JPH10501690A - 同種移植の寛容性を誘導するためのキメラｍｈｃクラスｉ抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 キメラＭＨＣクラスＩ分子は、受容体型Ｎ末端、ドナー型アルファ−１螺旋領域、及び受容体型アルファ−２ドメインを有しており、該分子は、移植時に受容体に投与されると、ドナー移植片に対する寛容性を誘導する。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称：同種移植の寛容性を誘導するためのキメラ ＭＨＣクラスＩ抗原 発明の分野 本発明は、組換え型の主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)分子、特に同種〔異系〕 移植片(allograft)の寛容性(tolerance)を誘導できるようにしたキメラＭＨＣク ラスＩの分子に関するものである。本発明はまた、移植を受ける者に対し、自己 型の調節ドメインと、ドナー型の免疫原性ドメインを有するキメラＭＨＣクラス Ｉ分子を投与することにより、移植された同種〔異系〕移植片の寛容性を誘導す る方法に関する。 発明の背景 主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)は、ほぼ全細胞の表面にみられる多形性(polym orphic)細胞膜の糖蛋白質である組織適合性抗原を含んでいる。個体は、個体群 の中の非常に数多くの対立遺伝子(alleles)から多形性形態を同時に発現する。 移植された異質な組織に対する拒絶反応は、抗体とクラスＩの組織適合性抗原が 細胞障害性リンパ球(ＣＴＬ)を認識することによって起こされる。Ｔ細胞受容体 は、異なる抗原のうち、特定の組織適合性抗原分子と関連するものだけを認識す る。 当該分野の専門家にとって公知のことであるが、ＭＨＣ分子は細胞内異質ペプ チド抗原と結合し、結合された抗原を細胞膜の表面に運搬し、Ｔ細胞による認識 のための抗原として存在する。Ｔ細胞が抗原結合ＭＨＣ分子を認識すると、次に 免疫反応のカスケード(cascade)を開始する結果になる。 器官移植においては、外科技術の多大な進歩、新薬の開発にもかかわらず、器 官移植を受ける者は大部分が、今なお拒絶反応の危険にさらされている。拒絶反 応を防止するために現在行なわれている治療は、広範囲に亘る免疫抑制薬に頼っ ている。その薬剤として、例えば、サイクロスポリンＡ(ＣｓＡ)があるが、この 薬の場合、患者は生涯摂取し続けなければならない。このように長期に亘って免 疫抑制を続けると、日和見感染、癌、薬剤特有の毒素性などを併発する結果とな る。それゆえ、手術期間(perioperative period)だけ投与する治療システムを開 発すれば、長期間に亘る免疫抑制の影響を回避することができるので大いに有用 である。 ＭＨＣ分子を利用して器官移植の拒絶反応を緩和することはこれまでにも試み られているが、従来の方法はドナー型のＭＨＣ抗原を発現するドナー細胞を全部 投与するものである。この方法では、同種〔異系〕抗原(alloantigen)を手術前 に投与する必要がある。それゆえ、移植時のかなり前からドナーを特定せねばな らないため、 臨床的な適用可能性が限られる。移植時に投与できる有効な治療システムの開発 が望まれる所以である。 発明の要旨 ＭＨＣクラスＩ分子の中に、免疫反応を生起させるのに重要で特異な機能性ド メインが含まれていることを見い出したものである。優性で同種異系(allogenic )のエピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子のアルファ−１ドメインの螺旋部分に存 在し、亜優性(sub-dominant)の同種異系エピトープは、アルファ−１ドメインの Ｎ−末端に存在している。予期せぬことであったが、アルファ−２ドメインは免 疫原性配列(immunogenic sequences)を欠いているが、異質(foreign)な抗原を認 識するのに重要な調節機能を果たすことがわかった。ドナー型の免疫優性アルフ ァ−１の螺旋状エピトープを、野生型(受容体)免疫優性エピトープと置換すると 、受容体型のアルファ−１Ｎ−末端とアルファ−２ドメイン配列によってフラン クされる時、免疫原性のあるＭＨＣクラスＩ分子は免疫寛容原(tolerogen)に変 換される。トランスフェクトされた(transfected)細胞で、これらの「準自己型( quasi-self)」のキメラＭＨＣクラスＩ分子をもった細胞の抽出物を、移植を受 ける者に投与し、その際、サイクロスポリン(ＣｓＡ)を７日クールで投与すると 、ドナー固有の移植寛容性を誘導した。このキメラ分子は、同種移植片の寛容性 を誘導し、臨床的に関連づけられたシステム を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、ＢＵＦ肝癌細胞におけるＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aを表わす発現ベクター(exp ression vector)の説明図である。ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aを符号化する遺伝子は、Ｓ Ｖ４０プロモータおよびエンハンサーを含むｐＳＧ５哺乳動物の発現ベクターの ＥｃｏＲＩ部位にて、適切な方向にサブクローン化された。 図２は、フルオレセインの蛍光色素を有するラビットの抗ラットＩｇＧ抗体( ２５０倍に希釈；白い部分)にさらすことにより、又はプリコートされた(pre-co ated)抗ＲＴ１^a抗体(濃い部分)を用いて、標準の細胞の表面と、トランスフェク トされた７３１６Ａ ＢＵＦ肝癌細胞(hepatoma；ヘパトーム)の表面で検出され たＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aのグラフである。染色された細胞の割合を夫々の図の中で示 している。 図２Ａは、トランスフェクトされていない(non-transfected)肝癌細胞であっ て、多クローン性抗ＲＴ１^a抗体にさらされた肝癌細胞を示している。 図２Ｂは、トランスフェクトされていない肝癌細胞であって、Ｒ２／１５Ｓ抗 ラットＲＴ１.Ａ^aクラスＩの多形性モノクローン抗体にさらされた肝癌細胞を示 している。 図２Ｃは、トランスフェクトされていない肝癌細胞で あって、ＭＲＣ ＯＸ１８抗ラットＲＴ１ＡクラスＩ単形性(monomorphic)モノク ローン抗体にさらされた肝癌細胞を示している。 図２Ｄは、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aでトランスフェクトされ、多クローン抗ＲＴ１^a 抗体にさらされた肝癌細胞を示している。 図２Ｅは、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aでトランスフェクトされ、Ｒ２／１５Ｓ抗ラット ＲＴ１.Ａ^aクラスＩ多形性モノクローン抗体にさらされた肝癌細胞を示している 。 図２Ｆは、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aでトランスフェクトされ、ＭＲＣ ＯＸ１８抗ラ ットＲＴ１ＡクラスＩ単形性モノクローン抗体にさらされた肝癌細胞を示してい る。 図３は、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aのトランスフェクタント(transfectants)によるＡ ＣＩ(ＲＴ１^a)に対する用量依存性免疫のグラフである。ＷＦ(ＲＴ１^u)ラットに 、ＡＣＵ心臓移植の７日前に１０⁵〜２×１０⁷細胞を注射した。水平な破線は、 注射を受けていないＷＦ受容体におけるＡＣＩ移植片の平均生存日数を示してい る。図中の黒丸は皮下注射、黒四角は静脈注射、黒菱形は門脈注射を示している 。白丸は、皮下投与された正常な肝癌細胞を表わしており、白四角は静脈注射、 白菱形は門脈注射を示している。 図４は、クラスＩＲＴ１.Ａ^aの略説明図であって、キメラ置換部位を示してい る。Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^aは、 最初の２０アミノ酸の配列(最初のベータストランドとループ)をＨＬＡ−Ａ２. １の配列に変換するＮ−末端において、４種類の残基変化(５、９、１１及び１ ７にて)を含んでいる。α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aは、α−１ドメインの(５８、６ ２、６３、６５、６６、６９、７０、７３、７７、８０の位置で)αヘリックス( ５１〜９０)の中に１０のアミノ酸変化を含んでおり、この領域はＲＴ１.Ａ^uの アミノ酸に変換される。α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aキメラは、最初のベータストラ ンドと、α−２ドメイン(９１〜１８２)のαヘリックス(９７、１０５、１４８ 、１５１、１５２、１６９、１７４、１８２の位置)に沿って、８個のアミノ酸 変化を含んでおり、このドメインをＲＴ１.Ａ^uのドメインに変換させる。ＴＭは トランス膜(trans-membrane)ドメインであり、ＣＹＴは細胞質ドメインである。 図５Ａ−Ｃは、ＰＣＲ遺伝子をＳＯＥすることにより変換されたＲＴ１.Ａ^aの ＣＤＮＡの生産を示す一連の写真である。変化したアミノ酸の位置は、各レーン の上に示されている。 図５Ａは、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^aの産物を示している。ＰＣＲ＃１、１４０ 塩基対(レーン２)と、ＰＣＲ＃２、１４９０塩基対(レーン３)の重複産物が、Ｐ ＣＲ＃３(レーン４)の中でＳＯＥ操作されている。 図５Ｂは、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aの産物を示してい る。ＰＣＲ＃１、３００塩基対(レーン２)と、ＰＣＲ＃２、１３１０塩基対(レ ーン３)の重複産物が、ＰＣＲ＃３(レーン４)の中でＳＯＥ操作されている。 図５Ｃは、α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aの産物を示している。４００、１５０、１ ２０及び９９０塩基対(レーン２〜５)の４種類の重複ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ＃５ (レーン６)の中で共にＳＯＥ操作されている。 図６は、キメラＮ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^a及びα−２ ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aのヌクレオチド配列を示している。ｃＤＮＡの全長は、２つの 方向に配列されている。図示の配列は、変換されたアミノ酸残基と、対応するヌ クレオチドの変化(アンダーラインが付されている)だけを表わしている。ドット 印は、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^a配列から変化の無かったことを示している。 図７は、トランスフェクトされたＢＵＦ肝癌細胞の細胞表面に検出されたキメ ラＲＴ１.Ａ^aを示すグラフである。ＲＴ１.Ａ^aのｃＤＮＡは、フルオレセインの 蛍光色素を持ったラビットの抗ラットＩｇＧ抗体(２５０倍に希釈)にさらされた もので、多クローン性の抗ＲＴ１.Ａ^a(８倍に希釈)抗体でプリコーティングした もの(濃く示される)と、していないもの(白く示される)がある。 図７Ａは、トランスフェクトされていない肝癌細胞に検出されたＲＴ１.Ａ^aを 示している。 図７Ｂは、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aでトランスフェクトされ た細胞に検出されたＲＴ１.Ａ^aを示している。 図７Ｃは、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aでトランスフェクトされた細胞に検出され たＲＴ１.Ａ^aを示している。 図７Ｄは、α−１ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aでトランスフェクトされた細胞に検出され たＲＴ１.Ａ^aを示している。 図７Ｅは、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^aでトランスフェクトされた細胞に検出され たＲＴ１.Ａ^aを示している。 図８は、ＷＦ宿主におけるキメラＲＴ１.Ａ^a抗原の免疫原性を示すグラフであ り、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)に対して免疫が用量依存性であることを表わしている。Ｗ Ｆラットは、ＡＣＩの心臓移植片攻撃を行なう７日前に、１０⁵〜２×１０⁷細胞 の皮下注射が行なわれた。平均生存時間は、日数で計算した。各グループには、 ５匹以上のラットを用いた。水平破線は、注射をしなかったＷＦ受容体における ＡＣＩ移植片の平均生存時間(５.４±０.５日)を表わしている。水平実線(５０ ％指数)は、生存時間が５０％縮まったことを表わしている。ＡＣＩ脾細胞(黒三 角)の皮下注射により、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^a(黒丸)のトランスフェクタントよりも ２.６倍、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a(黒四角)のトランスフェクタントよりも７.６ 倍、免疫原性が大きくなることを示した。キメラα−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^a(白四角 )、α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^a(白菱形)、トランスフェクトされていない肝癌細胞( 黒菱形)は、免疫原性能力を示さなかった。 図９は、２×１０⁷個のＡＣＩ脾細胞(黒三角)、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aのトランス フェクタント(黒丸)、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^aのトランスフェクタント(黒四角) 、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aのトランスフェクタント(白四角)、α−２ｄ^u−ＲＴ１ .Ａ^aのトランスフェクタント(白菱形)、トランスフェクトされていない肝癌細胞 (黒菱形)の投与を７日間続けた後のＷＦラットと、処理が行われず(non-treated )実験を受けていない(naive)宿主(白丸)から得たリンパ腺細胞の中の抗ＡＣＩ( ＲＴ１^a)の細胞障害性Ｔ細胞の頻度(frequency)を示すグラフである。データは 、限界希釈分析により作成した。 図１０Ａ−Ｃは、ＡＣＩ脾細胞又はキメラＲＴ１.Ａ^aトランスフェクタントで 処理されたＷＦラットの中で作られた抗ＲＴ１^a同種抗体(alloantibody)を示す グラフであり、ＡＣＩ脾細胞は黒三角、トランスフェクタントは、ＷＴ−ＲＴ１ .Ａ^aを黒丸、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^aを黒四角、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aを白四 角、α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aを白菱形で示している。比較対照となる標準の血清 は、処理が行なわれず実験を受けていない宿主(白丸)又はＡＣＩ心臓(白菱形)の ＷＦ拒絶体(rejectors)から得たものである。 図１０Ａは、ＩｇＧを結合する同種抗体の存在を示している。データは、チャ ンネルシフト(mean channel shift)の平均として与えられている。 図１０Ｂは、ＩｇＭを結合する同種抗体の存在を示している。データは、チャ ンネルシフトの平均として与えられている。 図１０Ｃは、抗ＡＣＩの細胞障害性同種抗体の存在を示している。データは、 特異的溶菌(specific lysis)の％として与えられている。 図１１は、ＷＦ(ＲＴ１^u)心臓の同種移植片のＡＣＩ(ＲＴ１^a)受容体を生体内 (インビボ)で免疫する際、ＡＣＩ宿主の中のキメラＲＴ１.Ａ^a抗原を皮下注射し たときの効果を示すグラフである。ＡＣＩラットは、注射されていないものを破 線で示し、ＷＦ(ＲＴ１^u)の心臓移植片の攻撃を行なう７日前に、ＷＴ−ＲＴ１. Ａ^a(黒丸)、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a(黒四角)、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^a(白四角) 、α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^a(白菱形)のトランスフェクタント又はＷＦ脾細胞(黒菱 形)で免疫性が与えられた。 図１２は、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^a(黒丸)、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a(黒四角)、α− １ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^a(白四角)、α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^a(白菱形)のトランスフェク タント、ＷＦ脾細胞(黒菱形)を皮下注射した後のＡＣＩラット、又は皮下注射し ていない宿主(白丸)から得られたリンパ腺内の抗ＷＦ(ＲＴ１^u)細胞障害性Ｔ細 胞の頻度を示すグラフである。データは、限界希釈分析により得られた。 図１３は、サイクロスポリン(cyclosporine)と結合されたｅ−ＨＡｇ−キメラ を移植中に投与することにより誘導された寛容性を示すグラフである。ＷＦ(Ｒ Ｔ１^u)のＡＣＩ(ＲＴ１^a)受容体は、注射処理されないもの(破線)と、ＣｓＡだ けを７日クール(7 day course)で経口投与したもの(実線)と、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^a (黒丸)、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a(黒四角)、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^a(白四角)、 α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^a(白菱形)のトランスフェクタント、ＷＦ肝細胞(黒矢印) から得られたｅ−ＨＡｇを一回注射したもの、トランスフェクトされていないＢ ＵＦ肝癌細胞(黒菱形)がある。 望ましい実施例の詳細な説明 ＭＨＣクラスＩ分子 主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)のクラスＩ移植抗原は、細胞表面の糖蛋白質で あり、抗原を細胞障害性Ｔ細胞に供給する。それらは、ヘテロダイマー(heterod imeric)であり、多形性で、ＭＨＣ符号化され、約４５ＫＤの重鎖からなり、こ れは約１２ＫＤのβ−２ミクログロブリン(β−２ｍ)の軽鎖とは共有結合してい ない。マウスのＨ−２系とヒトのＨＬＡ系について、ラットのＲＴ１系と同じ様 に考察した。クラスＩ分子の幾つかの対立遺伝子型の中で、ただ一つ、各々の種 (species)の中に移植片の生存に影響を及ぼすものがあった(ヒトでは、ＨＬＡ− Ａ、Ｂ；マウスでは、Ｈ−２Ｋ、Ｄ；ラットではＲ Ｔ.１Ａ)。 ＭＨＣクラスＩ重鎖の細胞外部分は、アルファ−１、アルファ−２及びアルフ ァ−３の３つのドメインに分化され、各ドメインは、約９０アミノ酸長さであり 、別個のエクソンに符号化されている。アルファ−３ドメインとベータ−２ｍは 、比較的保存がよく、免疫グロブリンの一定ドメインに対してアミノ酸配列が相 同性であることを示している。多形性のアルファ−１とアルファ−２のドメイン は、免疫グロブリンの一定領域又は可変領域に対する配列の相同性をあまり示し ていないが、互いには配列の相同性を少し有している。細胞膜端部の多形性アル ファ−１(約９０アミノ酸)ドメインとアルファ−２(約９２アミノ酸)ドメインは 、各々が、非平行で、ベータ構造のひだ状のシートを４枚含んでおり、それらは 、一つのアルファ螺旋領域(第１の領域は、アルファ−１ドメインからのもの、 第２の領域は、アルファ−２ドメインからのもの)により、境界を成している。 アルファ−２ドメインは、多形度が少なく、アルファ−３(約９２アミノ酸)ドメ インの細胞膜基部に取り付けられており、その後には、保存されたトランス膜( ２５アミノ酸)と細胞質内(約３０アミノ酸)セグメントがある。ラット、マウス 、及びヒトのクラスＩＭＨＣ分子は、公知の様々なＭＨＣクラスＩ分子のヌクレ オチド配列に基づいて、同様な構造的特徴を有するものと考えられる。 ＭＨＣクラスＩ分子の構造と機能については、例えば、文献［Matsumura et a l.，1992，Science 257:927-934; Bjorkman and Parham，1990，Annu ．Rev．Bio chem. ，59:253-288; and Germain，1994，Cell，76:287-299］を参照することが できる。免疫優性エピトープ アルファ−１ドメインは、アルファ−１螺旋領域及び亜優性のＮ末端の同種異 系決定基(allogenic determinant)の中に、免疫優性、免疫原性のエピトープを 含んでいることを示した。アルファ−２ドメインは、免疫原性エピトープを含ん でいない。 免疫優性で免疫原性のエピトープがアルファ−１螺旋領域に含まれていること は、次の実験によって示された。ＲＴ１.Ａ^a分子のキメラ突然変異体は、アルフ ァ−１螺旋領域を、ＲＴ１.Ａ^u遺伝子シーケンスの対応するアルファ−１螺旋領 域と置換することにより作られた。このキメラ遺伝子から作られた蛋白質は、Ｒ Ｔ１^b(ＢＵＦ)の宿主を、ＡＣＩ移植片をもった被移植ＲＴ１.Ａ^aの方に感作す る(sensitize)ことはできなかった。これは、同じキメラペプチドが、ＲＴ１^b( ＢＵＦ)の宿主を、ＲＴ１.Ａ^u抗原を発現するＷＦｕ同種移植片の方に感作した ことと対比される。アルファ−１^aの螺旋エピトープを含んだ追加のキメラは、 ＡＣＩ移植片に対してＢＵＦの宿主とＷＦｕの宿主の両方を免疫にした。亜優性免疫原性エピトープ アルファ−１ドメインのＮ末端セグメントに亜優性の免疫原性エピトープの存 在することが次の実験によって示された。野生型ＲＴ１.Ａ^a遺伝子は、Ｎ末端エ ピトープ(約２０アミノ酸)をヒトＨＬＡ−２.１配列の対応するＮ末端エピトー プと置換することによって変更された。この置換の結果、ＷＦｕ宿主の場合、Ｒ Ｔ１^a(ＡＣＩ)に対する免疫原性が低下し、Ｎ末端における免疫原性エピトープ の存在を示した。しかし、Ｎ末端^aエピトープだけがＲＴ１.Ａ^aキメラの中に存 在し、このキメラには、アルファ−１^a配列が対応するアルファ−１^u配列と置換 されており、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)移植片に対してＢＵＦ(ＲＴ１^b)又はＷＦｕ(ＲＴ １^u)ラットのどちらか一方を感作することはできなかった。亜優性エピトープは 、アルファ−１ドメインの最初のベータストランド及びループに対応している。調節エピトープ アルファ−１ドメインとは異なり、アルファ−２の同種異系ドメインは、免疫 原性能力のある決定基を欠いていた。これは、２つの実験によって示された。野 生型ＲＴ１.Ａ^a遺伝子の変更は、アルファ−２^aドメイン全体を、対応するアル ファ−２^uドメイン配列と置換することにより行なわれた。このキメラ遺伝子に より符号化された蛋白質と、アルファ−１^u螺旋配列を含むキメラ遺 伝子により符号化された蛋白質は、どちらも、夫々、ＷＦｕ(ＲＴ１^u)とＡＣＩ( ＲＴ１^a)の心臓同種移植片に対して、ＢＵＦ(ＲＴ１^b)受容体を免疫にすること はできなかった。 免疫原性があるエピトープを同種同系配列(syngenic sequences)によりフラン キングすると、宿主の免疫反応は、不応答性(unresponsiveness)の方に向けられ る。この観察は、２つの実験結果に基づいている。最初は、アルファ−２^uドメ イン配列と共に、Ｎ末端^a及びアルファ−１螺旋^aの免疫原性エピトープでトラン スフェクトされた細胞が注射されたＷＦｕ(ＲＴ１^u)宿主は、ＲＴ１^a(ＡＣＩ)の 同種移植片の方に感作されなかった。更に、これらの受容体は、抗ＡＣＩアロ抗 体を産生することができず、同種の特異なＣＴＬの機能を抑制する陰性の調節Ｔ 細胞が存在することを示した。同じキメラ分子は、ＢＵＦ(ＲＴ１^b)の受容体を 感作してＡＣＩ(ＲＴ１^a)の心臓の拒絶反応を加速(accelerate)した。第２に、 受容体型Ｎ末端^a及びアルファ−２^a配列によりフランクされた優性ドナー型アル ファ−１^u螺旋状免疫原性エピトープをもったトランスフェクタントが注射され たＡＣＩ受容体では、(ＷＦｕ)ＲＴ１^u心臓の同種移植片の生存を延ばした。こ れは、ＷＦｕ同種抗原に対するｆＴｃの減少方向と一致した。同じキメラ分子は 、ＢＵＦ(ＲＴ１^b)受容体におけるＷＦｕ(ＲＴ１^u)の加速された拒絶反応 を誘導した。これは、受容体型クラスＩ分子に現われたドナー型免疫原性エピト ープが免疫寛容原性になることを示すものである。キメラに誘導された寛容性 同種移植片に対して反応が行なわれないように誘導する際、特異的クラスＩＭ ＨＣ同種抗原の果たす役割は、マウスの実験から明らかである。受容体Ｎ末端^a 及びアルファ−２^a配列によってフランクされたアルファ−１^uヘリックスでトラ ンスフェクトされた細胞の抽出物が、ＣｓＡ療法の７日クールと共に、移植開始 時(０日目)、門脈を経て一度注射された。この注射処理により、ＡＣＩ(ＲＴ１^a )受容体の８０％が、ＷＦｕ(ＲＴ１^u)心臓の同種移植片に対してドナー固有の寛 容性を誘導した。これは、野生型ＲＴ１.Ａ^a、つまり肝細胞をもったＷＦｕクラ スＩのＲＴｌｕ^aと、Ｎ末端抗原が置換され又はアルファ−２ドメインが置換さ れたキメラ分子の抽出物は、移植片の拒絶反応を防止する上で効果がなかったこ とと対比される。この様に、修飾(modification)されたクラスＩのＭＨＣ同種抗 原を用いて、キメラクラスＩ分子を開発し、無傷の野生型抗原に対して陰性の免 疫反応を誘導した。キメラ(準自己型)クラスＩ分子を用いて寛容性を誘導するこ とは、移植片の拒絶反応を防止する上で、新規であり且つ臨床的に適応可能であ る。有用なキメラ 本発明の有用なキメラ分子は、ＭＨＣクラスＩ抗原であり、これは、受容体型 アルファ−１ドメイン、受容体型アルファ−２ドメインのＮ末端領域と、ドナー 型アルファ−１ドメインの螺旋領域を有している。キメラＭＨＣクラスＩ分子又 はそれらを符号化した遺伝子の修飾又は変更は、免疫原性があり且つ調節性のエ ピトープを著しく変えることなく、また本発明のキメラの機能を変えることなく 行なうことができることは、当該分野の専門家であれば理解することができるだ ろう。本発明の有用なキメラは、三次元の形態で、望ましくは外部ペプチドと結 合し存在させるのに十分な表面をもたらすものが望ましい。本発明のキメラＭＨ ＣクラスＩ分子として、ドナー型免疫原性決定基（アルファ−１ｈ）、受容体型 Ｎ末端免疫原性決定基(アルファ−１Ｎ)、受容体型アルファ−２決定基が挙げら れる。 本発明の有用なキメラ分子は、次の要領にて作製し、スクリーンされてもよい 。キメラ遺伝子は、当該分野で公知の組換え方法により作製してもよい。望まし い方法として、実験例２に記載される如く、ＰＣＲに基づいてスプライシングを 重複延長(overlap extension)する方法がある。特定のＭＨＣクラスＩ抗原を符 号化した遺伝子は、免疫優性α−１ｈエピトープを、異なるＭＨＣクラスＩ分子 の対応する免疫優性α−１ｈエピトープと置き換えられる。なお、保存されたエ ピトープは、受容体 のＭＨＣクラスＩ型から成り、免疫優性エピトープの置換配列は、特定されたド ナーのＭＨＣクラスＩ型から得ることが望ましい。キメラ蛋白質を符号化した遺 伝子でトランスフェクトされた細胞は、これら蛋白質を発現し、該蛋白質は、例 えば３モルのＫＣｌで抽出される。キメラ蛋白質を含有する抽出物約１０ミリグ ラムが、ドナーの器官移植時(０日目)に、モデル受容体(例えばラット)の門脈に 注射される。移植された動物には、７日クールでＣｓＡが経口投与がある(１０m g/kg、０〜６日)。実験動物と標準動物に対して、平均生存率を求めた。本発明 の有用なキメラ分子は、ドナー固有の移植寛容性を誘導できるものである。 免疫寛容原性効果をもたらすＭＨＣクラスＩ蛋白質を符号化した特定のキメラ ＭＨＣクラスＩ遺伝子として、α−１ドメイン（約２０アミノ酸）及びα−２ド メインの受容者型Ｎ末端部分を符号化した遺伝子配列、α−１ドメインのドナー 型螺旋領域を符号化した遺伝子配列がある。置換されたドナー配列は、α−１の 螺旋領域の多形性領域を含むことが望ましい。 本発明のキメラＭＨＣクラスＩ分子の受容体への移植は、望ましくは移植時に 投与して行なわれ、これは当該分野で公知の方法により行なわれる。分子は、注 射されることが望ましく、静脈内への注射が最も望ましい。キメラ分子は、精製 された糖蛋白質として投与され、これ は分子を発現する抽出物又は細胞全体として投与される。投与量及びその処方は 、医師が公知の方法に基づいて決める。 望ましい実施例において、キメラ分子を符号化した遺伝子でトランスフェクト された細胞の抽出物は手術中投与され、これは７日クールのＣｓＡ療法と共に行 なわれる。 実施例 実験例１ 野生型ＲＴ１.Ａ^aの効果の特徴づけ 野性型ＲＴ１.Ａ^aのｃＤＮＡは、J．Howard［Rada et al.，1990，PNAS USA， 87:2167-2171］から入手した。これを、ＳＶ４０プロモータ及びエンハンサー［ Stratagene，LaJolla,カリフォルニア州］を含む哺乳動物の発現ベクターｐＳＧ ５のＥＣＯＲＩ部位にて適当な方向にサブクローン化された。このベクターは、 リポフェクチン試剤［GIBCO，Grand Island，NY; Felinger et al.，1987］を用 いて、耐ネオマイシン遺伝子を含むｐＳＶ２−ＮＥＯと共に、ＢＵＦ(ＲＴ１^b) のモリスヘパトーム７３１６Ａ細胞［Masuji et al.，Acta Med ．Okyama，28:28 1-293，1974］の中で、一緒にトランスフェクトされた。２５μlのリポフェクチ ン(lipofectin)プラスミドＤＮＡ(１０μ ｐＳＧ５−ＲＴ１.Ａ^a：ｐＳＵ２ＮＥ Ｏ、１０：１)複合体が、６０ml培養皿にある４ml無血 清培地［完全ＲＰＭＩ,Sigma,St．Louis,ミズーリ州］の中の２×１０⁵細胞に加 えられた。３７℃で６時間培養した後、培地(medium)は１０％のウシ胎児血清Ｒ ＰＭＩで置換された。更に４８時間培養した後、４００μg/ml(最終濃度)のジェ ネティシン(Geneticin)［G418，GIBCO,Grand Island,ニューヨーク州］を培養培 地に加えることにより、安定なトランスフェクタントが選択され、生存群が増や され、ＲＴ１.Ａ^aの表面発現を分析した。 トランスフェクトされた細胞は、ＦＡＣＳにより分析され、蛍光色素を有する ラビットの抗ラットＩｇＧ抗体(２５０倍に希釈)に細胞をさらすことにより、或 いは特定の抗体でプリコートすることにより細胞表面のＲＴ１.Ａ^aを検出した。流動細胞計測分析(Flow Cytometry Analysis) トランスフェクトされたＢＵＦ(ＲＴ１^b)肝癌細胞の表面に野生型ＲＴ１.Ａ^a が発現するのを検出するために、トランスフェクトされたＢＵＦ肝癌細胞と、ト ランスフェクトされていないＢＵＦ肝癌細胞をハンクスの平衡塩類溶液［HBSS; Sigma，St．Louis,ミズーリ州］の中で懸濁させた。なお、この溶液には、５％ ウシ胎児血清(ＦＣＳ)が補充されている。約３×１０³細胞を、４℃、５０μlの 希釈液の中で３０分間培養した。希釈液は、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aに対して多クロー ンＢＵＦ(ＲＴ１^b)抗体を４倍、８倍及び１６倍に希釈した液、又はＲ２／１ ５Ｓ抗ラットＲＴ１.Ａ^aクラスＩの多形性モノクローン抗体［Bioproducts for Science，Indianapolis,インディアナ州］、又は抗ラットＲＴ１.Ａ^aクラスの単 一構造のモノクローン抗体ＭＲＣ ＯＸ １８［Bioproducts for Science，India napolis,インディアナ州］を１５０倍に希釈した液である。洗浄後、フルオレセ イン(ＦＩＴＣ)を接合したラビットの抗ラットＩｇ［Zymed labs，San Francisc o,カリフォルニア州］の２５０倍希釈液５０μｌを細胞に加えられた。第２の培 養の後、細胞を洗い流して、１.５％パラホルムアルデヒドと結合させた。ＦＩ ＴＣラビット抗ラットＩｇでのみ染色された細胞を用いて、バックグラウンドの 特異性のない蛍光が測定された。分析は、ベクトン・ディッキンソンのレーザー フローサイトメトリーシステム［Mountain View,カリフォルニア州］に基づいて 行なわれた。データは、試料の蛍光とバックグラウンドの染色との差をプラスの 染色として計算され、細胞の割合として求めた。 図２に示す如く、野生型ＲＴ１.Ａ^aの安定トランスフェクタントのＦＡＣＳ分 析の結果、抗ＲＴ１^aの多クローン抗体又は特定の抗ＲＴ１.Ａ^aクラスＩのＲＴ ２／１５Ｓモノクローン抗体では、(９０％よりも大きな)陽性染色が上昇するこ とが分かった。更に、抗ラットＲＴ１Ａクラスの同一構造(monomorphic)のモノ クローン抗体ＭＲＣ ＯＸ１８で染色すると、トランスフェクトされ た細胞の方が、トランスフェクトされていない細胞よりもクラスＩ分子の全表面 発現は、より多くなることが分かった。 成人した雄の同系繁殖体のＷＦｕ(ＲＴ１^a)ラット［Harlan Sprague Dawley,I ndianapolis,インディアナ州］には、１×１０⁵〜２×１０⁷の標準細胞又はトラ ンスフェクトされた細胞が、ＡＣｌの心臓同種移植の７日前に注入された。移植 片の平均生存時間を計算により求めた。心臓移植 異所性の心臓移植組織をドナーのラット［Harlan Sprague Dawley,Indianapol is,インディアナ州］から得て、これを前述［Ono and Lindsey，1969，J ．Thora cic Cardiovasc．Surg. 51: 225-229］した如く、腹腔内に入れた。ドナーの心 臓は、ヘパリンが加えられた心臓麻痺性溶液を冷やしたものを、大動脈の中を灌 流させた。これは、受容体を塩酸ケタミン(ketamine hydrochloride)［Parke-Da vis，Morris Plains，ニュージャージ州;100g重さ当り0.1 mg］で麻酔をかけた 後、大静脈及び肺静脈の結紮による回復前に行なわれた。腎臓の下の大静脈及び 大動脈の微小血管は、ドナーの肺動脈及び大動脈に吻合され、これは、８−０ナ イロン縫糸［Ethicon，Somerville,ニュージャージ州］を用いて行なわれた。低 温イシェミー時間(cold ischemia time)は、４５分より短かった。心臓の活動状 態は、腹の触接により評価した。 データは、平均生存時間(ＭＳＴ)±Ｓ.Ｄ.として与えられ、ｔ試験により比較し た。Ｐ＜０.０５の値は、統計的に有意差のあることを示した。 生後約４週間乃至６週間で、体重約１６０〜２００ｇ(ＲＴ１^u)のＷＦｕラッ ト［Helen Sprague-Dowdy,Indianapolis,インディアナ州］を、１〜２×１０⁷の 野生型ＲＴ１.Ａ^aでトランスフェクトされたＢＵＦ肝癌細胞(これは、標準の肝 癌細胞ではなく、トランスフェクトされていないＢＵＦ（ＴＲ１^b）肝癌細胞)と 共に、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)心臓の同種移植片の攻撃の７日前、皮下注射した。この 結果、移植された動物の平均生存時間は、夫々、５.４±０.５日間から３±０. ０日、又は２.８±０.４日へと縮まった(Ｐ＜０．００１)。静脈内での輸送(int ravenous delivery)は、免疫原性がより少なく、門脈ルートは効果がなかった。 これらのデータを図３に示す。 実験例２ キメラＲＴ１.Ａ^aクラスＩ抗原の生産と特徴づけ ポリメラーザ連鎖反応(ＰＣＲ)に基づいて、遺伝子のスプライシングを重複延 長(splicing with overlap extension)する方法(遺伝子のＳＯＥ操作)を用いて 、プライマーのパネルを使った３つのキメラ分子を作り出す。この方法は、次の 文献に記載されており、多くの目的のために引用することによって本願への記載 加入とする［Horton et al.，Biotechniques，8:528(1990)，"Gen e Splicing by Overlap Extension: Tailor-Made Genes Using the Polymerase Chain Reacion］。 野生型ＲＴ１.Ａ^aのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ３.３／１［Rada et al. ，1990，PNAS USA，87:2167-2171］は、５'及び３'のフランキング「外側プライ マー(outside primers)」のＡとＬ(配列データ用の表１を参照)の間で、ＰＣＲ 増幅反応するための鋳型として用いられた。なお、前記プライマーは、Ｅｃｏ Ｒ Ｉの制限部位と、内側重複する「ＳＯＥ操作」のプライマーを含んでおり、 塩基置換を含んだ。最初のＰＣＲ反応では、５'の外側プライマー(５００ng)を １μl、最初の内側プライマー(５００ng)を１μl、ｄＮＴＰ(２５mM)を１μl、 ＤＮＡ鋳型(１μl)を１μl、１０Ｘ hot tubＤＮＡポリメラーゼ緩衝剤を１０μ l、hot tubＤＮＡポリメラーゼ［Amersham，Arlington，イリノイ州］を１μl、 及びｄＨ₂Ｏ８５μlを用いた。第２のＰＣＲ反応では、第２の内側プライマーと ３'のフランキング外側プライマーを用いた。 ＰＣＲ反応は、鉱油(mineral oil)を適用して行なわれ、 ９４℃での変性(denaturation)を１分間； ５３℃でのアニーリングを２分間； ７２℃での伸長(elongation)を３分間； のサイクルを２回行なった後、 ９４℃での変性を１分間； ５９℃でのアニーリングを２分間； ７２℃での伸長を３分間； のサイクルを２３回行なった後、７２℃で１０分間の伸長にて終了した。 ２種類のＰＣＲ産物を低融点アガロースゲルの中で電気泳動させて、切出し(e xcision)用のＤＮＡバンドを産生し、６０℃で溶融した。第３のＳＯＥ操作のＰ ＣＲ反応では、２つの外側フランキングプライマーを用い、第１及び第２のＰＣ Ｒ反応の溶融ゲルのスライス５μlをＤＮＡ鋳型として、１.６kbのＲＴ１.Ａ^aの ＤＮＡ断片を産生し、これを切り出し、溶出し、エタノールを析出させ、７０％ エタノールで洗浄し、ｄＨ₂Ｏの中で溶解した。これらの反応に使用されたプラ イマーを表１に示す： 内側(internal)プライマーＢ、Ｃ、Ｄ及びＥを用いて、Ｎ末端置換えを行なっ た。 最初の４つの個々のＰＣＲ反応において、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫの６つの 内側プライマーを用いた。次に、プライマーＡとＬでＳＯＥ操作による反応を１ 回行ない、アルファ−２ドメインを変えた。 これらの反応では、野生型ＲＴ１.Ａ^aのｃＤＮＡのＮ末端(Ｎ)、アルファ−１ 螺旋領域(α−１ｈ)又はアルファ−２ドメイン(α−２ｄ)の中で置換が行なわれ た。これらの遺伝子の配列を、図４に模式化して示しており、産生されたキメラ の構成を表２に示す： 野性型ＲＴ１.Ａ^aのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ３.３／１［Rada et al. ，PNAS USA，87:2167-2171，1990］が、５'と３'のフランキング外側プライマー (ＡとＬ)の間で、ＰＣＲ増幅反応を行なうために、鋳型として用いられた。各プ ライマーは、ＥｃｏＲ Ｉ部位を含み、内側で重複するＳＯＥ操作を行なった２ つのプライ マーは、塩基置換を含んでいる。Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^aの突然変異体は、ヒト ＨＬＡ−Ａ２.１のアルファ−１ドメインの最初のベータストランド及びループ の中の最初の２０アミノ酸を符号化したＮ末端ヌクレオチドを担持している。３ つのＰＣＲ反応では、内側プライマーＢ及びＣを用いて、ヌクレオチドのコード を、Ｌｅｕ⁵からＭｅｔに、Ｔｙｒ⁹からＰｈｅに、Ａｌａ¹¹からＳｅｒに、Ｌｅ ｕ¹⁷からＡｒｇに変更された。図５Ａは、第１のＰＣＲ反応(プライマーＡ及び Ｂ；１４０塩基対、レーン２)と第２のＰＣＲ反応(プライマーＣ及びＬ；１４９ ０塩基対、レーン３)の産物を示しており、これらは、第３のＰＣＲ反応(プライ マーＡ及びＬ)の中でＳＯＥ操作され、１.６kbのキメラｃＤＮＡ(レーン４)を作 った。 アルファ−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aのｃＤＮＡは、アルファ−１ヘリックス(アミノ 酸５１〜９０)の中に、ＲＴ１.Ａ^uを含んでおり、このため、内側プライマーＤ 及びＥを用いて、Ｇｌｕ⁵⁸をＡｓｐに、Ｇｌｎ⁶²をＡｒｇに、Ｇｌｎ⁶³をＧｌｕ に、Ａｒｇ⁶⁵をＧｌｎに、Ｉｌｅ⁶⁶をＬｙｓに、Ｇｌｕ⁶⁹をＧｌｙに、Ｔｒｐ⁷⁰ をＡｓｎに、Ｉｌｅ⁷³をＡｓｎに、Ａｓｐ⁷⁷をＳｅｒに、Ｔｈｒ⁸⁰をＡｓｎに変 えた。図５Ｂは、第１のＰＣＲ反応(プライマーＡ及びＤ)が３００の塩基対断片 (レーン２)を作り出したことを示しており、塩基対断片は、第３のＰＣＲ 反応(レーン４)の中で、第２のＰＣＲ(プライマーＥ及びＬ、レーン３)により作 られた１３１０塩基対断片の中にＳＯＥ操作が行なわれた。 アルファ−２Ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^a突然変異体は、アルファ−２^uドメイン(アミノ 酸９１−１８２)を含んでいるので、Ｇｌｕ⁹⁷をＡｒｇに、Ｓｅｒ¹⁰⁵をＴｈｒに 、Ｇｌｕ¹⁴⁸をＡｓｐに、Ａｒｇ¹⁵¹をＧｌｙに、Ｔｒｙ¹⁵²をＶａｌに、Ｓｅｒ^{1 69} をＡｒｇに、Ｌｅｕ¹⁷⁴をＨｉｓに、Ｓｅｒ¹⁸²をＬｅｕに変えることができる 。図５Ｃに示される如く、ＰＣＲ１(プライマーＡ及びＦ、レーン２)、ＰＣＲ２ (プライマーＧ及びＨ、レーン３)、ＰＣＲ３(プライマーＩ及びＪ、レーン４)、 ＰＣＲ４(プライマーＫ及びＬ、レーン５)の４つの初めのＰＣＲ反応の中で、Ｆ 、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ及びＫの６つの内側プライマーが用いられた。４つのＰＣＲ断 片(４００、１５０、１２０及び９９０塩基対)が、最後の１つのＰＣＲ反応(プ ライマーＡ及びＬ、レーン６)の中で、ＳＯＥ操作された。ＰＣＲ産物のサブクローニング及び配列 野生型と突然変異を起こしたＲＴ１.Ａ^aのＰＣＲ産物を個々に、ｐＴ７ブルー のＴベクター［Novagen，Madison，ウィスコンシン州］の中に結紮した。前記ベ クターは、各端部に単一の３'ｄＴ残基と、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ［Promega，Mad ison,ウィスコンシン州］を用いた耐 アムピシリン遺伝子を含んでいる。Epicurean Coli XL-1Blue MRF'コンピテント 細胞［Stratagene，La Jolla，カリフォルニア州］は、結紮混合物により耐アム ピシリン細胞の中に転換され、ＬＢアムピシリンプレートの上に載せられた。生 存している群体は、アムピシリン(１００mg/ml)を含む５mlのＬＢ培地の中で、 別個に増殖され、プラスミドＤＮＡがミニプレプ(mini-prep)により抽出され、 ＥｃｏＲ Ｉにより消化され、１.６kbＲＴ１.Ａ^a断片を存在させるためにスクリ ーンされた。陽性群体は、２５０mlのＬＢアムピシリン培地の中で別々に培養さ れ、プラスミドＤＮＡは、Qiagen-tips５００［Qiagen，Chatsworth,カリフォル ニア州］を用いて、製造者の仕様に基づいて、マクシプレ(maxi-pre)により抽出 された。プラスミドＤＮＡの配列形成は、２つの外側プライマーと多数の内側プ ライマーを用いて、蛍光ベースのTag dyedeoxy［商標名］ターミネーターのサイ クル配列形成キット［Applied Biosystems，Foster City,カリフォルニア州］を 用いて、２つの方向に行なわれた。要するに、２０μl反応(ＴＡＣＳ緩衝剤、ｄ ＮＴＰ合剤、dyedeoxy A、G、T及びCのターミネータ、ampliTag ＤＮＡポリメラ ーゼ、ＤＮＡ鋳型、及びプライマー)は、２５の熱サイクル反応(９６℃で３０秒 ；５０℃で１５秒；６０℃で４分)で行なわれ、Centri-Sepスピンカラム［Princ eton Separations，Adelphia,ニュージャージ州］ で精製され、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)の３７３Ａ ＤＮＡシーケンサに装填された。データ分析は、マッキントッシュＩＩ Ｃｉコ ンピュータにより、ＡＢＩ３７３Ａ分析ソフトウェア(バージョン１.１.１)を用 いて行なわれた。変更されたアミノ酸と核酸の配列を図６に示しており、ここで は変化された残基にアンダーラインが付され、ドット印は、野生型ＲＴ１.Ａ^a配 列からどんな変化も無かったことを示している。ＢＵＦ(ＲＴ１^b)肝癌細胞のトランスフェクション ＳＶ４０プロモータを含む真核発現ベクターｐＳＧ５［stratagene，LaJolla ，カリフォルニア州］の中でサブクローン化された野生型又は突然変異したＲＴ １.Ａ^aのｃＤＮＡは、リポフェクチン試剤［Gibco，Grand Island,ニューヨーク 州; Felinger et al.，1987］を用いてＢＵＦモリスヘプトーム７３１６Ａ細胞 ［Matsuji et al.; 1974，Acta Med Okyama 28: 281-293］をトランスフェクシ ョン(transfection)するために用いられた。リポフェクチン(２５μl)−プラス ミドＤＮＡ(１０μｇ；ｐＳＧ５−ＲＴ１.Ａ^a：ｐＳＶ２ＮＥＯ；１０：１)の複 合体は、６０mm組織培養皿の中の４ml無血清培地［完全ＲＰＭＩ;Sigma，St．Lo uis,ミズーリ州］の中の２×１０⁵細胞に加えられた。３７℃で６時間培養した 後、培地はウシ胎児血清(ＦＣＳ)−ＲＰＭＩで置き換え られた。更に４８時間培養した後、安定なトランスフェクタントが、４００μg/ ml(最終濃度)のジェネティシン［G418; Gibco，Grand Island，ニューヨーク州 ］を添加することにより選択された。生存する群体は増えて、ＴＲ１.Ａ^aの表面 発現を分析した。 実験例１の記載と同じ様に、フローサイトメトリ分析を行ない、野生型の表面 発現、又はトランスフェクトされたＢＵＦ(ＲＴ１^b)細胞のキメラＲＴ１.Ａ^aの 表面発現を検出した。 安定なキメラトランスフェクタントは全てのものが、同様な表面染色レベル、 つまり９０％よりも多いレベルの表面染色を示した。これに対し、トランスフェ クトされなかった肝癌細胞の表面染色は約３８％に過ぎなかった。これらの結果 を図７Ａ〜７Ｅと、表３に示す。 実験例３ ＢＵＦ宿主におけるキメラＲＴ１.Ａ^a抗原の免疫原性 成人した雄の同系繁殖体のバッファローラット(ＢＵ Ｆ;ＲＴ１^b)を、Harlan Sprague Daroley［Indianapolis,インディアナ州］から 購入し、底部にワイヤーが付けられたケージの中に入れて、明と暗のサイクルが 繰り返し行なわれた。ラットは、水と食べ物を自由に摂取できる状態におかれた 。ＢＵＦの宿主は、トランスフェクトされた肝癌細胞ラインと同じハプロタイプ をもっており、この宿主は、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)、又はWistar Furth(ＷＦｕ；ＲＴ^u )の心臓の同種移植片で移植を行なう７日前に、野生型又は実施例２の突然変異 したキメラ抗原のどちらか一方をもった２×１０⁷細胞が皮下注射された。 心臓移植は、実験例１に記載したのと同じ要領にて実施した。 表４に示される様に、置換されたアルファ−２^uドメイン配列、又は置換され たＮ末端ＨＬＡ配列を有するキメラＭＨＣクラスＩ抗原を持った細胞を注射する と、両方とも、ＢＵＦ(ＲＴ１^b)宿主を、ＷＦｕ(ＲＴ１^u)ドナーではなく、ＡＣ Ｉ(ＲＴ１^a)から移植片に対して免疫にした。これに対し、置換されたアルファ −１^u螺旋配列を持ったキメラ抗原は、ＢＵＦ(ＲＴ１^b)受容体を、ＡＣＩ(ＲＴ １^a)ドナーの同種抗原に対してではなく、ＷＦｕ(ＲＴ１^u)に対して感作した。 これらの事実により、アルファ−１の螺旋領域(但し、ＲＴ１.Ａ^aとＲＴ１.Ａ^u のクラスＩ同種抗原のアルファ−２ドメインではない)は、移植拒絶反応の加速 を誘導する優性の免疫原 性エピトープを含んでいることがわかる。更に、アルファ−１^u螺旋配列で置換 された突然変異体に存在するＮ端末^aのエピトープは、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)移植片の 拒絶反応の加速を誘導することはできなかった。 実験例４ ＷＦ受容体におけるキメラＲＴ１.Ａ^a抗原の免疫原性 成人した雄の同系繁殖体であるＷＦ(ＲＴ１^u)ラットを実験例３の記載と同じ 要領にて購入し、ケージに入れた。ＷＦラットは、キメラＭＨＣクラスＩ分子α −１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^a及びα−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aの置換配列と同じ様なハプロタ イプの配列を有している。これらの動物は、１×１０⁵〜２×１０⁷のＡＣＩ(Ｒ Ｔ１^a)の脾細胞、又は、キメラ突然変異体ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^a、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ １.Ａ^a、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^a又はα−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aでトランスフェクト された肝癌細胞を、 実験例１及び３に記載した方法に基づいて、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)の心臓の同種移植 片で移植する７日前に、皮下注射することにより、免疫性が与えられた。 １０×１０⁶のＡＣＩ(ＲＴ１^a)の脾細胞で免疫すると、移植された動物の平均 生存時間は５.４±０.５日から２.３±０.５日(ｐ＜０.００１)まで縮まり、一 方、２０×１０⁶のＷＴ−ＲＴ１.Ａ^a又はＮ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a(Ｎ^aエピトー プを欠いている)は、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)の移植拒絶反応を２.８±０.４日(ｐ＜０. ００１)及び４.２±０.４日(ｐ＜０.００１)まで加速した。これらのデータを表 ５に示す。 図８に示される様に、平均生存時間(５０％指数)の半分とするには、ＷＦ受容 体には、７.５×１０⁶のＡＣＩ細胞、２０×１０⁶のＷＴ−ＲＴ１.Ａ^a又は５７ ×１０⁶のＮ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^aのトランスフェクタントが注射されなければ ならない。 しかし、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aトランスフェクタントは、α−１^a螺旋エピト ープを欠失しているので、２０×１０⁶を投与してもＡＣＩ(ＲＴ１^a)移植片(平 均生存時間：５.４±０.５、ＮＳ；図８)の拒絶反応の加速を誘導することはで きなかった。このデータは、免疫優性で免疫原性のあるエピトープがこの領域に 存在することを確認するものである。ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aとＮ^HLA-A2.1−ＲＴ１. Ａ^aのトランスフェクタント(ｐ＜０.００１；図８)の免疫原性が相違することは 、Ｎ末端の置換えによって、免疫原性がある亜優性のエピトープが除去されるこ とを示唆している。 なお、免疫原性があるＮ^aとα−１ｈ^aエピトープはα−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aキ メラトランスフェクタントに存在すると推定されるが、これらエピトープはＷＦ 受容体(平均生存時間：４.９±０.４、ＮＳ；図８)に免疫性を与えることはでき なかったことと対比される(但し、この突然変異体は、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)の心臓に 対してＢＵＦ(ＲＴ１^u)動物を感作した)。宿主型α−２ｄ^uのフランキング配列 は、免疫原性があるドナー型α−１^aエピトープに対する宿主の反応調節能力を 低下させた。 この調節能力の低下を確認するために、限界希釈分析を行ない、正常ラットと 免疫ＷＦラットのリンパ腺(ＬＮ)細胞における抗ＡＣＩ細胞障害性Ｔ細胞(ｆＴ ｃ)のインビトロ頻度を量的に求めた。限界希釈分析 プレートは底部に９６マイクロリットルの窪みを有し、窪みの中には、１０％ の熱不活性化されたＦＣＳと、１０ユニット/mlＭの精製されたＩＬ−２［Colla borative Research Inc.,bedford,マサチュセッツ州］で補足された完全ＲＰＭ Ｉ １６４０の培地の中に、５×１０⁴個の照射された(２０００ラット)免疫原 性脾刺激体(splenic stimulators)が入れられており、キラー細胞(responder ce lls)を１：２５,６００乃至１：４００まで２４段階に希釈したものを１組とし て、文献［Ito et al.,1990，Transplantation 49: 422-428］に記載された方法 により、プレートの窪みの中に植種した(seeded)。３７℃で７日間培養した後、 ３７℃で６時間培養をさらに行ない、各窪みにおける細胞障害活性を評価した。 １×１０⁴個のＡＣＩ又はＷＦの標的細胞は、予めConcanavalin A(Con A)で３日 間刺激が与えられ、２００〜５００mCi/mg Cr［Amersham，Arlington,イリノイ 州］の比活性がラベルされている。カートリッジ収集システム［Skatron Inc.， Stering，バージニア州］を用いて、得られた上澄から⁵¹Ｃｒを放出し、これを ガンマカウンターの中で測定した。 得られた結果につき、クロムの自然放出の平均が標準偏差(ＳＤ)の３倍を超え るときの値に、陽性(positive)の符号を付した。ｆＴｃの９５％信頼限界を有す る最小 χ(カイ)二乗推定値は、キラー細胞の個数と、陰性細胞の数の自然対数とのポア ソン分布関係により得られた。最尤推定量と最小χ二乗値とのひらき(divergenc e)が１０％未満で、χ二乗表から推定される確率が０.０５よりも大きいとき、 「単一ヒット(a single hit)」のポアソンモデルと一致するものとみなした。 このデータは図９に示されている。予想されたように、ＡＣＩの脾細胞又はＷ Ｔ−ＲＴ１.Ａ^aのトランスフェクタントは、両方とも、移植拒絶反応の加速を誘 導するものであり、これらの投与により、ｆＴｃは、実験に使われていない動物 での１：１２６３８から、１：２５４８及び１：３４７４まで夫々増加した。こ れに対し、α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aのトランスフェクタントは同種移植片の拒絶 反応を加速しなかったため、最初はｆＴｃを１：３８６１まで増加させ、次に、 陰性調節細胞にＶ字形プロフィールの特徴をもたらし、その活性は１：６４００ ０より少ないｆＴｃ値では明白である［Florence et al.,1989,Transplantation 47:156,162］。同種抗体の検出 階段希釈された実験血清(１：４、１：１６又は１：６４)をＡＣＩリンパ腺( ３×１０³)と共に、４℃で３０分間培養処理し、１週間経過した後のＷＦラット から得た血清の中で、抗ＡＣＩ(ＲＴ１^a)結合同種抗体が検出された。洗浄後、 ＦＩＴＣが接合されたラビットの抗ラ ットＩｇＧ(１：２５０)又はラビットの抗ラットＩｇＭ(１：１００)の５０μｌ が、第２の培養に対して添加された。細胞は洗浄されて結合された(fixed)。染 色の強さは、平均のチャンネルシフト(mean channnel shift)(ＭＣＳ)として表 わした。このＭＣＳは、試料の平均蛍光と、フルオレセインを有する第２の抗体 のみから得られた平均蛍光との差である。抗ＩｇＧへの結合は図１０Ａに示され 、抗ＩｇＭへの結合は図１０Ｂに示されている。 実験血清における細胞障害性の抗ＡＣＩ同種抗体は、補体依存性で抗体仲介さ れた２段階の細胞障害性分析により検出された。血清は５６℃で３０分間、熱不 活性化され、９６マイクロリットルの窪み部付プレートの中で、ＨＢＳＳを用い て、５％ＦＣＳと共に階段希釈された。⁵¹Ｃｒのラベルが付されたＡＣＩリンパ 腺の標的細胞(１×１０⁵)が各窪み部に加えられ、４℃で３０分間培養された。 低毒素のラビット補体［Cedar Lane，Toronto，カナダ］を５０ml(８倍に希釈) を加える前に、細胞は洗浄され、その後、３７℃で３０分間培養された。上澄が 集められ、ベックマンのガンマカウンターにより放射能が求められた。最大溶解 (maximum lysis)は、０.８％Triton［Sigma，St.Louis，ミズーリ州］で処理す る際に、標識ターゲットから放出される⁵¹Ｃｒに基づいている。補体単独との培 養により得られたバックグラウンド計数 は１０％最大溶解よりも少なかった。特異的溶解のパーセントは次の要領により 求めた。 細胞障害性抗体の存在は図１０Ｃに示されている。 α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aトランスフェクタントをＷＦ(ＲＴ１^u)宿主に注射した が、抗ＲＴ１^a同種抗体の産生を刺激することはできなかった。これは、ＷＴ− ＲＴ１.Ａ^a、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a及びα−１ｈ^u-ＲＴ１.Ａ^aを持ったトラン スフェクタントは全てのものが、補体非依存性のＩｇＧ抗体の産生を引き起こし たが、ＩｇＭ抗体の産生を引き起こさなかったことと対比される。これらの結果 より、ドナー型α−１^aの免疫原性があるドメインを、受容体型α−２^uドメイン と組み合わせると、同種移植片に対する感作を抑制する調節反応を誘導できるこ とがわかった。 実験例５ ＡＣＩ受容体におけるキメラＲＴ１.Ａ^a抗原の免疫原性 ＷＦ(ＲＴ１^u)脾細胞、野生型、又はキメラＲＴ１.Ａ^aトランスフェクタント( ２×１０⁷)は、これまでの実験例の中で記載した方法及び分析を用いて、ＷＦ( ＲＴ１^u)の心臓移植を行なう７日前に、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)受容体に皮下注射され た。ＡＣＩは、実験例２のキメラ抗原の主鎖(backbone)と同じハプロタイプを有 している。注射 処理が行なわれた動物の平均生存時間を表６及び図１１に示している。 ＷＦ脾細胞は、移植された受容体の平均生存日数を５.４±０.６日から４.０ ±０.７日(ｐ＜０.０１)に縮めた。一方、同種同系のＷＴ−ＲＴ１.Ａ^aトランス フェクタントは効果がなかった(５.５±０.５；ＮＳ)。Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a 、α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^a及びα−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aのトランスフェクタントが 移植されたＷＦ(ＲＴ１^u)心臓の平均生存時間は、８.７±１.０日(ｐ＜０.０１) 、９.２±１.３日(ｐ＜０.００１)、１４.０±１０.３日(ｐ＜０.０１)であり、 注射処理をしていない標準の５.９±０.６日と比べて少し長くなった。 さらに、表７及び図１２に示されるように、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a、α−２ ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^a又はα−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aを持ったトランスフェクタントで免 疫すると、ＡＣＩ(ＲＴ１^a)ラットのリンパ腺細胞におけるＷ Ｆ同種異系抗原に対するｆＴｃは、１：１５５７２、１：２０６８９及び１：６ ５６２２となり、実験をしていない動物が１：１１２６４であるのと比べて少な くなった。これは、ＷＦ脾細胞で免疫したとき、ｆＴｃが１：７５４１に増加し たことと対比される。これらのデータは、免疫原性のあるものを皮下注射したと きも、キメラＲＴ１.Ａ^a分子、特に受容体のＮ末端及びα−２ドメイン配列によ りフランクされたドナーのα−１ヘリックスを持った分子に免疫寛容原性能力が あることを示している。 実験例６ ＲＴ１^a受容体のＲＴ１^u同種移植片に対するα−１^u−ＲＴ１.Ａ^aによる寛容性 への誘導 ＣｓＡ療法と共に、移稙中、抗原を投与した臨床的に関連のあるモデルについ て、準自己型のキメラ抗原の免疫寛容原性をさらに調べた。このモデルは、例え ば、文 献［Didlake et al.,1988 Transplantation 46:743-747；Florence et al.,1989 Transplantation 47:156-162; Ito et al.,1990 Transplantation 49:422-428; Hamashima et al.,1994,in press; Yasumura et al.,1983 Transplantation 36 :603-609］に記載されている。 ＷＦ(ＲＴ１^u)心臓のＡＣＩ(ＲＴ１^a)受容体には、ＣｓＡを７日間経口投与す る(１０mg/kg; ０−６日)と共に、さらに、Ｎ^HLA-A2.1−ＲＴ１.Ａ^a、α−１ｈ^u −ＲＴ１.Ａ^a又はα−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aのトランスフェクタントから、又はト ランスフェクトされていないＢＵＦ肝癌細胞(ＲＴ１^b)から、又はドナー型ＷＦ( ＲＴ１^u)のヘパトシステスから調製した３Ｍ ＫＣｌ抽出物(１０mg)を、手術直 前に１回、門脈への静脈注射を行なった。 ＫＣｌ抽出物は、３ｍ ＫＣｌで１８時間処理することにより細胞から調製さ れ、その後、蛋白質の配列(configuration)、濃縮(concentration)及びＰＢＳに よる透析が行なわれた。これは、文献［Reisfeld and Kahan,1970，Fed ．Proc. 29:2034-2040］に記載された要領にて行なわれた。 ＭＨＣ抗原(ｅ−ＨＡｇ)は、正常なＢＵＦ肝癌細胞、ＷＴから、又は前述した ように安定なキメラトランスフェクタント［Reisfeld and Kahan,1970，Fed ．Pr oc. 29:2034-2040］から得られた３Ｍ ＫＣｌで抽出された。ＭＨＣ抗原、ｅ− ＨＡｇ(１０mg)は、移植の日に直ちに 門脈から投与され、その後７日間、１０mg/kg/dayのＣｓＡを０日から６日まで 、強制的に経口投与された。ＣｓＡ粉末は、Sandoz［Basel,スイス］から入手し 、１％エチルアルコールと９９％Cremophor［Sigma，St.Louis,ミズーリ州］の 混合物の中で溶解された。データを表８及び図１３に示す。 ＣｓＡ単独投与したものは、ＷＦ心臓同種移植の生存時間は１６.２±１.６日 に延びた。ＷＦ(ＲＴ１^u)のヘパトシテス、ＷＴ−ＲＴ１.Ａ^a、Ｎ^HLA-A2.1−Ｒ Ｔ１.Ａ^a、α−２ｄ^u−ＲＴ１.Ａ^aのトランスフェクタント、又はトランスフェ クトされなかったＢＵＦ肝癌細胞(図１０)から得られたＫＣｌ抽出物については 追加の効果はなかった。これは、α−１ｈ^u−ＲＴ１.Ａ^aの抽出物が、受容体の ８０％までが、その生存時間は著しく延びた(平均生存時間＞１７０日、ｐ＜０. ００１)ことと対比される。 ６０日以上、ＷＦ(ＲＴ１^u)の心臓の同種移植が行なわれたＡＣＩ(ＲＴ１^a)受 容体の中で、５つの受容体は、ドナー型ＷＦ(ＲＴ１^u)の二次的で異所の心臓移 植片(平均生存時間＞１２０日)を受け入れた。これに対し、３つの受容体は、第 三者のBrown Norway(ＲＴ１^u)の二次的で異所の心臓移植片を直ちに拒絶した(平 均生存時間は７.０±１.７時間)。二次的な移植組織は、首部の血管に吻合され た。 その次に、これら寛容性のＡＣＩ受容体は、ドナー型ＷＦの皮膚の同種移植片 を２１日よりも長く受け入れた(ｎ＝８)が、第三者のBrown Norwayの皮膚の同種 移植片は８.０１±０.０日以内に拒絶した。 これらの結果は、ＣｓＡに加えて、同種同系の配列を持ったフランキングα− １の免疫原性エピトープが、ドナー特異的な移植寛容性を誘導すること示してい る。 発明を詳細に説明したが、当該分野の専門家であれば、技術、手順、材料及び 装置について種々の変形をなし得るであろう。本発明は、添付の請求の範囲の記 載及び精神の範囲内におけるそのような変形も包含するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/705 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カーン，バリー ディー. アメリカ合衆国 77024 テキサス，ヒュ ーストン，レイン ホロウ ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． キメラ主要組織適合性複合体クラスＩ分子であって： Ｎ端末領域と螺旋領域を有するアルファ−１ドメイン；及び アルファ−２ドメイン； を含んでおり、アルファ−１ドメインの螺旋領域は、異なる対立遺伝子の主要 組織適合性クラスＩ分子のアルファ−１ドメインの対応する螺旋領域と置換えら れている。 ２． 置換えられた螺旋領域は、特定されたドナーの対立遺伝子型主要組織適合 性複合体クラスＩ分子に一致している請求項１のキメラ分子。 ３． Ｎ末端領域とアルファ−２ドメインは、特定された受容体の対立遺伝子型 主要組織適合性複合体クラスＩ分子と一致している請求項１のキメラ分子。 ４． キメラ主要組織適合性複合体クラスＩ分子であって： 特定された受容体の対立遺伝子型Ｎ末端領域と、特定されたドナーの対立遺 伝子型螺旋領域を有するアルファ−１ドメイン；及び 特定された受容体の対立遺伝子型のアルファ−２ドメイン； を含んでおり、特定された受容体とドナーの対立遺伝子型は、主要組織適合性 クラスＩ分子の異なる対立遺伝子型である。 ５． 主要組織適合性クラスＩ分子を符号化するキメラ遺伝子であって、該遺伝 子は： 特定された受容体の対立遺伝子型Ｎ末端多形性アルファ−１領域を符号化す る核酸配列； 特定されたドナーの対立遺伝子型多形性アルファー１螺旋領域を符号化する 核酸配列；及び 特定された受容体の対立遺伝子型のアルファ−２ドメインを符号化する核酸 配列； を含んでおり、受容体型とドナー型は、主要組織適合性複合体クラスＩ分子の 異なる対立遺伝子型である。 ６． ドナーの移植片に対し受容体の寛容性を誘導する薬学的組成物であって、 該組成物は、薬学的に許容できる担体の中に、寛容性の誘導に有効な量のキメラ 主要組織適合性複合体クラスＩ分子を含んでおり、該分子は、特定された受容体 型Ｎ末端領域及び特定されたドナー型螺旋領域を含むアルファ−１ドメインと、 特定された受容体型のアルファ−２ドメインを有しており、ドナーの対立遺伝子 の主要組織適合性複合体クラスＩ型と、受容体の対立遺伝子の主要組織適合性複 合体クラスＩ型は異なっており、アルファ−１ドメインのＮ末端領域と、アルフ ァ−２ドメインのＮ末端領域 は、受容体と同じ対立遺伝子型であり、アルファ−１ドメインの螺旋部分は、ド ナーと同じ対立遺伝子型である。 ７． キメラ分子は、分子を発現する細胞の抽出物として提供される請求項６の 薬学的組成物。 ８． キメラ分子は、分子を発現する全細胞として提供される請求項６の薬学的 組成物。 ９． キメラ分子は、精製された糖蛋白質として提供される請求項６の薬学的組 成物。 １０．ドナーの移植片に対し、受容体の寛容性を誘導する方法であって： 受容体に対し、寛容性を有効に誘導する量のキメラ主要組織適合性複合体ク ラスＩ抗原を投与するステップを有しており、アルファ−１ドメインとアルファ −２ドメインのＮ末端部分は、受容体の対立遺伝子型からなり、アルファ−１螺 旋領域はドナーの対立遺伝子型からなり、受容体の対立遺伝子型とドナーの対立 遺伝子型は異なっている。 １１．投与は、ドナーの移植片を移植する時に行なわれる請求項１０の方法。 １２．サイクロスポリンが投与される請求項１０の方法。 １３．サイクロスポリンは、移植後約７日間毎日投与される請求項１２の方法。 １４．キメラ分子は、手術中１回投与される請求項１３ の方法。 １５．キメラ分子は、細胞の抽出物の形態である請求項１０の方法。 １６．キメラ分子は、分子を発現する細胞の形態である請求項１０の方法。 １７．キメラ分子は、実質的に精製された糖蛋白質の形態である請求項１０の方 法。 １８．投与は注射により行なわれる請求項１０の方法。 １９．注射は門脈の中に行なわれる請求項１８の方法。 ２０．投与により、受容体の中の抗ドナー抗体の産生が抑制される請求項１０の 方法。