JPH10501548A - 血栓崩壊性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示された本発明は、天然のプラスミノーゲン、及び天然のトロンビンによる切断でプラスミン活性を生じる非天然プラスミノーゲン類似体を活性化し得る剤の投与による血栓崩壊の複合治療に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 血栓崩壊性組成物 この発明は、1つもしくは複数の血栓を持つ、又はそれを生じる危険性のある 患者に対する改良された血栓崩壊処置用製品及び方法に関する。詳しくは、本発 明は天然のプラスミノーゲン、及び天然のトロンビンによる切断でプラスミン活 性を生じる非天然のプラスミノーゲン類似体を活性化し得る剤の投与による血栓 崩壊の複合治療に関する。発明の背景 プラスミノーゲン活性化因子 天然のプラスミノーゲンを活性化し得る剤は公知であり、血栓崩壊の治療に用 いられ、臨床試験中であるか、又はその目的のために提案されている。そのよう な化合物の例には、組織型プラスミノーゲン活性化因子(tＰＡ)、ウロキナーゼ 、ストレプトキナーゼ及び繊維結合性唾腺プラスミノーゲン活性化因子(ＤＳＰ Ａ)があげられる。tＰＡ及びストレプトキナーゼを用いる静注処置は、急性心筋 梗塞による死亡率を減ずるのに成功している。 この成功にもかかわらず、入手可能な剤には欠点があるために、血栓崩壊に重 要な限界のあることが広く認識されている[Ｍarder及びＳherry、Ｎew Ｅngland Ｊournal of Ｍedicine,1989,318:1513-1520参照]。例えば、tPAは体から急速 に排出され、かつ臨床的に有用な投与量では血栓特異性が相対的に欠如する。急 速なtＰＡのクリアランスは、該タンパク質が大量に静注点滴で投与されなけれ ば ならないことを意味し、患者が病院に入るまで治療の開始を遅らせる。tＰＡの 急速なクリアランスと関連したさらなる問題は、tＰＡの投与を停止した時に一 般に生じる再灌流血管の再閉塞である。最後に、tＰＡの治療上の投与量の血栓 特異性の相対的な欠如により、出血の危険性が生じる。出血の危険性は、現在の 血栓崩壊剤が臨床的に有用な投与量では血栓に特異的でなく、かつ全身循環にお いてプラスミノーゲンを活性化してプラスミンを生じるため、それらに共通の問 題である。 ウロキナーゼも同様の急速な血漿クリアランスを有し、連続的な点滴による投 与を必要とする。 tＰＡの急速なクリアランスを克服するため、その半減期を増大させる多くの 試みがなされているが、臨床開発中のtＰＡの変異型はtＰＡの3-5倍の遅さで取 り除かれるにすぎないらしい[Ｔhromb.Ｈaemostas.66: 569-574,1991;Ｔhromb． Ｈaemostas.70:307-312,1993];tPAの血漿半減期はヒトでは約5分である[Ｂounam eauxら、“Ｃontemporary issues in Ｈaemostasis and Ｔhrombosis"vol.1 p5- 91,1985.カレンらが編集、Ｃhurchill Ｌivingstone]。これらtＰＡ変異型はボ ーラス(bolus)での投与及び/又は投与量の削減を可能にするかもしれないが、再 閉塞を妨げるのに有効なだけ長く循環中に残留することはないと考えられる。そ れらはまた出血の危険性を大きく減少させることはないと考えられるが、その危 険性は循環中の持続性のために増すかもしれない。 プラスミノーゲン活性化因子の臨床効率を改良する別の方法は、 抗凝固剤及び抗血小板剤を用いる補助治療を介するものである。ヘパリン及びア スピリンの補助使用でのtＰＡの治療効率の改良において、わずかながら成功が みられた。しかしながら、そのような治療法には、梗塞に関連した動脈の再疎通 について失敗率15-20％、再閉塞率5-10％という限界がある。その結果、30日で の再梗塞率は4-6％であり、患者の5-7％及び15-17％に心臓性ショック及び鬱血 性心臓麻痺がそれぞれ起こり、死亡率は5-8％の範囲である[Ａm.Ｊ.Ｃardiol.75 : 7-13 1995]。ヘパリン及びアスピリンの使用にもかかわらず、初期に血栓崩壊 を失敗し、かつ再閉塞を生じたことは、進行中のトロンビン活性の結果であると 考えられる。このため、より有効かつ選択的な剤が研究されている。ヒルジンは トロンビンの有効な阻害剤であり、動物モデルで血小板の沈着及び血栓形成の減 少においてヘパリンより優れていることを示し[Ｃirculation 79:657-665,1989] 、冠動脈血栓症のモデルで血栓崩壊を速くし、かつ再閉塞を減少させることがわ かった[Ｃirculation 83:1048-1056及びＣirclation Ｒesearch 70:829-834,199 2]。補助治療について、米国特許第4,944,943号は、tＰＡのような血栓崩壊剤と ヒルジンが示唆された唯一の例である抗血栓剤の使用を開示している。米国特許 第5,126,134号は、補助治療にtＰＡのようなプラスミノーゲン活性化因子とヒル ジンの使用を開示している。しかしながら、tＰＡの補助剤としてのヒルジンを 研究する3つの臨床試験が、出血の発生率が高いために1994年に中止された[Ｃir culation 90:1624-30，1631-37及び1638-42,1994]。さらに、これらの試験は 以前の水準より高いヘパリン投与量を研究し、それもまた出血発生率の増加に関 連していることを見い出した。したがって、トロンビン活性阻害剤を用いる補助 的な抗血栓治療の強化は、結果として好ましくない出血の増加を生じさせると思 われる。トロンビン活性可能なプラスミノーゲン変異体 特許公報ＷＯ91/09118及びＷＯ94/10318(ともにブリティッシュ バイオ-テク ノロジー リミテッド)は血栓症状の処置の新しい方法を記載しているが、それは 天然の凝血カスケードにそれ自身関係する酵素、特にトロンビンによる切断で活 性化され、プラスミン又はプラスミン様活性を生じるプラスミノーゲン変異体の 使用に基いている。そのような剤の1つの利点は、それらの血栓に対する特異性 にある。活性は血栓部位で特に凝縮されるトロンビンにさらされて生じるので、 血栓崩壊プラスミン活性は必要な場所で生じ、それにより系内の活性及び出血の 危険性を減ずる。そのような化合物は抗血栓の効果をも有することが予期される 。なぜなら、血栓形成の傾向は、その部位での剤のトロンビン切断で生じる血栓 崩壊プラスミン活性により妨げられるからである。天然のＧlu-プラスミノーゲ ンば2.2日の血漿半減期を有しており[Ｔhromb.Ｈaemostas.43:77-89 1980]、循 環中の持続性の延長により、トロンビン活性可能なプラスミノーゲンに、その作 用の血栓選択性を補完するさらなる利点を与えている。 ＷＯ91/09118及びＷＯ94/10318のトロンビン活性可能なプラスミノーゲン変異 体の有効性は、抗プラスミンに抵抗性を導入するこ とを目的としたＷＯ94/03614(ブリティッシュ バイオ-テクノロジー リミテッド )に開示されているさらなる変異体、すなわちプラスミンの同起源のセリンプロ テアーゼ阻害剤により高められるかもしれない。発明の概要 この発明は、上記の種のトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体が、系 内のプラスミン産生、したがって出血の危険性をあまり増大させずにtＰＡのよ うなプラスミノーゲン活性化剤の血栓崩壊活性を増加させることができるという 本願発明者の知見に基く。この知見は、プラスミノーゲン活性化因子のボーラス の投与すなわち治療の早期開始を可能にし;必要なプラスミノーゲン活性化因子 の有効投与量を減少させることにより、出血の危険性を減少させ;血栓の再形成 による開いた血管の再閉塞の発生率を低下させることにより、より有効な新しい 血栓崩壊治療の利用を可能にしている。発明の詳細な説明 本発明によれば、血栓崩壊の治療における同時、個別又は連続使用のためのプ ラスミノーゲン活性化因子及びトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体を 含む製品が提供される。 本発明は、プラスミノーゲン活性化因子及びトロンビン活性可能なプラスミノ ーゲン類似体の有効量の同時、個別又は連続的な静注投与を含む、血栓崩壊又は 抗血栓治療が必要な患者の処置方法をも含む。 本発明の別の態様によれば、： a)プラスミノーゲン活性化因子を用いる血栓崩壊治療が進行中である患者の処置 ;及び/又は b)該プラスミノーゲン活性化因子を用いる血栓崩壊治療が進行中である患者に必 要なプラスミノーゲン活性化因子の有効投与量の削減;及び/又は c)プラスミノーゲン活性化因子を用いる血栓崩壊治療が進行中である患者におけ る出血の危険性の低減 のための剤の製造におけるトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体の使用 が提供される。 そのような補助的抗血栓治療は、急性の血管疾患、例えば:心筋梗塞、卒中、 変性狭心症、肺動脈塞栓症、深静脈血栓症、末梢動脈閉塞、体外循環、動静脈吻 合及び他の静脈血栓形成の処置に用いられ、病理血栓の除去を促進させることが できる。 用語“プラスミノーゲン活性化因子”は、プラスミノーゲンを活性化し、プラ スミン型の血栓崩壊活性を生じる化合物を意味する。そのような化合物の例は、 tＰＡ、ＤＳＰＡ、ウロキナーゼのようなプラスミノーゲンを直接切断してプラ スミンを生じる化合物、及びプラスミノーゲンを切断してプラスミンを放出する 能力を失わない配列の変化を有するこれらタンパク質の変異体、ならびにストレ プトキナーゼのように、プラスミノーゲンと複合体を形成し、プラスミノーゲン 分子の切断によるプラスミンの放出を可能にする構造変化を引き起こす、プラス ミノーゲンを間接的に活性化す る化合物を含む。 用語“トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体”は、トロンビンによる 分子の切断でプラスミン又はプラスミン型活性を保持するプラスミンに実質的に 同一な分子を放出する配列変化を有することによって、野性型プラスミノーゲン とは異なる分子を意味する。トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体は、 天然のプラスミノーゲンと比較すると、プラスミノーゲン活性化因子により非効 率的に活性化される。トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体は、野性型 プラスミノーゲンに比較して、分子のトロンビン切断性及び切断生成物のプラス ミン活性にともに影響しない、又はトロンビン切断性及び切断生成物のプラスミ ン活性を保持しつつ分子にさらなる利益、例えばＷＯ94/03614に記載の抗プラス ミン抵抗性を付与する変異を与える配列変化を有していてもよい。 トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体は、上記のブリティッシュ バ イオ-テクノロジー特許公報に開示されている。トロンビンによる分子の切断で プラスミン活性を生じる変異は、野性型プラスミノーゲンの本来の切断部位に相 当する分子中の位置に、又はそれに近い位置にあることが好ましい。それと関連 して、プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンが790アミノ酸のタンパク質であ り、切断部位がＡrg(560)-Ｖal(561)のペプチド結合であることを示したＳottru p-Ｊensenらのタンパク質シークエンスの研究[Ａtlas of Ｐrotein Ｓequence a nd Ｓtructure(Ｄayhoff，Ｍ.Ｏ.編集)5増補 3,p95(1978)]の結果として番号付けされている。しかしながら、トロンビン活性 可能なプラスミノーゲン類似体の合成において、中間体として有用な好適なプラ スミノーゲンcＤＮＡはＦorsgrenらにより単離されており[ＦＥＢＳ Ｌetters 2 13:254-260(1987)]、65番目の位置に余分なＩleを持つ791残基のタンパク質をコ ードしている。この明細書では、プラスミノーゲンのアミノ酸番号は、Ｆorsgre nのcＤＮＡのそれに対応している。 本発明での使用に現在好ましいプラスミノーゲン活性化因子はtＰＡであるが 、監督当局によりヒトの治療に是認される場合には、ＢＭ 06.022[Ｍartin.Ｕ.e t al.Ｔhromb.Ｈaemostas.66: 569-574，1991]又はＴ103Ｎ.ＫＨＲＲ296-299Ａ ＡＡＡ[Ｐaoni Ｎ.Ｆ.et al．Ｔhromb．Ｈaemostas.70: 307-312,1993]として知 られるような“第２世代tＰＡs”が、より好ましいかもしれない。 本発明での使用に現在好ましいトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体 はＷＯ94/10318に開示されたそれらを含むが、それらはＰ3が塩基性アミノ酸残 基、Ｐ4が疎水性アミノ酸残基かつＰ1'とＰ2'のそれぞれが個々に非酸性アミノ 酸残基であるＰ4-Ｐ3-Ｐro-Ａrg-Ｐ1'-Ｐ2'の切断部位配列を有し、該部位はＡr gとＰ1'の間をトロンビンにより切断し得る。本発明での使用に特に好ましいト ロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体は、ＷＯ94/10318の実施例2に記載 されているようにＢＢ-10153であるが、これは野性型プラスミノーゲンと比較し て、アミノ酸残基Ｐro(559)、Ｇly(560)がＴhr-Ｔhr-Ｌys-Ｉle-Ｐroで置換され 、Ｖal(562)がＩleで置換され、トロ ンビンにより切断可能な切断ルーブを生じ;かつさらに2つのアミノ酸Ｇlu606が Ｌysに、Ｇlu623がＬysに置換し、α2-抗プラスミンの結合が損なわれるプラス ミノーゲン類似体である。 本発明の製品において、プラスミノーゲン活性化因子及びトロンビン活性可能 なプラスミノーゲン類似体は、規制要件及び/又は製品の品質管理の理由で、単 位投与量形態で、特に別々の静注ボーラス注射用に個別包装されることが好まし い。標準的な注射用タンパク質製剤技術により、好適な単位投与量製剤の製造が 可能である。tＰＡの単位投与量濃度は一般に0.05-1.5mg/kg体重、好ましくは0. 1-0.5mg/kg体重の範囲にあり、トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体の 単位投与量濃度は一般に0.1-5mg/kg体重、好ましくは0.5-3mg/kgの範囲、より好 ましくは2mg/kg体重であろう。 ヒトに対するトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体ＢＢ-10153の最大 投与量は、一般に5mg/kg以下であろう。 また、製造に用いられる製剤技術により2つの成分の十分な安定化及び保存が 可能であれば、本発明の製品はプラスミノーゲン活性化因子及びトロンビン活性 可能なプラスミノーゲン類似体の混合物の単一の単位投与量を含んでいてもよい 。 ヒトの患者の処置について、個々の治療上、tＰＡは当初3時間にわたる静注点 滴により100mgを投与量として与えられていた。これは今では15mgの静注ボーラ スの投与、続いて30分にわたる0.75mg/kg体重の静注点滴(最大50mg)、次いで60 分にわたる0.5mg/kg の点滴(最大35mg)からなる短縮した方式によって、取って替わられている[Ｊ.Ａ m.Ｃoll.Ｃardiol.14:1566-1569,1989及びＮ.Ｅng.Ｊ.Ｍed.329:673-682,1993] 。tＰＡは50mgの静注ボーラス注射2回で有効であると最近報告されているが、単 一の静注ボーラスとしては有効でない[Ｊ.Ａm．Ｃoll.Ｃardiol.23:6-10,1994] 。長時間作用するtＰＡ変異型であるレテプラーゼ(reteplase)(ＢＭ06.022)は、 1千万単位(ＭＵ)の静注ボーラスを２回、その30分後に5ＭＵを投与される[Ａm. Ｊ.Ｃardiol.72:518-524，1993]。 ストレプトキナーゼは、1時間にわたる静注点滴により150万単位の投与量とし て投与される。 投与するプラスミノーゲン活性化因子及びトロンビン活性可能なプラスミノー ゲン類似体の有効投薬量は、現在の投薬量についての知識及びtＰＡ投与量の可 能な削減に基いて、医師によって決定される。 発明者は、動物研究から、tＰＡ投与量の3倍又はそれ以上の削減は、補助的な トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体ＢＢ-10153を用いて、両方の剤の 静注ボーラスとしての投与を一般に可能にすることを見い出している。同様の削 減は、他のプラスミノーゲン活性化因子を用いても予期される。したがって、ト ロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体の補助投与は、プラスミノーゲン活 性化剤の単一のボーラスとしての投与を可能にするかもしれない。 現在のいずれの方法においてもtＰＡの最大投与量は100mgであ る。トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体の共投与により、有効な全t ＰＡ投与量は80mg、好ましくは70mg、60mg、50mg、40mg、35mg、30mg、20mg又は 10mgに減少できる。 トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体の共投与により、有効な全レテ ブラーゼtＰＡ投与量は12ＭＵ、好ましくは10ＭＵ、8ＭＵ、7ＭＵ、6ＭＵ、5Ｍ Ｕ、4ＭＵ、3ＭＵ、2ＭＵ又は1.5ＭＵに減少できる。同様の全投与量の削減は、 Ｔ103Ｎ.ＫＨＲＲ296-299ＡＡＡＡとして知られるものを含む他の“第２世代tＰ Ａs”にもなし得る。 トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体の共投与により、有効な全スト レプトキナーゼ投与量は1.2ＭＵ、好ましくは1ＭＵ、0.8ＭＵ、0.7ＭＵ、0.6Ｍ Ｕ、0.5ＭＵ、0.4ＭＵ、0.3ＭＵ、 0.2ＭＵ又は0.15ＭＵに減少できる。 プラスミノーゲン活性化因子及びトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似 体が静注ボーラス注射によりそれぞれ別々に投与される場合、投与の順序は重要 ではない。プラスミノーゲン活性化因子を最初に、次いでトロンビン活性可能な プラスミノーゲン類似体を投与することが好ましいかもしれない。 トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体及びtＰＡ剤が別々に投与され る場合は、最初の剤の投与1-30分後、好ましくは約10分後、より好ましくは約5 分後に最初の剤が投与されてよいと考えられる。 プラスミノーゲン活性化因子及びトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似 体は、静注点滴によって、2つの成分を別々の供 給源から、又は(その製造に用いられる製剤技術が、2つの成分の効力の十分な安 定化及び保存を可能にしているならば)混合成分を単一の供給源から投与しても よい。 同時投与は、2つの物質を同時に投与し得る装置を用いて影響されてもよい。 また、同時投与はトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体又はtＰＡのど ちらかの一方を先に投与することを含むと考えられ、もう一方の成分をそのすぐ 後に投与してもよい。この明細書中で“すぐに”は、最初の成分の投与後1分ま でのあらゆる時間を意味する。 また、プラスミノーゲン活性化因子又はトロンビン活性可能なプラスミノーゲ ン類似体の一方を静注点滴によって投与し、もう一方を静注ボーラス注射によっ て投与してもよい。 本発明の1つの具体例を、以下の実施例により例証するが、この実施例は発明 を制限するものではない。実施例 トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体の製造 トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体ＢＢ-10153の設計、構造、発現 及び精製はＷＯ94/10318に記載されている。 ＢＢ10153は、アミノ酸残基Ｐro(559)、Ｇly(560)がＴhr-Ｔhr-Ｌys-Ｉle-Ｌy s-Ｐroで置換され、かつＶal(562)がＩleにより置換されてトロンビンにより切 断可能な切断ループを生じ;さらにＧlu606からＬysへ及びＧlu623からＬysへの2 つのアミノ酸置換がα2-抗プラスミンの結合を損なわせるプラスミノーゲン類似 体である。静注tＰＡ及びＢＢ-10153の補助効果についての生物学的試験 tＰＡ及びトロンビン活性可能なプラスミノーゲンＢＢ-10153の血栓崩壊活性 は、大腿動脈中の血栓形成が銅線のコイル(銅は血栓形成の強力な刺激物である) の挿入によって誘導されるうさぎの動脈血栓モデルで測定した。血液流は、超音 波フロープローブ(flow probe)メーターによりコイルのすぐ遠位でモニターした 。 雄のニュージーランドホワイトラビット2.5-3.0kgを、17.5mg/mlのペントバル ビトン溶液を35mg/kgの添加投与量で静注注射(耳の静脈)し麻酔にかけた。静脈 カニューレを装着し、ペントバルビトンを18mg/kg/hr(点滴速度2ml/hr)で実験の 間中注入した。麻酔をかけたうさぎの気管にカニューレを挿入し、動物に人工的 に呼吸させた。呼吸終期ＣＯ₂は6％に設定し、吹き込む空気は酸素を補給した。 一方は麻酔注入、他方は試験化合物の濃縮塊投与のため、両方の頸静脈にカニュ ーレを挿入した。左の頸動脈は血圧及び心 拍を記録するためにカニューレを挿入した。 両肢からの大腿動脈は周辺組織から切り離し、確実に側枝を外した。腹壁切開 を行ない、大動脈が回腸動脈に分岐する位置の上部で腹膜を開けた。フロープロ ーブ(2ＳＢ Ｔransonic)は、側回旋動脈及び浅腹壁動脈(浅腹壁より約2-3cm遠位 )より遠位の左大腿動脈中に設置した。次いで、重炭酸塩約5mlを任意のアシドー シスを正すために与えた。血液サンプルを採取し、pH(7.35-7.45)及び血液ガスp Ｏ₂(100-120mmＨg)及びpＣＯ₂(35-45mmＨg)を調べた。21径のニードルの周りに 直径0.5mmのワイヤーを10回転させた銅コイルを血栓の誘導に用いた。コイルは 、側回旋動脈のすぐ遠位で、右大腿動脈のカニューレ挿入によるフロープローブ より近位の左大腿動脈中に置いた。コイルとプローブ間の枝を接合した。カニュ ーレはコイルを右の回腸動脈、次いで大動脈に上げるのに用い、血液により左の 回腸動脈、次いで大腿動脈に運ばせた。コイルは、最終的にピンセットを用いて 固定した。血液流は、超音波フロープローブメーターにより大腿動脈中のコイル のすぐ遠位でモニターした。左大腿動脈を通る血液流は血管にコイルを置いて5 分以内で停止し、流停止後30分で処置を開始した。複合治療には、ＢＢ-10153を 静注濃縮塊の注射として最初に与え、その5分後にまた濃縮塊としてtＰＡを与え た。1.0mlの血液サンプルを分析前及び薬剤投与0.5、1、2、3及び4時間後の頸動 脈から採取した。サンプルの血液凝固は、3.8％w/vのクエン酸三ナトリウム(10 中1部)で阻止した。サンプルを14000回転/分で10分間回転し、次いで血漿 を用いて出血タンパク質を測定した（方法参照）。t ＰＡの血栓崩壊活性 3mg/kgのtＰＡ(アクチライズ(actilyse)、ベーリンガーインゲルハイムから購 入)は、4/6の動物に長い再灌流を、残りの2匹に短い再灌流を生じた。1mg/kgのt ＰＡは、2/8の動物に有意な再灌流を誘導したが、他の6匹では再灌流はなかった 。0.3mg/kgのtＰＡはどんな有意な再灌流も誘導しなかった。ＢＢ-10153の血栓崩壊活性 ＢＢ-10153は、4mg/kgまでの投与量で投与された時、閉塞した大腿動脈の再灌 流を誘導しなかった。t ＰＡ及びＢＢ-10153の複合処置の血栓崩壊活性 tＰＡの血栓崩壊力は、ＢＢ-10153の共投与によりかなり増加した。1mg/kgのt ＰＡと2mg/kgのＢＢ-10153の複合は、4/6の動物に長時間再灌流を誘導し、1匹に 有意だがより短時間の再灌流を、1匹に短時間の流れを数回誘導した。このパタ ーンは、3mg/kgのtＰＡにより生じるパターンに類似していた。0.3mg/kgのtＰＡ と2mg/kgのＢＢ-10153の複合は、3/4の動物に相当時間流れを誘導した。血漿α2-抗プラスミン及びフィブリノーゲンレベルにおけるtＰＡ及びＢＢ-1015 3の効果 ＢＢ-10153の共投与によるtＰＡの血栓崩壊力の増加は、プラスミンの系内の 生成に有意な増加を伴わなかった。3mg/kgのtＰＡは、コントロールの20％未満 への血漿α2-抗プラスミン(α2-ＰＩ)レベルの低下及びコントロールの約25％へ の血漿フィブリノーゲンレ ベルの低下により実証されるように、系内のプラスミンの生成をもたらした。1m g/kgのtＰＡは、α2-ＰＩ及びフィブリノーゲンのレベルをそれぞれコントロー ルの約60％及び75％に低下させた。2mg/kgのＢＢ-10153は、血漿α2-ＰＩ及びフ ィブリノーゲンのレベルに影響しなかった。1mg/kgのtＰＡと2mg/kgのＢＢ-1015 3の複合は、1mg/kgのtＰＡだけで生じた系内プラスミン活性と比較して、小さな 増加を生じたにすぎなかった。 0.3mg/kgのtＰＡはα2-ＰＩ及びフィブリノーゲンのレベルにほとんど影響せ ず、これは0.3mg/kgのtＰＡと2mg/kgのＢＢ-10153の血栓崩壊複合で変化しなか った。方法 出血タンパク質 全ての測定は、インストルメンテイションラボラトリーズのＡＣＬ300Ｒ凝血 計で行なった;凝血計はＰＣ及び関連ソフトウェア(リサーチソフトウェア)を備 えていた。凝血試験用の全試薬及びキットは、インストルメンテイションラボラ トリーズより購入した。α2-抗プラスミン アッセイは、凝血計に備えられた標準的なキットと抗プラスミン試験用の既定 説明を用いて行なった。フィブリノーゲン Ｃlaussの方法の改良型を用いた[Ｃlauss.Ａ，Ａcta Ｈaematol.17:237 1957] 。較正血漿を用いて検量線(凝血時間に対するフィブリノーゲン濃度の逆数)をつ くった。検量線用の血漿は、インストルメ ンテイションラボラトリーズ(ＩＬ)より得た。濃度は2.95、1.475、0.98、0.737 5、0.59及び0.295g/l(ストックからの希釈率はストック、1:2、1:3、1:4、1:5及 び1:10)。試験血液サンプル中のフィブリノーゲンは、トロンビンの時間アッセ イの結果を用いて検量線から決定した(以下参照)。データ分析は、ＡＣＬ300Ｒ 凝血計で行なうためＩＬが供給するリサーチソフトウェアを用いてＰＣで行なっ た。トロンビンの時間 トロンビンを100mmolのＣaＣl₂で3ＮＩＨＵ/mlの濃度にする改良をして、標準 的なキットを用いた。アッセイは研究モード(すなわち1凝血サイクル)の設定− サンプル及び試薬量75μl、活性時間180秒、勾配間間隔1秒、捕捉時間300秒、速 度1200rpmで行なった。パス マット デフ(Ｐath ｍatt.def)(Ｓ/ＲＸ100.Ｓ4.Ｓ 4.閾値(3.50))を用いて、分析した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウッド ラーズ マイケル イギリス国、オーエックス４ ５エルワ イ、オックスフォード カウリー、ウォト リントン ロード（番地なし）ブリティッ シュ バイオテック ファーマシューティ カルズ リミテッド (72)発明者 カマー マイケル ビリスフォード イギリス国、オーエックス４ ５エルワ イ、オックスフォード カウリー、ウォト リントン ロード（番地なし）ブリティッ シュ バイオテック ファーマシューティ カルズ リミテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血栓崩壊の治療における同時、個別又は連続使用のためのプラスミノーゲン 活性化因子及びトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体を含む製品。 ２．プラスミノーゲン活性化因子及びトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類 似体の有効量の同時、個別又は連続的な静注投与を含む、血栓崩壊又は抗血栓治 療の必要な患者の処置法。 ３．a)血栓崩壊治療が進行中である患者のプラスミノーゲン活性化因子を用いる 処置;及び/又は b)該プラスミノーゲン活性化因子を用いる血栓崩壊治療が進行中である患者 に必要なプラスミノーゲン活性化因子の有効投与量の削減;及び/又は c)プラスミノーゲン活性化因子を用いる血栓崩壊治療が進行中である患者に おける出血の危険性の低減 のための剤の製造におけるトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体の使用 。 ４．プラスミノーゲン活性化因子がtＰＡである請求項1記載の製品、請求項2記 載の方法又は請求項3記載の使用。 ５．トロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体が、Ｐ3が塩基性アミノ酸残 基、Ｐ4が疎水性アミノ酸残基かつＰ1'とＰ2'のそれぞれが個々に非酸性アミノ 酸残基であるＰ4-Ｐ3-Ｐro-Ａrg-Ｐ1'-Ｐ2'の切断部位配列を有し、該部位がＡr gとＰ1'の間をトロンビンにより切断し得る請求項1記載の製品、請求項2記載の 方法又は請求項3記 載の使用。 ６．本発明の使用のためのトロンビン活性可能なプラスミノーゲン類似体がＢＢ -10153である請求項5記載の製品、方法又は使用。