類の血圧低下を測定する ことを特徴とする霊長類の血圧を低下させる方法。 ２．該オリゴヌクレオチドを約３０〜１２０ｍｇ／ｋｇ／時の一定速度での丸 塊静脈内注入として投与する請求項１に記載の方法。 ３．該オリゴヌクレオチドを約３０ｍｇ／ｋｇ／時の一定速度で投与する請求 項２に記載の方法。 ４．該オリゴヌクレオチドを約４０ｍｇ／ｋｇ／時の一定速度で投与する請求 項２に記載の方法。 ５．霊長類１ｋｇ当たり５〜２０ｍｇのオリゴヌクレオチドを１０分かけて投 与する請求項１に記載の方法。 ６．霊長類１ｋｇ当たり８０ｍｇのオリゴヌクレオチドを１２０分かけて投与 する請求項１に記載の方法。 ７．該オリゴヌクレオチドの長さが約６〜５０ヌクレオチドである請求項１に 記載の方法。 ８．該オリゴヌクレオチドの長さが約２０〜３３ヌクレオチドである請求項７ に記載の方法。 ９．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのデオキリボヌクレオチドを含む 請求項１に記載の方法。 １０．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 １に記載の方法。 １１．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 ９に記載の方法。 １２．該オリゴヌクレオチドが修飾されている請求項１に記載の方法。 １３．少なくとも５０％の低下が測定される請求項１に記載の方法。 １４．(ａ)霊長類にオリゴヌクレオチドを投与し、その際、該オリゴヌクレオチ ドは長さが２〜５０ヌクレオチドであり、少なくとも一つのホスホロチオエート インターヌクレオチド結合を有し、ついで (ｂ)霊長類において少なくとも５０％の血圧の低下を測定する ことを特徴とする霊長類の血管拡張を刺激する方法。 １５．該オリゴヌクレオチドを約３０〜１２０ｍｇ／ｋｇ／時の一定速度での丸 塊静脈内注射として投与する請求項１４に記載の方法。 １６．該オリゴヌクレオチドを約３０ｍｇ／ｋｇ／時の一定速度で投与する請求 項１５に記載の方法。 １７．該オリゴヌクレオチドを約４０ｍｇ／ｋｇ／時の一定速度で投与する請求 項１５に記載の方法。 １８．霊長類１ｋｇ当たり５〜２０ｍｇのオリゴヌクレオチドを１０分かけて投 与する請求項１４に記載の方法。 １９．霊長類１ｋｇ当たり８０ｍｇのオリゴヌクレオチドを１２０分かけて投与 する請求項１４に記載の方法。 ２０．該オリゴヌクレオチドの長さが約６〜５０ヌクレオチドである請求項１４ に記載の方法。 ２１．該オリゴヌクレオチドの長さが約２０〜３３ヌクレオチドである請求項２ ０に記載の方法。 ２２．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのデオキリボヌクレオチドを含む 請求項１４に記載の方法。 ２３．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 １４に記載の方法。 ２４．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 ２２に記載の方法。 ２５．該オリゴヌクレオチドが修飾されている請求項１４に記載の方法。 ２６．少なくとも５０％の血圧低下が測定される請求項１に記載の方法。 ２７．(ａ)霊長類にオリゴヌクレオチドを投与し、その際、該オリゴヌクレオチ ドは長さが２〜５０ヌクレオチドであり、少なくとも一つのホスホロチオエート インターヌクレオチド結合を有し、ついで (ｂ)血液試料中の補体活性の減少を測定する ことを特徴とする霊長類の補体を枯渇させる方法。 ２８．該オリゴヌクレオチドを約３０〜１２０ｍｇ／ｋｇ／時の一定速度での丸 塊静脈内注射として投与する請求項２７に記載の方法。 ２９．該オリゴヌクレオチドを約３０ｍｇ／ｋｇ／時の一定速度で投与する請求 項２８に記載の方法。 ３０．該オリゴヌクレオチドを約４０ｍｇ／ｋｇ／時の一定速度で投与する請求 項２８に記載の方法。 ３１．霊長類１ｋｇ当たり５〜２０ｍｇのオリゴヌクレオチドを１０分かけて投 与する請求項２８に記載の方法。 ３２．霊長類１ｋｇ当たり８０ｍｇのオリゴヌクレオチドを１２０分かけて投与 する請求項２８に記載の方法。 ３３．該オリゴヌクレオチドの長さが約６〜５０ヌクレオチドである請求項２８ に記載の方法。 ３４．該オリゴヌクレオチドの長さが約２０〜３３ヌクレオチドである請求項３ ３に記載の方法。 ３５．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのデオキリボヌクレオチドを含む 請求項２８に記載の方法。 ３６．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 ２８に記載の方法。 ３７．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む請求項 ３５に記載の方法。 ３８．該オリゴヌクレオチドが修飾されている請求項２８に記載の方法。 ３９．少なくとも５０％の補体活性の減少が測定される請求２８に記載の方法。