JPH10501408A - Ｇｌｓ１をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グルカンシンターゼ遺伝子１（ＧＬＳ１）をコードするＤＮＡをクローニングし、１，３−β−Ｄグルカンシンターゼ活性を変調する化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイに使用する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＬＳ１をコードするＤＮＡ 発明の背景 サッカロミセス・セレビシエＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ菌の突然変異表現型を復帰させる遺伝子を含むＤＮＡ分子は単離及び精製さ れている。この遺伝子はＧＬＳ１（グルカンシンターゼ遺伝子１）である。ＧＬ Ｓ１は１，３−β−Ｄグルカンシンターゼのサブユニットをコードしている。従 って、ＧＬＳ１によってコードされたタンパク質は真菌性疾患の薬剤療法の標的 となる。本発明はまた、アスペルギルス・フミガーツスＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、カンジダ・アルビカンスＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａ ｎｓ、シゾサッカロミセスポンペＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐ ｏｍｂｅ及びＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓなどの他の真菌類 から単離されるＧＬＳ１のホモローグを包含する。 治療用化合物の作用モードを理解するためには、多様な実験方法が必要である 。１つの方法では、被験化合物に耐性または感受性の生物を単離する。このよう な生物を使用して薬剤標的 をコードする遺伝子を単離し得る。 真菌類の細胞壁は多数のポリマー、即ち、キチン、α−及びβ−グルカン類及 びマンノプロテイン類から成る複合体構造を有している。真菌類の細胞壁は生細 胞の多様な細胞プロセスに関与する。即ち、栄養成長、形態形成、高分子の取込 み及び分泌、浸透圧変化の防御、などは細胞壁の組成及び結合性（ｉｎｔｅｇｒ ｉｔｙ）の変化の影響を受ける。（真菌類には不可欠であり哺乳類細胞には欠如 している）細胞壁の合成を阻止することによって作用する抗真菌性化合物は高い 殺真菌性活性を有し、しかも哺乳類細胞に対する毒性が低い。 １つのクラスのβ−グルカン阻害物質は、アキュレアシンＡ、エキノカンジン Ｂ及びニューモカンジンのようなリポペプチド抗生物質から成る。これらの化合 物は、非極性脂肪酸側鎖を含む環状ヘキサペプチドである。エキノカンジンは、 １，３−β−Ｄグルカンの合成を阻止するので、細胞壁の結合性を破壊して酵母 細胞を溶菌させる殺真菌性を有している。ｉｎ ｖｉｔｒｏのエキノカンジンは グルコースが１，３−β−Ｄグルカンの形態に重合することを阻止する。 別のクラスのβ−グルカン合成阻害物質は、パピューラカン ジン及びキーシアカンジンから成る。これらの化合物は芳香環系に結合したグリ コシド成分と２つの長鎖脂肪酸とを含有している。これらの化合物はエキノカン ジンと同じ作用モードを有している。 カリニ・ニューモシスティスＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉはそ の嚢子の壁にβ−グルカンを含んでいることが証明された（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ，Ｙら，１９８９，Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．３６：２１Ｓ−２２Ｓ）。パピュ ーラカンジン及びエキノカンジンのようなβ−グルカン合成阻害物質はＰ．ｃａ ｒｉｎｉｉ感染症の治療に有用であろう。カリニ肺炎のラットモデルにおいて、 Ｌ−６７１，３２９（エキノカンジン）及びＬ−６８７，７８１（パピューラカ ンジン）の双方が感染ラット肺の嚢子の数を減少させるために有効であった（Ｄ ．Ｍ．Ｓｃｈｍａｔｚら，１９９０，ＰＮＡＳ ８７：５９５０−５９５４）。 これらの結果は、β−グルカン合成がＰ．ｃａｒｎｉｉ感染症の治療に有効な治 療薬を同定するための標的であることを示唆する。 β−グルカン合成に影響を及ぼした薬剤耐性酵母菌を単離するために数多の研 究がなされてきた。単離された突然変異体と しては、ａｃｕ１（Ｍａｓｏｎ，Ｍ，Ｍ，ら，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｂｓｔｒａｃｔ＃１５４）、及び 、ｐａｐ１（Ｄｕｒａｎ，Ａ．ら，１９９２，Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｔ．Ｇ．Ｖｉｌｌａ ａｎｄ Ｊ．Ａｂａｌｄｅ，Ｅｄ ｓ．），Ｓｅｒｉｖｉｃｉｏ ｄｅ Ｐｕｂｌｉｃａｃｉｏｎｅｓ，Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｓｐａｉｎ，ｐｐ．２２１−２３２） がある。 本発明では、グルカン合成に特異的に作用した突然変異株を単離するための選 択物質としてより効力のあるエキノカンジン（Ｌ−７３３，５６０）を使用した 。１つの突然変異体（ＭＳ１４株）はエキノカンジン耐性であり、またキチンシ ンターゼ阻害物質ニッコマイシンＺに超感受性である。ＭＳ１４中の突然変異が ＦＫＳ１遺伝子中に存在することを確認し、これをｆｋｓ１−４と命名する。別 の突然変異体（ＭＳ１株）はエキノカンジン耐性であり、パピューラカンジン及 びラパマイシンの双方に超感受性である。ＧＬＳ１遺伝子をクローニングするた めにＭＳ１株を使用した。発明の概要 １，３−β−Ｄグルカン（ＧＬＳ１）の生合成に関与するタンパク質をコード するＤＮＡ分子を同定し、クローニングし、発現させ、抗真菌性化合物のスクリ ーニングアッセイで使用する。図面の簡単な説明 図１。エキノカンジン耐性を与える単一遺伝子突然変異を示す減数分裂産物の 分離パターン（２：２）。ＭＳ１と野生株ＧＧ１００−１４Ｄとの交配によって 得られた四分子の４つの減数分裂産物を示す細胞を、７．５μＭのＬ−７３３， ５６０を含む培地にスポットした。２８℃で２日間増殖させると、４つの分離体 のうちの２つが増殖可能であり、これは薬剤耐性表現型の２：２分離を証明する 。 図２。ブイヨン微量希釈アッセイによってＭＳ１株（Ｇｌｓ１−１突然変異体 ）のエキノカンジンＬ−７３３，５６０耐性を試験した。 図３。ＭＳ１株（ｇｌｓ１−１）の形態的欠陥。細胞の集合体が（Ａ）、集合 体の中心に向かって溶菌を開始し（Ｂ）、集合体の全部の細胞が溶解する（Ｃ＆ Ｄ）ことが示されている。 図４。１，３−β−Ｄグルカン合成及びキチン合成に対するＬ−７３３，５６ ０及びニッコマイシンＺの効果。Ｘ２１８０−１Ａ（野生型）及びＭＳ１（ｇｌ ｓ１−１突然変異体）から調製した膜抽出物を使用して、１，３−β−グルカン シンターゼ反応（Ａ）及びキチンシンターゼ反応（Ｂ）を触媒した。基質として 、ＵＤＰ−グルコース（Ａ）及びＮ−アセチルグルコサミン（Ｂ）を使用した。 図５。１，３−β−Ｄグルカンシンターゼ活性に対するＧＴＰγＳの効果。漸 増濃度のＧＴＰγＳの存在下で１，３−β−グルカンシンターゼ反応をプライム するために野生株及び突然変異株の膜抽出物を使用した。 図６。ｇｌｓ１−１の最小相補性フラグメントの位置決定。ｇｌｓ１−１相補 性活性を有する１７ｋｂのクローンの部分的制限地図を示す（Ａ）。ＧＬＳ１の 転写方向を矢印で示す。制限地図の下方の線で示す酵母ゲノムのＤＮＡフラグメ ントを動原体プラスミドＹＣＰ５０に挿入した（Ｂ）。組換えプラスミドでＭＳ １（ｇｌｓ１−１突然変異体）を形質転換させた。形質転換細胞のエキノカンジ ン耐性表現型の相補性を試験した。図示のプラスミドは上から下にｐＪＡＣ２、 ｐＨＦ及びｐＥＦ である。制限酵素の略号は、ＤはＤｐｎＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＨはＨｉｎｄIII 、ＫはＫｐｎＩである。 図７。ＧＬＳ１はエキノカンジンに対する感受性を媒介する。 図８。３４８個のアミノ酸から成るＧＬＳ１遺伝子産物のハイドロパシープロ ット。 図９。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＬＳ１のヌクレオチド配列及び予想アミ ノ酸配列。 図１０。ＧＬＳ１はｇｌｓ１−１突然変異のパピューラカンジン−及びラパマ イシン−超感受性表現型に相補性を有している。 （Ａ）ｇｌｓ１−１突然変異を有する細胞に対するラパマイシンの効果。 （Ｂ）同じ突然変異細胞に対するパピューラカンジンＢの効果。プラスミド上の ＧＬＳ１によって形質転換された突然変異細胞は双方の薬剤に対する感受性を回 復する。 図１１。ゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション。クローン化されたＧ ＬＳ１のホモローグが他の真菌類中に存在するか否かを試験するために、Ｓ．ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＬＳ１遺伝子に由来のＤＮＡプローブを複数の異種真菌 類のゲノ ムＤＮＡにハイブリダイズさせた。Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐ ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｓ ｃａｒｉｎ ｉｉ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどの数種の真 菌類中にＧＬＳ１ホモローグの存在が証明される。発明の詳細な説明 １，３−β−Ｄグルカン（ＧＬＳ１）の生合成に関与するタンパク質をコード するＤＮＡ分子を同定し、クローニングし、発現させ、抗真菌性化合物のスクリ ーニングアッセイに使用する。 抗真菌性化合物はヒトを含む動物の真菌性感染症の治療に使用される。より安 全でより有効な抗真菌性化合物の需要は増加の一途を辿っている。真菌類の細胞 壁の構造が哺乳類の細胞膜の構造とは違っているので、真菌類の細胞壁の維持ま たは生合成を特異的に妨害する化合物は薬剤スクリーニングの標的となり得る。 細胞壁の生合成は真菌類及び植物の維持及び成長の基礎となる。細胞壁は支持 組織を形成し、原形質を環境から機械的に保護する。高分子の選択的取込み、浸 透圧調節、細胞増殖及び細 胞分裂は細胞壁で生じる。細胞外栄養素の加水分解及び形態形成中の細胞壁高分 子の代謝回転に関する酵素活性は細胞外マトリックスと関連する。 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁は８０％−９０％という多量の多糖類から 成る。細胞壁ポリマーの主成分はグルカン及びマンナンであり、更に、少量のキ チンが存在する（Ｃａｂｉｂ，Ｅ．，１９９１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅ ｎｔｓ Ｃｈｅｍｉｔｈｅｒ．３５：１７０−１７３）。グルカンは細胞壁の剛 性を支持及び維持し、マンノプロテインは細胞壁の浸透性を調節すると考えられ ている（Ｚｌｏｔｎｉｋら，１９８４）。 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁の３０％−６０％は３種類のグルカンによ って構成されている（Ｆｌｅｅｔ，Ｇ．Ｈ．，１９８５，ｐ．２４−５６．Ｍ． Ｒ．ＭｃＧｉｎｎｉｓ（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉ ｃａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ ｅｗ Ｙｏｒｋ）。グルカンの最も多い形態（全体の６０％）は、アルカリまた は酢酸に不溶であり、分枝状１−３−βポリマーであり、３％の１−６−β鎖間 結合を含むフィブリル状構 造を有し、１−６−β残基間結合が欠如している。グルカンの二番目の形態（全 体の３２％）は、希アルカリに可溶であり、不定形構造を有し、主として１−３ −β結合を含み、多少の１−６−β結合を含む。グルカンの最も少ない形態（全 体の８％）は、酸に可溶であり、高度に分枝状であり、主として１−６−β結合 を含んでいる。 エキノカンジンは、恐らくは１，３−β−グルカンの合成を阻止することによ って、細胞壁の生合成を妨害する。細胞壁形成の基幹酵素は１，３−β−グルカ ンシンターゼである。この酵素は動物細胞には存在しないので、抗真菌性化合物 を開発するための標的となり得る。１，３−β−グルカンシンターゼは、基質と してＵＤＰ−グルコースを使用し界面活性剤に可溶なＧＴＰ−結合タンパク質に よって賦活される膜関連酵素である（Ｋａｎｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｅ．Ｃａｂｉ ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５８０８−５８１ ２）。 栄養要求性、温度感受性及びＵＶ感受性突然変異体を単離するための文献（Ｓ ｈｅｒｍａｎら，１９８６）に記載の技術と同様の技術を使用して薬剤耐性突然 変異体を単離する。 ＧＬＳ１遺伝子は、細胞にエキノカンジン耐性を与える突然変異（ｇｌｓ１− １）の相補性を利用して染色体ＤＮＡライブラリーから単離され得る（Ｓｈｅｒ ｍａｎら，１９８６）。ＤＮＡクローニングベクター中でＤＮＡフラグメントの ライブラリーを調製し、個々のクローンをＧＬＳ１の存在に基づいてスクリーニ ングすることによって染色体ＤＮＡからＧＬＳ１遺伝子を単離し得る。例えば、 プラスミドＹＣｐ５０中のＧＲＦ８８株に由来のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲ ノムＤＮＡのライブラリーは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２からＡＴＣＣ３７４１５として入手 し得る。 プラスミドライブラリーは、微生物の純粋培養物から染色体ＤＮＡを単離する ことによって調製され得る。例えば、１種類以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素 で部分消化することによって染色体ＤＮＡを断片化する。得られたＤＮＡフラグ メントを大きさによって分け、次いでフラグメントをクローニングベクターに挿 入し得る。 クローニングベクターを少なくとも１つの制限エンドヌクレ アーゼによって切断し、ホスファターゼによって処理し、ＤＮＡフラグメントを ＤＮＡリガーゼによって結合させる。クローニングベクターを使用して、ＤＮＡ 取込み能力を有するコンピテント宿主細胞を形質転換させる。クローニング、Ｄ ＮＡプロセシング及び発現に使用し得る宿主細胞の非限定例は、細菌、酵母、真 菌類、昆虫細胞及び哺乳類細胞である。大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ ｉ Ｋ−１２のＲＲ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ１１ＳまたはＤＨ５ａ株 は有用な宿主細胞である。約５×１０⁴の独立ゲノムＤＮＡフラグメントがクロ ーニングベクターに結合すると、ライブラリーが形成される。完全ライブラリー は完全ゲノム像を含んでいると考えることができよう。形質転換手順中に組換え ＤＮＡ分子を取込んで安定に維持するコンピテント宿主細胞は、プラスミド選択 薬剤を補充した培地での増殖能力によって同定され得る。アンピシリン耐性遺伝 子を含むプラスミドベクターの場合、アンピシリンが選択薬剤である。１つのラ イブラリーの完全像を得るためには、形質転換混合物を寒天プレート上に広げ、 適正条件下でインキュベートする。形質転換細胞を、寒天プレートの表面から少 量の液体培地に再浮遊させる。細胞浮遊液を、選択薬剤を補充し たより多量の液体培地に接種し、３７℃で一夜インキュベートする。次に、当業 界で公知の方法で細胞からプラスミドＤＮＡを抽出する。 スクリーニングは、プラスミドライブラリー中のＧＬＳ１遺伝子を同定するよ うに計画する。１つの戦略では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤ２−８Ｂ株また はＤ２−８Ｄ株のようなｇｌｓ１−１突然変異体を使用する必要がある。細胞を 、ＤＮＡ取込み能力を有するコンピテント細胞とし、次いでライブラリーＤＮＡ によって形質転換させる。ＧＬＳ１遺伝子を含んだ形質転換体は選択薬剤エキノ カンジンに対してプラスミド依存的な感受性増加を示すであろう。 形質転換混合物のアリコートを選択培地で平板培養する。形質転換体のコロニ ーを採取し、液体培地に再浮遊させ、プールし、２５％グリセロールを補充した 培地中で−８０℃で凍結保存する。１ミリリットルあたりのコロニー形成単位の 数として定義される力価を当業界で公知の方法で測定する。 ＧＬＳ１遺伝子を含む形質転換体の同定は、プラスミド選択培地を含む寒天プ レートを用い、各プレート上でカウント可能な数のコロニーが増殖するように該 プレートにライブラリーを 平板培養することによって行う。各コロニーの一部分をレプリカ平板法によって ２つの寒天プレートに移す。１つのプレートは、中級の感受性をもつ細胞を致死 させる濃度の選択薬剤エキノカンジンを補充したプラスミド選択培地を含み、第 ２のプレートは、プラスミド選択培地だけを含む。陽性クローンはエキノカンジ ン非含有プレートでは正常に増殖するがエキノカンジン含有プレートでは殆どま たは全く増殖しない。 潜在性クローンのエキノカンジン感受性表現型は種々の試験によって検出され 得る。１つの試験では、コロニーから採取した細胞を種々の濃度の選択薬剤エキ ノカンジンを含むプレートの表面に直接塗抹する。２日間のインキュベーション 後に試験の結果を記録する。薬剤の存在下で増殖し難くかった細胞は潜在的陽性 であり、相補的遺伝子を担持するプラスミドを含む可能性が高い。 第２の試験では、レプリカ平板法を用い、各コロニーの一部分を、第１の試験 で使用した濃度の約２倍の濃度の選択薬剤エキノカンジンを含む寒天培地に移す 。陽性クローン（エキノカンジン感受性クローン）はこれらのプレート上で増殖 しない。 第３の試験では、コロニーから採取した細胞をプラスミド選 択液体培地に接種し、飽和まで増殖させる。飽和培養物のアリコートを選択薬剤 エキノカンジン補充または非補充の新しい液体培地に接種する。波長６００ｎｍ の光学密度によって増殖を測定する。エキノカンジンの存在下で増殖しないコロ ニーをエキノカンジン感受性として記録する。 別の試験では、ブイヨン微量希釈アッセイでクローンを試験する。このアッセ イでは１つの濃度範囲の選択薬剤エキノカンジンを用いて試験する。陽性クロー ンは選択薬剤エキノカンジンに対して初期の耐性突然変異体よりも高い感受性を 示す。 ＧＬＳ１遺伝子の機能性コピーを含む組換えプラスミドを同定するために、上 述のような試験を使用してゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。 エキノカンジン感受性の増加がプラスミドにコードされたＧＬＳ１のコピーに起 因するか否かを判断するために、陽性クローンからプラスミドＤＮＡを除去して エキノカンジン感受性の減少を試験する。エキノカンジン感受性の増加がプラス ミドの存在に起因するものであるならば、プラスミドの除去によってこの表現形 質が喪失するであろう。 エキノカンジン感受性の増加がＧＬＳ１遺伝子を含有するプ ラスミドの存在に起因するものであることは、陽性クローンからプラスミドＤＮ Ａを単離することによってより直接的に証明し得る。ＤＮＡ取込み能力を有する コンピテント大腸菌の細胞をプラスミドで形質転換させ、形質転換体を同定し単 離する。プラスミドＤＮＡを形質転換大腸菌から単離し次いで制限エンドヌクレ アーゼによって消化してばらばらの大きさのフラグメントを得る。各フラグメン トの大きさをゲル電気泳動のような慣用の方法によって測定する。プラスミドを 種々の酵素によって消化し、切断地図を作成する。切断地図はクローン化された フラグメント毎に異なっており各フラグメントに特異的である。詳細な切断地図 によってゲノム内部の特定遺伝子を十分に同定し得る。エンドヌクレアーゼ消化 によって作製したクローン化遺伝子のフラグメントをアガロースゲルから精製し 、当業界で公知の方法によって適当な配列決定用ベクターに結合するとよい。ベ クターの非限定例としては、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ＹＥｐ２４、ｐＧＥＭ３ Ｚｆ（＋）、ｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）及びｐＧＥＭ７Ｚｆ（−）がある。 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＬＳ１遺伝子を使用して病原性真菌類の相同遺 伝子を単離及び特性決定し得る。Ｃ．ｎｅｏ ｆｏｒｍａｎｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ及びＰｈｙｔ ｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓの菌株を非限定例とする他の真菌類は細 胞壁に１−３−β−Ｄグルカンを有しているので、これらの真菌類の各々にはＧ ＬＳ１の機能性ホモローグが存在している可能性が高い。ＧＬＳ１の機能性ホモ ローグは細胞壁に１−３−β−Ｄグルカンを有している他の生物中にも存在する かもしれない。 ＧＬＳ１ホモローグは被験生物から染色体ＤＮＡを単離することによって検出 され得る。単離された染色体ＤＮＡの一部分を多数の制限酵素によって切断する 。ＤＮＡの消化フラグメントをゲル電気泳動によって分離する。次いでフラグメ ントを固体膜支持体に移す。次に膜を標識プローブと共に一夜ハイブリダイズさ せる。ブロットを洗浄し、次いでＸＡＲ−５フィルムに露光し、慣用の方法（Ｌ ａｓｋｅｙ ａｎｄ Ｍｉｌｌｓ（１９７７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，８２ ：３１４−３１６）によって現像する。ブロット洗浄条件は、高度の相同性（≧ ８０％の測定値）を有するフラグメントだけがプローブにハイブリダイズするよ うな条件である。プローブにハイブリダイズする消化フラグメントの大きさ及び パターンからゲノム地 図を作成する。各生物毎に、地図は染色体中のＧＬＳ１ホモローグを十分に特異 的に同定する。 ｇｌｓ１−１（ＭＳ１株）、ｇｌｓ１−２（ＭＳ４１株）及びｇｌｓ１−３（ ＭＳ４３株）またはＧＬＳ１の分裂物または欠失物を非限定例とするＧＬＳ１遺 伝子の突然変異はグルカンシンターゼ阻害物質のスクリーニングに有用である。 このようなスクリーニングは、ＧＬＳ１野生株に比較したときのこれらの突然変 異体のエキノカンジン耐性及びパピューラカンジン感受性の増加に依存する。こ のような感受性の違いを検出し得る任意の技術を使用し得る。寒天プレート上の 阻害ゾーンアッセイが特に有用である。 クローン化されたＧＬＳ１ ｃＤＮＡを適当なプロモーターと他の適当な転写 調節要素とを含む発現ベクターに分子クローニングすることによって組換え発現 させ、原核性または真核性の宿主細胞に移入して組換えＧＬＳ１を産生させる。 本文中で発現ベクターは、クローン化された遺伝子コピーの転写及び適正宿主 中でのそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列であると定義される。このよ うなベクターは、細菌、酵母、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のよう な種々の 宿主中で真核細胞遺伝子を発現させるために使用され得る。 特殊設計されたベクターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞のように宿主間 でＤＮＡをシャトリングさせ得る。適正に構築された発現ベクターは、宿主細胞 中での自律複製用の複製起点と、選択可能マーカーと、限定数の有用な制限酵素 部位と、高コピー数の能力と、活性プロモーターとを含み得る。プロモーターは 、ＲＮＡポリメラーゼに指令してＤＮＡと結合させＲＮＡ合成を開始させるＤＮ Ａ配列であると定義される。強力プロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させる プロモーターである。発現ベクターの非限定例は、クローニングベクター、修飾 されたクローニングベクター、特殊設計されたプラスミドまたはウイルスである 。 哺乳類細胞中で組換えＧＬＳ１を発現させるために種々の哺乳類発現ベクター を使用し得る。組換えＧＬＳ１発現用の適当な市販の哺乳類発現ベクターの非限 定例としては、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅ ｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、 ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２ −１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐ ＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４ ６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６ ５）がある。 また、ＧＬＳ１をコードするＤＮＡを発現ベクターにクローニングして組換え 宿主細胞で発現させてもよい。組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく 、その非限定例は細菌、酵母、哺乳類細胞及び昆虫細胞である。市販されている 適当な哺乳動物種に由来の細胞系の非限定例は、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７ ０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲ Ｌ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣ Ｃ ＣＣＬ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（Ａ ＴＣＣ ＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１）である。 発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融 合及び電気穿孔を非限定例とする多数の技術 のいずれかによって宿主細胞に導入され得る。発現ベクター含有細胞をクローン 増殖させ、個々に分析して、ＧＬＳ１タンパク質を産生しているか否かを判断す る。ＧＬＳ１発現宿主細胞クローンの同定は、抗ＧＬＳ１抗体との免疫反応性及 び宿主細胞関連ＧＬＳ１活性の存在などを非限定例とする数種の手段によって行 うとよい。 また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生させた合成ｍＲＮＡを用いてＧＬＳ１ ｃＤＮＡ を発現させてもよい。合成ｍＲＮＡは、小麦胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を 非限定例とする種々の無細胞系に有効に翻訳でき、またカエル卵母細胞への微量 注入を非限定例とする細胞主体系に有効に翻訳できる。 最適レベルの酵素活性及び／またはＧＬＳ１タンパク質を産生する（１つまた は複数の）ＧＬＳ１ ｃＤＮＡ配列を判定するために、修飾されたＧＬＳ１ ｃ ＤＮＡ分子を構築する。宿主細胞をｃＤＮＡ分子で形質転換させ、ＧＬＳ１ Ｒ ＮＡ及びタンパク質のレベルを測定する。 宿主細胞中のＧＬＳ１タンパク質のレベルを、イムノアフィニティ法及び／ま たはリガンドアフィニティ法のような種々の方法で定量する。ＧＬＳ１特異的ア フィニティビーズまたはＧ ＬＳ１特異的抗体を使用して³⁵Ｓ−メチオニン標識するかまたは非標識のＧＬＳ １タンパク質を単離する。標識ＧＬＳ１タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって 分析する。非標識ＧＬＳ１タンパク質は、ＧＬＳ１特異的抗体を用いるウエスタ ンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイによって検出する。 組換え宿主細胞中でＧＬＳ１を発現させた後、ＧＬＳ１タンパク質を回収して 活性形態のＧＬＳ１を得る。ＧＬＳ１精製手順はいくつか存在し、適宜使用し得 る。組換えＧＬＳ１は細胞溶解液から精製してもよくまたはならし培地から精製 してもよく、このためには分画化、クロマトグラフィーなどの当業界で公知の段 階を組合わせてまたは単独で使用するとよい。 更に、全長の新生ＧＬＳ１またはＧＬＳ１のポリペプチドフラグメントに特異 的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体によって作製したイムノアフ ィニティカラムを使用して他の細胞性タンパク質から組換えＧＬＳ１を分離し得 る。 組換えタンパク質は抗体の産生にも使用し得る。本文中で使用された「抗体」 なる用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の双方、並びに、抗原 またはハプテンに結合し得るＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２フラグメントのよう な抗体フ ラグメントを包含する。 ＧＬＳ１に対する単一特異的抗体は、ＧＬＳ１に反応性の抗体を含有する哺乳 動物の坑血清から精製されるか、または、標準法を用いてＧＬＳ１に反応性のモ ノクローナル抗体として調製される。本文中で使用される単一特異的抗体なる用 語は、ＧＬＳ１に対して均一結合特性を有する単一抗体種または多数抗体種であ ると定義される。本文中で使用される均一結合なる用語は、上述のＧＬＳ１関連 抗体種のような抗体種が特異的抗原またはエピトープに結合する能力を意味する 。酵素特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどの 動物を、任意に免疫アジュバントを添加した適正濃度のＧＬＳ１で免疫すること によって感作される。免疫動物としてはウサギが好ましい。 ＧＬＳ１に反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウスのＧＬＳ １免疫のような慣用の方法によって調製し得る。 抗ＧＬＳ１をｉｎ ｖｉｔｒｏ産生するために、約２％のウシ胎仔血清を含む ＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させると十分な量の特異的ｍＡｂが得られる 。当業界で公知の方法によ ってｍＡｂを精製する。 腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価を血清学的または免疫学的な種々の アッセイによって定量する。アッセイの非限定例としては、沈降、受動凝集、エ ンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法、ラジオイムノア ッセイ（ＲＩＡ）法がある。体液中または組織及び細胞の抽出物中のＧＬＳ１の 存在を検出するために同様のアッセイを使用する。 上述のような方法は単一特異的抗体を産生するために使用されてもよく、ＧＬ Ｓ１ポリペプチドフラグメントまたは全長の新生ＧＬＳ１ポリペプチドに特異的 な抗体を産生するために使用されてもよい。 ＧＬＳ１ ｃＤＮＡ、ＧＬＳ１またはＧＬＳ１タンパク質に対する抗体を含む キットを作製し得る。このようなキットは、ＧＬＳ１ ＤＮＡにハイブリダイズ するＤＮＡを検出するため、または、サンプル中のＧＬＳ１タンパク質もしくは ペプチドの存在を検出するために使用される。このようなキャラクタリゼーショ ンは、法化学分析、分類学的決定及び疫学的研究などを非限定例とする種々の目 的に有用である。 本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗 体は、ＧＬＳ１ ＤＮＡ、ＧＬＳ１ ＲＮＡまたはＧＬＳ１タンパク質のスクリ ーニング及びレベル測定に使用され得る。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮ Ａ分子及び抗体は、ＧＬＳ１の検出及び型判定に適したキットの構成成分となる 。このようなキットは、閉鎖境界を維持する適当な区画形成性担体を少なくとも １つの容器中に含むであろう。担体は更に、ＧＬＳ１を検出するための適当な組 換えＧＬＳ１タンパク質または抗ＧＬＳ１抗体のような試薬を含むであろう。担 体は更に、標識抗原または酵素基質などのような検出手段を含み得る。 遺伝コードが縮重性なので、特定アミノ酸をコードするコドンが２種以上存在 し、従って、アミノ酸配列は、類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのセットのいず れかによってコードされ得る。ＧＬＳ１配列に一致するのはセットの１成員だけ であり、このセットはミスマッチを伴うＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下であ ってもＧＬＳ１ ＤＮＡにハイブリダイズし得るであろう。また、ミスマッチの ＤＮＡオリゴヌクレオチドもＧＬＳ１ ＤＮＡにハイブリダイズし、ＧＬＳ１を コードするＤＮＡの同定及び単離を可能にするであろう。 特定生物に由来のＧＬＳ１をコードするＤＮＡは他の生物に 由来のＧＬＳ１のホモローグを単離及び精製するために使用され得る。このため には、前者のＧＬＳ１ ＤＮＡを、ＧＬＳ１のホモローグをコードしているＤＮ Ａを含むサンプルと共に適正なハイブリダイゼーション条件下で混合するとよい 。ハイブリダイズしたＤＮＡ複合体を単離し、この複合体から相同性ＤＮＡをコ ードしているＤＮＡを精製し得る。 特定アミノ酸をコードする種々のコドンには相当量の重複（ｒｅｄｕｎｄａｎ ｃｙ）が存在することが知られている。従って、同一アミノ酸の任意の翻訳をコ ードする代替コドンを含むＤＮＡ配列も本発明の目的である。本明細書の記載で は、１つまたは複数の置換コドンを有する配列を縮重性変異と定義する。発現さ れたタンパク質の最終物理的特性を実質的に変化させないようなＤＮＡ配列また は翻訳タンパク質中の突然変異も本発明の範囲に包含される。例えば、ロイシン の代わりにバリン、リシンの代わりにアルギニン、または、グルタミンの代わり にアスパラギンが存在するような置換はポリペプチドの機能性変化を生じないで あろう。 ペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変し、天然産生ペプチドの特性とは異な る特性を有するペプチドをコードさせること も可能である。ＤＮＡ配列を改変する方法の非限定例としては、部位特異的突然 変異誘発がある。改変された特性の非限定例としては、基質に対する酵素の親和 性の変化がある。 本文中で使用されたＧＬＳ１の「機能性誘導体」なる表現は、ＧＬＳ１の生物 活性に実質的に同様の生物活性（機能的にまたは構造的に）を有する化合物を意 味する。「機能性誘導体」なる用語は、ＧＬＳ１の「フラグメント」、「変異体 」、「縮重変異体」、「アナローグ」、「ホモローグ」または「化学誘導体」を 包含すると理解されたい。「フラグメント」なる用語は、ＧＬＳ１の任意のポリ ペプチドサブセットを意味する。「変異体」なる用語は、完全ＧＬＳ１分子また はそのフラグメントに構造及び機能が実質的に同様である分子を意味する。分子 がＧＬＳ１に「実質的に同様である」という表現は、双方の分子が実質的に同様 の構造を有するかまたは双方の分子が実質的に同様の生物活性を有することを意 味する。従って、２つの分子が実質的に同様の活性を有するとき、一方の分子の 構造が他方の分子中に見出されない場合または２つのアミノ酸配列が一致しない 場合であっても変異体であると考えてよい。「アナローグ」なる用語は、完全Ｇ ＬＳ１分子またはそのフラグメントに実質的に同様の機能を有する分子を意味す る。 本発明の目的はまた、ＧＬＳ１をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現及びＧ ＬＳ１タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ機能を変調する化合物のスクリーニング方法 を提供することである。これらの活性を変調する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペ プチド、タンパク質または非タンパク質性有機分子のいずれでもよい。化合物は 、ＧＬＳ１をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはＧＬＳ１タンパク質 の機能を増進または減衰させることによって変調し得る。ＧＬＳ１をコードする ＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはＧＬＳ１タンパク質の機能を変調する化合物 は、種々のアッセイによって検出され得る。アッセイは、発現または機能の変化 の有無を判断する単なる「イエス／ノー」アッセイでもよい。被験サンプルの発 現または機能を標準サンプルの発現または機能のレベルに比較することによって 定量的なアッセイを行ってもよい。 以下の実施例で本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例の細部に限定 されない。実施例１ 菌株、プラスミド及び培地 この研究で使用した酵母菌株を表１にまとめる。突然変異株はＸ２１８０−１ Ａ株に由来する。 ＧＧ１００−１４Ｄ株及びＸ２１８０−１Ａ株は夫々、Ｋ．Ｂｏｓｔｉａｎ及 びＣ．Ｂａｌｌｏｕから得られた。突然変異体をＸ２１８０−１Ａ中で作製し、 ＧＧ１００−１４Ｄに異種交配した。略号：ｗｔ、野生型；Ｅｃｈ，エキノカン ジン；Ｓ，感受性；Ｒ，耐性。 以下の培地を使用した。ＹＰＡＤ培地は、１％のバクト酵母エキスと２％のバ クト−ペプトンと２％のデキストロースと０．００３％の硫酸アデニンとを含む 。合成デキストロース（ＳＤ）培地は、アミノ酸非含有の０．６７％のバクト酵 母窒素基材（Ｄｉｆｃｏ）と２％のデキストロースと２％のバクト寒天（Ｄｉｆ ｃｏ）とを含む。合成完全（ＳＣ）培地は、培地１リットルあたり各２０ｍｇの アデニン、ヒスチジン及びウラシルと６０ｍｇのロイシンと３０ｍｇのリシンと ２０ｍｇのトリプ トファンとを補充したＳＤ培地である。胞子形成培地は、２％のバクト寒天（Ｄ ｉｆｃｏ）と０．３％の酢酸カリウムである。Ｕｒａ欠失培地は、ウラシル非含 有ＳＣ培地である。固形培地は約２０ｇ／リットルの寒天を使用して調製する。実施例２ ＤＮＡ操作及び形質転換 標準ＤＮＡ操作法を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓ ｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｂｒ，Ｎ．Ｙ．）。大腸菌ＤＨ５ａ株（Ｈａｎａｈ ａｎ，Ｄ．，１９８３，「プラスミドによる大腸菌の形質転換に関する研究（Ｓ ｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄｓ）」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １６６：５５７−５８０）を細菌形質転換宿主として使用した。ＤＮＡライブラ リーによる酵母形質転換を電気穿孔によって実施した（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．ａｎ ｄ Ｌ．Ｇ ｕａｒｅｎｔｅ，１９９１，「電気穿孔による酵母の高い形質転換効率（Ｈｉｇ ｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」，Ｉｎ Ｃ．Ｇｕｔｈｒｉｅ ａ ｎｄ Ｇ．Ｆｉｎｋ（ｅｄｓ．），Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎ ｚｙｍｏｌ．１９４：１８２−１８７）。種々のプラスミドサブクローンによる 他の全ての酵母形質転換はアルカリカチオン法によって行った（Ｉｔｏ，Ｈ．， Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．Ｍｕｒａｔａ ａｎｄ Ａ．Ｋｉｍｕｒａ，１９８３， 「アルカリカチオンによる完全形酵母細胞の形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ ｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｌｋａｌ ｉ ｃａｔｉｏｎｓ）」，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：６３−６８）。ア ルカリ溶菌法によって大腸菌からプラスミドＤＮＡを調製した（Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ，Ｊ．ら，前出）。大腸菌を形質転換するためにプラスミドを既述の手順で酵 母から単離した（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｆ．Ｗｉｎｓｔｏｎ，１９ ８７，「酵母の１０分間調製物は大腸菌形質転換用の自律プラスミド を有効に放出する（Ａ ｔｅｎ−ｍｉｎｕｔｅ ＤＮＡ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ ｎ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｒｅｌｅａｓｅｓ ａｕ ｔｏｎｏｍｏｕｓ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」，Ｇｅｎｅ５７：２６７−２７ ２）。ＭＳ１株のエキノカンジン耐性表現型に相補性である野生型遺伝子ＧＬＳ １を、動原体シャトルベクターＹＣｐ５０中で構築した酵母ゲノムライブラリー から後述のごとく単離した（Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｐ．Ｎｏｖｉｃｋ，Ｊ．Ｈ． Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，１９８７， Ｇｅｎｅ．６０：２３７−２４３）。実施例３ ＧＬＳ１の特定領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマー及びシーク エナーゼ試薬キット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）を用いて 、ＧＬＳ１の５′端及び３′端のヌクレオチド配列をジデオキシチェーンターミ ネーション法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ ａｎｄ Ａ．Ｃｏｕ ｌｓｏｎ，１９７７，「チェーンターミネーション阻害物質によるＤＮＡ配列決 定（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７， １９７７）によって決定した。実施例４ ＰＣＲ増幅 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を公表されている手順に従って実施した（Ｍ ｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆ．Ａ．Ｆａｌｏｏｎａ，１９８７，「ポリメラ ーゼ触媒連鎖反応によるｉｎ ｖｉｔｒｏの特異的ＤＮＡ合成（Ｓｐｅｃｉｆｉ ｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ａ ｐｏ ｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０。Ｘ２１８０−１Ａ株に由 来の約５ｎｇの合成ＤＮＡを鋳型として使用した。染色体IIIのＭＡＴ遺伝子座 から左側に５ｋｂ離れた領域の１．５ｋｇのフラグメントを増幅するように合成 オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。２つのプライマーの配列を以下に示 す。 ５′−ＴＧＡＣＡＧＴＡＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＡＡ ＴＡＴＴＧＧＡＡＡＴＧ−３′（配列番号１）、及び、 ５′−ＴＣＡＧＡＴＡＡＴＴＴＴＡＴＣＧＧＴＡＣＣＴＴＴＴＡＴＡＴＧＴＴＡ ＡＡＴ−３′（配列番号２）。 増幅したＤＮＡフラグメントをゲル精製し、ランダムプライミング法によって 放射性標識し（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ，１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７：２６６）、公表されている プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，前出）に従って動原体ベクターＹＣｐ ５０（Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｄ．ら，前出）中で酵母ゲノムＤＮＡライブラリーを含む 細菌コロニーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。実施例５ 遺伝子破壊 ＧＬＳ１遺伝子の染色体破壊を１段階遺伝子破壊プロトコルによって実施した （Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｊ．，１９８３，「酵母中での１段階遺伝子破壊（ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ）」， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２０２−２１１）。ｐＪＡＣ２−１ の１．６ｋｂｐのＤｐｎＩフラグメントをｐＵＣ１８の ＨｉｎｃII部位にクローニングすることによってプラスミドｐＪＡＣ４を構築し た。ＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＶによってｐＪＡＣ４を二重消化すると、ＧＬＳ１によ ってコードされた４０個のＣ−末端アミノ酸をほぼ含む１．２ｋｂのフラグメン トが切除された。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子を担持する１．５ ｋｂのＤＮＡフラグメントをＹＣｐ５０プラスミドからＮｒｕＩ−ＳｍａＩフラ グメントとして単離した。精製したフラグメントをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで 処理し、プラスミドｐＪＡＣ４上のＧＬＳ１のＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＶ部位に平滑 端結合すると、ＧＬＳ１の破壊欠失を含むプラスミドｐＪＡＣ９が得られた。プ ラスミドｐＪＡＣ９を大腸菌中で増殖させ、プラスミドの構造を制限分析によっ て確認した。 ｇｌｓ１：：ＵＲＡ３破壊フラグメントをｐＪＡＣ９から２．７ｋｂのＸｂａ Ｉ−ＨｉｎｄIIIフラグメントとして精製し、これを野生型ＧＬＳ１遺伝子を含 むｕｒａ３−５２酵母株（菌株ＧＧ１００−１４Ｄ及びＤ２−５Ａ）の形質転換 に使用した。ウラシル原栄養性酵母形質転換体をウラシル欠失ＳＣ培地で選択し た。２つの形質転換株の各々から、１つのＵｒａ＋形質転換体を単コロニー形成 によって精製した。２つの形質転換体の 各々から得られた３つのＵｒａ＋単コロニーのＬ−７３３，５６０耐性を試験す ると、薬剤耐性を示すことが判明した。これらのコロニーを更に特性決定し、Ｇ ＬＳ１遺伝子座における組込み現象をサザンハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ，Ｊ．ら，前出）によって確認した。ＧＧ１００−１４Ｄ及びＤ２−５ Ａ中のＧＬＳ１遺伝子の破壊によって得られた２つの突然変異体を夫々ＭＳ１０ ０及びＭＳ１０１と命名した。 完全ゲノムＤＮＡを菌株ＧＧ１００−１４Ｄ、Ｄ２−５Ａ、ＭＳ１００及びＭ Ｓ１０１の静置培養物から単離した。約５μｇの量の各ＤＮＡをＤｒａＩによっ て制限消化した。消化産物を１％アガロースゲルに溶解し、ＺｅｔａプローブＧ Ｔナイロン膜に移し、製造業者のプロトコル（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）に従ってハイブリダイゼーション処理した。ＧＬＳ１に内在するＤｒ ａＩフラグメントの³²Ｐ放射性標識プローブをランダムプライマー法（Ｆｅｉｎ ｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９８４，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：２６６）によって調製した。実施例６ 液体ブイヨン微量希釈アッセイ 突然変異株のエキノカンジン感受性／耐性を定量するために、対数期まで増殖 させた酵母細胞を２ｍｌのＳＣブイヨンに接種し、２８℃で一夜インキュベート した。平底の９６ウェルのマイクロタイタープレートに７５μｌのＳＣ培地を２ 〜１２列に播種した。列１には、１５０μｌの培地を加えた。エキノカンジン（ Ｌ−７３３，５６０）を滅菌蒸留水中の３０μｇ／ｍｌ濃度の溶液に調製した。 エキノカンジン溶液のアリコート（７５μｌ）を列３に添加し、列３から７５μ ｌを列４に移し、次いで各ウエルの内容物を混合した。列４から７５μｌを列５ に移し、以後同様にして列１２まで系列希釈し、列１２から７５μｌを廃棄した 。ＵＲＡ欠失培地中で６×１０⁵細胞／ｍｌの希釈物を酵母菌株から調製した。 次に、７５μｌの細胞浮遊液を列２〜１２まで添加し、４×１０⁴細胞／ウエル とした。プレートを２８℃で２４−４８時間インキュベートした。エキノカンジ ンの存在下及び非存在下の増殖を６００ｎｍの吸光度によって測定した。実施例７ グルカンシンターゼアッセイ 対数期まで増殖させた突然変異細胞及び野生型細胞から膜抽出物を調製した（ Ｋａｎｇ ａｎｄ Ｃａｂｉｂ，ＰＮＡＳ，８３，５８０８−５８１２，１９８ ６）。ガラスビーズで均質化した後、未破壊細胞及び破片を低速遠心分離（１， ０００×ｇで５分間）によって除去した。上清流体を１００，０００×ｇで６０ 分間遠心し、得られたペレットを２．５ｍｌ（湿潤細胞１ｇあたり）のバッファ で洗浄した。バッファは、０．０５Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）と０．５ ｍＭのＤＴＴと１．０ｍＭのＰＭＳＦとを含んでいた。洗浄したペレットを５％ グリセロールを含有する同じバッファに再懸濁させた。このタンパク質抽出物は 酵素アッセイで使用する１，３−β−グルカンシンターゼ及びキチンシンターゼ のソースとして役立った。 ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｒｐ．）を用い、 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｒｐ．）を標準として用いて タンパク質濃度を測定した。１，３−β−グルカンシンターゼ反応を従来から公 表されている手順（Ｃａｂｉｂ，Ｅ．ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｋａｎｇ，１９８ ７，Ｆｕｎｇａｌ １，３−β−ｇｌｕｃａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ，Ｍｅｔｈｏ ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１３８：６３７−６４２）で実施した。簡単に説明する と、８０ｍｌの反応物は、１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と、０ ．２５ｍＭのジチオトレイトールと、３０ｍＭのＫＦと、０．３Ｍのグリセロー ルと、０．２３％のＢＳＡと、０．１２５ｍＭのＰＭＳＦと、２ｍＭのＵＤＰ− グルコースと、１０ｍＭのグアノシン５′−（ｇ−チオ）三リン酸（ＧＴＰ−γ Ｓ）と、０．１ナノモルのＵＤＰ−〔³Ｈ〕グルコース（Ａｍｅｒｓｈａｍ；４ ．５Ｃｉ／ミリモル）と、２５ｍｇの膜タンパク質抽出物とを含んでいた。薬剤 を用量滴定（ｄｏｓｅ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）するために、０．０、０．１、０ ．５、５、２５及び５０ｍＭのＬ−７３３，５６０の存在下で反応を実施した。 ２５℃で１５０分間インキュベーション後、トリクロロ酢酸に不溶な物質に組込 んだ〔³Ｈ〕−グルコースをガラス繊維フィルター（１０２×２５８ｍｍ）に回 収し、ベータプレート液体シンチレーションカウンター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．；ハーベスター２８００シリーズ）を用い て測定した。このような反応の産物は、ラミナリナーゼ（Ｓｉｇ ｍａ，＃Ｌ９２５９）によって可溶化されるがα−アミラーゼ（Ｓｉｇｍａ，＃ Ａ２６４３）によって可溶化されないことによって検証された。実施例８ キチンシンターゼアッセイ 従来から公表されているキチンシンターゼアッセイを使用した（Ｋａｎｇ，Ｍ ．Ｓ．，Ｎ．Ｅｌａｎｇｏ，Ｅ．Ｍａｔｔｉａ，Ｊ．Ａｕ−Ｙｏｕｎｇ，Ｐ．Ｗ ．Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ｅ．Ｃａｂｉｂ，１９８４，「サッカロミセス・セ レビシエからのキチンシンターゼの単離。反応産物中への捕捉による酵素の精製 （Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｂｙ ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１ ４９６６−１４９７２）。約１２５ｍｇの膜タンパク質抽出物をトリプシン活性 化し、キチンシンターゼ反応を触媒するために使用した。１００ｍｌの反応物は 、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５と、４０ｍＭのＭｇＣｌと、 ３２ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）と、１ｍＭのＵＤＰ−Ｎ −アセチル−〔¹⁴Ｃ〕グルコサミン（４×１０⁵ｃｐｍ／マイクロモル）と、０ ．８ｍｇ／ｍｌのジギトニンとを含んでいた。０．０、０．１２５、０．５、２ 及び８μＭのニッコマイシンＺの存在下で反応させた。３０℃で３０分間インキ ュベーション後、反応産物を１０％のトリクロロ酢酸で沈殿させ、Ｗｈａｔｍａ ｎガラスマイクロファイバーＧＦ／Ａディスクに回収し、取込まれた〔¹⁴Ｃ〕− ＧｌｃＮＡｃをカウントした。実施例９ エキノカンジン耐性自然突然変異体の単離 １，３−β−グルカンの生合成に関与する遺伝子の突然変異体を単離するため に、ニューモカンジンＢ化合物、Ｌ−７３３，５６０を使用してＸ２１８０−１ Ａ株中の耐性突然変異体を同定した。７．５ｍＭのＬ−７３３，５６０の存在下 でコロニーを形成し得る約４０個の自然突然変異体を以下のごとく単離した。野 生型Ｘ２１８０−１Ａ株をＳＤ最小培地中で定常期まで増殖させた。約１〜３× １０⁶の細胞を、７．５、１５または４５ｍＭのＬ−７３３，５６０を含むＳＤ プレートに散布した。 ２８℃で４日間インキュベーション後、エキノカンジン耐性コロニーが１−３× １０^-6の頻度で出現した。突然変異株ＭＳ１、ＭＳ４１及びＭＳ１４をこの手順 によって単離した。ＭＳ１４はＦＫＳ１遺伝子中に突然変異（ｆｌｓ１−４）を 含む。ＭＳ１及びＭＳ４１は突然変異ｇｌｓ１−１及びｇｌｓ１−２を夫々含む 。実施例１０ ＥＭＳ突然変異誘発及びｇｌｓ１−３突然変異を含むＭＳ４３株の単離 ＹＰＡＤブイヨン（５ｍｌ）にＸ２１８０−１Ａ株の一夜培養物を接種して初 期細胞密度１×１０⁶細胞／ｍｌとし、３０℃で一夜インキュベートした。一夜 培養物の２．５ｍｌのアリコートを５０ｍＭのＫＰＯ₄バッファ，ｐＨ７．０中 で遠心分離によって２回洗浄し、１０ｍｌの同じバッファに再浮遊させた。洗浄 細胞の５ｍｌのアリコートに、１５０μｌのエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ） を添加した。処理した細胞の浮遊液を撹拌し、３０℃で１時間インキュベートし た。洗浄培養物の別の５ｍｌを氷上に未処理で維持した。処理した５ｍｌの細胞 に等容の調製直後の１０％（ｗ／ｖ）フィルター滅菌チオ硫酸 ナトリウム溶液を加えて混合した。細胞を回収し、滅菌水で２回洗浄し、５ｍｌ のＹＰＡＤに再浮遊せさ、２４℃で４〜６時間インキュベートした。適正な細胞 希釈物を最小培地（ＳＤ）で平板培養した。未処理培養物を希釈し同様に平板培 養した。２４℃で３日間増殖後、コロニーを０．００１μｇ／ｍｌのＬ−７３３ ，５６０含有及び非含有のＹＰＡＤ培地にレプリカ平板法で培養し、３０℃でイ ンキュベートした。この手順によって試験した１，０００個のコロニー中、１０ 個のコロニーがＬ−７３３，５６０に耐性であった。ＭＳ４３と命名したこれら の耐性菌株のうちの１つは、後述するようにｇｌｓ１−３突然変異を含むことが 判明した。実施例１１ 遺伝子解析 ３つの突然変異株（ＭＳ１、ＭＳ４１、ＭＳ４３）の各々と野生株ＧＧ１００ −１４Ｄとの間の異種交配を実施した。四分子分析は、３つの突然変異株のいず れにおいてもＬ−７３３，５６０耐性が単一形質として分離することを示した（ 図１）。単一遺伝子突然変異は突然変異株と野生株とを交配しときにメンデルの 法則（２：２）で分離すると予測される。 ＭＡｔａエキノカンジン耐性突然変異体をＭＡＴａエキノカンジン感受性株Ｇ Ｇ１００−１４Ｄ（野生型）に交配することによって３つの突然変異株の突然変 異の優性または劣性を試験した。得られた３つのＭＡＴａ／ＭＡＴａヘテロ接合 二倍体株Ｄ２（ＭＳ１×ＧＧ１００−１４Ｄ）、Ｄ１２（ＭＳ４１×ＧＧ１００ −１４Ｄ）及びＤ２８（ＭＳ４３×ＧＧ１００−１４Ｄ）はいずれもＬ−７３３ ，５６０に感受性を示し、これは、ＭＳ１、ＭＳ４１及びＭＳ４３株が劣性突然 変異を有することを示す。 これらの突然変異が劣性であることは、ヘテロ接合二倍体Ｄ２、Ｄ１２及びＤ ２８が突然変異体の表現型よりもむしろ野生型の表現型を示すという観察によっ て確認された。二倍体Ｄ２、Ｄ１２及びＤ２８から得られた薬剤耐性分離体を用 いて相補性試験を実施した。ＭＳ１、ＭＳ４１またはＭＳ４３に由来する突然変 異を含む耐性単離物間に形成された二倍体（Ｄ１３２、Ｄ１３６、Ｄ１３７、Ｄ １４０、Ｄ１４１及びＤ１４２）はＬ−７３３，５６０に対する耐性を示し、こ れは３つの突然変異間に相補性が存在しないことを示す。 これらの結果は、独立に単離された３つの突然変異ｇｌｓ１ −１（ＭＳ１株）、ｇｌｓ１−２（ＭＳ４１株）及びｇｌｓ１−３（ＭＳ４３株 ）が１つの相補性グループを構成することを示す。異なる遺伝子または非連鎖遺 伝子中の突然変異は特定の表現型に相補性であり得る。同じ遺伝子または緊密に 連鎖した遺伝子中の突然変異は通常は互いに相補性にはなり得ないので、１つの 相補性グループとして分類される。実施例１２ ｇｌｓ１突然変異の遺伝子マッピング ＭＳ４１とＧＧ１００−１４Ｄとの異種交配によって得られた３７の四分子の 減数分裂分離体の遺伝子解析に基づいて、ｇｌｓ１−１突然変異をマッピングす ると、染色体IIIのＭＡＴ遺伝子座から１．３５センチモルガンの範囲内に存在 することが判明した（表２）。同様の解析によって、ｇｌｓ１−２（ＭＳ４１株 ）及びｇｌｓ１−３（ＭＳ４３株）の双方がＭＡＴ遺伝子座に連鎖することが判 明した。両親型の四分子のクラスはＧＧ１００−１４ＤとＭＳ１との交配から得 られたクラス（１２四分子）またはＧＧ１００−１４ＤとＭＥＳ４３との交配か ら得られたクラス（１９四分子）だけであった。突然変異が非連鎖遺伝子座また は異なる染色体中に局在する遺伝子に生じた場 合、後代の優性テトラ型クラス（Ｔ）が予測されるであろう。遺伝子交配で使用 した突然変異株及び野生株の表現型を以下に示す。菌株 表現型 ＭＳ１ Ｍａｔ ａ，エキノカンジン^R ＭＳ４１ Ｍａｔ ａ，エキノカンジン^R ＭＳ４３ Ｍａｔ ａ，エキノカンジン^R ＧＧ１００−１４Ｄ Ｍａｔ ａ，エキノカンジン^R ＭＡＴａ耐性突然変異体（ＭＳ１、ＭＳ４１またはＭＳ４３株）とＭＡＴａ感 受性野生株（ＧＧ１００−１４Ｄ）との異種交配から得られた四分子は以下の３ つのテトラ型のいずれか１つを示す筈である。 １．両親型表現型（ＰＤ）： Ｍａｔ ａ エキノカンジン^R Ｍａｔ ａ エキノカンジン^S 姉妹種は両親のいずれかの表現型を示す。 ２．非両親型表現型（ＮＰＤ）： Ｍａｔ ａ エキノカンジン^S Ｍａｔ ａ エキノカンジン^R 姉妹種はいずれの両親の表現型も示さない。 ３．テトラ型表現型（Ｔ）：姉妹種は両親型表現型及び非両親型表現型の双方（ Ｍａｔ ａ エキノカンジン^S、Ｍａｔ ａ エキノカンジン^R、Ｍａｔ ａ エ キノカンジン^R、Ｍａｔ ａ エキノカンジン^S）を示す。 ３つのｇｌｓ１突然変異体と野生株ＧＧ１００−１４Ｄとの異種交配によって 得られたデータを表２にまとめる。 ＜１というＮＰＤ比は連鎖を示す。このデータは３つのｇｌｓ突然変異がＭＡ Ｔに連鎖していることを示す。２つの遺伝子座の間のマップ距離は｛１００（１ ／２Ｔ）＋ＮＰＤ｝／四分子の総数によって計算する。ｇｌｓ１−１とＭＡＴと の間の距離は５０／３７＝１．３５センチモルガンである。実施例１３ ＭＳ１突然変異株のキャラクタリゼーション ＭＳ１株は左右相称的交配欠陥を示す（即ち、２つのｇｌｓ１−１コピーを含 むホモ接合二倍体産生用交配は効率が極めてよくない）。得られるホモ接合二倍 体は胞子形成培地で継代培養したときに胞子を形成しない。ホモ接合二倍体は浸 透圧的に不安定であり、水に浮遊させると破裂する。 対照的に、ヘテロ接合二倍体を産生するための野生型細胞と３つのｇｌｓ１突 然変異のいずれかを含む細胞との交配は正常に進行する。 形態学的には、ＭＳ１細胞は３０℃のＹＰＡＤ培地中でいくつかの凝集細胞（ 図３）及び多数の出芽を示し、ときには綿状増殖を示す。ＭＳ１株はまたＹＰＡ Ｄ中では野生型親株よりもゆっくりと増殖する。この緩徐な増殖の特徴は、細胞 が分裂期 に入る前の長い遅滞期を有することである。実施例１４ 抗真菌性薬剤のＭＳ１株に対する効果 ＭＳ１株は細胞の壁、膜、ステロール及びタンパク質合成に影響を及ぼす３０ 種以上の阻害物質パネルに対して試験したときに多剤耐性を示さなかった。 Ｌ−７３３，５６０に対する耐性に加えて（図２）、ＭＳ１細胞は、１，３− β−グルカンシンターゼ阻害物質であるパピューラカンジン及び免疫抑制剤であ るラパマイシンに対して野生型親株よりも感受性である（図１０）。実施例１５ １，３−β−グルカンシンターゼ及びキチンシンターゼの活性レベル 細胞膜から得られた粗酵素調製物の１，３−β−グルカンシンターゼ及びキチ ンシンターゼの活性を試験した。Ｌ−７３３，５６０及びニッコマイシンＺに対 するこれらのポリマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成の感受性を試験した（図４）。 これらの実験は、ＭＳ１のグルカン合成活性が野生型細胞に比べて低下してい る（８０％未満の活性）ことを示した。実施例１６ ＧＴＰγＳによる１，３−β−Ｄ−グルカン合成の賦活 ＧＴＰγＳによる１，３−β−グルカン合成の活性化を試験するために、３． ３μＭのＧＴＰγＳの非存在下及び存在下で１，３−β−ＤグルカンへのＵＤＰ −グルコースの取込みを測定した。ＭＳ１突然変異体の酵素活性によるグルカン 合成はＧＴＰγＳによって賦活された（約１９倍）。これはＭＳ１突然変異酵素 による６倍の賦活と対比を成す（図４）。 別の実験では、種々の濃度のＧＴＰγＳによる突然変異体及び野生型の膜の賦 活を試験した。ＭＳ１突然変異体の酵素活性はＧＴＰγＳの濃度増加に顕著には 応答しなかった（図５）。実施例１７ 機能的相補性及びハイブリダイゼーションによるＧＬＳ１遺伝子の単離 エキノカンジン耐性表現型の相補性によってＧＬＳ１遺伝子をクローニングし た。酵母菌Ｄ２．８Ｂ（ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｇｌｓ１−１を動原体ベク ターＹｃＰ５０（Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｄ．ら，１９８７，Ｇｅｎｅ．６０：２３７− ２４３）中の酵母ゲノムＤＮＡライブラリーで形質転換させ、次いで、Ｕ ｒａ欠失培地で形質転換体を選択した。形質転換体（２４００）をＵｒａ欠失培 地のマスタープレートに接種し、０．０または７．５μＭのＬ−７３３，５６０ を補充した同じ培地を含むプレートにレプリカ平板法で培養した。３０℃で２〜 ３日間のインキュベーション後、４つの感受性コロニーを単離した。これらの４ つのコロニーのうちで、Ｄ２．８Ｂ（ｐＪＡＣ２−１）と命名した１つのコロニ ーは相補性プラスミドｐＡＣ２−１を含むことが判明した。別の実験として、Ｍ ＡＴの左側に約７ｋｂ離れて位置する配列を示す１．５ｋｂのＤＮＡフラグメン トをＰＣＲによって増幅し、放射性標識し、コロニーハイブリダイゼーションに よってＹＣｐ５０を主体とする酵母ゲノムライブラリーをスクリーニングするた めのプローブとして使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，前出）。この手順に よって約４８００の細菌コロニーをスクリーニングすると、ｐＪＡＣ２−２と命 名されたプラスミドを含むハイブリダイズクローンが得られた。 ｐＪＡＣ２−１及びｐＪＡＣ２−２は同一の制限地図を有するＤＮＡフラグメ ントを含む。ｐＪＡＣ２−２をＤ２．８Ｂ株に導入した。３つの酵母形質転換体 を試験すると、Ｌ−７３３， ５６０に対して野生型のレベルの感受性を獲得したことが判明した。更に、形質 転換体から調製した膜抽出物は、形質転換しない突然変異体の膜に関連する低レ ベルの１，３−β−グルカンシンターゼ特異的活性を復帰させていた。 Ｄ２．８Ｂ（ｐＪＡＣ２−２）と命名した酵母形質転換体から形質転換用プラ スミドｐＪＡＣ２−２を除去するために、ＹＰＡＤブイヨン中で一夜増殖させ次 いでＹＰＡＤプレートに平板培養して単コロニーを形成させる処理を連続３回繰 返した。処理後のクローンはプラスミドを喪失し、Ｌ−７３３，５６０耐性を示 した。実施例１８ Ｇｌｓ１−１最小相補性フラグメントの決定 クローン化したインサートＤＮＡを内部切断する制限酵素で消化することによ って、ｐＪＡＣ２のｇｌｓ−１相補性領域を規定した（図６）。ＹｃＰ５０にサ ブクローニングした制限フラグメントを含むプラスミドを大腸菌ＤＨ５ａ中で増 殖させ、制限パターンに関して特性決定し、次いで突然変異酵母株ＭＳＤ２．８ Ｂに導入した。得られた酵母形質転換体の増殖速度及び薬剤耐性表現型を試験し た。ｇｌｓ１−１相補性活性は約４ ｋｂのＫｐｎＩフラグメント（図１）中に存在していた。更に相補性分析して、 ＧＬＳ１遺伝子を含む１．６ｋｂｐのＤｐｎＩフラグメントを規定した。 １７ｋｂの出発ライブラリークローンから得られたより小さいＤＮＡフラグメ ントの制限解析及びサブクローニングを用いて、ｐＪＡＣ２の４ｋｂのＫｐｎＩ フラグメントを単一コピーベクターＹＣｐＬａｃ３３にクローニングしてｐＪＡ Ｃ１を作製した。ｐＪＡＣ１はＭＳ１突然変異体表現型に相補性であった。 同様の解析によって、ｐＪＡＣ２から得られた１．６ｋｂのＤｐｎＩフラグメ ントを細菌ベクターｐＵＣ１８のＨＩｎｃII部位にクローニングしてｐＪＡＣ４ と命名されたプラスミドを産生した。ＧＬＳ１を含む１．６ｋｂのＢａｍＨＩ／ ＳｐｈＩフラグメントをｐＪＡＣ４から精製し、ＹＥｐ２４及びＹＣｐ５０の双 方のプラスミドにサブクローニングして（ＢａｍＨＩ及びＳｐｈ１によって消化 ）、ｐＪＡＣ５及びｐＪＡＣ３を夫々作製した。双方のプラスミド（ｐＪＡＣ３ 及びｐＪＡＣ５）はｇｌｓ１−１薬剤耐性／感受性表現型に相補性であった（図 ７、８）。実施例１９ ＧＬＳ１のヌクレオチド及び推定アミノ酸の配列解析 ジデオキシチェーンターミネーション法を使用してＧＬＳ１の５′端のヌクレ オチド配列を決定した。最初の２００ｂｐの配列を決定し、染色体IIIのＹＣＲ ３４の読取り枠（ＯＲＦ）と比較した（Ｏｌｗｅｒ，Ｓ．ら，１９９２，Ｎａｔ ｕｒｅ ３５７：３８−４６）。比較した２００ｂｐ全部の配列が一致した。こ れらの結果は、ＧＬＳ１とＹＣＲ３４のＯＲＦとが一致することを示唆した。Ｇ ＬＳ１／ＹＣＲ３４のヌクレオチド配列及び予測アミノ酸配列を図９に示す。 ＧＬＳ１／ＹＣＲ３４の５′非翻訳領域の６００ｂｐの配列は、プロモーター 「ＴＡＴＡ」ボックスの４つの候補を含む。更に、酵母のＨＡＰ１結合部位に高 度に相同なＵＡＳ要素の２つの候補が存在する。従って、ＧＬＳ１のプロモータ ー領域は、酵母遺伝子ＣＹＣ１のプロモーター領域に顕著な類似性を示す。４つ の「ＴＡＴＡ」要素の配列適合度は２つの遺伝子でほぼ一致する。ＵＡＳ配列も またＣＹＣ１のＵＡＳ１に高度な相同性を示す。これはＧＬＳ１発現がＣＹＣ１ の発現と同様にして調節され得ることを示唆する。 ＧＬＳ１／ＹＣＲ５３４の３４８アミノ酸の推定タンパク質産物をタンパク質 データベースに比較した。既知のタンパク質との有意な相同性は見出されなかっ た。Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのアルゴリズムを用いて３４８残基のアミ ノ酸をハイドロパシー分析した（図１０）。推定タンパク質産物は塩基性（ｐＩ ＝１０．３）であり、疎水性である。配列中に複数のロイシンジッパー構造モチ ーフが存在し、これはタンパク質産物が二量体を形成し得ることを示す。実施例２０ ＧＬＳ１遺伝子破壊 ＧＬＳ１が必須であるか否かを試験するために、１段階遺伝子破壊によってＧ ＬＳ１遺伝子の染色体欠失を生じさせた（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｊ．，１９ ８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１２：２０２−２１１）。ＧＬＳ １をコードする配列の大部分を含むプラスミドｐＪＡＣ４の１．２ｋｂの領域を ＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントとして欠失させた。ＵＲＡ３遺伝子を含む１ ．５ｋｂのＤＮＡフラグメントとの平滑端結合によってｐＪＡＣ４の欠失領域を 置換した。ＧＬＳ１の破壊コピーを２．７ｋｂｐのＨＩｎｄII／ＸｂａＩフラグ メ ントとして切除し、このフラグメントを使用してＧＬＳ１を含有する２つの野生 株ＧＧ１００−１４Ｄ及びＤ２．５Ａを形質転換した。 得られたＵｒａ＋酵母形質転換体のエキノカンジン耐性を試験した。２つの形 質転換体（ＧＧＤｇｌｓ１及びＤ２．５ＡＤｇｌｓ１）はＬ−７３３，５６０に 対する耐性を獲得しており、更に分析した（図９）。ＧＬＳ１遺伝子座の変質を サザンハイブリダイゼーション分析によって確認した。ＧＬＳ１の欠失した単相 体菌株が生存適性を有することは、遺伝子が増殖に必須でないことを示す。実施例２１ 病原性真菌類中に存在するＧＬＳ１のホモローグ 酵母の膜調製物を塩及び界面活性剤で処理することによって酵母１，３−β− Ｄグルカンシンターゼを可溶性及び不溶性の２つの画分に分画し得る。ＧＴＰの 存在下で２つの画分を混合することによってグルカンシンターゼ活性を再生し得 る。Ｃａｂｉｂと彼の共同研究者らは、可溶化した画分は酵母と他の真菌類との 間で互換性を有することを示した。これは、真菌類のグルカン合成酵素間に相同 性が有り得ることを示唆する。 クローン化したＧＬＳ１のホモローグが他の真菌類に存在してるか否かを試験 するために、複数の異種真菌類のゲノムＤＮＡを調製し、一連のＰＣＲ及びサザ ンハイブリダイゼーション分析を行った。結果は、ＧＬＳ１ホモローグが、Ｃａ ｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ 、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ及びＰｈｙｔｏｐｈｔｈ ｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓなどの他の真菌類に存在することを示した（図１１ ）。実施例２２ Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ＣａｒｉｎｉｉからのＧＬＳ１ホモローグの単離 Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉに感染した雄のスプレーグ・ドーリーネズミのラット全肺 をＢｒｉｎｋｍａｎｎホモジナイザーで均質化し、文献（Ｐ．Ａ．Ｌｉｂｅｒａ ｔｏｒら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３０（１１）：２９６８−２ ９７４）に記載の手順でＤＮＡを単離する。２〜５μｇの精製ＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉのような制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲルでフラグメントを 分離する。ＤＮＡをニトロセルロースのような固体支持体に移し、サザン法（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ．Ｍ．１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７）によってＧ ＬＳ１に相同性をもつフラグメントを探す。低減した緊縮性でブロットを洗浄す ることによって軽度に相同な遺伝子を同定し得る。 ハイブリダイズするフラグメントがサザンブロットで観察されたアガロースゲ ルの領域からミニライブラリーを調製することによってＰ．ｃａｒｉｎｉｉのＧ ＬＳ１ホモローグをクローニングする。フェノール：ＣＨＣｌ₃抽出によって夾 雑物を除去した後、ゲルのこの領域から得られたＤＮＡフラグメントを適当なプ ラスミドベクターに結合し、大腸菌を形質転換させる。ミニライブラリーを担持 した大腸菌クローンを寒天プレートに広げ、ｉｎ ｓｉｔｕコロニー溶解によっ てＧＬＳ１に相同なインサートを探す。個々の形質転換体から得られたＤＮＡを ニトロセルロースに移し、放射性標識したＧＬＳ１ ＤＮＡフラグメントにハイ ブリダイズさせ、洗浄し、フィルムに露光する。ＧＬＳ１に相同性を有するイン サートを含むコロニーをフィルム上で可視化する。次に、プラスミドＤＮＡを陽 性クローンから単離し、増殖させ、分析する。標準法によるＤＮＡ配列解析を使 用して、ＧＬＳ１に対する相同性の程度を確認し、ＧＬＳ １用の破壊Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現させることによって機能的相同性 を証明し得る。実施例２３ 植物病原性真菌類からのＧＬＳ１ホモローグの単離 Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓのような植物病原性真菌類か らＧＬＳ１ホモローグをクローニングするために、高分子量ゲノムＤＮＡをＡｔ ｋｉｎｓ ａｎｄ Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５： ２２７２−２２７８）によって記載された方法で単離し、制限酵素によって部分 消化し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得られるクローニングキット及び慣用の方法 （Ｍａｎｉａｔｉｓ）を用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｍｂ ｄａ−Ｄａｓｈにクローニングする。ＧＬＳ１からのプローブを用いてライブラ リーをスクリーニングする。実施例２４ ＧＬＳ１突然変異体（ＭＳ１、ＭＳ４１及びＭＥＳ７−４３株）はエキノカン ジン耐性及びパピューラカンジン超感受性であるが、ｆｋｓ１−４突然変異体（ ＭＳ１４株）はエキノカンジン耐性（野生型よりも５０倍耐性）及びニッコマイ シンＺ− 超感受性（１０００倍の感受性）である。ＧＬＳ１及びｆｋｓ１−４の突然変異 体は、エキノカンジン、パピューラカンジン及びニッコマイシンＺに対する耐性 ／感受性の違いに基づいてキチン及びグルカンのシンターゼ阻害効果をもつ抗真 菌性化合物をスクリーニングし分類するためのアッセイに組込むことができる。 このアッセイから得られたデータ及び増殖阻害ゾーンのミリメートルで示す大き さを次表に示す。 酵母菌ＭＳ１及びＭＳ１４株は、グルカン及びキチンの合成 阻害物質をスクリーニングするアッセイで使用し得る。このアッセイはまた、パ ピューラカンジン及びエキノカンジンのような種々のクラスのグルカン合成阻害 物質を識別し得る。 ＭＳ１４に活性であるがＭＳ１及び野生株に対して不活性である化合物は、「 キチンシンターゼ型」の阻害物質である。ＭＳ１に対して活性であるが野生株及 びＭＳ１４に対してより低度に活性である化合物は「パピューラカンジン型」阻 害物質である。「エキノカンジン型」阻害物質は野生株に対する活性に比べてＭ Ｓ１細胞に対する活性が低下しており、ＭＳ１４に対する活性は更に低下してい る。実施例２５ 他の宿主細胞系中でＧＬＳ１ポリペプチドを発現させるためのＧＬＳ１のクロー ニング （ａ）細菌発現ベクター中のＧＬＳ１ ｃＤＮＡのクローニング 異種タンパク質の発現を指令するように設計された発現ベクターに最適ＧＬＳ １ ｃＤＮＡ配列を挿入した後、大腸菌のような細菌中で組換えＧＬＳ１を産生 させる。これらのベクターは、組換えＧＬＳ１が単独で合成されるかまたは以後 の操作に 適した融合タンパク質として合成されるように構築されている。発現は、組換え ＧＬＳ１が可溶性タンパク質として回収されるかまたは不溶性封入体の内部に回 収されるように調節するとよい。これらの目的に適したベクターとしては、ｐＢ Ｒ３２２、ｐＳＫＦ、ｐＵＲ、ｐＡＴＨ、ｐＧＥＸ、ｐＴ７−５、ｐＴ７−６、 ｐＴ７−７、ｐＥＴ、ｐＩＢＩ（ＩＢＩ）、ｐＳＰ６／Ｔ７−１９（Ｇｉｂｃｏ ／ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴＺ１８ Ｒ、ｐＴＺ１９Ｒ（ＵＳＢ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などがあ る。 （ｂ）ウイルス発現ベクター内へのＧＬＳ１ ｃＤＮＡのクローニング ＧＬＳ１ ｃＤＮＡ配列を含むワクシニアウイルスを感染させたＨｅＬａ Ｓ ３細胞のような哺乳類宿主細胞中で組換えＧＬＳ１を産生させる。ＧＬＳ１：ワ クシニアウイルスを産生させるために、ＧＬＳ１ ｃＤＮＡを先ずｐＳＣ１１、 ｐＴＫｇｐｔＦ１ｓ、ｐＭＪ６０１のようなトランスファーベクターまたは他の 適当なベクターに結合させ、次いで相同組換えによってワクシニアウイルスに移 入する。プラーク精製及びウイルス 増幅後、ＧＬＳ１：ワクシニアウイルスを使用して哺乳類宿主細胞を感染させ、 組換えＧＬＳ１タンパク質を産生する。実施例２６ グルカンシンターゼサブユニットペプチドの産生方法 （ａ）ＧＬＳ１タンパク質をコードするＤＮＡによって宿主細胞を形質転換し て組換え宿主細胞を作製し、（ｂ）グルカンシンターゼサブユニットペプチドを 産生させる条件下で組換え宿主細胞を培養し、（ｃ）組換えグルカンシンターゼ サブユニットペプチドを回収することによって組換えＧＬＳ１を産生する。組換 えグルカンシンターゼサブユニットを標準法によって精製し特性決定する。実施例２７ グルカンシンターゼサブユニット活性を変調する化合物を種々の方法で検出し 得る。グルカンシンターゼサブユニットに影響を与える化合物の同定方法は、 （ａ）被験化合物をグルカンシンターゼサブユニット含有溶液と混合して混合物 を形成し、 （ｂ）混合物中のグルカンシンターゼサブユニット活性を測定し、 （ｃ）混合物のグルカンシンターゼサブユニット活性を標準に比較する、段階か ら成る。 グルカンシンターゼサブユニット活性を変調する化合物は医薬組成物に配合し 得る。このような医薬組成物は、真菌類感染を特徴とする疾患または症状を治療 するために有効であろう。実施例２８ グルカンシンターゼサブユニットをコードするＤＮＡに構造的に近縁のＤＮＡ をプローブによって検出する。適当なプローブは図示のヌクレオチド配列の全部 または一部分を有するＤＮＡ、図示のヌクレオチドの配列の全部または一部分を 有するＤＮＡによってコードされたＲＮＡ、図示のアミノ酸配列の一部分に由来 の縮重オリゴヌクレオチド、またはＧＬＳ１によってコードされたペプチドに対 する抗体から得ることができる。実施例２９ グルカンシンターゼサブユニットまたはグルカンシンターゼサブユニットペプ チドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの検出及びキャラクタリゼーションに有用 なキットを慣用の方法によって作製する。キットは、グルカンシンターゼサブユ ニットをコードするＤＮＡ、組換えグルカンシンターゼサブユニットペ プチド、グルカンシンターゼサブユニットをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡ 、または、グルカンシンターゼサブユニットに対する抗体を含み得る。キットは 、法医学サンプルまたは疫学サンプルのような試験サンプルの特性決定に使用さ れ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 9/10 9359−4Ｂ 9/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/43 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 39/395 9051−4Ｃ 37/48 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グルカンシンターゼサブユニットまたはその機能性誘導体をコードする単離 ＤＮＡ。 ２．図９のヌクレオチド配列またはその機能性誘導体を有する請求項１に記載の 単離ＤＮＡ。 ３．請求項１に記載の単離ＤＮＡまたはその相補的配列によってコードされた単 離ＲＮＡ。 ４．請求項１に記載の単離ＤＮＡを含む発現ベクター。 ５．請求項４に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。 ６．組換えグルカンシンターゼサブユニットペプチドの産生方法であって、 （ａ）宿主細胞を請求項１に記載の単離ＤＮＡによって形質転換させて組換え 宿主細胞を作製する段階と、 （ｂ）組換えグルカンシンターゼサブユニットペプチドを産生し得る条件下で 組換え宿主細胞を培養する段階と、 （ｃ）グルカンシンターゼサブユニットペプチドを回収及び精製する段階とか ら成る方法。 ７．請求項６に記載の方法によって産生される精製された組換 えグルカンシンターゼサブユニットペプチド。 ８．単離及び精製されたグルカンシンターゼサブユニットペプチドまたはその機 能性誘導体。 ９．図９のＤＮＡによってコードされていることを特徴とする請求項８に記載の 単離及び精製されたグルカンシンターゼサブユニットペプチド。 １０．図９のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項９に記載の単離及び 精製されたグルカンシンターゼサブユニットペプチド。 １１．グルカンシンターゼサブユニットペプチド活性を変調する化合物の同定方 法であって、 （ａ）被験化合物をグルカンシンターゼサブユニットペプチドを含む溶液と混 合して混合物を形成する段階と、 （ｂ）混合物中のグルカンシンターゼサブユニットペプチド活性を測定する段 階と、 （ｃ）混合物のグルカンシンターゼサブユニットペプチド活性を標準に比較す る段階とから成る方法。 １２．請求項１１に記載の方法によって同定される化合物。 １３．請求項１２に記載の化合物を含む医薬組成物。 １４．請求項１に記載の単離ＤＮＡと、組換えグルカンシンターゼサブユニット ペプチドまたはその機能性誘導体と、組換えグルカンシンターゼサブユニットペ プチドもしくはその機能性誘導体に対する抗体とから成るグループから選択され た試薬を含むキット。 １５．請求項８に記載のグルカンシンターゼサブユニットペプチドに免疫反応性 の抗体。 １６．請求項１２に記載の化合物を動物に投与することから成る疾患の治療を要 する動物の治療方法。