JPH10501421A

JPH10501421A - ヒト・免疫不全ウイルスの増殖阻害化合物および方法

Info

Publication number: JPH10501421A
Application number: JP8505242A
Authority: JP
Inventors: ライダー，トーマス・ビー; クウォー，セオドア・ジェイ
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1994-07-19
Filing date: 1995-07-14
Publication date: 1998-02-10
Anticipated expiration: 2015-07-14
Also published as: CA2194398A1; EP0697414A1; US5733781A; ATE228142T1; EP0697414B1; AU3135495A; DE69528867D1; JP3307944B2; AU699233B2; WO1996002557A1; KR970704768A

Abstract

(57)【要約】ヒト・免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増殖を阻害するためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。好ましいＨＩＶ標的部位が同定され、標的部位にハイブリダイゼーションするか、または標的部位に類似であるように設計されたオリゴヌクレオチドが記載されている。オリゴヌクレオチドの好ましい使用は、ＨＩＶ感染患者においてＨＩＶ増殖を阻害することである。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト・免疫不全ウイルスの増殖阻害化合物および方法発明の分野本発明は、ヒト・免疫不全ウイルスの増殖を阻害する化合物および方法に関する。発明の背景アンチセンスオリゴヌクレオチドのごときオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡのごとき標的ＲＮＡとハイブリダイゼーションすることができ、そのＲＮＡからの蛋白生成を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を説明するために多くの機構が提案されている。例えば、Helenen,C.and Toulme,J.B iochimica et Biophysica Acta 1049:99(1990)、およびUhlmann,E and Peyman,A .Chemical Reviews 90:543(1990)参照。提案された機構は、細胞ＲＮａｓｅＨのためのＤＮＡ：ＲＮＡ基質の形成、成熟前の転写終結を誘導する発生期のｍＲＮＡへのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、およびプレ−ｍＲＮＡイントロン／エキソンジャンクションにハイブリダイゼーションすることによるｍＲＮＡプロセッシングの妨害を包含する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる核酸活性の阻害に関するこれらの機構および数種の他に提案された機構は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的核酸配列にハイブリダイゼーションする能力に基づいている。 Tullisの米国特許第５,０２３,２４３号は、蛋白翻訳を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用についての一般的説明を提供する。Kajiの米国特許第４,６８９,３２０号は、単純ヘルペスウイルスを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによる単純ヘルペスウイルスに感染したマウスの死亡率の低下を示すデータを提供する。Goodchildらの米国特許第４,８０６ ,４６３号は、ＨＩＶ感染した培養細胞におけるＨＴＬＶ−III（ＨＩＶ）複製および遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力に関するデータを提供する。Cantinらの米国特許第５,１１０,８０２号には、ＨＩＶ複製を阻害するためのメチルホスホン酸結合オリゴヌクレオチドの使用が記載されている。これらの米国特許を、参照により、本明細書に記載されているものと見なす。 Matsukura et al.Proc.Natl.Acad.Sci.86:4244(1989)には、ｒｅｖヌクレオチド配列を標的とするホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチドを用いるＨＩＶ発現の阻害が記載されている。ＨＩＶ核酸領域に相補的な核酸配列を有するオリゴヌクレオチドが、Moncany およびMontagnierのＥＰＯ０４０３３３３Ａ２（１９９０年公開）；Sauvaig oおよびFouqueのＥＰＯ０５１６５４０Ａ１（１９９２年公開）；AlizonらのＰＣＴ／ＥＰ８５／００４８７；GingerasらのＰＣＴ／ＵＳ９２／０２０３７；およびIrvineらのＰＣＴ／ＵＳ９２／１１１６８のごとき文献に述べられている。発明の概要本発明は、ヒト・免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の増殖を阻害する化合物および方法に関する。好ましいＨＩＶ標的部位が同定され、標的部位にハイブリダイゼーションするように設計されたオリゴヌクレオチド、あるいは標的部位に類似であるオリゴヌクレオチドが記載されている。オリゴヌクレオチドの好ましい使用は、ＨＩＶ感染患者におけるＨＩＶ増殖を阻害するための抗ＨＩＶ剤としてである。本発明の他の使用は、検出プローブまたは増幅プライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用することによりＨＩＶの存在を検出すること、およびオリゴヌクレオチドのＨＩＶ増殖阻害能を測定してＨＩＶ株に対する抗ＨＩＶ剤としての適性を評価し、あるいは患者におけるＨＩＶの存在を診断することを包含する。本発明オリゴヌクレオチドは以下の抗ＨＩＶ核酸配列に基づく：好ましい核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有し、好ましい核酸配列を必須としてなるオリゴヌクレオチドも、本発明により包含される。「実質的に対応」とは、特定の配列と同一であるかまたは２０％未満のヌクレオチド塩基の相違（ＲＮＡまたはＤＮＡ同等ヌクレオチドを除く）を有し、クレイムされている活性（例えば、抗ＨＩＶ活性）を有するオリゴヌクレオチドをいう。ヌクレオチドの相違は、ミスマッチ、内部付加、内部欠失、および／または外部欠失を包含する。さらに、特定配列の外部のさらなるヌクレオチドが存在していてもよい。さらなるヌクレオチドはＨＩＶ核酸に相補的であってもよく、相補的でなくてもよい。好ましくは、実質的に対応する配列は、特定配列に対して１０％未満の相違、より好ましくは、５％未満の相違がある。核酸配列を「必須としてなる」とは、オリゴヌクレオチドが特定ヌクレオチド配列に対して０ないし１０％、好ましくは０ないし５％のヌクレオチド塩基の相違（ＲＮＡまたはＤＮＡ同等ヌクレオチドを除く）を有し、クレイムされている活性（例えば、抗ＨＩＶ活性）を有することを意味する。ヌクレオチド相違は、ミスマッチ、内部付加および／または内部欠失を包含する。さらに、「必須としてなる」は、さらなるヌクレオチドは４個まで、または外部欠失は２個までというサイズ制限も課す。さらなるオリゴヌクレオチドはＨＩＶ核酸に対して相補的であってもよく、相補的でなくてもよい。「ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物」とは、同一の相補的塩基対のハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子をいう。ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物は異なる糖基（すなわち、デオキシリボースに対してリボース）を有し、ＲＮＡ中のウラシルおよびＤＮＡ中のチミンの存在によって異なっていてもよい。ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物間の相違は実質的に対応する核酸配列における相違の一因とはならない。なぜなら、同等物は特定配列に対して同程度の相補性を有するからである。抗ＨＩＶ剤として用いる場合、好ましくは、本発明オリゴヌクレオチドはデオキシヌクレオチドから作られる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、そのＲＮＡ同等物よりも、ＨＩＶ阻害において有効でありうる。なぜなら、ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＤＮＡ：ＨＩＶＲＮＡ２本鎖を形成することができ、そこでＨＩＶＲＮＡはＲＮａｓｅＨによって分解されるからである。かくして、本発明の第１の態様は、インビボまたはインビトロでのＨＩＶ増殖を阻害しうる単離オリゴヌクレオチドを記載する。オリゴヌクレオチドは１８ないし１００個のヌクレオチドの長さであり、好ましい核酸配列の実質的に対応した核酸配列を有する。「ＨＩＶ増殖」とは、ＨＩＶの正味の増加をいい、ＨＩＶ蛋白ならびに核酸の細胞内増加およびＨＩＶウイルス粒子ならびに核酸による細胞の感染を包含する。ＨＩＶ増殖はインビボ（すなわち、患者）においても、インビトロ（すなわち、培養細胞）においても起こりうる。例えば、ＨＩＶに感染した培養細胞におけるＨＩＶｐ２４蛋白の産生を測定することにより、ＨＩＶ増殖を測定することができる。ＨＩＶ増殖の阻害は、ある程度のＨＩＶ増殖の減少を引き起こす。インビボまたはインビトロにおいてＨＩＶ増殖を阻害しうるオリゴヌクレオチドは本発明の別の態様において有用である。好ましくは、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、後の実施例記載の方法により測定した場合、１０００ｎＭまたはそれ以下、より好ましくは３００ｎＭまたはそれ以下、ずっと好ましくは１００ｎＭまたはそれ以下のインビトロでのＥＣ₉₀（９０％の阻害を達成するのに必要な濃度）を有する。より好ましい抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは高い治療指数を有する。治療指数とは、細胞増殖を阻害するオリゴヌクレオチド濃度をＨＩＶ増殖を阻害するオリゴヌクレオチド濃度で割ったものである。細胞総数の５０％の阻害を達成するために必要なオリゴヌクレオチド濃度であるＩＣ₅₀に関して細胞毒性効果を表すことができる。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの治療指数を、インビボでの使用の前にインビトロにおいて測定することができる。好ましい抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、後の実施例記載の方法により測定した場合、５より大きいＩＣ₅₀／ＥＣ₉₀ 値、好ましくは２０より大きい、より好ましくは３５より大きいＩＣ₅₀／ＥＣ₉₀ 値を有する。「単離オリゴヌクレオチド」とは、ヒトの介在なしには天然において見いだすことのできない形態のオリゴヌクレオチドをいう。かかるオリゴヌクレオチドは、ある程度精製されたオリゴヌクレオチド、および外来核酸と組み換えされたものを包含する。好ましいオリゴヌクレオチドは、個々のヌクレオチドを結合している少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を、より好ましくは９５％より多いホスホロチオエート結合を含む。１００％のホスホロチオエート結合を用いる実施例を記載する。ホスホロチオエート結合の存在は、アンチセンス阻害機構とは明らかに別の抗ＨＩＶ活性を提供する。もう１つの態様は、好ましい核酸配列である配列番号（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.）１〜１８、２０〜２５およびそれらのＲＮＡ同等物であるＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２６〜４３および４５〜５０；およびＤＮＡおよびＲＮＡ同等物の相補配列であるＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.５２〜６９、７１〜７６および７７〜９４および９６〜１０１の群から選択される核酸配列を有する長さ２０ないし１００ヌクレオチドの単離オリゴヌクレオチドを記載する。もう１つの態様は、患者におけるＨＩＶ増殖を阻害することのできる治療組成物を記載する。組成物は、好ましい核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有する長さ１８ないし１００ヌクレオチドの治療上有効量の単離オリゴヌクレオチドを含有する。また組成物は医薬上適合する担体を含有する。「治療上有効量」とは、ＨＩＶ感染患者におけるＨＩＶの増殖を阻害する量である。好ましくは、治療上有効量は、ある程度はＨＩＶ感染に関連する１またはそれ以上の症状を緩和する。「医薬上適合する担体」とは、オリゴヌクレオチドを添加して溶解できるか、そうでなければ患者への投与を容易にすることのできる処方である。医薬上適合する担体の例は、水、セイライン、生理学的に緩衝化されたセイライン、シクロデキストリン、およびカチオン性リポソームを包含する。もう１つの態様は、好ましい核酸配列に実質的に対応した核酸配列を有するオリゴヌクレオチドに作動可能に結合した転写部位を含む組み換え核酸を記載する。「作動可能に結合」とは、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの転写が、ある程度、転写部位の調節下にあることを意味する。組み換え核酸の使用は、特定の核酸配列を有する大量のオリゴヌクレオチドの生産、および特定の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドのＨＩＶ感染細胞中への送達を包含する。もう１つの態様は、ＨＩＶ増殖を阻害または減少させる方法を説明する。該方法は、ＨＩＶ増殖減少有効量のオリゴヌクレオチドに細胞を接触させることを包含する。オリゴヌクレオチドは、好ましい核酸配列に実質的に対応する長さ１８ないし１００ヌクレオチドの核酸配列を有する。「増殖減少有効量」とは、ＨＩＶ増殖を阻害しるに十分な量をいう。好ましくは、該方法は、患者におけるＨＩＶ増殖を阻害するために用いられる。もう１つの態様は、ＨＩＶ感染患者の治療方法を説明する。該方法は、好ましい核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有する治療上有効量の長さ１８ないし１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを患者に投与することを包含する。本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい具体例および請求の範囲の記載から明らかである。図面の簡単な説明図１ａおよび１ｂは、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、慢性的に感染した細胞（８Ｅ５細胞）におけるＨＩＶ遺伝子発現阻害能を説明する。図２ａおよび２ｂは、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、慢性的に感染した細胞（８Ｅ５細胞）におけるＨＩＶ遺伝子発現阻害能を説明する。図３ａおよび３ｂは、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.８に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、慢性的に感染した細胞（８Ｅ５細胞）におけるＨＩＶ遺伝子発現阻害能を説明する。図４は、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでの処理による、細胞変性的なＨＩＶの効果からの感染細胞（ＨＩＶ−１_II _IB に感染したＳｕｐＴ−１）の防御、および対応するウイルス減少傾向を示す。好ましい具体例の説明本発明は、ＨＩＶゲノムを標的とするオリゴヌクレオチドに関する。特定のＨＩＶ核酸配列にハイブリダイゼーションするように、あるいは特定のＨＩＶ核酸配列に類似であるようにオリゴヌクレオチドを設計し、好ましくはオリゴヌクレオチドを用いてＨＩＶ増殖を阻害する。オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ増殖阻害能および／またはＨＩＶ核酸配列へのハイブリダイゼーション能に関連した種々の使用がある。かかる使用は、治療薬としての使用および診断アッセイにおける使用を包含する。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチトを単独または他の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドもしくは抗ＨＩＶ治療と組み合わせて用いて、ＨＩＶ増殖を阻害することができる。例えば、第１の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを第２の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。第２の抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、１）下位標的（subtargeted）オリゴヌクレオチド、２）第２の別標的オリゴヌクレオチド、または３）非標的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのいずれかであってよい。第１のオリゴヌクレオチド標的領域中の小さな領域にハイブリダイゼーションするように下位標的オリゴヌクレオチドを設計する。かくして、下位標的オリゴヌクレオチドの核酸配列は、標的オリゴヌクレオチドの核酸の切断バージョンを含むこととなる。２つの別標的ヌクレオチドの組み合わせ例は、１：１の割合で使用される、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.５１のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。以下の核酸配列が提供される。これらの配列を含むオリゴヌクレオチド、およびこれらの配列に実質的に対応する配列を含むオリゴヌクレオチドは、本発明の１またはそれ以上の態様において有用である。好ましい抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、抗ＨＩＶ活性を有することが示されているオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。好ましい抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を変更して、同じ部位を標的とする他の有用抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを得ることができる。本開示を指針として用いて、当業者は、好ましい抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの有用変種を得ることができる。ＨＩＶ増殖を阻害するオリゴヌクレオチドの能力に関して種々の可能な機構および例を本明細書に示す。請求の範囲において特に述べない限り、これらの機構および例は本発明を限定するものでなく、むしろ本発明をさらに例示説明するものである。特定のオリゴヌクレオチドが機能する正確な機構が別の機構と組み合わされることが考えられる。Ｉ.ＨＩＶ増殖の阻害このセクションは、ＨＩＶ感染患者の治療のための、および患者におけるＨＩＶの存在を診断するための抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの設計および使用を説明する。オリゴヌクレオチドの初期設計および試験後、さらなる試験をインビボで行ってオリゴヌクレオチド有効性をさらに評価することができる。また、治療的投与にはいる前に細胞に対するオリゴヌクレオチドの毒性を評価するために試験を行うこともできる。かくして、本開示は、本明細書記載の好ましい核酸配列に実質的に対応した核酸配列を有するオリゴヌクレオチトを包含する、抗ＨＩＶ活性を有するオリゴヌクレオチドを得るために必要なガイダンスを提供する。Ａ.オリゴヌクレオチドの設計オリゴヌクレオチドのＨＩＶ増殖阻害能に影響する因子は、オリゴヌクレオチド修飾、オリゴヌクレオチドサイズ、および核酸配列を包含する。これらの因子の重要性を、まず、インビトロで決定することができ、次いで、インビボ研究で決定することができる。１.オリゴヌクレオチドの修飾オリゴヌクレオチドを修飾してその抗ＨＩＶ活性および治療有効性を向上させることができる。好ましい修飾は、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込み、オリゴヌクレオチド安定性、およびＨＩＶ増殖阻害能を向上させる。修飾オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合および／または修飾糖基を有するオリゴヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのＨＩＶ阻害を妨害しない修飾プリンまたはピリミジン塩基を含むこともできる。修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、およびホスホロジチオエートを包含する。修飾糖基の例は、α−アノマーおよび２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドを包含する（Cantin and Woolf,Trends in Microbiolog y 1:270〜276,1933）。好ましくは、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含む。ホスホロチオエート結合は、オリゴヌクレオチド安定性を増大させ、オリゴヌクレオチド取り込みを容易にし、大いに配列依存的であると思われる機構によりオリゴヌクレオチドがＨＩＶ増殖を阻害することを可能にする。かくして、ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチドは、その核酸配列に基づいて特異的ＨＩＶ標的部位を標的とすることによりＨＩＶを阻害し、さらに特異的配列に依存しない機構によりＨＩＶを阻害する。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドはウイルス逆転写を阻害し、さらにＣＤ４へのｇｐ１２０の結合およびＰＫＣのホスホリレーション活性を阻害する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのサイズが増加するにつれてウイルス逆転写阻害効果が増大する。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、Cohenらの米国特許第５,２６４,４２３号、およびKinchington et al.Antiviral Research,17:53〜62,1992により記載されている。オリゴヌクレオチド取り込みおよび安定性を測定する実験におけるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの細胞結合は、常にホスホジエステルオリゴヌクレオチドの１０倍であった。この効果の一部は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの細胞取り込みよりも大きなホスホジエステルオリゴヌクレオチドの細胞取り込みによるものと思われ、その効果の一部はホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの向上した安定性が原因である。取り込み機構における相違は、オリゴヌクレオチド安定性の相違に対してよりも、細胞会合に対して大きな影響を与えると思われる。２.オリゴヌクレオチドのサイズ異なる抗ＨＩＶ機構および細胞取り込みを包含する異なる因子として、最適オリゴヌクレオチドサイズも考慮に入れるべきである。好ましくは、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは長さ１８ないし１００ヌクレオチドであり、好ましい核酸配列、好ましい核酸配列に実質的に対応する核酸配列、または好ましい核酸配列を必須としてなる核酸を含む。かかるオリゴヌクレオチドはＨＩＶ標的部位を標的とする。相補的標的領域の外側のさらなるヌクレオチドはＨＩＶ核酸に相補的であってもよく、あるいは相補的でなくてもよい。好ましくは、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは長さ１８ないし５０ヌクレオチド、より好ましくは長さ２０〜３５ヌクレオチドである。標的配列に相補的な長い核酸配列を含むオリゴヌクレオチドは、短いオリゴヌクレオチドと比較すると、標的特異性の向上およびオリゴヌクレオチド：標的２本鎖の安定性向上を包含するいくつかの利点を提供する。オリゴヌクレオチド：標的２本鎖の向上した安定性は、異なる様式でオリゴヌクレオチド核酸阻害効果を容易にしうる。例えば、主要効果が翻訳停止である場合、２本鎖の向上した安定性は、リボゾームのオリゴヌクレオチド置換を妨害することによって翻訳停止を促進させることができる。有り得る機構のもう１つの例は、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素でのＤＮＡ：ＲＮＡＨＩＶ２本鎖のＲＮＡ鎖の分解を包含する。この例において、２本鎖の向上した安定性は、２本鎖がリボヌクレアーゼにより作用を受ける可能性を増大させる。ＲＮａｓｅＨにより分解されるためには、好ましくは、ＤＮＡ：ＲＮＡＨＩＶ２本鎖における抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは３個またはそれ以上の隣接ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を含む。長いオリゴヌクレオチドについて有り得る欠点は、オリゴヌクレオチド取り込みの低下および毒性効果増大の可能性を包含する。これらの効果の程度は、少なくとも一部には、オリゴヌクレオチドのサイズおよびオリゴヌクレオチド結合のタイプにより決定される。例えば、ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドを用いると、生じ得る毒性効果がより明確になりうる。３.オリゴヌクレオチド核酸配列本明細書記載のオリゴヌクレオチドは、表１に示す標的部位を標的とする。ＨＩＶ標的核酸領域に相補的であるように、ＨＩＶ核酸配列領域と類似となるように、あるいはＨＩＶ核酸配列領域に相補的かつ類似であるようにオリゴヌクレオチドを設計することにより標的化を行う。相補的オリゴヌクレオチドは、標的配列において相補的ヌクレオチドと安定な水素結合を形成しうるヌクレオチド配列を有する。例えば、アデニンはチミジンまたはウラシルと水素結合を形成し、グアニンはシトシンと水素結合を形成する。かくして、相補的オリゴヌクレオチドは実質的にはその標的配列と相補的であり、好ましくは、その標的配列と完全に相補的である。核酸配列に「実質的に相補的」とは、オリゴヌクレオチドが該核酸配列にハイブリダイゼーションして検出可能な２本鎖を形成し、好ましくは、該核酸配列に対して完全に相補的な核酸とは０ないし１０％、より好ましくは０ないし５％のヌクレオチド塩基の相違を有することを意味する。ヌクレオチド塩基の相違は、ミスマッチ、内部付加および／または内部欠失を包含する。類似オリゴヌクレオチドは、その標的領域と同一または機能的に同等の核酸配列を有する。機能的に同等な核酸配列は同一の相補的水素結合パートナーを有する。例えば、チミジンおよびウラシルは、相補的水素結合形成の目的については機能的に同等である。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドにより異なる標的部位が標的とされる。異なる標的部位は異なる機能を有する異なる蛋白、例えば、酵素、構造、および調節蛋白をコードしている。標的部位に相補的な抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは標的とされる核酸によりコードされる蛋白産生を阻害すると考えられる。表１に示すように、以下の遺伝子は相補的オリゴヌクレオチドによって標的とされる：ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｇａｇ、ｔａｔ、ｔｅｖ、ｖｉｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ。さらに、重複エキソンにより、ＨＩＶゲノム中の数種の遺伝子は、１またはそれ以上の読み枠中に多くの同一の核酸配列を含む（Schwartz et al．Jour nal of Virology 64:2519(1990)）。かくして、特定の標的部位への言及は、１種より多い蛋白が特定のオリゴヌクレオチドによって阻害されうるという可能性を排除するものではない。ｔｅｖおよびｔａｔ遺伝子は調節蛋白をコードしている。ｖｉｆ遺伝子はウイルス感染性にとり重要な蛋白をコードしている。ｖｐｕ遺伝子は、ウイルス粒子アッセンブリーのためのエンベロープ蛋白の正常な利用可能性に必要と考えられる蛋白をコードしている。ｖｐｒ遺伝子は、感染の初期段階におけるＨＩＶ核酸の遺伝子発現および核局在化の促進に必要な蛋白をコードしている。ｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子は、ウイルス−細胞結合のための受容体を包含するウイルス粒子構造蛋白をコードしている。数個の標的部位が１種よりも多い蛋白の産生に関与していてもよい。ＨＩＶ遺伝子は、前駆体蛋白をコードしている数個の読み枠を有している。そのうえ、いくつかのＨＩＶｍＲＮＡ翻訳の間に、リボゾームがヌクレオチドを読み飛ばし、かくして、異なる遺伝子産物が生じると考えられる（Vaishnav and Wong-Stal l Annu.Rev.Biochem 60:577〜630,1991）。ＨＩＶ核酸はポリ蛋白および前駆体蛋白をコードすることができる。例えば、ＰｏｌはＧａｇ−Ｐｏｌポリ蛋白として作られる。前駆体蛋白は開裂されて１個よりも多い蛋白を生じる。ｐｏｌ遺伝子は、開裂されて３つの酵素を生じる前駆体蛋白をコードしている。３つの酵素は、プロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼである。ｇａｇ遺伝子は、開裂されて３つの酵素を生じる前駆体蛋白をコードしている。３つの酵素は、マトリックス蛋白、カプシド蛋白、およびＨＩＶＲＮＡコーティング蛋白である。ｅｎｖ遺伝子は、開裂されて２つの糖蛋白を生じる前駆体糖蛋白をコードしている。２つの糖蛋白は、ｇｐ１２０およびトランスメンブラン蛋白ｇｐ４１である。前駆体蛋白の一部である、ｍＲＮＡによりコードされている蛋白を標的とするオリゴヌクレオチドは、前駆体蛋白の一部でもある別の蛋白、時に、下流蛋白を阻害しうる。さらに、ＨＩＶｍＲＮＡの正常な寿命に対する妨害はすべての関連シストロンの発現を途絶させる可能性がある。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１３の核酸配列、またはＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１３に実質的に対応する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶｇａｇ核酸配列に類似の核酸配列を有する。かかるオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ核酸のウイルス粒子中へのパッキングを阻害しうる。ｌｙｓ−ｔＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドはｌｙｓ−ｔＲＮＡに対する競争的阻害剤として作用し、そのことにより、ＨＩＶ逆転写酵素活性を阻害し、ＨＩＶ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）核酸合成を低下させうる。ｌｙｓ−ｔＲＮＡをＨＩＶｃＤＮＡ核酸合成に対するプライマーとして用いる。ｌｙｓ−ｔＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを、ＨＩＶゲノムＲＮＡにアニーリングされたｔＲＮＡに類似するように設計する。かかるオリゴヌクレオチドは４つの領域を含む（５'から３'へと）：１）ＨＩＶ非相補的センス領域；２）「相補的」センス領域；３）非相補的ループ領域；および４）ＨＩＶ相補的領域。領域２および４は実質的に相補的であり、好ましくは、互いに完全に相補的であり塩基対ステム構造を形成する。塩基対ステム構造の長さを選択して、オリゴヌクレオチドがＨＩＶ逆転写酵素活性を阻害する能力を最適化すべきである。ＨＩＶ逆転写酵素に対する最強の阻害に関連する塩基対ステムの長さを、ルーチンな実験によって決定することができる。ｌｙｓ−ｔＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドの例は、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１０の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドによって提供される。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.１０のオリゴヌクレオチドは、７個の塩基が非相補的であるセンス領域、２２個の塩基が「相補的」である領域、４個の塩基が非相補的であるループ領域、および１５個の塩基が相補的である領域を有する。ＲＲＥは、Ｒｅｖ蛋白によるｅｎｖおよびスプライシングされていないｍＲＮＡの輸送促進に関与している。ＲＲＥはＲｅｖ−応答エレメントである。ＲＲＥ核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチドはかかる輸送を阻害すると考えられる。上記のように、標的配列にハイブリダイゼーションするように相補的オリゴヌクレオチドを設計する。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、隣接した相補的塩基のセグメント長、水素結合にかかわる塩基のタイプ（例えば、Ｇ：Ｃ水素結合の形成はＡ：Ｔよりも強力である）、内部付加ならびに欠失、およびオリゴヌクレオチドの構造上の化学修飾のごとき因子に影響されるであろう。特定の配列にハイブリダイゼーションするように設計されたオリゴヌクレオチドを、適当な融解温度（Ｔｍ）（５０％のオリゴヌクレオチドがその標的核酸にハイブリダイゼーションする温度）を有するように設計すべきである。プローブ長およびヌクレオチド組成（Ａ＋Ｔに対するＧ＋Ｃのパーセンテージ）を変化させることにより適当なＴｍを得ることができる。該プローブ長およびヌクレオチド組成は、生理学的温度（３７℃）よりも約２〜１０℃高いＴｍを生じるはずである。オリゴヌクレオチドの相補的領域が長いほど、標的核酸への水素結合が増し、一般的には、Ｔｍが高くなる。ＧおよびＣのパーセンテージの増加もまたＴｍを上昇させる。なぜなら、Ｇ−Ｃ塩基対はさらなる水素結合を有しており、それゆえ、Ａ−Ｔ塩基対よりも熱安定性が高いからである。「同種プロテクションアッセイ（Homogeneous Protection Assay）」と題されたArnoldらの欧州特許出願第８８３０８７６７.８号（公開番号３０９２３０）、および「非アイソトープＤＮＡプローブ法（Nonisotopic DNA Probe Techniques）」（Academic Press,San Diego（Kricka編、１９９２年）の２７５頁のNelsonらの部分に従うハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ（ＨＰＡ）によってハイブリダイゼーションを測定することのように、当該分野で知られた方法を用いてＴｍを測定することができる（これらの文献を参照により本明細書に記載されているものとみなす）。「アクリジニウムエステル標識およびヌクレオチドプローブの精製（Acridi nium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes）」と題されたA rnoldらのＰＣＴ／ＵＳ８８／０３３６１（これらの文献を参照により本明細書に記載されているものとみなす）により記載されたように、オリゴヌクレオチドをアクリジニウムエステル誘導体で標識することができる。以下のようにしてＨＰＡを用いてＴｍを測定することができる。オリゴヌクレオチドをアクリジニウムエステルで標識する。過剰量のＨＩＶＲＮＡ標的を用いて、オリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドをコハク酸リチウムバッファー（０.１Ｍコハクリチウム酸バッファー（ｐＨ５.０）、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＥＧＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中で形成する。次いで、核酸ハイブリッドを含有する溶液の一部をコハク酸リチウムバッファー溶液で希釈する。その一部を、予想Ｔｍよりも低い温度から始めて２〜５℃ずつ上昇させつつ種々の温度で５分間インキュベーションする。次いで、この溶液をわずかにアルカリ性のホウ酸バッファー（０.１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム、（ｐＨ７.６）、５％（ｖ／ｖ）TRITON^RX-100）で希釈し、低温で１０分間インキュベーションする。これらの条件下で、１本鎖オリゴヌクレオチドに結合したアクリジニウムエステルは加水分解され、一方では、ハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチドに結合したアクリジニウムエステルは加水分解から相対的に保護される。かくして、加水分解処理後に残存するアクリジニウムエステルの量は、試料中に存在するハイブリッド分子数に比例する。溶液に過酸化水素およびアルカリを添加することにより生じる化学発光をモニターすることにより残存アクリジニウムエステルを測定することができる。化学発光をルミノメーター（例えば、Gen-Probe LEADER^RIまたはLEADER^R50）で測定することができる。得られたデータを、温度に対する最大シグナルのパーセント値としてプロットする（通常は最低温度から）。このアッセイにおいて、Ｔｍが決定され、それは最大シグナルの５０％が残存する温度である。上記方法のほかに、当業者によく知られたアイソトープ法によりＴｍを測定することができる（例えば、Hogan et al.上記文献参照）。生理学的条件下で起こると予想されるハイブリダイゼーションの測定値を得るために、ある程度生理学的条件を模倣するように設計されたオリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイにより、オリゴヌクレオチドをスクリーニングすることができる。生理学的条件の複雑さにより、オリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイは、細胞中での実際のハイブリダイゼーション挙動の正確な複製というよりもむしろその近似を提供する。ＤＮＡオリゴヌクレオチド、対応アクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチド、およびＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を用いてオリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイを行うことができる。該アッセイは、引き続き行われるＲＮａｓｅＨ活性による標的ＲＮＡの分解を測定することにより、ＤＮＡオリゴヌクレオチドがＲＮＡ標的にハイブリダイゼーションしてＤＮＡ：ＲＮＡ２本鎖を形成する能力を測定する。アクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドを用いて残存標識核酸配列を検出する。オリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイを以下のようにして行うことができる：１）生理学的バッファー水溶液のごとき溶液中でオリゴヌクレオチドをそれらの標的核酸にハイブリダイゼーションさせる。標的核酸の例は精製ＨＩＶｍＲＮＡである。１００μｌの生理学的バッファー中０.９ｐｍｏｌの標的ｍＲＮＡ、０.１ｐｍｏｌのアクリジニウムエステル標識プローブを用いて、３７℃で２時間ハイブリダイゼーションを行うことができる。反応物を分けて、最適ＲＮＡｓｅＨ酵素活性用に１ｘ最終バッファー濃度の２系とする。２）E.coliのＲＮａｓｅＨ（Life Technologies,Gaithersburg,MD、０.４ユニット／反応）を、２系の反応物の一方に添加する。他方の反応物にはＲＮａｓｅＨを入れず、（−）ＲＮａｓｅＨ対照として役立つ。反応物を３７℃で１時間インキュベーションし、９５℃で５分間変性させることにより反応停止し、直接氷上に置く。３）反応物の一部を適当なホスホジエステルアクリジニウムエステル−プローブとハイブリダイゼーションさせる。適当なアクリジニウムエステル−プローブは、試験オリゴヌクレオチドと同じ核酸配列とハイブリダイゼーションし、相補的領域にアクリジニウムエステルを含むことができる。アクリジニウムエステル −プローブを６０℃で１時間ハイブリダイゼーションさせる。標的核酸配列以外の領域にハイブリダイゼーションすると予想されるアクリジニウムエステル−プローブを用いて対照ハイブリダイゼーションを行う。４）一部をハイブリダイゼーションバッファー（０.１Ｍコハクリチウム酸バッファー（ｐＨ５.０）、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＥＧＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中に希釈する。１２ｘ７５ｍｍのルミノメーターチューブ中で、３００μｌの０.１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムバッファー（０.１５Ｍ四ホウ酸ナトリウム、（ｐＨ７.６）、５％（ｖ／ｖ）TRITON^RX-100）を用いて、ハイブリダイゼーションしていない標識プローブが完全に加水分解されるまで（通常６〜８分）、５０マイクロリットルの複製物を加水分解する。１.５ＮＮａＯＨ、０.１％Ｈ₂Ｏ₂を１回注入することにより化学発光を生じさせ、ルミノメーターで測定する。当業者に理解されるように、この方法の変法を用いることができる。例えば、異なる量の試薬およびインキュベーション時間を用いてアッセイを行うことができる。Ｂ.治療的使用抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの好ましい使用は、ＨＩＶ感染患者の治療におけるものである。ＨＩＶ増殖を阻害することにより、ＡＩＤＳ関連徴候を遅延および／または除去することができる。治療的使用に関して考慮すべき事項は、オリゴヌクレオチドの薬理、投与方法、疾病の段階および他の薬剤との相互作用を包含する。これらの考慮すべき事項は相互に関連しており、例えば、投与方法はオリゴヌクレオチドの薬理に影響する。１.薬理学薬理学的考慮は、毒物学、薬物動態学、吸収、分布、代謝および排泄を包含する。これらの考慮すべき事項は、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドがその標的部位に到達する能力、ＨＩＶ増殖を阻害する能力、および患者に悪影響を及ぼす副作用を生じる可能性に関連する。当該分野で知られた方法および本明細書記載の方法を用いて、異なる薬理学的考慮事項を評価することができる。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは、患者に重大な影響を及ぼすことなくウイルス増殖を阻害することにより、治療薬として効果的に機能しうる。治療薬として使用する場合、いくつかの悪い副作用が存在することがありうる。余命の延長または免疫系の応答向上のごとき全体として患者に有益なことを提供することにより、全体的な治療効果を得ることができる。標準的な医学的方法および用量規則のごとき考慮事項を用いて悪い副作用を減じることができる。例えば、低い治療指数を有する抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを、連続した治療期間において低濃度で使用することができる。必須の細胞機能を阻害するのと同程度にＨＩＶ核酸を阻害する抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドは本発明のあまり好ましくない具体例である。かかるオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ感染細胞にのみ送達することにより（例えば、ＨＩＶ感染細胞を標的とする認識分子を含むリポソームを用いて）、治療的に作用する可能性がある。細胞アッセイおよび実験動物のごときモデルを用いて治療的投与前にオリゴヌクレオチドの毒性を評価することができる。細胞アッセイを用いて剤の細胞毒性効果およびそのＨＩＶ増殖阻害能を測定することができる（例えば、Weislow et al.J.Natl.Cancer Inst.81:577〜586(1989)および後の実施例記載の方法参照）。好ましくは、実験動物を用いて抗ＨＩＶオリゴヌクレオチトの毒性を測定する。２.投与裸のオリゴヌクレオチド、発現ベクター（かかる抗ＨＩＶをコードしている）を介して、あるいは生理学的に許容される処方に含ませて、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを患者に導入することができる。医薬上適当な薬剤送達方法は、リポソーム、放出ビヒクル、イオン泳動、イオン対分子、および共有結合付加物の使用を包含する。異なるタイプの送達方法が、本発明において有用であり、オリゴヌクレオチド修飾、微粒子担体薬剤送達ビヒクル、およびレトロウイルス発現ベクターを包含する。ホスホジエステル結合により結合された抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドはゆっくりと細胞に取り込まれる。細胞取り込みを促進するために、ホスホジエステル結合において抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを修飾してもよく、例えば、個々のヌクレオチドをホスホロチオエートまたはメチルホスホネート結合により結合してもよい。かかる修飾もまた、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの感受性を低下させることに役立ちうる。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドをコードしている発現ベクターを用いて細胞内オリゴヌクレオチドを生産することができる。例えば、Rhodes and James Journal of General Virology 71:1965〜1975,1990（参照により本明細書に記載されているものとみなす）には、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用するＲＮＡを製造するためのベクターの使用が記載されている。治療的処置において発現ベクターを使用することに関して有り得る欠点は、それにより生成されたＲＮＡがホスホロチオエート結合を含まないであろうということである。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを用いて、異なる処方および投与経路を用いて、ＨＩＶ患者を治療することができる。適当な投与経路は、筋肉内、エアロゾル、経口（錠剤またはピル形態）、局部、全身、目、腹腔内および気管内を包含する。全身および局部投与の両方のために薬剤送達ビヒクルを選択することができる。ゆっくりと放出するリザーバーとして役立つように、あるいはその成分を標的細胞に直接送達するようにかかるビヒクルを設計することができる。直接送達薬剤ビヒクルを用いる利点は、１回の投与で複数の分子が送達されることである。かかるビヒクルは薬剤の循環半減期を延長するが、かかるビヒクルなしでは薬剤は急速に血流から除去されてしまう。詳説されている薬剤送達ビヒクルの例は、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体付着性微小球である。リポソームは、細胞膜を形成している脂質と同様に配列された脂質からなる中空小胞である。それらは、水溶性化合物を取り込むための内部親水性空間を有し、直径０.０５ないし数ミクロンのサイズである。薬剤送達としてのリポソームの使用はいくつかの利点を提供する。核酸を送達するためのビヒクルとしてのリポソームの使用を記載した文献は、Sullivan et al.,Antisense Research and Development 2:187〜197(1992)、およびJuliano a nd Akhtar,Antisense Research and Development 2:165〜176(1992)を包含する。リポソームは、細胞内安定性、取り込み効率および生物学的活性の増大に有用でありうる。リポソーム使用の他の利点は以下のことがらを包含する：リポソームは組成上無毒であり生分解性であり；長い循環半減期を示し；その表面に認識分子を容易に結合させて組織を標的とすることができる。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを全身的に投与してもよい。全身的吸収は、薬剤の血流中の蓄積、次いで、全身への分布に関連している。全身的吸収を導く投与経路は、静脈、皮下、腹腔内、鼻腔内、気管内および目への投与を包含する。これらの投与経路のそれぞれは、アクセス可能な障害細胞を抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドに曝露する。皮下投与は、循環系中のリンパネットワークに通じている局所的なリンパ節に注入するものである。循環系に入る速度は、原理的には、分子量またはサイズの関数である。リポソームまたは他の薬剤担体の使用は、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドをリンパ節に局在化させることができる。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチトを修飾して細胞中に拡散させることができ、あるいはリポソームは、未修飾または修飾抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの細胞への送達に直接関与することができる。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドをリンパ球およびマクロファージ表面に結合させることのできるリポソーム処方も有用である。これは、感染細胞に対するマクロファージおよびリンパ球の免疫認識の特異性を利用することによって、ＨＩＶ感染細胞への送達を促進する。腹腔内投与も、循環系への侵入を導く。オリゴヌクレオチド−送達ビヒクル複合体び分子量またはサイズは侵入をコントロールする。細胞中での抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの治療レベルの確立は、流出および分解に対する細胞取り込みの競争速度に依存する。分解程度の低下は抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの細胞内半減期を延長する。かくして、好ましい抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを修飾してヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を増大させ、細胞取り込みを増加させる。正確な用量および投与回数は臨床試験の有効性データに依存する。送達ベヒクル、疾病の徴候、投与経路、およびオリゴヌクレオチド安定性のごときいくつかの因子は用量に影響する。考えられる用量は０.００１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。治療期間は疾病徴候がある間ずっと延長されるであろう。局部投与、目への適用および膣への適用については１日複数回の投与が考えられる。Ｃ.ＨＩＶ防御アッセイオリゴヌクレオチドのＨＩＶ細胞変性効果阻害能を測定するアッセイに抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを用いることもできる。これらのアッセイは、ヒトにおける病原体としてのＨＩＶの存在を確認するための用途、いずれのオリゴヌクレオチドを患者に投与すべきかを決定するための用途、およびオリゴヌクレオチドの初期有効性を評価するための用途（後記実施例５参照）を包含する種々の用途を有する。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドおよび細胞増殖を測定する標準的方法を用いてＨＩＶ防御アッセイを行うことができる。細胞増殖測定法は、細胞の代謝状態を測定するためにＸＴＴ（２,３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド）のごとき色素の使用、核酸複製を測定するための放射性ヌクレオチドもしくはＢＵｄＲのごとき修飾ヌクレオチド前駆体の使用、および宿主核酸の産生を測定するための宿主核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの使用を包含する。蛍光、化学発光、酵素または放射性標識のごとき検出可能標識を含むオリゴヌクレオチドを用いて、細胞増殖を測定するために宿主相補的オリゴヌクレオチドを用いるアッセイを行うことができる。ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡに存在するような宿主核酸配列領域にハイブリダイゼーションするようにオリゴヌクレオチドを設計することができる。かかるヌクレオチド配列領域の例は当該分野において知られており、標準的方法により得ることができる。宿主標的核酸の好ましいソースはｒＲＮＡである。一般的には、ｒＲＮＡに特徴的な核酸配列を有する核酸は、ｍＲＮＡに存在する核酸配列よりもずっと豊富に細胞中に存在する。ＨＩＶ感染細胞（ＣＤ４⁺）はＣＤ４抗原を含んでいる。主要標的部位はＴ− ヘルパーリンパ球および単球／マクロファージ系の細胞である。ＨＩＶ感染の疑いのあるヒトからのかかる細胞についてＨＩＶ防御アッセイを行うことができる。該アッセイをかかる細胞について直接行うこともでき、あるいはＣＤ４⁺細胞から得た溶解物を用いて行うこともできる。溶解物を用いて、単離細胞よりもＨＩＶ細胞変性効果に対して感受性のある細胞を感染させることができる。ＨＩＶ防御アッセイを以下のようにして行うことができる：１）ヒトからＣＤ４⁺細胞を単離する。好ましい細胞はＴ−リンパ球である。２）抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの存在下（処理細胞）および不存在下（対照細胞）で細胞増殖に適合した条件で細胞をインキュベーションする。細胞増殖に適合した条件の例は、Techniques in HIV Research（A.AlaldociniおよびB.D.Wa lker編）,Stockton Press.N.Y.中、S.GartnerおよびM.Popovic,1980,Virus Isolation and Production,pp.53〜70により記載されている。３）細胞を抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドに曝露した後、１またはそれ以上の時点で処理細胞および対照細胞の増殖を測定する。対照細胞の正常な増殖は、ＨＩＶ感染のごときウイルス感染がないことを示す。対照細胞の増殖を健康であることが知られている同じタイプの細胞と比較することにより、正常な増殖を測定することができる。対照細胞の正常増殖以下の増殖は、ＨＩＶのごときある種の細胞の障害の存在を示す。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの処理細胞におけるＨＩＶ細胞毒性に対する防御能は、障害がＨＩＶによるものであり、試験した抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを用いて患者を治療できることを示す。異なる株のＨＩＶの核酸配列の多様性により、このアッセイにおいて抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドがＨＩＶ細胞毒性を阻害できないことは、時々、正確にＨＩＶ存在を示すことをできなくする。かくして、ＨＩＶ防御アッセイを当該分野で知られた他のアッセイとともに用いてＨＩＶの存在を検出すべきである。他のＨＩＶ検出アッセイによって、しかしＨＩＶ防御アッセイによってではなくＨＩＶに感染していると決定された患者を、異なるオリゴヌクレオチドに関連してＨＩＶ防御アッセイを用いて再試験すべきである。ＩＩ.オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによるＨＩＶの検出ＨＩＶ核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを検出プローブとして用いてＨＩＶ標的配列の存在を測定することができ、増幅プライマーとして用いて選択的にＨＩＶ核酸を増幅することもできる。標的核酸または標的配列に相補的な核酸配列領域のいずれかへのハイブリダイゼーションは、ＨＩＶの存在を検出するのに有用である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または転写媒介増幅歩（例えば、「核酸増幅方法（Nucleic Acid Amplification Method）」と題されたKacianおよびFultzのＥＰＯ出願第９０３０７５０３.４号）のごとき増幅反応において標的核酸を鋳型として用いて、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を製造することができる。ＨＩＶ検出用プローブおよび増幅プライマーの設計に関する有用なガイドラインを本明細書に記載し、それは後記セクションＩ.Ａで議論された考慮事項を含み、オリゴヌクレオチドのその相補的配列へのハイブリダイゼーションに関するものである。セクションＩ.Ａにおける考慮事項を、オリゴヌクレオチドが作動する条件下での異なるハイブリダイゼーションに鑑みて考慮すべきである。抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドを生理学的条件下で使用する。対照的に、増幅および検出プローブを広範な条件下で使用することができ、好ましくは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で使用する。標的ヌクレオチド配列領域のプライマー５’および標的ヌクレオチド配列領域のプライマー３’を用いて核酸分子上に存在する標的ヌクレオチド配列領域を増幅する。核酸配列増幅の最適部位は、長さが約１５塩基より長く約３５０塩基以内の、好ましくは１５０塩基以内の隣接配列である保存されたヌクレオチド配列領域である。これらの領域にハイブリダイゼーションするように増幅プライマーを設計する。転写媒介増幅（transcription mediated amplification）のためにプロモーターをプライマーに結合することができる。プライマーまたはプロモーター／プライマーのセットにより観察される増幅の程度は、オリゴヌクレオチドがその相補的配列領域にハイブリダイゼーションする能力および酵素により伸長される能力を包含するいくつかの因子に左右される。ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性はいくつかの因子によって影響され、それらの因子の操作により正確な感度および特異性が決定され、そこで特定のオリゴヌクレオチドが、その標的に完全に相補的であるかどうかにかかわらず、その標的にハイブリダイゼーションする。種々のアッセイ条件の重要性および効果は当業者に知られており、「非ウイルス生物の検出および／または定量のための核酸プローブ(Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitati on of Non-Viral Organism)」と題されたHoganらのＥＰＯ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９のごとき文献に記載されている。種々の長さおよび塩基組成の、オリゴヌクレオチド検出および増幅プローブを用いることができるが、好ましいプローブは長さ１８ないし１００ヌクレオチド、より好ましくは、長さ１８ないし５０ヌクレオチドであり、標的核酸に対して十分に相補的であり厳密な条件下（例えば、プローブオリゴヌクレオチドがＨＩＶ標的配列領域にハイブリダイゼーションするが、ヒト・核酸または他の生物由来の核酸にはハイブリダイゼーションしない条件）でハイブリダイゼーションするものである。最適プライマーは１８〜３８塩基の標的結合領域を有し、標的に対する予想Ｔｍ（融解温度）は約６５℃である。オリゴヌクレオチド：非標的核酸ハイブリッドの安定性を最小にするようにオリゴヌクレオチド検出プローブおよび増幅プライマーを設計すべきである。プローブは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、標的と非標的ヌクレオチド配列領域を識別すべきである。プローブの設計において、オリゴヌクレオチド：標的とオリゴヌクレオチド：非標的２本鎖との間のＴｍ値の相違をできるだけ大きくすべきである（例えば、少なくとも２℃、好ましくは５℃）。プローブおよび標的領域の２次構造もハイブリダイゼーションに影響する。オリゴヌクレオチドがその標的にハイブリダイゼーションする速度は、一部には、プローブに相補的な領域中の標的核酸の２次構造の熱安定性に左右される。ハイブリダイゼーションを阻害する強力な内部構造を形成する核酸領域はあまり好ましくない標的部位である。かかる構造の例はヘアピンステム−ループ構造を包含する。同様に、過度の自己相補性を有するプローブも避けるべきである。十分な自己相補性がある場合には、分子内および分子間ハイブリッドがプローブ内で形成する可能性がある。注意深いプローブの設計によってかかる構造を避けることができる。市販コンピュータープログラムを用いてこれらのタイプの相互作用を検索できる。利用可能なコンピュータープログラムは、MacDNASIS^TM2.0（Hitach i Software Engineering American Ltd.）およびOLIGO^R ver.4.1（National Bio science）を包含する。自然界において完全なゲノム標的ヌクレオチド配列領域は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物と同様、２本鎖形態で存在する。これらの２本鎖標的核酸はプローブ：標的ハイブリダイゼーションを阻害する。熱変性のごとき標準的方法を用いるハイブリダイゼーション工程の前ならば２本鎖標的にアクセス可能である。ハイブリダイゼーション速度の標準的な測定値はＣ₀ｔ_1/2であり、それは１リットルあたりのヌクレオチドのモル数に５０％の核酸がハイブリダイゼーションするのに要する時間（秒）を掛けたものとして測定される。かくして、それは、遊離プローブ濃度に、その濃度において起こる最大ハイブリダイゼーションの５０％が起こる時間を掛けたものである。一定時間において、種々の量のプローブを一定量の標的にハイブリダイゼーションさせることによってこの値を測定する。標準的方法により、Ｃ₀ｔ_1/2はグラフで見いだされる。非特異的プライマー伸長（プライマー−ダイマー形成または非標的コピー）の程度は、増幅効率に影響する可能性がある。それゆえ、好ましくは、プライマーは、特に３'末端において低い自己相補性または交差相補性を有する。見かけのプライマー伸長を減少させるために長いホモポリマー領域および高いＧＣ含量を避けるべきである。市販コンピュータープログラムを用いて、設計のこの態様の助けとすることができる。利用可能なコンピュータープログラムは、MacDNASIS^T ^M 2.0（Hitachi Software Engineering American Ltd.）およびOLIGO^R ver.4.1（ National Bioscience）を包含する。検出プローブを合成したならば、よく知られた方法（J.Sambrook,E.F.Fritsch およびT.Maniatis,Molecula rCloning,第１１章（第２版，１９８９年））を用いてそれを標識することができる。有用な標識は、蛍光、化学発光、酵素および放射性基を包含する。ＩＩＩ.オリゴヌクレオチドの合成ホスホジエステル結合ならびに修飾結合を含むオリゴヌクレオチドを、当該分野で知られた方法により合成することができる。例えば、Methods in Enzymolog y 154:287(1987),Caruthers,et al.には、標準的なホスホラミダイト固相化学によるホスホジエステル結合含有オリゴヌクレオチドの合成方法が記載されており；Bhattの米国特許第５,２５２,７２３号には、ホスホロチオエート結合含有オリゴヌクレオチドの合成方法が記載されており；KlemらのＰＣＴＷＯ９２／０７８６４には、メチルホスホネート結合を包含する異なる結合を有するオリゴヌクレオチドの合成が記載されている。ＩＶ.実施例本発明の異なる態様および具体例を説明する実施例を以下に記載する。これらの実施例は、開示された本発明を何ら限定しない。それよりもむしろ、実施例は、好ましい核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有する抗ＨＩＶオリゴヌクレオチド、および好ましい核酸配列を必須としてなる抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの同定に使用可能な方法論を記載する。また、実施例は治療的使用を容易にするための抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドのさらなる特徴づけの方法論を記載する。実施例１：細胞増殖の測定この実施例は、細胞増殖の測定、およびオリゴヌクレオチドの細胞毒性の測定のための方法を説明する。新しい細胞の外観を顕微鏡観察すること、およびトリパンブルー排除法（R.I.Freshney,Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Techniques,p.257(Wiley-Liss,N.Y.1994)）を用いる細胞計数のごとき異なる方法を用いて、細胞の健康状態をモニターすることができる。ホルマザンへのＸＴＴの代謝変換を測定する比色アッセイ、および存在するｒＲＮＡ量を測定する定量的ハイブリダイゼーションアッセイを用いて細胞の代謝状態を調べることができる。ＸＴＴアッセイ結果およびｒＲＮＡレベルは両方とも、広範な細胞濃度にわたり、生細胞数と強く相関関係があった：ＸＴＴアッセイには少なくとも１０⁴ ないし１０⁶個／ｍｌの範囲；ｒＲＮＡアッセイには少なくとも１０³ないし１０⁶個／ｍｌの範囲。下記手順（「方法Ａ」）を用いて、後記実施例のいくつかにおける細胞増殖を測定した。まず、１ｍｇ／ｍｌの２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５ −スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ；Sigma Chemical Co.）および０．０２５ｍＭフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ；Sigma Chemical Co.）の溶液２５μｌを、１００μｌの感染または未感染細胞を入れたウェルに添加した。処理細胞を加湿５％ＣＯ₂雰囲気で３７℃ で４時間インキュベーションした。次いで、５％（ｖ／ｖ）TRIT0N^RX-100溶液を各ウェルに添加して最終界面活性剤濃度を０.５％とした。この濃度の界面活性剤はウイルスを不活性化した。各ウェルの４５０ｎｍおよび６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。６５０ｎｍにおける吸光度を用いてウェル中の残渣による光散乱を補正した。ＸＴＴの細胞代謝によるホルマザン生成を測定する４５０ｎｍにおける吸光度は生細胞数と強い相関関係があった。トリパンブルー存在下での顕微鏡試験により生細胞数を測定した。９６ウェルディッシュのウェルに、最終体積０.２５ｍｌの１０％ウシ胎児血清補足ＲＰＭＩ１６４０培地中１００００個／ウェルの細胞を種々の濃度のオリゴヌクレオチドとともに撒くことにより、オリゴヌクレオチドの細胞毒性を測定した。細胞を加湿５％ＣＯ₂雰囲気で３７℃で６日間インキュベーションし、次いで、各ウェルの内容物を混合し、新たな９６ウェルディッシュに移してＸＴＴアッセイを用いて細胞増殖を測定した。いくつかの実験においては、残りの培養物の細胞密度を生細胞計数により測定した。 Jurkat細胞を用いる細胞毒性の研究結果を表２にまとめる。試験オリゴヌクレオチドは、特定のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号により示されるヌクレオチドからなる）に対応したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであった。試験オリゴヌクレオチドの大部分は、９μＭｍまでの濃度においては細胞毒性効果を有していなかった（ＩＣ₅₀＞９）。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.５および１３に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、試験した範囲の高濃度側でいくぶんかの細胞毒性効果を有していた。初代ヒト細胞を用いて抗ＨＩＶ剤の細胞毒性のさらなる測定値を得ることができる。例えば、半固体培地における造血細胞のコロニー形成能を用いて多くの抗新生物剤の細胞毒性が測定されている。方法ＢおよびＣを用いて初代ヒト細胞における細胞毒性を測定することができる。方法Ｂ標準的方法を用いて、ヒト・骨髄細胞を集め、洗浄する（例えば、Exp.Hemato l(Suppl.16)13:16〜22,1985参照）。０.３％（ｗ／ｖ）寒天、２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）および１０ｎｇ／ｍｌヒト・顆粒球コロニー刺激因子を含有する組織培養培地中、種々の濃度のオリゴヌクレオチド存在下で細胞を８日間インキュベーションする。インキュベーション後、コロニー数を計数する。方法Ｃこの方法は、もともと、変異原試験において染色体変状可能性を測定するために開発された（Evans et al.,Mutat.Res.31:135,1975）。２０％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中にヒト・リンパ球を集め、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（フィトヘマグルチニン（Ｍ））に４８時間曝露することにより刺激する。種々の濃度の各オリゴヌクレオチドを異なる培養物に添加し、細胞をさらに２４時間インキュベーションする。リンパ球増殖阻害に関するＩＣ₅₀値を決定し、中期染色体についての顕微鏡観察を行う。実施例２：ＨＩＶ増殖の測定この実施例は、ＨＩＶ増殖を測定するためのＨＩＶ−１ｐ２４コア抗原のレベルの測定を説明する。下記のように、典型的には、細胞培養物上清をｐ２４抗原レベルアッセイ前に凍結した。凍結によりｐ２４抗原レベルを後ほど測定することができる。凍結培養物上清を室温で融解し、新鮮培地で種々のレベルに希釈した。 Coulter Corporationから購入したキャプチャＥＬＩＳＡ（capture ELISA）を用いてＨＩＶ−１ｐ２４抗原レベルを測定した。反応速度論的アッセイフォーマットを用い、製造者の説明書に従って行った。実施例３：急性感染アッセイ急性感染アッセイフォーマットは、低ウイルスカ価での感染を長時間インキュベーションと組み合わせて用いる。細胞およびウイルス集団が同時に増殖するので、多数のラウンドの感染およびウイルス複製が可能である。十分に低い感染の多重度（ルーチンな実験により測定）において、高レベルのウイルスマーカー（例えば、ｐ２４抗原）の産生は、単一世代の感染細胞におけるウイルス遺伝子発現のみならずインキュベーション中の感染性ウイルスの産生およびさらなるサイクルの細胞感染（およびおそらく重複感染）に左右される。かくして、この方法により明らかにされるオリゴヌクレオチドの感染性ウイルス産生阻害能は、予想される治療効率と相関関係がある。Ｔリンパ球細胞系における急性ＨＩＶ−１感染をブロックする能力についてオリゴヌクレオチドを試験した。JurkatクローンＥ６−１（ATCC TIB 152）およびＳｕｐＴ−１（Advanced Bio Technologies Inc.）についてアッセイを行った。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下で細胞を増殖させた。２ｘ１０⁶個／ｍｌより低い生存力価およびトリパンブルーで測定して９０％を越える生存率を有する細胞培養物のみを急性感染の宿主として用いた。約３ｘ１０⁶個の細胞を新鮮培地で希釈して最終体積２５ｍｌとし、１３５ｘｇで８分間遠心分離することによりペレット化した。培地を除去し、細胞を新鮮培地中におだやかに再懸濁して最終濃度１ｘ１０⁶個／ｍｌとした。ＨＩＶ−１株IIIＢ（１ｘ１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ；ＴＣＩＤ＝組織培養感染用量）を細胞に添加して細胞１個あたり０.０４の融合細胞形成ユニット（ｓｆｕ）の感染の多重度とした（０.７ｓｆｕ＝１.０ＴＣＩＤ₅₀）。ウイルスおよび細胞の混合物を、３７℃、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下で２時間インキュベーションし、次いで、培地で２５ｍｌに希釈し、１３５ｘｇで８分間遠心分離することによりペレット化した。ペレット化細胞を２５ｍｌの培地で２回洗浄し、次いで、培地に再懸濁して濃度８ｘ１０⁴個／ｍｌとした。種々の濃度のオリゴヌクレオチドを伴う１２５μｌの培地、あるいはオリゴヌクレオチドを伴わない１２５μｌの培地の入った丸底９６ウェルプレートのウェルに１２５μｌの体積として細胞を分注した。各オリゴヌクレオチド濃度を少なくとも２回試験した。３７℃、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下でプレートをインキュベーションした。６日後、ウェルを顕微鏡試験して全細胞量を概算し、融合細胞数を計数した。次いで、各ウェルの内容物をピペッティングにより混合し、各培養物１００μｌを平底９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移して細胞増殖を測定した。インキュベーションプレートを１３５ｘｇで８分間遠心分離することにより各培養物中の残りの細胞をインシトゥでペレット化した。８０μｌの清澄化培地を新たな９６ウェルプレートに移し、次いで行う上記実施例２に記載するｐ２４コア抗原レベルのアッセイ用に−８０℃で凍結した。異なる抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドのＥＣ₉₀を表３に示す。表３に示すすべてのオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート結合のみを含んでいた。ＥＣ₉₀は、ｐ２４抗原産生を９０％阻害するのに必要なオリゴヌクレオチド濃度をいう。実施例４：慢性感染アッセイ慢性感染ヒト細胞系８Ｅ５（ＡＴＣＣＣＲＬ８９９３）を用いてオリゴヌクレオチドをアッセイした。この細胞系は、単一プロウイルスＨＩＶゲノムを含んでいるＴ細胞白血病系（ＬＡＶ−１株）であり、逆転写酵素産生を不活性化するｐｏｌ遺伝子座における１個の塩基の挿入を伴っている（Folksら米国特許第４,７５２,５６５号）。この系におけるｐ２４産生はデノボ感染事象の関数ではないので、この系は、ＨＩＶ遺伝子発現を阻害しうる抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドの同定に有用である。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で８Ｅ５細胞培養物を増殖させた。３７℃、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下で細胞を増殖させた。２ｘ１０⁶個／ｍｌより低い生存力価を有し、トリパンブルー排除法による測定で９０％を越える生存率を有する培養物を用いて、オリゴヌクレオチドのＨＩＶ増殖阻害能を測定するアッセイを開始した。まず、新鮮培地を用いて培養物を１：２に希釈し、３７℃、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下で増殖させることによりアッセイを行った。細胞を１３５ｘｇで８分間遠心分離することにより集めた。培地を除去し、細胞を新鮮培地にゆるやかに再懸濁し、ペレット化し、培地中の遊離ウイルスを洗った。次いで、細胞を新鮮培地に再懸濁して８ｘ１０⁴個／ｍｌとし、１２５μｌの培地の入った丸底９６ウェルプレートのウェルに１２５μｌを分注した。ウェルは種々のオリゴヌクレオチド濃度であるかまたはオリゴヌクレオチドを添加されていない。８μＭ、２μＭ、０.５μＭ、１２５μＭおよび３１.３μＭの濃度においてオリゴヌクレオチドを少なくとも２回試験した。マイクロタイタープレートを３７℃、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下でインキュベーションした。６日後、ウェル内容物をピペッティングにより混合し、それぞれ１００μｌを平底９６ウェルプレートに移して細胞増殖を測定した。上記実施例１、方法Ａ記載のごとく細胞増殖を測定した。プレートを１３５ｘｇで８分間遠心分離することにより残りの培養物中の細胞をペレット化した。７５μｌの清澄化培地を新たな９６ウェルプレートに移し、後で行うｐ２４コア抗原測定のために−８０℃で凍結した。ペレット化細胞を残りの培地に再懸濁し、この細胞懸濁液５０μｌも、ｐ２４コア抗原測定用に−８０℃で凍結した。上記実施例２記載のごとく抗原レベルを測定した。ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２、３、および８に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについてのこのアッセイ結果を、それぞれ図１、図２および図３に示す。図１、２、および３の上のパネルは、抗ＨＩＶオリゴヌクレオチドでの処理により生じた８Ｅ５細胞から培地中へのｐ２４の分泌の減少を示す。これらの図の下のパネルは細胞毒性効果を示す。試験オリゴヌクレオチドそれぞれについて、ＨＩＶ阻害効果は細胞毒性効果よりも大きかった。かくして、これらの実験は、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２、３、および８に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの治療的使用についてのさらなる支持を提供するものである。実施例５：ＨＩＶ防御アッセイこの実施例は、オリゴヌクレオチドのＨＩＶ細胞変性効果阻害能をアッセイすることによるオリゴヌクレオチドの抗ＨＩＶ活性の測定を説明する。IIIＢ株のごときある種のＨＩＶ−１株でのＳｕｐＴ−１のごときある種の細胞の感染は、感染細胞の死滅を誘導する。ＨＩＶ増殖を防止する処理は、ＨＩＶにより誘導される細胞変性効果から細胞を救済するであろう。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸を補足したＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下で増殖したＳｕｐＴ−１細胞（Advanced BioTechnologies Inc.）についてアッセイを行った。２ｘ１０⁶個／ｍｌより低い生存力価およびトリパンブルー排除法で測定して９０％を越える生存率を有する細胞培養物のみを急性感染のための宿主として用いた。ルーチンに、約３ｘ１０⁶個の細胞を新鮮培地で希釈して最終体積２５ｍｌとし、１３５ｘｇで８分間遠心分離することによりペレット化した。培地を除去し、細胞を新鮮培地中におだやかに再懸濁して最終濃度１ｘ１０⁶個／ｍｌとした。ＨＩＶ−１株IIIＢ（１ｘ１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ；ＴＣＩＤ＝組織培養感染用量）を細胞に添加して細胞１個あたり０.０４の融合細胞形成ユニット（ｓｆｕ）の感染の多重度とした（０.７ｓｆｕ＝１.０ＴＣＩＤ₅₀）。ウイルスおよび細胞の混合物を、３７℃、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下で２時間インキュベーションし、次いで、培地で２５ｍｌに希釈し、１３５ｘｇで８分間遠心分離することによりペレット化した。ペレット化細胞を２５ｍｌの培地で２回洗浄し、次いで、培地に再懸濁して濃度８ｘ１０⁴個／ｍｌとした。種々の濃度のオリゴヌクレオチドを伴う１２５μｌの培地、あるいはオリゴヌクレオチドを伴わない１２５μｌの培地の入った丸底９６ウェルプレートのウェルに１２５μｌの体積として細胞を分注した。ウェルは、１００００個／ウェルの感染細胞および下記濃度のオリゴヌクレオチドを含んでいた：０、９μＭ、３ μＭ、１μＭ、３３３ｎＭ、１１１ｎＭ、３７ｎＭ、１２.３ｎＭ、４.１ｎＭ、および１.４ｎＭ。各濃度においてすべてのオリゴヌクレオチドを少なくとも２回試験した。プレートを３７℃、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下でインキュベーションした。６日後、ウェルを顕微鏡試験して全細胞量を概算し、融合細胞数を計数した。次いで、各ウェルの内容物をピペッティングにより混合し、実施例１記載の方法Ａを用いる細胞毒性効果のアッセイ用に各培養物１００μｌを平底９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移した。インキュベーションプレートを１３５ｘｇで８分間遠心分離することにより、残りの培養物中の細胞をペレット化した。８０μｌの清澄化培地を新たな９６ウェルプレートに移し、後で行う上記実施例２記載のｐ２４コア抗原測定のために−８０℃で凍結した。図４は、ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでの処理による、ＨＩＶの細胞変性効果からの感染細胞の防御を示す。ｐ２４コア抗原の合成により判断されるように、１００ｎＭ未満のオリゴヌクレオチド濃度においてはウイルス産生は弱まらず、ＸＴＴ代謝により判断されるように、細胞増殖はかろうじて検出可能である。オリゴヌクレオチド濃度を増加させると、ウイルス産生は１００〜１０００倍低下し、ＨＩＶ感染細胞の防御が行われ、その結果、ＨＩＶ感染細胞の増殖は未感染細胞の増殖と同じである。実施例６：ＨＩＶ感染に関するプラークアッセイこの実施例は、ＨＩＶプラークアッセイ形成アッセイを用いる、オリゴヌクレオチドの抗ＨＩＶ活性の測定を説明する。ＨＴ−６Ｃ細胞（組み換えレトロウイルスベクター由来のＣＤ４を発現するＨｅｌａ細胞のクローン６Ｃ、NIH AIDS R esearch and Reference Reagent Program）を、７５ｃｍ²の組織培養フラスコ中の、１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミンを補足したＤＭＥＭ培地（GibcoB RL）中、３７℃で、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下に維持した。トリプシン−ＥＤＴＡ（GibcoBRL）を用いて細胞をフラスコから剥離させ、２３０ｘｇで遠心分離して上記培地に再懸濁した。これらの細胞を４８ウェル組織培養ディッシュに２.５ｘ１０⁴個／ウェルで撒き、加湿５％ＣＯ₂雰囲気下３７℃で一晩増殖させた。アッセイを開始するために、培地を各ウェルから除去し、４％ウシ胎児血清、１００ユニットのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、８μｇ／ｍｌＤＥＡＥデキストランおよび０.５μｇ／ｍｌのポリブレンを補足したＤＭＥＭ培地２００μｌ中のＨＩＶ（１００ないし２００プラーク形成ユニット）を各ウェルに添加した。ディッシュを加湿５％ＣＯ₂雰囲気下３７℃でインキュベーションした。２時間後、種々の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する８００μｌの培地をウェルに添加し、ディッシュを加湿５％ＣＯ₂ 雰囲気下３７℃で３日間インキュベーションした。次いで、各ウェルから培地を除去し、１ｍｌの１００％メタノールを各ウェルに添加して細胞をディッシュに固定した。１５分後、メタノールを除去し、０.５ｍｌのリン酸緩衝化セイラインに溶解した０.３％クリスタルバイオレット色素を各ウェルに添加した。５分後、ウェルを水で濯ぎ、濯ぎ液を捨て、風乾した。各ウェルの顕微鏡観察の間に各ウェル中のプラーク数（暗色に染まる巨細胞）を計数した。図５は、種々の濃度のＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでの処理により生じたプラーク形成の減少パーセント値を示す。濃度が３００ｎＭよりも高い場合、プラーク形成は完全に抑制される。オリゴヌクレオチド濃度が低下するにつれこの減少は鈍り、約１０ｎＭにおいては、プラーク形成は未処理ＨＩＶ感染細胞のプラーク形成に到達する。表４は、６株のＨＩＶに対するＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.３に対応するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、プラーク形成アッセイにより測定した抗ウイルス能をまとめる。株Ａ０１８およびＰ０２２は、ＡＺＴ耐性について選択された臨床単離体である。実施例７：毒物学器官または血液組織における大きな形態学的変化を引き起こすオリゴヌクレオチドの能力を調べることにより、インビボ毒物学的試験を実験動物において行うことができる。例えば、毒物学的試験研究を以下のように行うことができる：１）尾静脈内注射によりオリゴヌクレオチドを試験マウスに注入する。対照マウスにはオリゴヌクレオチドを欠く対照溶液を与える。２）器官、組織、および血液パラメーターに対する試験オリゴヌクレオチドの効果を異なる時点（例えば、ｔ＝０および２４時間）で測定する。毒性効果を示す血液パラメーターは、血小板、赤血球、白血球、およびヘモグロビン数の変化を包含する。毒性効果を測定するためにモニターすべき重要な器官および組織の例は脾臓、肝臓、腎臓および胸腺である。他の具体例は以下の請求の範囲内にある。

【手続補正書】【提出日】１９９７年６月３日【補正内容】補正した請求の範囲１．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有し長さ２５ないし１００ヌクレオチドである単離オリゴヌクレオチドであって、インビボまたはインビトロにおいてＨＩＶの増殖を阻害するオリゴヌクレオチド。２．長さ２５ないし３５ヌクレオチドである請求項１のオリゴヌクレオチド。３．ＤＮＡである請求項２のオリゴヌクレオチド。４．少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項３のオリゴヌクレオチド。５．該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項４のオリゴヌクレオチド。６．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有し長さ１８ないし１００ヌクレオチドである単離ヌクレオチドであって、インビボまたはインビトロにおいてＨＩＶの増殖を阻害するオリゴヌクレオチド。７．長さ２０ないし３５ヌクレオチドである請求項６のオリゴヌクレオチド。８．ＤＮＡである請求項７のオリゴヌクレオチド。９．少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項８の単離オリゴヌクレオチド。１０．該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項９のオリゴヌクレオチド。１１．；それらのＲＮＡ同等物であるＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２６〜４３ならびに４５〜５０；およびＤＮＡならびにＲＮＡ同等物の相補配列であるＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.５２〜６９、７１〜７６ならびに７８〜９４ならびに９６〜１０１からなる群より選択される核酸配列を有し長さ２０ないし１００ヌクレオチドである単離オリゴヌクレオチド。１２．長さ２０ないし３５ヌクレオチドである請求項１１のオリゴヌクレオチド。１３．少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項１２のオリゴヌクレオチド。１４．該核酸配列を必須としてなる請求項１３のオリゴヌクレオチド。１５．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域を有し長さ２５ないし１００ヌクレオチドである治療上有効量の単離オリゴヌクレオチドおよび医薬上適合する担体からなる治療組成物であって、該オリゴヌクレオチドがインビボまたはインビトロにおいてＨＩＶの増殖を阻害するものである、患者におけるＨＩＶの増殖を阻害しうる治療組成物。１６．該オリゴヌクレオチドが長さ２５ないし３５ヌクレオチドである請求項１５の治療組成物。１７．該オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求項１６の治療組成物。１８．該オリゴヌクレオチドが少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項１７の治療組成物。１９．該オリゴヌクレオチドが該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項１８の治療組成物。２０．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域を有し長さ１８ないし１００ヌクレオチドである治療上有効量の単離オリゴヌクレオチドおよび医薬上適合する担体からなる治療組成物であって、該オリゴヌクレオチドがインビボまたはインビトロでＨＩＶの増殖を阻害するものである、患者におけるＨＩＶの増殖を阻害しうる治療組成物。２１．該オリゴヌクレオチドが長さ２５ないし３５ヌクレオチドである請求項２０の治療組成物。２２．該オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求項２１の治療組成物。２３．該オリゴヌクレオチドが少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項２２の治療組成物。２４．該オリゴヌクレオチドが該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項２３の治療組成物。２５．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域を有し長さ１８ないし１００ヌクレオチドである治療上有効量のオリゴヌクレオチドを含んでなるＨＩＶ感染患者の治療のための組成物。２６．該オリゴヌクレオチドが長さ２５ないし３５ヌクレオチドである請求項２５の治療組成物。２７．該オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求項２６の治療組成物。２８．該オリゴヌクレオチドが少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項２７の治療組成物。２９．該オリゴヌクレオチドが該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項２８の治療組成物。３０．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域に作動可能に結合された転写認識部位からなり、該抗ＨＩＶ核酸配列が、インビボまたはインビトロにおいてＨＩＶの増殖を阻害するオリゴヌクレオチドをコードしているものである組み換え核酸。

Claims

【特許請求の範囲】１．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有し長さ２５ないし１００ヌクレオチドである単離オリゴヌクレオチドであって、インビボまたはインビトロにおいてＨＩＶの増殖を阻害するオリゴヌクレオチド。２．長さ２５ないし３５ヌクレオチドである請求項１のオリゴヌクレオチド。３．ＤＮＡである請求項２のオリゴヌクレオチド。４．少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項３のオリゴヌクレオチド。５．該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項４のオリゴヌクレオチド。６．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列を有し長さ１８ないし１００ヌクレオチドである単離ヌクレオチドであって、インビボまたはインビトロにおいてＨＩＶの増殖を阻害するオリゴヌクレオチド。７．長さ２０ないし３５ヌクレオチドである請求項６のオリゴヌクレオチド。８．ＤＮＡである請求項７のオリゴヌクレオチド。９．少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項８の単離オリゴヌクレオチド。１０．該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項９のオリゴヌクレオチド。１１．；それらのＲＮＡ同等物であるＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.２６〜４３ならびに４５〜５０；およびＤＮＡならびにＲＮＡ同等物の相補配列であるＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.５２〜６９、７１〜７６ならびに７８〜９４ならびに９６〜１０１からなる群より選択される核酸配列を有し長さ２０ないし１００ヌクレオチドである単離オリゴヌクレオチド。１２．長さ２０ないし３５ヌクレオチドである請求項１１のオリゴヌクレオチド。１３．少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項１２のオリゴヌクレオチド。１４．該核酸配列を必須としてなる請求項１３のオリゴヌクレオチド。１５．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域を有し長さ２５ないし１００ヌクレオチドである治療上有効量の単離オリゴヌクレオチドおよび医薬上許容される担体からなる治療組成物であって、該オリゴヌクレオチドがインビボまたはインビトロにおいてＨＩＶの増殖を阻害するものである、患者におけるＨＩＶの増殖を阻害しうる治療組成物。１６．該オリゴヌクレオチドが長さ２５ないし３５ヌクレオチドである請求項１５の治療組成物。１７．該オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求項１６の治療組成物。１８．該オリゴヌクレオチドが少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項１７の治療組成物。１９．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域を有し長さ１８ないし１００ヌクレオチドである治療上有効量の単離オリゴヌクレオチドおよび医薬上許容される担体からなる治療組成物であって、該オリゴヌクレオチドがインビボまたはインビトロでＨＩＶの増殖を阻害するものである、患者におけるＨＩＶの増殖を阻害しうる治療組成物。２０．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域に作動可能に結合された転写認識部位からなり、該抗ＨＩＶ核酸配列が、インビボまたはインビトロにおいてＨＩＶの増殖を阻害するオリゴヌクレオチドをコードしているものである組み換え核酸。２１．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域を有し長さ１８〜１００ヌクレオチドであるＨＩＶ増殖低下に有効量のオリゴヌクレオチドであって、ＨＩＶの増殖を阻害するオリゴヌクレオチドにＨＩＶ感染細胞を接触させる工程からなるＨＩＶ増殖阻害または低下方法。２２．該オリゴヌクレオチドが長さ２０ないし３５ヌクレオチドである請求項２１の方法。２３．該オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求項２２の方法。２４．該オリゴヌクレオチドが少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項２３の方法。２５．該オリゴヌクレオチドが該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項２４の方法。２６．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域を有し長さ２５〜１００ヌクレオチドであるＨＩＶ増殖低下に有効量のオリゴヌクレオチドにＨＩＶ感染細胞を接触させる工程からなるＨＩＶ増殖阻害または低下方法。２７．該オリゴヌクレオチドが長さ２０ないし３５ヌクレオチドである請求項２６の方法。２８．該オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求項２７の方法。２９．該オリゴヌクレオチドが少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項２８の方法。３０．該オリゴヌクレオチドが該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項２９の方法。３１．からなる群より選択される抗ＨＩＶ核酸配列に実質的に対応する核酸配列領域を有し長さ１８ないし１００ヌクレオチドである治療上有効量のオリゴヌクレオチドであって、患者におけるＨＩＶの増殖を阻害するオリゴヌクレオチドを患者に投与する工程からなる、ＨＩＶ感染患者の治療方法。３２．該オリゴヌクレオチドが長さ２０ないし３５ヌクレオチドである請求項３１の方法。３３．該オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求項３２の方法。３４．該オリゴヌクレオチドが少なくとも５０％のホスホロチオエート結合を含む請求項３３の方法。３５．該オリゴヌクレオチドが該抗ＨＩＶ核酸配列を必須としてなる請求項３４の方法。