JPH10501419A

JPH10501419A - 細胞物質の検出方法

Info

Publication number: JPH10501419A
Application number: JP8502395A
Authority: JP
Inventors: マール，アンナ・エム; ボウ，アン・イー; ラフ−ロバーツ，アリソン・エル; クリンガー，キャサリン・ダブリュー
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1994-06-13
Filing date: 1995-06-13
Publication date: 1998-02-10
Also published as: EP0764218A1; AU2772695A; EP0764218A4; WO1995034685A1; US5501954A; AU702236B2; CA2192823A1

Abstract

(57)【要約】本発明方法は、分析のために核の形態を保存しつつ細胞中のＤＮＡを検出するための迅速な方法に関する。該方法は、ポリマー膜フィルター上に細胞を沈着させ（細胞中に含まれるＤＮＡはポリマー膜フィルター上に保持され、蛍光標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーションに利用可能である）、ポリマー膜フィルターを標識核酸プローブとともにインキュベーションし、次いで、標識核酸プローブを検出する（核酸プローブの検出はＤＮＡの存在を示すものである）ことからなる。プローブを細胞に侵入させ、ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせるための、別々の透過工程を必要としない。該方法は、単純で迅速であり、かつ臨床研究室において見いだされる試料体積に適用可能である。本発明方法は、ポリマー膜フィルター上で分別され、濾過され、増殖または定着される細胞についての、単一コピー配列プローブを用いる分析を可能する。さらに、該方法は、膜フィルター上において、単一コピーまたは繰り返しＤＮＡ配列を含むプローブの中期染色体ならびに静止期核へのハイブリダイゼーションを可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】細胞物質の検出方法発明の背景分子クローニング、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングおよびin situハイブリダイゼーションのごとき方法は、核酸ハイブリダイゼーションの特異性および感度を利用するものである。これらの方法は、日常的に、オートラジオグラフ検出法と組み合わされた高特異性放射活性ポリヌクレオチドプローブを使用する。 in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）における蛍光は、染色体分析と分子的方法との間のギャップを解決することを助ける重要かつ強力な診断の道具である。ＤＮＡプローブセットを標識し、細胞遺伝学的標品にそれらをハイブリダイゼーションさせる能力は、この方法を用いて微小な染色体異常を検出できることを示すものである。この方法の高い分解能により、単一コピー配列の直接的可視化が可能である。各染色体は、静止期核において別々のドメインまたは別個の集中的なテリトリーを占めているので（Lichter,P.,et al.PNAS USA.85:9664 〜9668,1988;Manuelidis,L.Hum.Genet.71:288〜293,1985;Cremer,T.et al.Exp.C ellRes.176:199〜220,1988）、大部分の核において各個別の染色体の存在に関する別個のＦＩＳＨシグナルが得られる。それゆえ、染色体１３の３つのコピーを伴う静止期核は、３つの染色体１３のＦＩＳＨシグナルを示すが、正常な二染色体核は２つのシグナルを生じるであろう。染色体特異的であるコスミド整列群に基づく適当なプローブセットを用いて、親の診断において染色体を数えることができる。三染色体核型はＦＩＳＨ法によって診断されている（Lichter,P.,et al .PNAS USA.85:9664〜9668,1988;Klinger,K.,et al.,Am.J.Hum.Genet.51:55〜65, 1992）。ＦＩＳＨ用試料標品中の変数がハイブリダイゼーションおよびシグナルの質に大いに影響しうることが示されている（Cheselet M-F（編）in situ hybr idization histchemistry.CRC Press,Boca Raton,pp39〜70中、Jordan,C.A. 1990.In situ hybridization in cells and tissue sections:a study of myeli n gene expression during CNS myelination and remyelination;Patterson,D. （編）Molecular genetics of chromosome 21 and Down syndrome.Wiley-Liss,N ew York,pp69〜78中、Lichter,J.P.,Jaunch,A.,Cremer,T.,and Ward,D.C.1990.D etection of Down syndrome by in situ hybridization with chromosome 21 sp ecific DNA probes; McNeil,et al.,Genet.Anal.Tech.Appl.8:41〜58,1991）。最適なＦＩＳＨパラメーターも細胞タイプに依存する。ＦＩＳＨは、しばしば、染色体分析と組み合わせて用いられる。臨床研究室で分析される大部分の染色体スプレッドは、人工的に誘導された細胞タイプ、または自然に分裂している細胞タイプ（例えば、リンパ球、羊水細胞、骨髄）の豊富なソースに由来する。標的細胞が豊富でない場合、あるいは標的細胞が静止しているかまたは分裂頻度が少ない場合には（例えば、Minimal Residual Diseaseにおけるまれな癌細胞または母性細胞循環における胎児細胞）、静止期ＦＩＳＨを用いると、染色体に基づく分析よりも多くの細胞が分析に利用できる。細胞損失を最小にし（例えば、細胞に有害でありうる細胞濃縮工程または遠心分離工程の数を減らす）、潜在的に有益な標的材料へのアクセスを最大にする、試料の捕獲および分析方法に対する必要性が明らかに存在する。最適なＦＩＳＨ結果を得るためには異なる細胞タイプは異なる処理工程を必要とすることは明らかである。さらに、複数の試料の単純、迅速、かつ同時の処理を可能にするプロセスに対する必要性が存在する。発明の概要本発明方法は、分析のために核の形態を保存しつつ細胞中のＤＮＡを検出するための迅速な方法に関する。該方法は、ポリマー膜フィルター上に細胞を沈着させ（細胞中に含まれるＤＮＡはポリマー膜フィルター上に保持され、蛍光標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーションに利用可能である）、ポリマー膜フィルターを標識核酸プローブとともにインキュベーションし、次いで、標識核酸プローブを検出する（核酸プローブの検出はＤＮＡの存在を示すものである）ことからなる。プローブを細胞に侵入させ、ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせるための、別々の透過工程を必要としない。該方法は、単純で迅速であり、かつ臨床研究室において見いだされる試料体積に適用可能である。本発明方法は、ポリマー膜フィルター上で分別され、濾過され、増殖または定着される細胞についての、単一コピー配列プローブを用いる分析を可能する。さらに、該方法は、膜フィルター上において、単一コピーまたは繰り返しＤＮＡ配列を含むプローブの中期染色体ならびに静止期核へのハイブリダイゼーションを可能にする。発明の詳細な説明本発明方法は、核の形態を実質的に無傷のまま、検鏡および細胞のＤＮＡ（すなわち、標的ＤＮＡ、分析されるＤＮＡ）の同定用に、細胞を迅速に単離することができるという知見に基づく。ポリマー膜フィルターの使用は、スライドガラスに優る多くの利点を有しており、例えば、細胞表面上の蛍光物質結合モノクローナル抗体による蛍光バックグラウンドの除去を伴う過剰な液体の簡単な除去を可能にしつつ、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）からの膜フィルター上への直接的な回収が可能となる。膜フィルター上への細胞の濾過もまた、細胞濃縮のための遠心分離の必要性を減じる。さらに、単一または複数の試料を扱う場合に、ポリマー膜フィルターは、細胞の損失を伴う種々の細胞濃縮工程（例えば、遠心分離）に対する必要性のごとき分析に必要とされる多くの工程を減らす。本発明方法は、いかなる細胞のＤＮＡの検出にも適する。これらの細胞は、原核細胞および真核細胞を包含する。好ましい具体例において、本発明方法を用いて、ヒトおよび他の哺乳動物の赤血球細胞、栄養芽層、白血球、羊水細胞、腫瘍細胞および割球のごとき単一細胞懸濁液中の哺乳動物細胞のＤＮＡの検出を行う。一般的には、細胞を濾過により膜上に沈着させる。細胞を膜上に定着させ、あるいは増殖させることができる。細胞沈着の正確な方法は、細胞タイプおよび細胞が受けた前処理に依存する。用語「細胞物質」は、細胞中のいずれかの場所に含まれている細胞成分をいい、例えば、核酸および蛋白をいう。細胞核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。細胞蛋白は、核マトリックスおよび細胞質に含有される蛋白、ならびにヒストンのごとき核酸結合蛋白を包含する。用語「核物質」は、細胞の核のいずれかの場所に含まれている物質をいい、核酸および各蛋白を包含する。用語「細胞懸濁液」は、細胞を含有するすべての液体をいう。この液体は、通常には単一細胞状態、すなわち、通常には他の細胞または構造、組織、器官の一部に付着していない細胞を含む。かかる細胞は血液または尿由来であってもよい。「細胞懸濁液」もまた、構造、組織、もしくは器官の一部由来で、現に液体に懸濁されている凝集していない細胞をいう。「細胞懸濁液」は、同じ構造、組織もしくは器官由来であってもよくそうでなくてもよい同種または異種の細胞タイプのいずれかを含んでいてもよい。用語「濾過」は、細胞を含有する液体試料のポリマー膜フィルターへの適用をいう。濾過は、試料を微小な穴を有する膜フィルターに通すことにより細胞および／または細胞の一部を液体試料中の過剰の流体から取るプロセスである。このプロセスは、圧力を利用することにより溶液から粒子を取り、膜上に保持するものである。濾過は、液体を多孔性の機械的障壁または膜フィルターに通すことにより懸濁物質を液体から物理的に取るプロセスである。これにより、流体から分離された物質の抽出および分析が容易になる。用語「細胞沈着または適用」は、濾過することおよび単一細胞または単一細胞懸濁液をポリマー膜フィルター上に適用することを包含する。これらの他の方法は、単一細胞含有液滴または単一細胞懸濁液をポリマー膜フィルター上に適用することおよびそれを乾燥させることを包含する。別の方法は、定着させること（ Klinger,K.et al.Am.J.Hum.Genet.51:55〜65,1992）を包含する。用語「ポリマー膜」または「ポリマー膜フィルター」は、ポリカーボネート、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリスルホン、ナイロン、セルロースエステル、ニトロセルロース、ポリプロピレンおよびテフロン（ＰＦＴＥ）から作られた有機膜フィルターを包含し、それらの膜は、ＤＮＡをハイブリダイゼーション、検出および分析に適した条件に保持し、in situハイブリダイゼーションプロセスによっても無傷のままにしておく特徴を有する。用語「標識リガンド」は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ３^TM、ＣｙＲＯ^TM、ＣＹ５^TM（Biological Detection Systems,Inc.,Pittsb urgh,PA）、Cascade Blue^TMおよびLucifer Yellow（Molecular Probes,Eugene,O R）のごとき蛍光色素で直接または間接的に標識された抗体および核酸（または核酸プローブ）を包含する。本発明標識核酸プローブを蛍光色素で直接または間接的に標識することができる。用語「結合」は、抗体がそれらの標的に結合する作用、および例えばハイブリダイゼーションによって核酸がそれらの標的に結合する作用を包含する。好ましい具体例において、本発明リガンドをビオチン（ｂｉｏ）で標識し、蛍光タグを付けたアビジンまたはストレプトアビジンで蛍光的に検出するか、あるいはジゴキシゲニン（ｄｉｇ）標識プローブを蛍光タグを付けた抗ジゴキシゲニンを用いて検出する。別法として、ＤＮＡリガンドを蛍光タグで直接標識することもできる。当業者に知られた標準的方法によってこれらを行うことができる。用語「検出」は、標識リガンド結合細胞物質（すなわち、標的ＤＮＡ）の分析または検出が装置の助けによって可能になるすべての検出方法を包含する。かかる装置は、顕微鏡、ＦＡＣＳ装置および蛍光計を包含する。当業者に知られたいずれのリガンド標識法であっても本発明方法の目的に適する。ニックトランスレーション（Rigby,et al.,J.Mol.Biol.,113:23,1977）またはランダムプライミング（FeinbergおよびVogelstein,Anal.Biochem.,132:6〜13 ,1983）によりジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim,Indiana polis,IN）またはビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim,Indianapol is,IN）をＤＮＡ中に取り込ませることができる。選択された蛍光発色基に結合したアビジンとともにインキュベーションすることによりビオチン含有化合物の検出を行うことができる。ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドの検出を、ＦＩＴＣ、Texas Red、ローダミンまたは他のいずれかの蛍光発色基に結合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて行うことができる。しばしば、選択された蛍光発色基（ＦＩＴＣ）Ｃｙ３^TM、ＣｙＲＯ^TM、ローダミン、Cascade BlueTMまたは Texas Red）に結合した２次抗体を用いてモノクローナル抗体を検出する。ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、ヨウ化プロピジウム、およびHoechst色素のごときＤＮＡ結合色素での染色によりＤＮＡの検出を行うことができる。他のＤＮＡ結合色素は、Molecular Probesから出されているＹＯＹＯ^TM、ＹＯ−ＰＲＯ^TM、ＴＯＴＯ^TM、ＴＯ−ＰＲＯ^TM、およびＳＹＢＲ^TMを包含する。上記のごとく、本発明方法は、多孔性ポリマー膜フィルター上で細胞を濾過することからなる。本発明膜フィルターを、焼結ガラスフィルターホルダーのごとき器具上に置いて、濾過を行っている間膜を維持固定してもよい。使用される正確なフィルターホルダーまたは装置に依存してＦＩＳＨの結果は変化しうる。膜フイルターと真空装置との間に挿入されるCellMicroSieves^TM（５μｍ；New Yor k,Carmel,NYのBiodesign Inc.）から作られた支持体は、一般的には、検出すべき標識リガンドのシグナルを増強し、細胞物質の形態および分配を膜フィルター上に保持することがわかっている。さらに、平へしフィルター（flatter filter ）を得て、顕微鏡分析を容易にすることができる。それは絶対に必要というわけではなく、それをプロトコールに含ませるかどうかは実験的に決定する必要がある。細胞または核を含有する液体試料の濾過を可能にし、試料の液体部分を透過させつつ細胞または核からなる細胞物質を保持し、所望シグナルの分析を妨害するに十分な自己蛍光を伴わずに引き続いて行われる保持細胞物質の顕微鏡検出を可能にするポリマー膜フィルターはいずれも本発明方法に適する。さらに、膜は、一連の処理および洗浄の間、細胞物質を保持しなくてはならず、さらに無傷のままでなければならない（すなわち、破れたり、はずれたりしない）。例えば、いくつかのニトロセルロース膜は本発明の目的には脆すぎる。さらにそのうえ、保持された核は顕微鏡分析に適した形態学的状態でなければならない。また、膜フィルターは、操作されている間その物理的一体性を維持し、比較的平らでなければならない（すなわち、巻き上がったり、使用試薬に溶解しない）。かかるポリマー膜フィルターは、認容性の下がっていく順に、ポリカーボネート、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリスルホン、セルロースならびにニトロセルロースの混合エステルから作られたものを包含する。試みられたいくつかのナイロン膜は、それらの自己蛍光のために不適当であった。孔サイズ５μｍまたはその以上の膜フィルターは、そのサイズのために細胞損失を引き起こすので、ある種の細胞タイプには適さないことがわかっていることに注意すべきである。０.１ μｍ未満の孔サイズの膜フィルターは固定されない細胞とともにフラグメント化したシグナルを生じる傾向がある。多くの試料の調製が単純化され、複数の膜フィルターをハイブリダイゼーションさせ同時に洗浄することができる。これらの後者の利点は臨床研究室における操作にとり重要である。本発明方法において種々の固定法を用いることができる。ある種の固定プロトコールは分析すべきシグナルの質または核の形態に影響するようであるということが見いだされたことに注意すべきである。多くの固定剤はシグナルの質に悪影響を及ぼす。有益な効果を有することがわかっている固定剤は、Streck's Tissu e Fixative（S.T.F.^TM;Streck Laboratories,Inc.,Omaha,NE）、Histochoice^TMM B Fixative（Amresco,Solon,OH）、RBC Fix^TM（Isolab,Inc.,Akron,OH）、およびZinc Formal-Fixx^TM（Shandon,Pittsburgh,PA）を包含する。マイクロウェーブ照射のごとき他の固定方法もＦＩＳＨに適用できる。いくつかの試料タイプは、良好なハイブリダイゼーションのために固定処理を必要としない。試料を固定すべき工程を実験的に決定する必要がある。フィルター上への沈着後、固定された、または固定されていない細胞はやはり、ＮａＯＨ、パパイン、およびトリプシンを包含する試薬に応答する可能性があり、サイズのごとき核形態の変化を示す可能性がある。このことはハイブリダイゼーション結果に影響するかもしれない。使用ＤＮＡプローブは、コスミド整列群からなる単一コピープローブ（１００〜１４０ｋｂ）であるか、または繰り返しプローブであるかのいずれかであった。標的は各ＤＮＡであった。使用した１３、１８および２１のコスミド整列群に関して、我々は、正常細胞については２個のシグナルを、そして異数体細胞については３〜４個のシグナルを期待した。本発明の１の好ましい具体例において、０.１または０.２μｍのCostar （Cambridge,MA）ポリカーボネート膜を、フィルターホルダー上の５μｍのCell MicroSieves^TMフィルター上に置く。焼結ガラスタイプのフィルターホルダーを真空フラスコの頂上部に置く。真空レギュレーターを４００ｍｍＨｇにセットして真空フラスコから真空源への配管を行う。細胞懸濁液をポリカーボネート膜上にピペッティングする。流体が膜を通過した後、膜フィルターをピンセットで取り、風乾する。膜をハイブリダイゼーションまで−２０℃で保存するか、または同日にハイブリダイゼーションに使用してもよい。ハイブリダイゼーションのためには、１０μｌの湿潤用溶液をスライドガラス上にピペッティングする。泡の生成が最小となる方法で、膜フィルターを注意深くこの液滴上に置く。次いで、１０μｌのハイブリダイゼーション混液を膜フィルター上に置く。次いで、カバーガラスをフィルター上にゆっくりと置いて泡の生成を最小限にする。次いで、スライドガラスを８０℃で９〜１３分変性させ、加湿チャンバ中３７℃で一晩インキュベーションする。ハイブリダイゼーション洗浄および分析を実施例１に説明する。多数の試料が存在する場合には、プラスチック袋中で、試料を含有する複数の膜フィルターを同時にハイブリダイゼーションさせ、次いで、検出蛍光物質とともにインキュベーションすることができる。ハイブリダイゼーションおよび検出洗浄の間、フィルターを束縛せずに、あるいはメッシュ袋に入れて洗浄することができる。もう１つの好ましい具体例において、ＦＡＣＳでソーティングされた試料を０ .１または０.２μｍの黒色ポリカーボネート膜フィルターを用いて収集することができる。上記との相違は、真空フラスコを用いずに、真空ホースを接続したプレキシガラス構造体の頂上部にフィルターホルダーを置くということである。一定の真空の存在下で、またはソーティング完了まで真空を差し止めながら、ＦＡＣＳから発出する細胞の流れを膜フィルター上に直接沈着させるかまたはその上に落とすことのできるように装置全体（膜フィルター、CellMicroSieves^TM、フィルターホルダー、プレクシガラス）を配置する。膜フィルターは乾燥していても、湿っていてもよい。それが湿っている場合には、ソーティング終了まで真空を差し止める。膜上に集まる液体が過剰でない場合にのみ、ソーティング終了まで真空を差し止めることができる。細胞を試験管中にソーティングするのではなく膜上に直接ソーティングし、次いで、膜フィルター上の細胞を濾過することの利点は、細胞損失が少なく、試料の取り扱いが少なく、迅速、容易な試料の処理が行えることである。まれな細胞が膜フィルター上にソーティングされる割合は、得られるＦＩＳＨの質に影響しうる。一定の真空の存在下で乾燥した膜上への直接ソーティングの場合、迅速に（２０秒またはそれ以下）膜上にソーティングされる胎児肝細胞は、数分間かけて沈着される同じ細胞よりも良好な結果を生じた。ＣＤ７１、糖蛋白Ａ、およびHoechst３３３４２に関してソーティングされた胎児肝細胞を用いる実験において、固定されていない細胞を用いて良質なハイブリダイゼーションが得られた。妊娠女性由来の血液を同じパラメーターを用いてソーティングした場合、固定細胞を用いて最良の結果が得られた。ソーティング前および膜上への沈着後に細胞を固定することは最良のＦＩＳＨの結果を生じた。ソーティングされていない母性試料については、良好なハイブリダイゼーション結果のためには固定しないことが必要であった。膜フィルター上でのＦＩＳＨ完了後、訓練された顕微鏡操作者または自動イメージプロセッシングのいずれかにより分析を行うことができる。全体として自動イメージップロセッシングと両立できる膜フィルター上のＦＩＳＨプロトコールを開発することが我々の最終目的である。これにはできる限り平らな試料を作成する必要があろう。３次元的な標的細胞は、不可能でないにしても、自動焦点調節を非常に困難にするであろうし、また、訓練された人にとっても分析を必ず複雑なものにする。好ましい具体例は、単一焦点平面に細胞およびシグナルを有するものであろう。また、このことは、試料を手動で読み取る場合にも分析を単純にする。本発明方法は、真空濾過によって細胞または細胞懸濁液をポリマー膜フィルター上に沈着させることからなる。さらに細胞を透過性にするための試薬処理を必要としない。単一コピー配列ならびに繰り返し配列に対するＤＮＡプローブをうまく用いて静止期および中期の染色体上の各ＤＮＡを探索した。我々の方法により、迅速な顕微鏡による染色体の計数のための十分に平らな核が得られる。プロトコール全体は、研究室で標準的に用いられているものよりも単純で、多数の臨床試料の迅速処理に適する。実施例１：膜フィルター上に捕獲された胎児肝細胞中のＤＮＡの検出 Ficoll-Paqueグラジエント（Pharmacia,Uppsala,Sweden）によりヒト・胎児肝細胞を分画した。５０ｍＬコニカルチューブ中で、細胞を２倍体積のHank's Bal anced Salt Solution（ＨＢＳＳ）またはＰＢＳで希釈した。１０ｍｌの希釈血液を１５ｍｌのコニカルチューブ中にピペッティングし、次いで、９インチのパスツールピペット中のFicoll-Paqueを血液試料の下に置いた。卓上遠心機中、２５℃にいおて、２０００ＲＰＭで２０分間チューブを遠心分離した。血清を含有する最上層を取り、捨てた。単核細胞層を新しいチューブに取り、ＰＢＳで２回すすぎ、完全ＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン）中に再懸濁し、ヘマサイトメーターで計数した。一部を０.２２μｍＰＶＤＦ膜フィルター（Millipore,Bedford,MA）または０. １もしくは０.２μｍポリカーボネート膜フィルター（Poretics,Livermore,CAまたはCostar,Cambridge,MA）のいずれかの上にスポットし、ＤＡＰＩアンチフェード溶液（５００μｇ／ｍｌの４,６−ジアミノ−２−フェニル−インドール（ＤＡＰＩ− Sigma,St.Louis,MO）、２.３３％ＤＡＢＣＯ（Sigma,St.Louis,MO） ,２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ８.０、９０％ｖ／ｖグリセロール）で染色して有核細胞数を決定することにより有核細胞濃度を決定した。次いで、ＤＡＰＩ陽性核の数を顕微鏡で計数した。細胞をＰＢＳ中に希釈して１００〜４００個／μｌの濃度とし、次いで、下記のごとく、最小５〜１０μｌの細胞を膜フィルター上で真空濾過した。焼結ガラス濾過装置（Kontes,Vineland,NJ）上に置かれた５μｍCellMicroSieves^TMフィルター上に膜フィルターを置き、４００ｍｍＨｇで真空濾過した。液体を膜フィルターで濾過した後、膜を取り、風乾した。膜フィルターを−２０℃で保存した。膜フィルターを貯蔵庫から取り出し、スライドガラス上の１０μｌの湿潤用溶液（５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０.１５ＭＮａＣｌ、０. １５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０）、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸）上に細胞側を上にして置いた。１０μｌのハイブリダイゼーションカクテル（５０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸、２００ｎｇ／μｌヒト・Ｃｏｔ１ＤＮＡ（GIBCO BRL,Life Technologies,Gathersburg,MD）、および超音波処理で６００ｂｐフラグメントとしたサケ・精子ＤＮＡ８００ｎｇ／ μｌ）を膜フィルター上に置いた。スライドガラス、パラフィルムまたはカバーガラスを膜フィルター上に置いた。ＤＮＡプローブを以下の濃度としてハイブリダイゼーションカクテル中に含有させた：１０ｎｇ／μｌ常染色体プローブ、０ .５〜２.５ｎｇ／μｌＸプローブまたは５ｎｇ／μｌＹプローブ。これらのプローブおよびプローブ標識プロトコールはKlinger,K.,et al.,Am.J.Hum.Genet., (1992)51:55に記載されている。８０℃のスライドウォーマー（slide warmer）で９〜１３分間核酸を変性させた。次いで、膜フィルターを加湿チャンバ中３７℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、膜フィルターをスライドガラスから取り、２ＸＳＳＣ ,ｐＨ７.０で２回すすいで過剰のハイブリダイゼーションカクテルを除去した。次いで、膜フィルターをバッチ法で洗浄した。それぞれ、最初の３回の洗浄を、５０％ホルムアミド、２ＸＳＳＣ,ｐＨ７.０中で４２℃で５分間行った。膜フィルターを２ＸＳＳＣで２回すすぎ、それぞれ、０.１ＸＳＳＣ中、６０℃で５分間、３回洗浄し、３％ＢＳＡ、４ＸＳＳＣ中、４２℃で５分間ブロッキングした。次いで、それらをスライドガラス上に固定し、４ＸＳＳＣ,１％ウシ・血清アルブミン（ＢＳＡ）、０.１％ツイン２０中、適当な蛍光物質とともに、３７℃ で３０分インキュベーションした。適当な蛍光物質とは：ストレプトアビジン− Ｃｙ３^TM（２.０μｇ／ｍｌ；Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.West Grove,PA）、抗ジゴキシゲニン−ＦＩＴＣ（１.０μｇ／ｍｌ；Boehringer Mann heim,Indianapolis,IN）、ＣｙＲＯ^TM（２５０ｎｇ／ｍｌ；Biological Dtetcti on Systems,Pittsburgh,PA）またはアビジン−ＦＩＴＣ（５.０μｇ／ｍｌ：Vector Laboratories,Burlingame,CA）であり、次いで、パラフィルムまたはカバーガラスで覆った。次いで、膜フィルターをスライドガラスから取り、４２℃において４ＸＳＳＣ、０.１％ツイン２０で５分間、３回洗浄し、室温において２ＸＳＳＣ中ですすぎ、スライドガラス上に置き、ＤＡＰＩアンチフェードをその上に置いた。約２５μｌのＤＡＰＩアンチフェードを膜フィルター上に置き、カバーガラスで覆い、ネイルポリッシュ（nail polish）で封をした。適当な励起およびエミッションフィルターを装備したZeiss AxioplanまたはAx ioscopeエピ蛍光顕微鏡を用いて分析を行った。遺伝学的に正常な胎児肝細胞において、細胞１個あたり染色体１３、１８または２１に関する２つのシグナルが検出された。女性の胎児肝細胞において、２つのＸシグナルが検出され、男性の胎児肝細胞において、１つのＸシグナルおよび１つのＹシグナルが検出された。実施例２：膜フィルターに適用された、ソーティングされた胎児肝細胞のハイブリダイゼーション女性胎児肝単核細胞を実施例１に記載のごとく得て、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）用に調製した。１％ＢＳＡを補足した１ｍｌのＰＢＳに細胞を再懸濁し、次いで、Ficoll Hypaqueグラジエントにより分画した。この１ｍｌの試料から、５０μｌの部分試料を、キーホル・リムペットのヘモシアニン（Bect on Dickinson,San Jose,CA）に対する抗体での染色用に取り、２０μｌの部分試料を取り、使用する各抗体で染色した。これらの部分試料を用いて細胞のバックグラウンド自己蛍光を測定した。試料の残りをＦＩＴＣ−抗−ＣＤ７１（Becton Dickinson,San Jose,CA）で染色した。試料中の１００万個の細胞ごとに１０μ ｌの抗体を染色のために使用した。抗体添加後、細胞をボルテックス撹拌し、次いで、氷上で３０分インキュベーションした。Eppendorf遠心機５４１５型（Epp endorf,Brinkmann Industries,Westbury,NY）の目盛りを４にセットして細胞を遠心分離した。溶液を吸引除去し、細胞を０.５〜１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ用に、細胞を６ｍｌのポリプロピレンチューブに移した。ソーティングされた細胞を０.２μｍの黒色ポリカーボネート（Costar）膜フィルター上で真空濾過した。ＢｉｏＸ（２.５ｎｇ／μｌ）および同時にＤｉｇ１８（１０ｎｇ／μｌ）とのハイブリダイゼーション後、２つのＸシグナルを容易に可視化されたが、１８のシグナル強度は中程度ないし弱いものであった。実施例３：ＰＶＤＦ膜フィルター上で標識核酸プローブを用いる臍帯血中のＤＮＡの検出単核ヒト臍帯血細胞をFicollグラジエントで分離し、約５００個の細胞を０. ２２μｍＰＶＤＦ（Millipore）膜フィルター上で真空濾過した。フィルターを７５ｍＭＫＣｌで飽和し、３７℃で２０分インキュベーションし、３：１メタノール：酢酸中で１０分間固定した。次いで、各３０〜６０秒のエタノールシリーズ（７０％、８０％、９０％、１００％）で細胞を脱水した。ＢｉｏＸ（２. ５ｎｇ／μｌ）、ＢｉｏＹ（５ｎｇ／μｌ）、Ｂｉｏ１３（１０ｎｇ／μｌ）、Ｂｉｏ１８（１０ｎｇ／μｌ）またはＢｉｏ２１（１０ｎｇ／μｌ）プローブのいずれかを含有するハイブリダイゼーションカクテル４０μｌにフィルターをハイブリダイゼーションさせた。ＤＮＡを８０℃で１０分間変性させ、フィルターを一晩ハイブリダイゼーションさせ、実施例１記載のごとく洗浄した。良好なＸおよびＹシグナル、および小さく鋭い１３、１８および２１のシグナルが観察された。実施例４：種々の膜フィルター上で標識核酸プローブを用いる胎児肝細胞中のＤＮＡの検出実施例１記載のごとく調製した単核胎児肝細胞を、異なるタイプのフィルター上で真空濾過（４００ｍｍＨｇ）した：フィルターは、セルロースの混合エスエル（Millipore and Whatman）、ニトロセルロース（Schleicher and Schuell）、ＰＶＤＦ（Millipore）、ポリフルオロテトラエチレン（ＰＦＴＥ：Miilipore）、ナイロン（Schleicher and Schuell and Micron Separations Inc.）、ポリスルホン（Gelman）、およびポリカーボネート（Costar）。細胞をＢｉｏＸＤｉｇＹまたはＤｉｇＸＢｉｏ２１のいずれかとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションシグナルの質は以下のごとし（最良から最悪への順に）：ポリカーボネート、ＰＶＤＦ、ポリスルホン、セルロースの混合エステル、ニトロセルロース、ＰＦＴＥ、そしてナイロン。実施例５：ポリカーボネート膜フィルター上に捕獲された母性試料中のＤＮＡの検出男性胎児を有していると考えられるドナーの羊水穿刺により得た２０ｍｌの血液からなる母性血試料を実施例１記載のごとく処理した。実施例２記載の方法と同様の方法により細胞を染色した。細胞をHoechst３３３４２で３７℃で３０分染色し、２回洗浄し、次いで、ＦＩＴＣに結合したモノクローナル抗体で染色した。細胞を４℃で４５分インキュベーションし、２回洗浄し、０.５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞を０.５ｍｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中にソーティングし、２枚の０.１μｍの黒色Costarポリカーボネート膜上で真空濾過し、それらをＢｉｏＸＤｉｇＹプローブとハイブリダイゼーションさせた。２枚のフィルターのうち、第１のものは４１４個の核を有しており、そのうち３１５個がＸＸ、５個がＸＹ、７２個が不明であった。実施例６：ＰＶＤＦおよびポリカーボネート膜上に直接ソーティングされた胎児肝細胞単核胎児肝細胞をFicollグラジエントから回収し、専売のモノクローナル抗体およびＣＤ３に対する抗体で染色した。モノクローナル抗体の標的およびＣＤ３の不存在に関してそれらを０.２２μｍＰＶＤＦ（Millipore）および０.２μｍポリカーボネート（Poretics）膜上に直接ソーティングした。使い捨てフィルターユニットから取り外したフィルター支持体上にフィルターを置いた。このフィルター支持体をプレクシガラス装置上の開口部上に置いた（該装置はさらに配管の一端を接続するための底部の開口を有する）。この配管を真空ホースに接続した。このセットアップにより、我々は、ソーターから出てきた細胞を膜上で真空濾過することができた。次いで、１００％エタノール、Optistain、３：１メタノール：酢酸、または７５ｍＭＫＣｌの種々の組み合わせを用いて、細胞を含有する膜フィルターを種々の方法で処理した。処理後、膜をＢｉｏＸＤｉｇ２１（Ｘは２.５ｎｇ／μ ｌ、２１は１０ｎｇ／μｌ）とハイブリダイゼーションさせ、実施例１記載のごとくＣｙ３^TMで検出した。両方のタイプの膜について、有意なＦＩＴＣバックグラウンド（すなわち、標的シグナルを妨害する自己蛍光）はなかった。０.２μｍポリカーボネート膜についての最良の処理プロトコールは、乾燥膜上にソーティングし、風乾し、Hema ticx Opstain II-Aバッファー（Gam Rad,San Juan Capistrano,CA）中に１分間浸し、乾燥し、次いで、ハイブリダイゼーションするものであった。０.２２μ ｍＰＶＤＦについての最良のプロトコールは、ポリカーボネートについてのものと同じであるか、または乾燥膜上のソーティングし、１００％エタノール中に１分間浸し、Opstainに１分間浸し、乾燥し、次いで、ハイブリダイゼーションするものであった。最良の膜は良好かつ強力なＣｙ３^TMならびにＦＩＴＣシグナルおよび良好な核形態を有し、良好なスライドに匹敵するものであった。男性胎児肝細胞は１つのＸシグナルを有し、女性胎児肝細胞は２つのＸシグナルを有し、いずれの性由来の細胞も２つの２１シグナルを有していた。実施例７：ポリカーボネート膜フィルター上に直接ソーティングされた母性血液細胞３人の妊婦由来の単核細胞（Ficoll分離し、次いで、プールしたもの）をＣＤ７１、糖蛋白ＡおよびHoechst３３３４２で染色した。CellMicroSieves^TM支持フィルターをフィルターホルダー上、ポリカーボネート膜の下に置いた。次いで、一定の真空下（５００ｍｍＨｇ）で、細胞を種々の乾燥ポリカーボネート膜フィルター上に直接ソーティングした。約１０００個の細胞をＦＡＣＳにより各膜上にソーティングした。次いで、膜をＤｉｇＸＢｉｏ１３とハイブリダイゼーションさせ、次いで、分析していずれの膜が最良の結果を示すかを決定した。自己蛍光は、Micron Separations Inc.およびMilliporeにより製造された膜上のハイブリダイゼーションシグナルを読むことを困難にした。０.２２μｍよりも大きい孔サイズを有する膜は、核をフィルターの孔中に引き込み、核をまさに３次元として分析を複雑にした。Costarにより製造された０.１、０.２、０.６ならびに０.８μｍの膜、および０.１ならびに０.２μｍのPoreticsの膜は最良のハイブリダイゼーションシグナルを生じた。ハイブリダイゼーションシグナルは明確かつ強力であった。実施例８：ＦＩＳＨのためにポリカーボネート膜上に直接ソーティングされた母性試料の調製３人の妊婦由来の末梢血（２０ｍｌ）をFicoll-Paque分離し、単核細胞層を取り（実施例１参照）、プールした。次いで、細胞を、ＣＤ７１、糖蛋白Ａ、Hoec hst３３３５２（実施例２参照）に関して染色し、一部を表２に示す時間、種々の固定剤で処理した。それぞれソーティング前の固定処理後、Eppendorf遠心機の目盛りを４にセットして４分間細胞をペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄した。すすいだペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、実施例６記載のごとく、黒色の乾燥０ .１μｍポリカーボネート膜上にソーティングした。細胞懸濁液を完全に膜上で濾過した後、膜を濾過器具から取り、表２に示すようにソーティング後の固定を行った。各ソーティング前固定条件から得られた細胞を、１０枚の膜上に直接ソーティングし、次いで、それぞれの膜をソーティング後固定処理のうちの１つで処理した。膜フィルターを風乾し、ハイブリダイゼーションまで−２０℃で保存した。膜をＢｉｏＸＤｉｇ２１とハイブリダイゼーションさせ、実施例１記載のごとく洗浄した。試料を分析し、各ソーティング前固定群からの最良のものを、染色体２１のシグナルの強度ならびに分離能および核の形態に基づいてランク付けした。最良のソーティング後固定は、２、１５および３０分間のＳ.Ｔ.Ｆ.^TMであった。一般的には、２分および１２分のホルムアルデヒドでのソーティング前固定はシグナルはほとんど得られないかまたは得られなかった。ソーティング前固定と組み合わせて用いられた最悪のソーティング後固定は：２分および１２分のホルムアルデヒド、６０分のＳ.Ｔ.Ｆ.^TMおよび１５分のホルムアルデヒドであった。最良の条件は、２つの強力かつ別個の染色体２１シグナルおよび２つの強力なＸシグナルを生じた。全体として最良の条件は：Ｓ.Ｔ.Ｆ.^TMで２５分ソーティング前固定し、Ｓ.Ｔ.Ｆ.^TMで２分ソーティング後固定するものであった。染色体２１プローブに関するハイブリダイゼーション効率は１００％であった。２番目に良かった条件は、ソーティング前に固定せず、Ｓ.Ｔ.Ｆ.^TMで２分ソーティング後固定するものであり、最良の条件と比較すると、この試料中の核の形態はあまり良くなく、ハイブリダイゼーション効率は最良の条件よりも低かった（９６％）。その次に良かった条件は、パラホルムアルデヒドで２分ソーティング前固定し、Ｓ.Ｔ.Ｆ.^TMで２分ソーティング後固定するもの、およびパラホルムアルデヒドで１２分ソーティング前固定し、Ｓ.Ｔ.Ｆ.^TMで２分ソーティング後固定するものであった。実施例９：ポリカーボネート膜上に直接ソーティングされたヒト胎児肝細胞および成人ＰＢＭＣｓ中のＤＮＡの検出ヒト男性胎児肝細胞を実施例１記載のごとく調製した。２人の妊婦由来の血液をFicoll分離し、次いで、プールした。次いで、プールした母性試料および胎児肝試料の両方を別々に、実施例２記載のごとくＣＤ７１、糖蛋白ＡおよびHoechs t３３３４２で染色した。細胞を計数し、次いで、胎児肝細胞のいくらかを、胎児細胞１個：母性細胞２５０個の割合で母性細胞中に添加した。Becton Dickins on Vantage FACSを用いて胎児／母性細胞混合物ならびに純粋な母性細胞集団を、実施例７記載の器具上に置かれた黒色の０.１μｍCosterポリカーボネート膜上にソーティングした。全部で１５００個の細胞をＦＡＣＳにより各膜上にソーティングした。真空圧を３５０ｍｍＨｇにセットした。実施例１に詳述した方法に従って膜をＤｉｇＸＢｉｏ１８とハイブリダイゼーションさせた。乾燥した（実施例６〜８のように）、または種々の溶液（ＰＢＳ、２ＸＰＢＳ、ＰＢＳ中１０％グリセロール、３５ｍＭＫＣｌ、または核単離バッファー（ＮＩＢ；２５０ｍＭ蔗糖、２５ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＰＩＰＥＳ、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭスペルミジン、ｐＨ７.０））で湿ったポリカーボネート膜上に細胞をソーティングした。湿った膜については、ソーティングが完了するまで真空にしなかった。乾燥した膜については、１セットをソーティング中ずっと真空にし、他のセットをソーティング完了まで真空にしなかった。最終的な試験変数は、支持体としての５μｍCellMicroSieves^TMの存在または不存在であった。ポリカーボネート膜が湿っている状況下では、支持体膜も同じ溶液で湿らせた。乾燥したポリカーボネート膜を器具上に置いた場合には乾燥したCellMicr oSieves^TM膜を用いた。膜フィルターをシグナルの質、核のバックグラウンドおよび核の形態に関して分析した。それぞれの湿／乾／真空条件について、CellMicroSieves^TM膜の存在あるいは不存在いずれが好ましいかについての決定を行った。次いで、好ましい CellMicroSieves^TMの配置を有する７枚の膜を互いに相対的に評価した。胎児肝細胞添加試料はある人により分析され、母性試料は別の人により分析された。胎児肝／母性添加物については、２つの細胞タイプにおいて観察されたシグナルまたは核のバックグラウンドにおいては一貫した相違はなかった。小片状または不規則な核は通常は母性のもので、胎児核は丸い傾向を示した。一般的には、Cell MicroSieves^TM支持体が存在する場合には、ＤＡＰＩ染色核はより大きく暗く、ＤＡＰＩで不均一に染まる少数の不規則な形態の核が存在した。胎児肝細胞添加試料および母性試料についての試料適用の好ましさを表３Ａおよび３Ｂに詳細に示す。フィルターを前以て湿らせることは核の分散に影響した。核のバックグラウンドはいくつかの溶液、例えばＫＣｌおよび２ＸＰＢＳにより影響された。種々の細胞が大部分のフィルター上に見られたが、他のものよりも総体的に悪い核を生じたものもあった（例えばＮＩＢ）。ハイブリダイゼーションが最適な場合、母性および胎児細胞両方について２つの染色体１８のシグナルが存在した。男性胎児細胞は１つのＸ染色体シグナルを有し、成人女性細胞は２つのＸシグナルを有していた。実施例１０：ポリカーボネート膜フィルター上で真空濾過されたヒト成人リンパ球のハイブリダイゼーション単核成人血液細胞をフィコールグラジエントから回収した。有核細胞濃度の測定後、懸濁液を希釈して２００個／μｌとし、その５μｌを０.２μｍポリカーボネート（Costar）膜上で４００ｍｍＨｇで真空濾過した。次いで、実施例１に記載のごとく、膜をＸＹプローブ（０.５ｎｇ／μｌおよび５ｎｇ／μｌ）とハイブリダイゼーションさせ、洗浄した。蛍光顕微鏡により、男性成人細胞はＸおよびＹシグナルを有し、成人女性細胞はＸシグナルを有していたことが示された。実施例１１：ポリカーボネート膜フィルター上で真空濾過されたヒト・赤白血球病（ＨＥＬ）細胞のハイブリダイゼーションＨＥＬ細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。次いで、細胞を、０.２μｍ黒色C ostarポリカーボネート膜上で真空濾過した。実施例１記載のごとく、膜をＢｉｏＸＤｉｇＹおよびＤｉｇＸＢｉｏ２１とハイブリダイゼーションさせた。核は、１つのＸ、２つのＹおよび４つの２１シグナルを示すか、あるいは１つのＸ、１つのＹおよび４つの２１シグナルを示した。実施例１２：ポリカーボネート膜上での羊水細胞のＤＮＡへのハイブリダイゼーション Klinger,K.W.,et al.,Am.J.Hum.Genet.,(1992)51:55に記載の方法に従ったが、スライドガラス上に置かれた湿った（ＰＢＳで）０.１μｍ孔の黒色Costar膜を用いる改変を行って、プールしておいた羊水および胎児肝細胞の試料を定着させた。さらに、実施例１記載の方法を用いて試料を膜上で真空濾過した。膜上での羊水細胞および胎児肝細胞のハイブリダイゼーションを、スライドガラス上に定着された同じ細胞で得られたハイブリダイゼーションと比較した。膜およびスライガラスをＢｉｏＸＤｉｇＹとハイブリダイゼーションさせ、実施例１の詳説に従って洗浄した。膜上に定着された羊水細胞のシグナル強度および質は、スライドガラス上に定着された羊水細胞について観察されたものに匹敵した。胎児肝細胞は、スライドガラス上に定着された場合に、湿った、または乾燥した膜の上に定着された場合よりもわずかに良好なシグナルを示した。膜上で濾過された羊水細胞および胎児肝細胞のシグナルの強度および質は、スライドガラスまたはフィルター上に定着された細胞に関するものよりもずっと良好であった。実施例１３：膜フィルター上での複数の試料の同時かつ効率的な処理１１枚の０.２μｍ黒色Costar膜フィルターの各４分円に胎児肝試料をスポットした。次いで、膜フィルターを半分に切り、それぞれに２つの胎児肝試料部位を設けた。次いで、１０枚の半円膜フィルターの各セットを互いに上に重ね、それぞれプラスチック製の袋に入れた。Ｂｉｏ１３（１０ｎｇ／μｌ）およびＤｉｇＸプローブ（１.５ｎｇ／μｌ）を含有する全部で５０μｌのハイブリダイゼーションカクテルを一方の袋に入れてから封をした。第２の袋に２５μｌの同じカクテルならびに２５μｌの湿潤用溶液を入れてから封をした。袋を８０℃の水浴中に１０分間置くことにより、重ねた膜上のＤＮＡおよびプローブを変性させた。次いで、袋を３７℃で一晩インキュベーションした。１１枚目の膜フィルターを半分に切り、実施例１に詳述した我々の標準的方法に従って両方の部分をハイブリダイゼーションさせた。両方をスライドガラス上に置き、一方の膜を１０ μｌのカクテルとハイブリダイゼーションさせ、第２の膜を、５μｌの湿潤用溶液で希釈した５μｌのカクテルとハイブリダイゼーションさせた。次いで、膜フィルターをすべて、我々の標準的プロトコールにより洗浄した。個々にスライドガラス上に固定する前に、袋の中のすべての膜に関して検出工程を行うことによりハイブリダイゼーションシグナルを検出した。結果は、それぞれ重ねた膜フィルターの中央部の膜フィルターはＸおよび１３シグナルを有する核を含んでおり、それらは強度および質において、重ねた膜フィルターの端のほうの膜フィルターと、あるいはスライドガラス上でハイブリダイゼーションした膜フィルターと区別できないものであった。さらに、より高濃度のハイブリダイゼーションカクテル（すなわち、湿潤用溶液を用いず）を用いた膜フィルターはより強力なハイブリダイゼーションシグナルを生じた。実施例１４：ドットブロット器具上での複数の試料の調製、次いで、ＦＩＳＨ黒色０.２μｍCostarポリカーボネート膜フィルターの長方形の片を、ドットブロット器具（９６ウェル Convertible Filtration Manifold System-GIBCOBR L）中に挟んだ。ＰＢＳに再懸濁された２５μｌの胎児細胞をピペットで各ウェル中に取り、真空（４００ｍｍＨｇ）を適用して膜上で細胞を濾過した。いくつかのポリカーボネート膜の下にはCellMicroSieves^TM５μｍ支持体フィルターを用いた。３つの異なる胎児肝試料を各フィルターに２４回適用して、９６個の試料を含む膜を２４個の部分に切ることができるようにし、各部分は３つの異なる胎児肝試料を有するようにした。さらに各部分は膜に番号を付けるために使用する部位を有していた。膜を２４個の部分に切断した後、実施例１に概説した標準法を用いてＤｉｇＸ（２.５ｎｇ／μｌ）およびＢｉｏＹ（５ｎｇ／μｌ）とハイブリダイゼーションさせたところ、男性細胞については強力かつ分離したＸおよびＹシグナルが、そして女性細胞については分離したＸシグナルが示された。 CellMicroSieves^TM支持体を用いて作成した場合にわずかな優位性が認められた。これらの結果は、我々が、ガラス焼結フィルターホルダー上で作成されたフィルターを用いて日常的に得ているハイブリダイゼーション結果に匹敵するものであった。実施例１５：ＮａＯＨ処理は核サイズおよびハイブリダイゼーションシグナルに影響する胎児肝単核細胞をＰＢＳ中に希釈（２０個／μｌ）し、５００個の細胞を０. ２μｍ白色ポリカーボネート（Poretics）、および０.２２μｍＰＶＤＦ（Milli pore）膜上で濾過した。次いで、さらなる３つのプロトコールのうちの１つを行う前に膜を風乾した。プロトコール１は、０.５ＭＮａＯＨ、中和バッファー（１.５ＭＮａＣｌ、０.５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０）、２ＸＳＳＣ、次いで、Optistainに順次２分間浸し、次いで、６５℃で５分間乾燥することからなっていた。プロトコール２は、Optistain、０.５ＭＮａＯＨ、次いで、中和バッファーに順次２分間浸し、次いで、６５℃で５分乾燥することからなっていた。プロトコール３用の膜を、０.５ＭＮａＯＨに３分間、中和バッファーに２分間、Optistainに２分間、次いで、６５℃で５分間乾燥した。Opt istain対照膜をOptistainに浸し、次いで、乾燥した。次いで、膜フィルターをＢｉｏＸＤｉｇ２１とハイブリダイゼーションさせた。ＰＶＤＦ膜については、３０μｌの湿潤用溶液および３０μｌのハイブリダイゼーションカクテルを用いたが、ポリカーボネート膜は１０μｌの湿潤用溶液および１０μｌのハイブリダイゼーションカクテルを必要とした。変性を８０℃で１３分行った。実施例１記載のごとく膜をハイブリダイゼーションさせ、洗浄した。使用蛍光物質は抗−ｄｉｇ−ＦＩＴＣおよびアビジンＣｙＲＯ^TMであった。これらの結果は、それぞれの膜フィルターはハイブリダイゼーションのための異なる最適条件を有することを示す。さらに、これらの結果は、膜上に固定されていない細胞も核サイズの変化によってやはり試薬に応答することができることを示す。実施例１６：ＰＶＤＦ膜フィルター上で濾過された、あるいはスライドガラス上でサイトスパン（Cytospun）された臍帯血細胞の細胞保持についての比較２種の臍帯血由来の単核細胞を、それぞれFicollグラジエントから回収し、５％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。臍帯血試料＃１からの約３００個の細胞および臍帯血試料＃２からの約１５０個の細胞を、６５０ｍｍＨｇの真空圧下でＰＶＤＦフィルター上で濾過し、風乾した。各臍帯血試料からの同数の細胞を、以下の条件下で顕微鏡用スライドガラス上でサイトスパンした（Cytospun3,Shandon Lipshaw,Pittsburgh,PA）：８００ｒｐｍ、５分、低加速度。ＰＶＤＦフィルターおよび顕微鏡用スライドガラスをＤＡＰＩアンチフェードで染色し、評点をつけた。臍帯血＃１については、ＰＶＤＦフィルター上の平均細胞保持数は、３５３個（１１３％）であり、それに対してサイトスパンスライドガラス上の細胞保持数は１６５個（５５％）であった。臍帯血＃２も同様の結果であり、ＰＶＤＦフィルター上に保持された平均細胞数は１４７個（９８％）であり、それに対してサイトスパンスライドガラス上の細胞保持数は１０３個（６８％）であった。臍帯血細胞の保持は、細胞をＰＶＤＦ膜フィルターで濾過した場合、スライドガラス上のサイトスパンの場合よりも良好であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラフ−ロバーツ，アリソン・エルアメリカ合衆国01746マサチューセッツ州ホリストン、コンコード・ストリート18 番 (72)発明者クリンガー，キャサリン・ダブリューアメリカ合衆国01776マサチューセッツ州サッドベリー、ボーディッチ・ロード54 番

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ．ポリマー膜フィルター上に細胞を沈着させ、ここに細胞のＤＮＡはポリマー膜フィルター上に保持され、標的ＤＮＡに特異的な標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションに利用可能であり、ｂ．標的ＤＮＡへの核酸プローブのハイブリダイゼーションに十分な時間、ポリマー膜フィルターを核酸プローブとともにインキュベーションし、次いで、ｃ．標識核酸プローブを検出し、ここに核酸プローブの検出は標的ＤＮＡの存在を示すものであるからなる、細胞中の標的ＤＮＡの検出方法。２．細胞が哺乳動物細胞である請求項１の方法。３．ポリマー膜フィルターがポリカーボネートから作られている請求項１の方法。４．ポリマー膜フィルターがＰＶＤＦから作られている請求項１の方法。５．工程ａ）の前に細胞が固定される請求項１の方法。６．工程ａ）の後にポリマー膜フィルターが固定される請求項１の方法。７．ａ．ポリマー膜フィルター上で細胞を濾過し、ここに細胞の標的ＤＮＡは標的ＤＮＡに特異的な標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションに利用可能であり、ｂ．標的ＤＮＡへの核酸プローブのハイブリダイゼーションに十分な時間、ポリマー膜フィルターを核酸プローブとともにインキュベーションし、次いで、ｃ．標識核酸プローブを検出し、ここに核酸プローブの検出は標的ＤＮＡの存在を示すものであるからなる、細胞中の標的ＤＮＡの検出方法。８．細胞が哺乳動物細胞である請求項７の方法。９．ポリマー膜フィルターがポリカーボネートから作られている請求項７の方法。１０．ポリマー膜フィルターがＰＶＤＦから作られている請求項７の方法。１１．工程ａ）の前に細胞が固定される請求項７の方法。１２．工程ａ）の後にポリマー膜フィルターが固定される請求項７の方法。１３．ａ．ポリマー膜フィルター上に細胞を沈着させ、ここに核のＤＮＡはポリマー膜フィルター上に保持され、標的ＤＮＡに特異的な標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションに利用可能であり、ｂ．標的ＤＮＡへの核酸プローブのハイブリダイゼーションに十分な時間、ポリマー膜フィルターを核酸プローブとともにインキュベーションし、次いで、ｃ．標識核酸プローブを検出し、ここに核酸プローブの検出は標的ＤＮＡの存在を示すものであるからなる、核中の標的ＤＮＡの検出方法。１４．核が哺乳動物核である請求項１３の方法。１５．ポリマー膜フィルターがポリカーボネートから作られている請求項１３の方法。１６．ポリマー膜フィルターがＰＶＤＦから作られている請求項１３の方法。１７．工程ａ）の前に細胞が固定される請求項１３の方法。１８．工程ａ）の後にポリマー膜フィルターが固定される請求項１３の方法。１９．ａ．ポリマー膜フィルター上で細胞を濾過し、ここに核の標的ＤＮＡは標的ＤＮＡに特異的な標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションに利用可能であり、ｂ．標的ＤＮＡへの核酸プローブのハイブリダイゼーションに十分な時間、ポリマー膜フィルターを核酸プローブとともにインキュベーションし、次いで、ｃ．標識核酸プローブを検出し、ここに核酸プローブの検出は標的ＤＮＡの存在を示すものであるからなる、核中の標的ＤＮＡの検出方法。２０．核が哺乳動物核である請求項１９の方法。２１．ポリマー膜フィルターがポリカーボネートから作られている請求項１９の方法。２２．ポリマー膜フィルターがＰＶＤＦから作られている請求項１９の方法。２３．工程ａ）の前に細胞が固定される請求項１９の方法。２４．工程ａ）の後にポリマー膜フィルターが固定される請求項１９の方法。