JPH10501963A

JPH10501963A - 遺伝子送達融合タンパク質

Info

Publication number: JPH10501963A
Application number: JP7527157A
Authority: JP
Inventors: ロバートダブリュー．オーバーエル，; カレンイー．ウェイザー，
Original assignee: ターゲテッドジェネティクスコーポレイション
Priority date: 1994-04-15
Filing date: 1995-04-17
Publication date: 1998-02-24
Also published as: CA2187818A1; WO1995028494A1; EP0753069A1; AU706572B2; AU2387295A

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物細胞のような標的細胞の遺伝子形質導入における使用のための遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）を提供する。GDFPは形質導入されるべき標的化核酸に結合する核酸結合ドメイン（NBD）、およびそれが融合される標的細胞への標的化核酸の移入を伸介または増大させる遺伝子送達ドメイン（GDD）を含む。GDDは、遺伝子送達を促進する１つ以上の成分を含み、これは結合/標的化成分、膜破壊成分、輸送/局在化成分、およびレプリコン組込み成分を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子送達融合タンパク質技術分野本発明は遺伝子送達の分野に関し、より詳細には、ポリヌクレオチドを標的細胞に導入するために有用なタンパク質に関する。さらにより詳細には、本発明は目的のポリヌクレオチドに結合し得、かつ結合されたポリヌクレオチドの標的細胞への（特に哺乳動物標的細胞への）送達を促進し得る融合タンパク質に関する。背景多くのウイルスが、哺乳動物細胞のための遺伝子送達ベクターとしての使用のために適応されている。ウイルスは細胞に入るための高度に効率的な機構を有しており、そしていくつかの場合ではウイルスゲノムを宿主細胞染色体に組み込むための特異的な機構も有する。ウイルスベクターによってもたらされる遺伝子形質導入の高効率は、ウイルスに基礎を置く遺伝子送達のためのシステムを使用することの主な利点である。さらに、ウイルスが粒子性であるという事実により、ウイルスに基礎を置くシステムは、インビボでの遺伝子送達のために考慮される。これらの貢献は、遺伝子移入研究におけるウイルスベクターの広範な使用に導いた。この目的のために使用されたウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、およびヘルペスウイルスを包含する。より最近では、ウイルスベクターの有用性は、レトロウイルスおよびアデノウイルスの遺伝子治療適用における使用に導いた。ウイルスに基礎を置く送達システムは遺伝子送達の高効率をもたらし得るが、これらは多くの不利益を被る。例えば、最も広く使用されるウイルスシステムであるレトロウイルスベクターは、複製能レトロウイルス（replication-competen t retrovirus）(RCR)の生成を防止するために広範に改変されているが、そのようなRCRは白血病誘発性である可能性を有するので（Donahueら、J．Exp．Med．1 76:1125-1135，1992を参照のこと）、遺伝子治療における使用のためのすべてのレトロウイルス調製物は、使用の前にRCRの非存在を確実にするために広範な確認試験を経なければならない。これらの安全性の懸念に加えて、レトロウイルスおよびその他のウイルスベクターは、移入され得る遺伝物質および感染され得る標的細胞についてのサイズおよび配列の束縛を提起し得る（IsraelおよびKauf mann，Blood，75:1074-1080，1990; ShimotohnoおよびTemin，Nature 299，265- 268，1982; Steadら、Blood，71:742-747，1988; ならびにBodineら、Blood，82 :1975-1980，1993を参照のこと）。効率的な非ウイルス遺伝子送達（non-viral gene delivery）（NVGD）システムの開発は、遺伝子移入/遺伝子治療研究をウイルスベクターの上記の制限なしで実施することを可能にし、そして測定可能性の容易さ、コストおよび生成のスピードの利点も有する。これらの利点に基づいて、非ウイルス遺伝子送達システムはまた、注射可能遺伝子送達システムを現実とすることにより、より多くの疾患が遺伝子治療を通して処置されることを可能にし得る。既存の非ウイルス遺伝子送達システムは、大きく物理的アプローチと生化学的アプローチとに分けられ得る。物理的方法は、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメント（particle bombardment）、スクレープローディング（ scrape loading）およびリン酸カルシウムトランスフェクションのような技術を包含する（例えば、Fechheimerら、P.N.A.S．84:8463-8467，1987; Chengら、P. N.A.S．90:4455-4459，1993;およびKriegler，M．(編)「Gene Transfer and Exp ression，a Laboratory Manual」1990，W.H．Freeman Publishersを参照のこと）。生化学的方法は、送達されるべきDNAと、DEAE−デキストラン、グラミシジンＳ、リポソーム、ポリアミドアミンポリマー、ポリアミン、ポリブレン、カチオン性タンパク質およびポリ−Ｌ−リジンベースの結合体などの試薬とを混合する工程を包含する（例えば、KawaiおよびNishizawa、Mol．Cell．Biol．4:1172- 1174，1984; Behrら、P.N.A.S．86:6982-6986，1989; Roseら、P.N.A.S．Biotec hniques 10:520-525，1991; PardridgeおよびBoado、F.E.B.S．Lett．288:30-32 ，1991; LegendreおよびSzoka、P.N.A.S．90:893-897，1993; HaenslerおよびSz oka、Bioconj．Chem．4:372-379，1993;ならびにWuおよびWu、J．Biol．Chem．2 62:4429-4432，1987を参照のこと）。これらの異なるアプローチは、それらの遺伝子送達の効率においておよびそれらの移入された配列の長期の（すなわち、安定な）保持をもたらす能力において変化する。しかし、生化学的アプローチは遺伝子治療の観点から一般により魅力的である。なぜなら、このようなアプローチは大部分の物理的アプローチよりも注射可能遺伝子送達システムにおける使用のためのより大きな潜在性を有するからである。化学的架橋により組み立てられるポリ−Ｌ−リジンまたは他の塩基性ポリマーに基づく結合体の使用での１つの問題は、架橋に必要な化学的工程が不正確および煩雑であり得ることである。さらに、このようなシステムにおける異なる結合体成分の化学量論を制御することは、特により多くの成分が遺伝子送達を促進するために添加される場合、非常に困難である。発明の要旨安全、効率的かつ安定な非ウイルス遺伝子送達システムの継続的および未曾有の（unmet）必要性の観点から、本発明は目的のポリヌクレオチドに結合し得かつ結合されたポリヌクレオチドの標的細胞への（特に遺伝子治療のためにヒト標的細胞への）送達を促進し得る融合タンパク質のモジュール構築のための一般化されたアプローチを提供する。遺伝子送達融合タンパク質（Gene Delivery Fusion Protein）（GDFP）と称する本発明のタンパク質は、標的化核酸に結合し得る成分を含む核酸結合ドメイン（NBD）；およびそれが融合される標的化核酸の標的細胞への送達を仲介するまたは促進する１つ以上の成分を含む遺伝子送達ドメイン（GDD）を含む。以下で詳細に記載するように、核酸結合ドメインは、その本質的な特性がそれらが核酸に結合し得ることである、多くの成分のいずれもを包含し得る。そのような成分の多くが当該分野で公知であり（例えば、以下に引用する参考文献を参照のこと）、それらは配列特異的な様式で核酸に結合するタンパク質および比較的非特異的に核酸に結合するタンパク質を包含する。考察および例示の目的のために、核酸結合ドメインは、以下でより詳細に記載するように、核酸結合ドメインが配列特異的核酸結合タンパク質のアナログを含むか含まないに依存して２つの基本的なサブセットのいずれかに便利にグループ化され得る。本発明の遺伝子送達融合タンパク質の第１のタイプ（ときおり本明細書中で「タイプＩGDFP」という）においては、核酸結合ドメインは配列特異的核酸結合タンパク質（配列特異的NBP）のアナログを含む。本発明の遺伝子送達融合タンパク質の第２のタイプ（ときおり本明細書中で「I型I GDFP」という）においては、核酸結合ドメインは配列非特異的核酸結合タンパク質（配列非特異的NBP）のアナログを含み、そして配列特異的NBPのアナログを含まない。従って、本発明のGDFPの１つの実施態様は、標的化核酸を標的細胞に送達することにおいて有用な高分子である。これは遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）を含み、このGDFPは、その成分が配列特異的核酸結合タンパク質に由来する標的化核酸中の同族(cognate)認識配列に結合し得る成分を含む核酸結合ドメイン（NBD ）；およびそれが融合される標的化核酸の標的細胞への送達を仲介するまたは促進する１つ以上の成分を含む遺伝子送達ドメイン（GDD）を含む。配列特異的NBP に由来する結合成分に加えて、タイプＩGDFPの核酸結合ドメインはまた、以下で論ずるようにさらなる結合成分を含み得、これは配列特異的核酸結合タンパク質または配列非特異的核酸結合タンパク質のいずれかに由来し得る。本発明のGDFPの別の実施態様は、標的化核酸を標的細胞へ送達することにおいて有用な高分子である。これは遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）を含み、この GDFPは、その成分が配列非特異的核酸結合タンパク質のアナログである標的化核酸に結合し得る成分を含む核酸結合ドメイン（NBD）；およびそれが融合される標的化核酸の標的細胞への送達を仲介するまたは促進する１つ以上の成分を含む遺伝子送達ドメイン（GDD）を含む。本発明の１つの局面において、標的化核酸の標的細胞への送達を促進する遺伝子送達ドメイン（GDD）の成分は、結合/標的化成分、膜破壊成分、輸送/局在化成分およびレプリコン組み込み成分からなる群より選択される。本発明の別の局面においては、種々の機能的ドメインおよびGDFPの成分は、可動性ペプチドリンカー配列（「フレキソン（flexon）」）により分離され、これは成分が互いに比較的独立してコンフォーメーションを取る能力を増強する。本発明のGDFPの別の実施態様は、GDFPをコードする組換えポリヌクレオチドである。このタイプの好ましい実施態様において、ポリヌクレオチドは発現ベクターであり、そして種々のドメインおよびGDFPの成分がインフレームの融合産物として発現されるように配置されており、それによってGDFPの単一の組換え産物としての効率的なモジュール合成を可能にする。さらに別の実施態様は、上記の組換えポリヌクレオチドを用いてGDFPを生産する方法である。この方法は、組換えポリヌクレオチドを転写および/または翻訳させる工程ならびにGDFPを回収する工程を包含する。本明細書中で論ずるように、好ましい方法はGDFPの単一のタンパク質産物としてのモジュール合成を包含する。さらに別の実施態様は、GDFPを用いて標的化核酸（tNA）を標的細胞に送達する方法であり、この方法はGDFPを標的化核酸と接触させてGDFP/核酸複合体を生成させる工程およびこのGDFP/核酸複合体を標的細胞と接触させる工程を包含する。好ましくは、tNAは発現ベクターである。好ましくは、標的細胞は哺乳動物細胞である。さらに別の実施態様は、上記のGDFPの使用方法によって生成された細胞およびその子孫である。図面の簡単な説明図１は、タイプＩGDFPを用いる遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）概念の実施態様の模式図である。図２Ａおよび図２Ｂは、IL-2、GAL4、GAL4/IL-2 GDFPおよびIL-2/GAL4 GDFPをコードする発現ベクターを生成するために用いるクローニングストラテジーのダイアグラムである。図３は、35-S標識したGAL4/IL-2m GDFPのSDS-PAGEゲルである。図４は、GAL4/IL-2m GDFPによるDNA結合活性の保持を示すゲルシフトアッセイである。図５は、GAL4/IL-2 GDFPによるIL-2生物活性の保持を示す。図６は、35-S標識したGAL4/IL-2 GDFPおよびIL-2/GAL4 GDFPのSDS-PAGEゲルである。図７は、GAL4タンパク質ならびにIL-2/GAL4 GDFPおよびGAL4/IL-2 GDFPの配列特異的DNA結合を示す。図８は、IL-2/GAL4 GDFPおよびGAL4/IL-2 GDFPのサイトカイン生物活性を示す。図９は、IL-2レセプターを有するCTLLに結合するGDFPの能力を表すアッセイの結果を示す。図10は、IL-2レセプターを有するCTLLへの標的オリゴマーの結合を仲介するGA L4/IL-2 GDFPおよびIL-2/GAL4 GDFPの能力を表すアッセイの結果を示す。図11は、IL-2レセプターを有するCTLLへの標的プラスミドの結合を仲介するGA L4/IL-2 GDFPの能力を表すアッセイの結果を示す。発明の詳細な説明本発明は、それによってDNA、RNAおよび/またはそのアナログ（遺伝子送達において使用されるべき「標的化核酸」または「tNA」）が遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）との会合により改変される非ウイルス遺伝子送達システムを提供する。本発明の非ウイルス遺伝子送達システムは、２つの別個の物質：送達されるべき標的化核酸、およびGDFPの高分子複合体を含む。GDFPは標的化核酸に結合し得、そしてGDFP/tNA複合体の形成に導く核酸結合ドメイン（NBD）；およびそれが融合されるGDFP/tNA複合体の標的細胞への送達を仲介するかまたは促進し得る遺伝子送達ドメイン（GDD）を含む。本発明の好ましい実施態様において、種々のGDFPドメインおよび成分をコードするオープンリーディングフレームは融合されてGDFPの単一のポリペプチドとしての発現を可能にする。しかし、GDFPは、例えば個々のドメインおよび/または成分の間の１つ以上の短い可動性ペプチドリンカー配列（「フレキソン」）も含み得る。一般的定義用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」はアミノ酸のポリマーをいうために交換可能に用いられ、そしていかなるポリマーの特定の長さもいわない。これらの用語はまた、例えばグリコシル化タンパク質、アセチル化タンパク質、リン酸化タンパク質などの翻訳後修飾タンパク質を包含する。例えば、１つ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを包含する）を含有するタンパク質、置換された結合ならびに天然に生じるおよび天然に生じないの両方の当該分野で公知であるその他の改変を有するタンパク質もまた、定義内に包含される。「天然」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、天然に生じる供給源から回収されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。従って、語句「天然ウイルス結合タンパク質」は天然に生じるウイルス結合タンパク質をいう。タンパク質またはポリペプチドの「ムテイン」形態は、例えば、部位特異的変異誘発またはその他の操作によってもたらされる；転写または翻訳におけるエラーによってもたらされる；あるいは合理的な設計により合成で調製されるアミノ酸配列における微少な改変を有するタンパク質またはポリペプチドをいう。微少な改変は、ポリペプチドの生物学的活性が保持されているおよび/またはムテインポリペプチドが少なくとも90%の天然形態との相同性を有する、アミノ酸配列を生じる改変である。ポリペプチドＸの「アナログ」は、特定の生物学的活性を保持するポリペプチドＸのフラグメントおよびムテイン；ならびにより大きな分子（それが通常その中に見出される分子以外）に取り込まれているポリペプチドＸ；ならびに合理的な設計により調製された合成アナログを包含する。例えば、DNA結合タンパク質のアナログは、DNAに結合する能力を保持する天然DNA結合タンパク質の部分、そのムテイン、組換え融合タンパク質に組み込まれた完全な天然結合タンパク質、または合理的な設計によって合成で調製された天然結合タンパク質のアナログをいい得る。「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそのアナログをいう。この用語は、分子の１次構造のみをいう。従って、二本鎖DNAおよび一本鎖DNAならびに二本鎖RNAおよび一本鎖RNAが包含される。この用語は、メチル化されたまたはキャップ化されたポリヌクレオチドのような修飾されたポリヌクレオチドも包含する。 DNA、RNAまたはポリヌクレオチドの「アナログ」は、形態および/または機能において（特に、相補的なポリヌクレオチド配列上の塩基対への配列特異的水素結合に従事する能力において）天然に生じるポリペプチドに似ているが、例えば通常でないまたは非天然の塩基あるいは改変された骨格を有することにおいてDN AまたはRNAと異なる高分子をいう。種々のそのような分子が、アンチセンス工学における使用のために記載されている；例えば、E．Uhlmannら、(1990)Chemical Reviews 90:543 584およびその中で概説される刊行物を参照のこと。特定のポリヌクレオチドの「アンチセンス」コピーは、ポリヌクレオチドに水素結合し得、そしてそれゆえポリヌクレオチドの発現を調整し得る（すなわち「アンチセンス」調節により）相補的な配列をいう。そのようなアンチセンスコピーはDNA、RNAまたはそれらのアナログであり得、アナログは上記のように改変された骨格を有するアナログを包含する。アンチセンスコピーが結合するポリヌクレオチドは、一本鎖形態（mRNA分子のような）または二本鎖形態（染色体の部分のような）であり得る。「レプリコン」は、適切な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの複製を可能にする複製起点（一般にori配列という）を含むポリヌクレオチドをいう。例は、所望の核酸が組込まれ得る標的細胞のレプリコン（特に、核染色体およびミトコンドリア染色体；およびまたプラスミドのような染色体外レプリコン）を含む。ポリヌクレオチドに対して適用される場合、「組換え」は、ポリヌクレオチドが、天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物を生じる、クローニング、制限および/またはライゲーション工程の種々の組み合わせの産物であるポリヌクレオチドを意味する。「組換え」は、組換えポリヌクレオチドのタンパク質産物をいうためにも用いられ得る。代表的には、（例えば、NBDおよびGDDの成分の）構造コード配列をコードするDNA配列は、cDNAフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカー、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられて、転写調節領域に作動可能に連結されたときに発現され得る合成遺伝子を提供し得る。そのような配列は、好ましくは、通常真核生物遺伝子において見出されるような内部の非翻訳配列（すなわち「イントロン」）によって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供される。そのような配列および本発明に関していうすべての配列はまた一般的に、ウイルス、原核生物または真核生物のDNAまたはRNAテンプレートを適切なPCRアンプリマー（amplimer）と共に用いてPCR増幅により得られ得る。「組換え発現ベクター」は、転写調節領域ならびにRNA分子および/またはタンパク質の発現のために必要なコード配列を含み、そして標的細胞に導入され得る（例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは本発明の非ウイルス遺伝子送達（NVGD）技術により）ポリヌクレオチドをいう。さらなる例は、本発明のGDFPを発現するために用いられる発現ベクターであり得る。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「標的細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」およびその他のそのような用語は、組換えベクターまたはその他の移入ポリヌクレオチドのための受容体として使用され得るまたは使用されている高等真核生物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞をいい、形質導入されたもとの細胞の子孫を包含する。自然な、偶発的な、または故意の変異により、単一の細胞の子孫が必ずしも完全にもとの親細胞と同一であるわけではないことが理解される（形態学的あるいはゲノムまたは全DNA相補性において）。「オープンリーディングフレーム」（または「ORF」）は、ポリペプチドまたはポリペプチドの部分をコードし得るポリヌクレオチド配列の領域である（すなわち、この領域はタンパク質コード配列の部分またはタンパク質コード配列全体を表し得る）。「融合された」または「融合」は、２つ以上のエレメント、成分などの任意の手段での連結をいう。これは例えば、化学的結合（共有結合または非共有結合のいずれでも）により作製された「融合タンパク質」、および以下で論じる、組換え手段により「融合タンパク質」を生成するためのインフレーム融合の使用を包含する。「インフレーム融合」は、もとのオープンリーディングフレーム（ORF ）の正しいリーディングフレームを維持する様式で、組換え手段により２つ以上のORFを連結して、単一のより大きなORFを形成することをいう。従って、生じる組換え融合タンパク質は、もとのORFによりコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である（このセグメントは天然には通常はそのように連結されない）。このようにリーディングフレームは、融合されたセグメントを通して連続的であるが、セグメントは、例えば、以下に記載のインフレーム可動性ポリペプチドリンカー配列（「フレキソン」）により物理的に分離され得る。「フレキソン」は、代表的には小さい側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびセリン）を含む可動性ポリペプチドリンカー配列（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸配列）をいう。本発明において、フレキソンはGDFP中に１つ以上の種々のドメインおよび成分の間に組み込まれ得る。これらの成分の間にフレキソンを組み込むことは、これらの成分が互いに比較的独立してコンフォーメーションをとることを可能にすることにより機能性を増進すると考えられる。フレキソン中に組み込まれるアミノ酸の大部分は、好ましくは小さい側鎖を有するアミノ酸である。フレキソンは、好ましくは約４と100との間のアミノ酸、より好ましくは約８と40との間のアミノ酸、そして最も好ましくは約10と30との間のアミノ酸を含む。米国特許第5,073,627号および第5,108,910号に記載のフレキソン（「ピクシー（Pixy）」）配列もまたフレキソンとしての使用に適切である。「転写調節領域」または「転写制御領域」は、転写に必要なすべてのシス作用性配列を含むポリヌクレオチドをいい、そして調節に必要な配列を含み得る。従って、転写調節領域は少なくともプロモーター配列を含み、そしてエンハンサー、転写因子結合部位、ポリアデニル化シグナルおよびスプライスシグナルなどのその他の調節配列を含み得る。「作動可能に連結」は、そのように記載される成分がそれらの意図される様式でそれらが機能することを可能にする関係にある配置をいう。例えば、プロモーター配列がコード配列の転写を推進する場合、プロモーター配列はコード配列に作動可能に結合されている。本明細書中で用いる用語「形質導入」は、挿入のために用いられる方法にかかわらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入をいう。この方法は、例えば、トランスフェクション、ウイルス感染、形質転換、エレクトロポレーション、および本発明の非ウイルス遺伝子送達技術を包含する。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中に安定にまたは一時的に維持され得る。安定な維持は、代表的には導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合性の複製起点を含んでいるかまたは染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）あるいは核染色体またはミトコンドリア染色体のような宿主細胞のレプリコンに組み込まれているかのいずれかを必要とする。「レトロウイルス」は、ウイルスRNAゲノムを複製するためにRNA指向性DNAポリメラーゼすなわち逆転写酵素を利用して、トリまたは哺乳動物宿主細胞の染色体DNAに組み込まれる二本鎖DNA中間体を生じるウイルスの分類である。多くのそのようなレトロウイルスが当業者に公知であり、そして例えば、Weissら編、RNA Tumor Viruses 、第２版、Cold Spring Harbor，New York(1984および1985)に記載されている。レトロウイルスゲノムを含むプラスミドもまた、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）およびその他の供給源から広く入手可能である。多数のこれらのウイルスの核酸配列が公知であり、そして例えば、GENBANK のようなデータベースから一般に入手可能である。「配列特異的核酸結合タンパク質」は、他の核酸配列よりも高い親和性で配列特異的な様式で核酸に結合するタンパク質、すなわち、特定の核酸配列（すなわち、下記の「同族認識配列」）に結合するタンパク質である。「配列非特異的核酸結合タンパク質」は、配列非特異的様式で核酸に結合するタンパク質、すなわち、核酸に一般的に結合するタンパク質である。所定のリガンドの「同族」レセプターは、通常このようなリガンドに結合し得るレセプターをいう。「同族」認識配列は、配列特異的核酸結合タンパク質の核酸結合ドメインが、他の核酸配列よりも高い親和性で結合するヌクレオチド配列として定義される。「同族」相互作用は、このようなタイプの結合に基づく分子間会合をいう（例えば、レセプターとその同族リガンドとの間の会合、および配列特異的核酸結合タンパク質とその同族核酸配列との間の会合）。「遺伝子送達」は、遺伝子移入のための標的細胞への標的化核酸の導入として定義され、そして標的化/結合、取り込み、輸送/局在化、レプリコン組み込みおよび発現を包含し得る。本明細書中で用いられる「リンパ球」は、大きな丸い核（ギザギザであり得る）および少ない細胞質を有する球形の細胞である。リンパ球は、非自己抗原を特異的に認識しそして応答する細胞であり、そして特異的免疫の発達を担う。種々のクラスのＢリンパ球およびＴリンパ球が「リンパ球」に含まれる。「リンパ造血幹細胞（lymphohematopoietic stem cell）」は、代表的には骨髄または末梢血から得られ、そして細胞分裂を通してリンパ系または造血系の任意の成熟細胞を生じ得る細胞である。この用語は、自己再生の有意だが制限された能力を有する方向付けられた前駆細胞（comitted progenitor cell）およびCF U-Sアッセイにおいて脾臓コロニーを形成し得るようなより始原の細胞、および移植された哺乳動物宿主中で長期のおよび/または多系列再集団形成能（multili neage re-populating ability）を保有するさらにより始原の細胞を包含する。「リンパ造血細胞」は、リンパ系または造血系の種々の成熟細胞（リンパ球およびその他の血液細胞を含む）ならびにリンパ造血幹細胞を包含する。「細胞の初代培養物」または「初代細胞」は、インビボの組織に直接由来し、そして広範に継代されていない細胞をいう。初代培養物は、主にその培養物が由来した組織に見出される核型と実質的に同一の核型の保持およびインビボでの細胞応答に実質的に類似する環境の操作に対する細胞応答により、細胞株および樹立培養物と区別され得る。以下で詳細に記載するように、本発明の非ウイルス遺伝子送達複合体は、核酸結合ドメイン（NBD）を通して標的化核酸に結合し、そして遺伝子送達ドメイン（GDD）を通して遺伝子送達を促進する遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）を包含する。これらのドメインの各々は多数の異なる機能的成分および準成分（sub- component）を包含し得る。これらの潜在的な成分のいくつかを以下のリスト中に要約する：非ウイルス遺伝子送達複合体（「GDFP/tNA複合体」） 1 ．遺伝子送達融合タンパク質(GDFP) A．核酸結合ドメイン（NBD）（1）核酸結合（NB）成分（2）その他の可能な成分（例えば、tNAの圧縮を仲介する） B．遺伝子送達ドメイン（GDD）（1）結合/標的化（B/T）成分（2）膜破壊（M-D）成分（3）輸送/局在化（T/L）成分（4）レプリコン組み込み（RI）成分 2 ．標的化核酸（tNA） A．GDFPの結合部位（以下を参照のこと） B．目的の配列（例えば、送達されるべき遺伝子） C．その他の可能な配列（例えば選択マーカー）各々のこれらのドメインおよび成分ならびに含まれ得るさらなるエレメントは、以下で詳細に定義され、そして記載される。本発明の実施は、他に示さないかぎり、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の当該分野の技術範囲の多くの従来技術を用いる。そのような技術は文献に十分に説明されており、例えば、Kriegler，M．（編）「Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual」（1990）、W.H．Freeman Publishers; Sambrook，FritschおよびManiatis「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 」第２版（1989）;F.M．Ausubelら（編）「Current Protocols in Molecular Bi ology」（1987および1993）;M.J．Gait（編）「Oligonucleotide Synthesis」（ 1984）;R.I．Freshney（編）「Animal Cell Culture」（1987）;J.M．MillerおよびM.P．Calos（編）「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」（1987 ）;D.M．WeirおよびC.C．Blackwell（編）「Handbook of Experimental Immunol ogy」J.E．Coligan，A.M．Kruisbeek，D.H．Margulies，E.M．ShevachおよびW． Strober（編）「Current Protocols in Immunology」（1991）；および「Method s in Enzymology」（Academic Press，Inc.）と題されたシリーズを参照のこと。本明細書中上記および下記両方のすべての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中に参考として援用される。Ｉ型遺伝子送達融合タンパク質の説明遺伝子送達融合タンパク質／標的化核酸複合体(GDFP/tNA) 本発明のコンセプトの１つは、標的化核酸(tNA)内の同族認識配列に結合し、標的細胞内へのtNAの送達を促進し得る、組換え遺伝子送達融合タンパク質(GDFP )を生成することである。GDFPは、核酸結合ドメイン(NBD)によって標的化核酸を結合し、遺伝子送達ドメイン(GDD)によって遺伝子送達を促進する。したがって、本発明の文脈においては、標的化核酸を、GDFPによって仲介または増大された１つまたはそれ以上の工程を通して送達し得る。具体的には、遺伝子送達プロセスは、以下の工程の内の１つまたはそれ以上を包含し得る：(1)GDF P/tNA複合体の、標的細胞の表面への結合および/または標的化；(2)(GDFPを用いる、あるいは用いない)標的細胞によるtNAの取込み；(3)tNAの、核あるいはミトコンドリア等の細胞小器官への細胞内輸送および/または局在化；および(4)tNA の、染色体等の細胞内レプリコンへの組込み。特定のGDFPが、これらの機能の全てを果たす必要は必ずしもない。例えば、発現ベクターを細胞の核へ送達するように意図されたGDFPは、以下を含むように構築され得る：(i)発現ベクター上の同族認識配列に結合し得るNBD；(ii)核局在配列等の輸送/局在化成分のみを有するGDD。次いでこのようなGDFPを標的化核酸と複合体化し、エレクトロポレーション等の形質導入法によって標的細胞に導入する。次いでGDFPにより、核、おそらくレプリコン中の特定部位への輸送/局在化を促進し得、そしてそれ故ベクターの発現が増大する。あるいは、例えば、前述のGDDを改変して、結合/標的化成分および膜破壊成分を含ませ得る。このようなGDDを用いて、GDFP/tNA複合体を、細胞集団の中の特定の細胞型に向けることが可能になり、また、複合体の取込みをエレクトロポレーション等を必要とせずに行うことが可能になる。前者の例のように、GDFPのエレクトロポレーション等の技術と組み合わせた使用は、無論、インビトロ遺伝子送達により適切であり得る。後者の例に記載されたGDFPの使用は、インビトロあるいはインビボいずれかにおける遺伝子送達に容易に適用可能である。同様に、GDFP/tNA複合体は、遺伝子送達を増大させる他のタンパク質あるいは単純な化学物質との混合物として用いられ得る。これには、例えば、膜破壊物質を途中で(in trans)添加することによってGDFP/tNA複合体の取込みを増大することが含まれる。他の成分の組合せが、遺伝子送達スキームの特定のデザイン目的物に従って調製され得る(そして特定のバージョンの成分が選択され得る)。これらの目的物は、例えば、標的化されるべき細胞の位置、標的化の所望の細胞特異性、および所望のtNAの細胞下(sub-cellular)目的地を含み得る。以下に、GDFP/tNA複合体の個々のドメインおよび成分、ならびにそれらの構築およびアセンブリをより詳細に記載する。１．遺伝子送達融合タンパク質(GDFP) GDFPは、核酸結合ドメイン(NBD)、および遺伝子送達ドメイン(GDD)の２つの主要ドメインを含む。これらの主要ドメインの各々は、それぞれ、核酸結合および遺伝子送達を促進する１つまたはそれ以上の成分を含む。これらの個々の成分は、天然に存在するタンパク質に由来し得、または合成物(例えば天然に存在する成分のアナログ)であり得る。種々の成分をコードするポリヌクレチオドは、公開された配列情報に基づいて合成することも可能であるが、代表的にはこれら成分をコードするクローン化DNAはプラスミドとして既に入手可能である。これらの成分をコードするポリヌクレチドはまた、例えば、MullisおよびFaloona（198 7）Meth．Enzymology 155:335に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応(PC R)法を用いても容易に得られる。以下に詳細に論議されるGDFPの構築において、ドメインおよびそれらの様々な成分をコードするDNA配列を、好ましくは、フレームを合わせて(in-frame)融合し、GDFPが都合良く単一ポリペプチド鎖として(つまりそれ以上のアセンブリは不要)合成され得る。様々なドメインおよび成分はまた、先により詳細に規定された「フレクソン(flexon)」と呼ばれるフレキシブルなペプチドリンカー配列によって分離され得る。Ａ．核酸結合ドメイン(NBD) 核酸結合ドメインは、GDFPの遺伝子送達ドメインが、tNAの標的細胞への送達を仲介あるいは増大し得るのに十分な親和性で、標的化核酸(tNA)に(直接あるいは間接的のいずれかで)結合し得る、所定長さのポリペプチドである。最も都合の良いのは、NBDが任意の中間結合要素を必要とすることなくtNAに直接結合することである。Ｉ型GDFPにおいて、NBDは、配列特異的核酸結合タンパク質のアナログである配列特異的結合成分を含む。この型の１つの好適な実施形態において、この成分は、NBDによる核酸結合を、tNAに関して配列特異的にすることができる。この場合、図１に示すように、NBDはtNA内の特異的同族認識配列に結合し得る。本明細書に記載されるように、Ｉ型GDFPアプローチの特有の利点の１つは、tN Aへの送達成分の化学量論結合が可能になるだけでなく、GDFPを、tNAに関して予め決められた位置に配置されることを可能にすることである。例えば、末端のインテグラーゼ認識配列の近位にあるNBD同族認識配列を配置すれば、後述のように、組込みを仲介するためのGDFPの使用を促進し得る。 NBDは、例えば、公知の核酸結合タンパク質、またはその核酸結合領域を含み得る。また、NBDは、同一のまたは異なる核酸結合タンパク質由来の２つまたはそれ以上の核酸結合領域を含み得る。NBD内の核酸結合領域のこのような多量体化によって、GDFPと標的化核酸との相互作用が所望の特異性および/またより高い親和性となることを可能にし得る。後述のように、この戦略を、単独であるいはtNA内の認識配列モチーフの多量体化と組み合わせて結合力を増加し得る。 GDFPのNBDドメインをコードするDNAは、多くの異なる供給源から得られ得る。例えば、核酸を結合し得る多くのタンパク質が分子的にクローニングされ、そしてそれらの同族標的認識配列が同定されている(例えば、Mitchell & Tjian、Sci ence 245:371-378、1989; PaboおよびSauer、Ann．Rev．Biochem．61:1053-1095 、1992; Harrison、S.C.、Nature 353:715-719、1991; JohnsonおよびMcKnight 、Ann．Rev．Biochem．58:799-839、1989; および上記文献中で検討され、本明細書中に参考として援用される文献を参照のこと)。このような配列特異的結合タンパク質は、例えば、転写または核酸複製に関係するタンパク質のような調節タンパク質を含み、そして代表的には、別のDNA結合ドメインおよび調節ドメインからなるモジュール構築を有する(例えば、Struhl、Cell 49:295-297、1987; Frankel およびKim、Cell 65:717-719、1991; およびPaboおよびSauer、Ann．Re v．Biochem．61:1053-1095、1992、ならびに上記文献中で検討され、本明細書中に参考として援用される文献を参照のこと)。このような核酸結合タンパク質の多くのファミリーが、例えば以下を含む再現(recurring)構造モチーフに基づいて特徴づけられている：バクテリオファージλcIリプレッサーのようなHelix-Turn-H erixタンパク質；Drosophila AntennapediaレギュレータのようなHomeodomainタンパク質；哺乳動物転写因子Oct2のようなタンパク質内に存在するPOUドメイン；亜鉛フィンガータンパク質(例えばGAL4)；ステロイドレセプター；ロイシンジッパータンパク質(例えばGCN4、C/EBPおよびc-jun)；βシートモチーフ(例えば原核Arcリプレッサー)；および他のファミリー(血清応答因子、c-myb、NFkBおよびrelのようなガン遺伝子などを含む)；例えば、PaboおよびSauer、Ann．Rev．B iochem．61:1053-1095、1992、および上記文献中で検討され、本明細書中に参考として援用される文献を参照のこと。これらのタンパク質の多くについて、核酸結合ドメインが詳細にマップされている。また、このようなドメインのいくつかについて、異種配列との組換え融合体が作製され、そして親のDNA結合ドメインの結合活性を保持することが示されている。例えば、酵母由来の転写アクティベーターGAL4の場合、DNA結合ドメインが規定されており、そしてこのドメインのDNA配列特異的結合活性を保持する異種隣接配列への融合が作製されている(Keeganら、Science 231;669-704、1986 ; MaおよびPtashne、Cell 48:847-853、1987)。機能的に結合ドメインを「交換」するこの能力はまた、例えば、E.coli lex Ａリプレッサー(BrentおよびPtash ne、Cell 43:729-736、1985)、酵母転写アクティベーターGCN4(HopeおよびStruh l、Cell 46:885-894、1986)、バクテリオファージλcIリプレッサー(Huら、Scie nce 250:1400-1403、1990)、哺乳類転写因子Spl(Kadonagaら、Cell 51:1079-109 0、1987)およびC/EBP(Agreら、Science 246:922-926、1989)を含む多くの他のDN A結合タンパク質について示されている。同様に、核DNA-結合性ステロイドホルモンレセプターにおける機能的な交換が報告されている(例えば、GreenおよびCh ambon、Nature 325:75-78、1987を参照のこと)。また、例えば、KlugおよびRhod es、Trends Biochem．Sci．12:464-471、1987; Berg、Cell 57:1065-1068、1989 ; Wasylykら、Eur．J．Biochem．211:7-18、1993; FaisstおよびMeyer、Nucl．A cids Res．20:3-26、1992; Struhl、Trends Biochem．Sci．14:137-140、1989; およびNelsonおよびSauer、Cell 42:549-558、1985もまた参照のこと。配列特異的核酸結合タンパク質は、インビトロで、異なる同族核酸配列に対して所定範囲の結合親和性を示し得る(例えば、Vasheeら、J．Biol.Chem 268:24699-24706 、1993を参照のこと)。本発明では、ウイルスにコードされた核酸結合タンパク質もまた用いられ得る。これらには、例えば、一本鎖DNA、二本鎖DNAそしてまたRNAをも結合し得るアデノウイルスE2A遺伝子産物(Cleghonら、Virology 197:564-575、1993、およびこれらに引用されている文献)；レトロウイルスINタンパク質(KrogstadおよびCh ampoux、J．Virol 64:2796、1990)；AAV rep68および78タンパク質(Owensら、J ．Virol 67:997、1993)；およびSV40Ｔ抗原(Arthurら、J．Virol.、62:1999-200 6、1988)が含まれる。Ｔ抗原を結合する細胞p53遺伝子産物もまた、DNA結合タンパク質である(Funkら、Mol．Cell Biol.、12:2866-2871、1992)。同様に、RNA結合タンパク質が同定されており、そしてこれらがNBD内に含まれることによって、GDFPを標的化RNAと会合させ、これによってGDFPの遺伝子送達ドメインにより仲介されるRNA送達を達成する。本発明の文脈において用いられ得るRNA結合タンパク質には、例えば、HIVのTatおよびRevタンパク質が含まれる。例えば、Tileyら、P.N.A.S.89:758-762、1992；およびCullenらのCell 73:417 -420、1993を参照のこと。同様に、インターフェロンで誘導可能な9-27遺伝子産物(Constantoulakisら、Science 259:1314-1318、1993)のような細胞RNA結合タンパク質もまた用いられ得る。Ｉ型GDFPの核酸結合ドメインはまた、(配列特異的核酸結合タンパク質由来の成分に加えて)１つまたはそれ以上の配列非特異的核酸結合タンパク質由来の成分を含み得る。このような配列非特異的結合タンパク質には、例えば、ヒストン (von Holt、Bioassays 3:120-124、1986; Rhodes、Nucleic Acids Res．6:1805- 1816、1979; Rodriguezら、Biophys．Chem．39:145-152、1991)；ヌクレオリン( Erardら、Eur．J．Biochem．191:19-26、1990)のようなタンパク質；ポリ-L-リジン(Liら、Biochemistry、12:1763-1772 1973; WeiskopfおよびLi、Biopolymer s 16:669-684、1977)、アビジン(PardridgeおよびBoado、F.E.B.S．Lett．288:3 0-32、1991)のようなポリ塩基性ポリペプチド配列；非ヒストン高移動度群タンパク質、および核酸と非特異的に相互作用する他のタンパク質(例えば、PaboおよびSauer、Ann．Rev．Biochem．61:1053-1095、1992、およびそこで検討されている文献を参照のこと)が含まれる。核酸を配列非特異的な様式で結合する他のタンパク質には、レトロウイルスヌクレオキャプシド(NC)タンパク質が含まれる (例えば、Gelfandら、J．Biol．Chem.、268:18450-18456、1993を参照のこと)。Ｂ．遺伝子送達ドメイン(GDD) GDFPのGDD部分は、遺伝子送達の有効性を仲介あるいは増大させる１つまたはそれ以上のポリペプチド領域を含んでいる。このような配列は、以下に述べるように、例えば、結合／標的化成分、膜破壊成分、輸送／局在化成分およびレプリコン組み込み成分を含み得る。特定のGDDは、上記の型の各々を示す成分を含む必要がない。逆に、GDDは、所定のタイプの単一成分を超える成分を含むことによって、所望の活性が得られ得る。さらに、GDDの特定のセグメントが２つまたはそれ以上のこれらの成分の機能を供し得る。例えば、ポリペプチドの単一の領域が、細胞表面への結合およびその表面における膜破壊の両方において機能し得る。(1) 結合／標的化（B/T）成分結合／標的化成分は、細胞表面への結合を仲介するポリペプチドの領域である（この結合は、特異的であっても非特異的であってもよく、また、直接的であっても間接的であってもよい）。所望の標的細胞の表面に結合し得る任意のタンパク質が、B/T成分の供給源として用いられ得る。このようなタンパク質は、例えば、特定の細胞表面レセプターに結合するサイトカインのようなリガンド、抗体、レクチン、ウイルス結合タンパク質、細胞接着性分子、および細胞表面に関連する任意のその他のタンパク質を含む。これらの結合タンパク質に対する「レセプター」はタンパク質を含むがこれらに限定されない。さらに、レセプターは、特定の細胞型に特異的および／または制限され得るが、必ずしもそうである必要はない。本質的には、B/T成分は、細胞表面分子に結合する任意のリガンドから調製され得る。具体例としては、B/T成分が由来し得るタンパク質の１つのグループはサイトカインである。サイトカインは、細胞間シグナル分子であり、それらのうちで最よく知られているものは哺乳動物体細胞の調節に関連している。その効果における成長促進および成長阻害の両方にあるサイトカインのファミリーのいくつかが特徴づけられている。従って、B/T成分は、哺乳動物細胞の表面上でサイトカインのレセプターと結合するために必要である、サイトカインポリペプチドの一部分あるいはサイトカインポリペプチドのそのような一部分の変異タンパク質を少なくとも含むアミノ酸配列を含み得る。サイトカイン由来のB/T成分は、以下に記載するように「サイトカインエフェクター活性」に関連するサイトカインの一部分も含み得るが、必ずしもこの一部分を含む必要はない。本発明において用いられ得るサイトカインの例は、例えば、インターロイキン (IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9(P40)、IL-10、I L-11、IL-12およびIL-13など)；CSF型サイトカイン(GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LIF 、EPO、TNF-αおよびTNF-βなど)；インターフェロン（IFN-α、IFN-βおよびIF N-γなど）；TGF-βファミリーのサイトカイン(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、インヒビンＡ、インヒビンＢ、アクチビンＡおよびアクチビンＢなど)；化学走性因子(NAP-1、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、SISβ、SISδ、SISε、PF-4、P BP、γIP-10、MGSAなど);成長因子(EGF、TGF-α、aFGF、bFGF、KGF、PDGF-A、PD GF-B、PD-ECGF、INS、IGF-I、IGF-II、NGF-βなど)；α型インタークリンサイトカイン(IL-8、GRO/MGSA、PF-4、PBP/CTAP/βTG、IP-10、MIP-2、KC、9E3など)；およびβ型インタークリンサイトカイン(MCAF、ACT-2/PAT744/G26、LD-78/PAT46 4、RANTES、G26、1309、JE、TCA3、MIP-1α,β、CRG-2など)を含む。多数のその他のサイトカインもまた当業者には公知である。これらのサイトカインの供給源、特性、標的およびエフェクター活性も記載され、そしてこれらサイトカインの多くについて、分子をコードするDNA配列もまた公知である。例えば、Van Snick ，J.ら（1989）J．Exp．Med．169：363-368；Paul，S.R.ら(1990)Proc．Natl．A cad．Sci．USA 87: 7512-7516; Gately，M.K.ら（1991）J．Immunol．147:874-8 82; Minty，A.ら(1993)Nature 362:248; およびArai，Kら(1990)Annu．Rev．Bio chem．59:783-836による総説：ならびにOppenheim，J.J.ら（1991）Annu．Rev． Immunol．9:617-48; Waldman，T.A.（1989）Annu．Rev．Biochem．58:875-911; Beutler，B.ら（1988）Annu．Rev．Biochem．57:505-18; Taniguchi， T.（1988）Annu．Rev．Immunol．6:439-64; Paul，W.E.ら（1987）Annu．Rev．I mmunol．5:429-59; Pestka，S．ら（1987）Annu．Rev．Biochem．56:727-77；Ni cola，N.A.ら（1989）Annu．Rev．Biochem．58:45-77; およびSchrader，J.W．( 1986)Annu．Rev．Immunol．4:205-30；およびこれらで検討および／または引用されている特定の刊行物を参照のこと。これらの刊行物は、本明細書にその全体が参考として引用されている。サイトカインをコードする多くのDNA配列はまた、GENBANKなどの配列データベースからも一般的に利用可能である。公表されている配列情報に基づいて、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを合成することも可能であるが、代表的には、そのようなサイトカインをコードするクローニングされたDNAは、プラスミドとして既に入手可能である。サイトカインをコードするポリヌクレオチドは、例えば、MullisおよびFaloona(1987)Meth．Enz ymology 155:335により記載されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を用いることによっても得られ得る。所定の標的細胞型に有効な新しいサイトカインを同定するアッセイを含む、サイトカインの検出、精製および特徴付けはまた、上記で参照した文献、ならびに例えば、Clemens，M.J.ら(編)(1987)”Lymphokines and Int erferons”IRL Press，Oxford；およびDeMaeyer，E.ら(1988)”Interferons and Other Regulatory Cytokines”John Wiley & Sons，New Yorkを含む多くの刊行物に記載されている。細胞の特定のサブ集団を標的化するために適したリガンドは、そのサブ集団の細胞上に存在するレセプターに結合するリガンドである。再度、サイトカインを例として挙げると、多数のこれらの分子についての標的細胞が、上記のように既に公知である。また、多くの場合において、サイトカインに対する特異的細胞表面レセプターは既に同定および特徴づけられている。例えば、上記で参照した刊行物を参照のこと。代表的には、サイトカインに対する細胞表面レセプターは、単鎖ポリペプチドあるいは複数のタンパク質サブユニットのいずれかからなる貫膜糖タンパク質である。レセプターは、一般に、高い親和性および特異性を有するそれらの同族リガンドに結合し、そして様々な体細胞上に広く分散するか、あるいは所定の細胞サブセットに極めて特異的であり得る。所定の細胞型上のサイトカインレセプターの存在はまた、所定の細胞の成長あるいはその他の特性を調整するサイトカインの能力からも予測され、そして例えば、標識化されたサイトカインのそのような細胞への結合を監視することによって、および上記で引用された文献に記載されているようなその他の技術によって決定され得る。このように、例えば、多数のサイトカインレセプターが特徴付けされ、そしてそれらの多くが、類似の構造モチーフを共有するレセプターファミリーに属することが知られている。例えば、Miyajima，A.ら、Ann．Rev．Immunol．10:295-33 1(1992)による総説、および本明細書において参考として援用される、この引例で検討される刊行物を参照のこと。Ｉ型サイトカインレセプター(すなわち、造血成長因子レセプター)は、例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、GM- CSF、G-CSF、EPO、CNTFおよびLIFのレセプターを含む。II型サイトカインレセプターは、例えば、IFN-α、IFN-βおよびIFN-γのレセプターを含む。III型サイトカインレセプターは、例えば、TNF-α、TNF-β、FAS、CD40およびNGFのレセプターを含む。IV型サイトカインレセプター(免疫グロブリン様すなわち「Ig様」レセプター)は、IL-1のレセプターならびにIL-6およびG-CSF(Ｉ型モチーフに加えてIg様モチーフを有する)のレセプターを含む。これらのレセプターファミリーは、例えば以下に記載されている。Smithら、Science 248: 1019-1023，1990 ）；Larsenら、J．Exp.Med.、172: 1559-1570，1990）；McMahanら、EMBO J．10 :2821-2832，1991)、およびCosmanら、Trends Biochem Sci 15: 265-269，1990) による総説;およびMiyajima、A.ら、Ann．Rev．Immunol．10:295-331(1992)、およびこれらにおいて検討される刊行物であり、これらのすべては本明細書に参考として援用される。新しいサイトカインが特徴づけられると、これらは、所望の結合特性および特異性を示す限り、本発明において用いられ得る。サイトカインの同定および特徴付け、ならびに特定の標的細胞を活性化するサイトカインの能力を試験するためのアッセイの使用は、当該技術分野で公知である。例えば、上記で参照した文献、およびClemens，M.J.ら(編)(1987)「Lymphokines and Inter ferons」IRL Press，Oxford; およびDeMaeyer，E.,ら(1988)「Interferons and Other Regulatory Cytokines」John Wiley & Sons，New Yorkを参照のこと。特定のリガンドの選択は、所望の標的細胞上での同族レセプターの存在に依存する。これはまた、その他の細胞上に同族レセプターがそれに対応して存在しないこと(これは標的化を回避するために好ましくあり得る)にも依存し得る。サイトカインとともに、例えば、様々な細胞系の調節における特定の分子の役割が当該分野において周知である。造血系では、例えば、造血コロニー刺激因子およびインターロイキンは、成熟血液形成細胞の生成および機能を調節する。リンパ球は、多くの、増殖のためのサイトカインに依存する。例えば、細胞障害性Ｔリンパ球(CTL)は、外来抗原に応答して成長および増殖を行うための、IL-2などのヘルパーＴ(Ｔ_H)細胞由来のサイトカインに依存する。(ZinkernagelおよびDoherty ，Adv．Immunol．27:51、1979; Maleら、Advanced Immunololy，第7章、Gower P ubl.、London，1987; Jacobsonら、J．Immunol.133:754、1984)。IL-2は、例えば、CTLに対して潜在的な分裂促進因子であり(GillisおよびSmith、Nature 268: 154，1977)、そして抗原およびIL-2の組み合わせによって、一次CD4⁺Ｔ細胞のインビトロ増殖を引き起こす。インビボでのCD8⁺CTLの成長および維持に対するIL- 2の重要性は、導入された抗レトロウイルスCD8⁺細胞の治療有効性が後にIL-2の投与が行われると増大する養子免疫治療のモデルで示されている(Cheeverら、J ．Exp．Med．155:968，1982: Reddehaseら、J．Virol．61:3102、1987)。IL-4およびIL-7もまた、成熟CD8⁺CTLの増幅を刺激し得る(Aldersonら、J．Exp．Med．1 72:577、1990)。IL-2の場合は、IL-2レセプターは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、グリオーム細胞および単核細胞系列の細胞上で発現される(Smith 、Science 240:1169、1988)。しかし、高親和性IL-2レセプター発現の最も高いレベルは、活性化Ｔ細胞において観察されている(Waldemann、Ann．Rev．Bioche m、58:875、1989)。IL-2レセプター複合体は、３つのタンパク質成分から成る。それらは、低親和性レセプターα、Tacあるいはp55(Leonardら、Nature 311:626 、1984)、中間親和性レセプターβあるいはp70(Hatakeyama、Science 244:551、 1989)およびp70レセプターサブユニットと相互作用するシグナル形質導入タンパク質γあるいはp64(Takeshitaら、Science 257:379，1992)である。αおよびβ サブユニットの一緒の組み合わせは、IL-2レセプターの高親和性形態を形成し(H atakeyama、Science 244:551、1989)、α-β-γの組み合わせは、最も高い親和性を有するようである(Asaら、P.N.A.S．90:4127-4131、1993)。従って、例えば、IL-2を含むGDFPは、高レベルのα-β-γ高親和性レセプターを発現する活性化Ｔリンパ球に遺伝子送達を特異的に標的化するために用いられ得る。多数のその他のサイトカインの細胞標的が公知であり、そして総説および上記で引用したその他の文献において記載されている。さらに、これらの文献に記載されているアプローチに従って、任意の特定の細胞集団あるいはサブ集団が、所定のサイトカインに対する感受性について容易にアッセイされ得る。特定のリガンドの選択はまた、(細胞表面への結合の他に)リガンドが有し得るその他の活性によって影響され得る。例えば、サイトカイン由来B/T成分を有するGDFPは、サイトカインの活性に従って標的細胞を調整するために用いられ得るサイトカインエフェクター活性を有し得る。代表的には、この型のGDFPは、サイトカインをコードする配列全体を、GDFPをコードするポリヌクレオチドに組み込むことによって調製される。しかし、レセプターへの結合に必要がなく、サイトカインエフェクター活性にとっても必須ではないサイトカイン配列の部分を除去することもまた可能である。このような場合、GDFPは、(i)特異的標的細胞への結合；(ii)標的化核酸の標的細胞への送達；および(iii)このように標的にされた細胞のサイトカイン調整を含む活性の組み合わせを提供し得る。このような活性の組み合わせによって、例えば、特定の細胞の形質導入を、形質導入細胞の増殖と組み合わせることが可能になる。これは、所定の細胞集団内で標的細胞の増殖を促進するために用いられ得るので、遺伝子送達において一般的に有利である。また、そうでなければ標的細胞の分裂(導入遺伝子の効率的で安定な組み込みに必要であり得る)を誘発させることが困難あるいは不可能であり得るようなインビボでの遺伝子送達についてこれは特に有利であり得る。随伴するエフェクター活性を有さないサイトカインのようなリガンドの、レセプター結合能力を利用することが好ましい場合もある。これは、例えば、適したレセプター結合特性を有するサイトカインが、ネガティブなあるいは望ましくない影響を標的細胞活性に対して有するときであり得る。このタイプのGDFPは、例えば、エフェクター活性に対応するドメインが、例えば、置換、挿入あるいは欠失によって変異により改変されたサイトカイン配列から調製され得る。例えば、 IL-2は欠失分析に供され、配列のどの部分がレセプター結合に関連し、そしてどの部分がサイトカインエフェクター活性に重要であるかが同定される。例えば、 Brandhuber，B．J.ら、J．Biol．Chem．262: 12306-308、1987; Brandhuber，B ．J.ら、Science 238: 1707-09、1987；Zurawski，S.M.ら、EMBO J．7:1061-69 、1988；およびArai，Kら、Annu．Rev．Biochem．59:783-836、1990を参照のこと。多数のその他のサイトカインのレセプター結合およびエフェクタードメインが同様に特徴付けられている。Araiら、前述に同じ、および、そこに引用されているその他の総説および文献を参照のこと。新規なリガンドおよびそれらの同族レセプターの分子的なクローニングが、最近、迅速に行われたことによって、これらの分子の幅広いアレイ(array)が生成されている。特に、直接cDNA発現クローニング、および増殖を誘発または標的細胞上での特異的細胞表面レセプターへの結合のいずれかに対するスクリーニングアッセイの組み合わせによって、多くの新しい分子がクローニングされるに至った(例えば、Cosmanら、Trends Biochem Sci 15：265-269、1990を参照のこと)。これらの技術の出現によって、それらの結合特性および特異性に基づいて、GDFP のB/T成分として本発明において用いられ得る、細胞に結合するサイトカインおよびその他のタンパク質を含む、より多くのリガンドのクローニングが行われることが明らかである。flk-2/flt-3リガンド(Lymanら、Cell 75:1157-1167、1993 )由来のB/T成分が目的である。なぜなら、サイトカインは、初期造血細胞上で発現されるレセプターflk-2/flt-3に特異的に結合するからである(Matthews，W．ら、Cell 65:1143、1991；およびSmallら、P.N.A.S．91:459-463、1994)。従って、本発明の文脈において、flk-2リガンド由来のB/T成分を含むGDFPは、遺伝子送達をリンパ造血幹細胞に向けるために用いられ得る。上記の原理は、好都合な例としてサイトカインを用いて示されているが、これらの原理はまた、例えば、抗体、レクチン、ウイルス結合タンパク質、細胞接着性分子および細胞表面と関連する任意のその他のタンパク質を含む、細胞表面に結合し得る他のリガンドにも適用可能である。例えば、細胞表面抗原に対する多数の抗体が同定および記載されている。白血球に対する抗体が特徴づけられており、そして「CD」シリーズの抗原として分類されている。例えば、Coligan，J.ら(編)、「Current Protocols in Immunology 」Current Protocols、1992，1994を参照のこと。さらに、特定の標的細胞に特異的な新しい抗体を単離する技術は、当該分野においては常套である。有用な抗体は、所望の標的細胞の表面上で抗原と相互作用する抗体である。抗体／抗原結合は、フローサイトメトリーあるいはその他の免疫化学検出方法によって容易に決定および監視され得る。特定の標的細胞の表面上で専らあるいは優先的に発現される抗原が特に重要である。例えば、CD34抗原が、ヒトリンパ造血幹細胞上で発現される(Andrewsら、 Blood 80:1693-1701、1992)。トランスフェリン(例えば、Zenke，M.ら、P.N.A.S．87:3655-3659、1990を参照のこと)もまた、本発明の文脈においてB/T成分として用いられ得る。特定の細胞、例えば、呼吸上皮細胞を標的にすることもまた、免疫グロブリン (Ig)レセプターを介して行い得る(例えば、Ferkol，T.、J．Clin．Invest．92:2 394-2400(1993)を参照のこと)。本発明のGDFPはまた、例えば、乳糖の付加によって化学的に改変され得、GDFP を、アシアログリコプロテインレセプターに、そしてそれ故肝臓の肝細胞に標的化する(例えば、Neda，H.ら、J．Biochem．266: 14143-14146、1991を参照のこと)。 B/T成分が由来し得る別のグループのタンパク質はレクチンである。そのような多数の分子およびそれらの同族レセプターが同定および特徴づけられている( 例えば、Lis & Sharon、Ann．Rev．Biochem．55:35-67、1986による総説; およびこの文献に引用されている刊行物を参照のこと)。 GDDそしてそれ故GDFP/tNA複合体を細胞表面に標的化し得るタンパク質はまた、ウイルス由来であり得る。細胞に結合し得る多くのそのようなウイルスタンパク質が同定されており、例えば、レトロウイルスの周知のエンベロープ(「env」) タンパク質；インフルエンザウイルスのようなRNAウイルスの血球凝集タンパク質；セムリキ森林熱ウイルス(KielianおよびJungerwirth（1990）Mol．Biol．Me d．7:17-31)のようなウイルスのスパイクタンパク質；およびアデノウイルスのような非エンベロープウイルス由来のタンパク質(例えば、Wickhamら、Cell 73: 309-319、1993を参照)を含む。具体的な例として、マウス白血病ウイルス(MuLV)系において、gp70分子のアミノ末端領域は、細胞表面レセプターへの結合に関連していることが周知である。例えば、HeardおよびDanos、J．Virol．65:4026-4032、1991を参照のこと。Batt iniら、J．Virol．66: 1468-1475(1992)もまた、p15E TMタンパク質と相互作用する(そしてそれによって、ウイルス取り込みを仲介する)タンパク質の能力を妨害せずに、異なるMuLV envレセプターへの結合に切り換えるために、gp70のアミノ末端領域の一部分を交換し得ることを報告している。Weiss，R.ら、in Weiss ，R．ら(編)、RNA Tumor Viruses、Cold Spring Harbor、New York(1984および1 985)もまた参照のこと。同様に、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)系においては、gp1 20の変異分析により、CD4レセプターへの結合に重要である分子の部分が同定された。例えば、Kowalski，M.ら、Science 237: 1351-1355、1987を参照のこと。レセプター結合に重要な領域を同定するためのさらに別のアプローチは以下の通りである：結合を阻害することが知られている抗体を用いて、ウイルス結合タンパク質の切断フラグメントを免疫親和性精製し得；次いで、このフラグメンが部分的に配列決定され、ウイルス結合タンパク質の対応するドメインを同定する。例えば、Laskey，L.A.ら、Cell 50:975-985、1987を参照のこと。このような技術は、M-D成分がGDFP/tNA複合体の取り込みを仲介し得るままであるが（以下に記載）、結合の特異性が原則的にはウイルス結合タンパク質レセプターではなく、例えばB/T成分の一部分に対応する同族サイトカインレセプターの存在によって決定されるGDFPを生成するために用いられ得る。用いられ得るウイルスタンパク質の他の具体的な例は、VSVのＧタンパク質であり、これは、レトロウイルスベクターによる標的感染のために用いられている。例えば、Emiら、J．Virol．65: 1202-1207、1991を参照のこと。 B/T成分が由来し得る他のグループのタンパク質は細胞接着性分子である。多数のそのような分子、およびそれらの同族レセプターが同定および特徴づけられている(例えば、Springer，T.、Nature 346:425-434、1990、およびこの文献に引用されている刊行物を参照のこと)。(2) 膜破壊(M-D)成分膜破壊成分とは、局部的に細胞膜を破壊し得、その結果GDFP/tNA複合体が細胞膜を通過し得る、タンパク質配列である。標的細胞によるGDFP標的化核酸複合体の取り込みを促進するM-D成分は、代表的には疎水性特性を有するタンパク質構造の膜活性領域である。このような領域は、代表的には、タンパク質または粒子の細胞進入の容易化に関連する膜活性タンパク質中にある。例えば、ウイルスは一般的にエンドサイトーシスにより細胞に進入し、そしてエンドソーム膜を破壊するためのメカニズムを進化させた。多くのエンベロープ化ウイルスは細胞膜を破壊し得る表面タンパク質をコードし、これは、例えばレトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンドビスウイルス、セムリキフォレスト(Semliki Forest)ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、センダイウイルス、ワクチニアウイルス、およびマウス肝炎ウイルスを包含する；例えば、KielianおよびJungerwirth，Mol．Biol．Med.，7:17-31，1990；およびMarshおよびHeleni us，Adv．Virus Res.，36:107-151，1989を参照されたい。しばしば疎水性膜破壊ドメインの手段により、ウイルスの結合タンパク質が特異的細胞表面レセプターに結合し、続いてウイルスの進入を仲介するウイルス進入のメカニズムは、インフルエンザウイルスを含めエンベロープ化ウイルスにおける共通のテーマであり、そして多くのこのような分子が当業者に公知である。例えば、Hunterおよび Swanstrom，Curr．Top．Micro．and Immunol．157:187，1990；およびWhite，J. ，Science 258:917-924，1992による概説；およびそれらに概説されている刊行物を参照されたい。従って、例示として、本発明のM-D成分は、通常、宿主細胞へのウイルスの取り込みの仲介に関連するウイルス性結合タンパク質の一部分に、あるいは結合タンパク質のそのような一部分のムテインに由来し得る。このようなウイルス性結合タンパク質に由来し得るGDFPの部分はまた、ウイルス粒子を標的細胞上の特異的レセプターと会合させる結合タンパク質の部分を含んでもよいが、必ずしも必要ではない(従って、この後者の部分は、上記のB/T成分として機能し得る)。多くのウイルスが特徴付けされており、そしてこれらの多くについて、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列が公表されている。種々のウイルスによりコードされている結合タンパク質は、一次アミノ酸配列において相当の変化が存在し得るが、一般的に機能的相同性を共有する。例示のためにレトロウイルスを用いると、天然のenv遺伝子産物は、典型的には、ポリタンパク質前駆体であり、これは細胞表面への輸送の間にタンパク質分解的に切断されて２つのポリペプチドを産生する：外側表面上のグリコシル化ポリペプチド(「SU」タンパク質)および膜にまたがる、すなわち膜貫通タンパク質(「TM」タンパク質)である；例えば、Hunter， E.およびR．Swanstrom，Curr．Topics Microbiol．Immunol．157:187-253，1990 を参照されたい。SUタンパク質は感染プロセスにおける第１段階としての標的細胞の表面上の特異的レセプターへの結合の原因となる。TMタンパク質は、そのＣ末端を通じてウイルスコアタンパク質と会合しているのみならず、結合の後に起こる重要な膜融合事象の原因となり、そしてウイルスの細胞への進入を引き起こす(例えば、HunterおよびSwanstrom（1990）Curr．Top．Micro．and Immunol．1 57:187；KielianおよびJungerwirth（1990）Mol．Biol．Med．7:17-31；およびM arshおよびHelenius（1989）Adv．Virus Res.，36:107-151を参照されたい)。膜融合事象は、TMタンパク質のアミノ末端に存在する疎水性ポリペプチド配列により達成される。SUタンパク質およびTMタンパク質のこれらのペアならびにこれらを産生するウイルスの例は：マウス乳腫瘍ウイルス由来のgp52およびgp36である (Racevskis，J.ら、J．Virol．35:937-48，1980)；ラウス肉腫ウイルス由来のgp 85およびgp37(Hunterら、J．Virol．46:920，1983)；モロニー(Moloney)マウス白血病ウイルス由来のgp70およびp15E(Kochら、49:828，1984)；マーソンファイザー(Mason Pfizer)サルウイルス由来のgp70およびgp20(Bradac，J.ら、Virolog y 150:491-502，1986)；ヒト免疫不全ウイルス由来のgp120およびgp41(Kowalski ，M.ら、Science 237:1351-1355，1987)；およびヒトＴ細胞白血病ウイルス由来のgp46およびgp21(Seikiら、Proc．Natl．Acad．Sci．80:3618，1983)；および本明細書中に引用される参考文献中に記載される他のペアおよびウイルスである。これらの型のタンパク質の機能的類似性は、コアタンパク質および核酸が第１のウイルスにより提供され、そしてエンベロープタンパク質(宿主域を決定する) が異なるウイルスにより提供される、よく裏付けされた現象である「偽型付け(p seudotyping)」によりさらに説明される(例えば、Vileら、Virology 180:420，1 991;Millerら、J.Virol．65:2220，1991；およびLandauら、J.Virol，65:162，1 991を参照されたい)。本発明における使用のためのフラグメントを得るために使用され得るレトロウイルスの例として、ハーベイ(Harvey)マウス肉腫ウイルス(Ha- MSV)、カーステン(Kirsten)マウス肉腫ウイルス(Ki-MSV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(Mo-MSV)、種々のマウス白血病ウイルス(MuLV)、マウス乳腫瘍ウイルス (MMTV)、マウス肉腫ウイルス(MSV)およびラット肉腫ウイルス(RaSV)のようなマウスレトロウイルス；ウシ白血病ウイルス(BLV)；ネコ白血病ウイルス(FeLV)およびネコ肉腫ウイルス(FeSV)のようなネコレトロウイルス；ヒヒ内在性ウイルス (BaEV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV-IおよびHIV-II)、ヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV-IおよびHTLV-II)、テナガザル白血病ウイルス、マーソンファイザーサルウイルス(M-PMV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、およびサル肉腫ウイルス(SSV )のような霊長類レトロウイルス；種々のレンチウイルス；およびトリ赤芽球症ウイルス、トリ白芽球症ウイルス(ALV)、トリ骨髄球症、トリ肉腫ウイルス(ASV) 、トリ細網内皮症関連ウイルス(REV-A)、フジナミ(Fujinami)肉腫ウイルス(FuSV )、脾臓壊死ウイルス(SNV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)のようなトリレトロウイルスが挙げられる。他の多くの適切なレトロウイルスが当業者に公知であり、そしてWeissら編、RNA Tumor Viruses、第２版、第２巻、Cold Spring Harbor ，New YorkのTeich，1-16頁によりレトロウイルスの分類法が提供されている。レトロウイルスゲノムを含むプラスミドもまた、ATCCおよび他の供給源から広く入手可能である。小疱性口内炎ウイルスのGタンパク質またはインフルエンザウイルスの血球凝集素のような非レトロウイルス性結合タンパク質がレトロウイルスのコアに偽型付けされた場合、感染性ビリオンもまた産生されている(例えば、Emiら、J．Vir ol．65:1207，1991；およびDongら、J．Virol．66:7374，1992を参照されたい) 。これらの後者の例は、種々のウイルスと細胞へのそれらへの進入様式との間の機能的共通性があり、これにより種々の供給源由来のウイルス性結合タンパク質の使用を可能にすることを示す。インフルエンザ血球凝集素はまた、ポリ-L-リシンベースの化学的結合体の取り込みを増強することが報告されている(Wagner ら、P.N.A.S．89:7934-7938，1992)。多くのウイルス性結合タンパク質の配列が公知であり、そして一般的に、GENB ANKのような配列データベースから入手可能である。さらに、ウイルス性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ウイルス粒子自体から容易に得られる。また、ウイルス性結合タンパク質をコードする多くの異なる遺伝子がクローン化されそして特徴付けされているため、結合タンパク質をコードするDNAを含むプラスミドは多くの異なる供給源から入手可能である。ウイルス性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えばMullisおよびFaloona（1987 ）Meth．Enzymology 155:335により記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応(P CR)方法論を用いて得られ得る。本発明の例示的実施態様として、GDFPは、B/T成分を含むウイルス性結合タンパク質をコードする遺伝子の領域を含み得、この場合GDFPは、この遺伝子が由来するウイルスに対して通常の感受性の細胞を包含する標的細胞に対して使用され得る。本発明の他の実施態様において、標的化は、上記のB/T成分の説明において論じた他の型のリガンドに対するレセプターを有する細胞に制限され得る。例えば、M-D成分がウイルスレセプターに結合する能力を有するウイルス性結合タンパク質由来であり、しかし例えば適切なサイトカインレセプターを有する細胞の標的化を制限することが所望される場合、このような特異性を達成するために使用され得るいくつかのアプローチが存在する。一つのアプローチは、天然のウイルス性結合タンパク質レセプターに対するウイルス性結合タンパク質に由来するドメインの結合親和性に比較して、所望の標的細胞に対する非常に高い結合親和性を有するサイトカインをベースにしたB/T成分を利用することてある。多くのサイトカインがそのレセプターに対して結合する非常に高い親和性を示すことが公知であり、そして例えばM-D成分をより低い結合親和性のウイルス性結合タンパク質に基づかせることが可能であるため、標的化は、同族のサイトカインレセプターを有する細胞に効果的に焦点を合わせ得る。結合を制限する別の適切なアプローチは、変異ウイルス性結合タンパク質からM-D成分を得ることである。但し、この変異により、天然のウイルス性結合タンパク質レセプターを介する結合をもたらすタンパク質の能力を破壊されるが、しかしウイルスの取り込みを仲介するウイルス性結合タンパク質の能力は妨害されない。このような変異ウイルス性結合タンパク質をコードするプラスミドは当該分野で入手可能であり；そしてまた、上記のようにコード領域の部分を欠失させるかまたはコード配列にアミノ酸の置換を導入することによりこのようなウイルス性結合タンパク質変異体の新たな型を調製することもまた充分に当業者の能力内である。上記の原理を、ウイルスタンパク質を好都合な例として用いて説明したが、これらの原理はまた、細胞膜を破壊し得る他のポリペプチドにも適用可能である( 例えば、White，J.，Science 258:917-924，1992による概説、およびそこで概説される刊行物を参照されたい)。機能的および/または構造的に類似する他のドメインは、種々のウイルス、原核生物または真核生物供給源に由来し得る。さらに具体的な例として、ジフテリア毒素のような細菌性毒素は、低いpHでプロトンが付加されるようになり、そして細胞膜を破壊し、細胞内への毒素の進入を促進する高度なα-らせん構造および疎水性特性を有する特定のドメイン(ジフテリア毒素の場合、「TM」ドメインとして公知)を有する(例えば、Choeら、(1992)Nature 357:216-222；vanderSpec kら、J．Biol Chem 268:12077-12082，1993；およびParkerおよびPattus，Trend s Biochem．Sci．18:391-395，1993を参照されたい)。Pseudomonas外毒素Ａのような毒素は同様の膜破壊ドメインを有する(例えば、Stromら、Ann．N.Y．Acad． Sci．636:233-250，1991を参照されたい)。同様のM-D成分はヘモリシンのような他の細菌性毒素に由来し得る(Suttorpら、J．Exp．Med.，178:337-341，1993)。本明細書中に記載されるように、このような膜破壊成分をGDFP中に含むことにより膜破壊および標的細胞へのGDFP-tNA複合体の進入を促進する。ストレプトリジンＯ、細胞障害性Ｔリンパ球により発現される、ペルフォリン (perforin)およびS.aureus αトキシンのような細胞溶解性ポア(pore)形成タンパク質もまた、膜を破壊する能力を有する(例えば、OjciusおよびYoung，Trends Biochem．Sci.，16:225-230，1991；Suttorpら、J．Exp．Med.，178:337-341， 1993を参照されたい)。ストレプトリジンＯは、培養培地に添加された場合、培養細胞によるDNAの取り込みを促進することが示されている(Barryら、Biotechni ques 15:1018-1020)。膜破壊を誘導させる能力を有する多くの細菌性細胞溶解素が存在する(例えば、BraunおよびFocareta.，Crit．Rev．Microbiol．18:115-15 8，1991；およびvan der Gootら、Nature 354:408-411，1991を参照されたい)。膜破壊は、タンパク質におけるpH誘導性疎水性変化の方法によりしばしば起こるが、これはまた、酵素的手段、例えば、ホスホリパーゼを包含する酵素手段により起こり得る(例えば、BraunおよびFocareta.，Crit．Rev．Microbiol．18:115- 158,1991(およびそこで引用される参考文献)；およびLondon，Mol．Microbiol． 6:3277-3282，1992を参照されたい)。膜破壊機能を誘導するためにpHシフトが必要な場合、これを達成し得るいくつかの方法がある。例えば、GDFP/tNA複合体は、酸性エンドソームを通じて取り込まれ得る；または膜破壊機能の活性化を仲介するために細胞外媒体のpHを一時的に低くし得る。いくつかの場合(例えば、ジフテリア毒素)、周囲の媒体のpH変化を誘導する前の膜活性成分の酵素的ニック( nick)は膜破壊を促進すると考えられる(例えば、SandvigおよびOlsnes，J．Cell Biol．87:828-832，1980；Moskaugら、J．Biol．Chem．263:2518-2525，1988；およびZalmanおよびWisnieski，Proc．Natl．Acad．Sci．81:3341-3345，1984を参照されたい)。トリプシンおよびウロキナーゼのような周知の酵素がインビトロでニック活性を提供するためにうまく使用されている(例えば、Williams，D.P .ら、J．Biol．Chem．265:20673-20677，1990)。ニック活性を提供し得る酵素はまた、細胞表面で見出されることが公知である(例えば、Williams，D.P.ら、同上、を参照のこと)。ジフテリア毒素膜貫通領域を含むGDFPの構築および特徴付けの例は、下記の実施例８に記載される。 M-D成分の他の供給源として、中でもMycobacterium tuberculosisの52kD進入タンパク質(Arrudaら、Science 261:1454-1457，1993)のような細胞内への生物の進入を促進する細菌性タンパク質；Listeria monocytogenesの内部(internali n)タンパク質(Portnoyら、Inf．Imm．(U.S.)60:1263-1267)；およびYersinia en terocoliticaのインベーシンタンパク質(Youngら、J．Cell Bio.，116，197-207 )が挙げられる。膜破壊ドメインの合成アナログも作製し得る。例えば、KaiserおよびKezdy，S cience 223:249-255，1984を参照されたい。(3) 輸送/局在化(T/L)成分輸送/局在化成分は、核またはミトコンドリアのような特定の小細胞区画へのG DFP/tNA複合体の輸送および/または局在化を仲介するかまたは増大させる。タンパク質の輸送および/または局在化を仲介する多くの配列が同定されている。例示として、これらは、SV40 Ｔ抗原の核局在化配列(nls)(Colledgeら、Mol ．Cell Bio．6:4136-4139，1986)；およびHIVマトリックスタンパク質(Bukrinsk yら、Nature 365:666-669，1993)の核局在化配列を包含する。これらは、代表的には短い塩基性ペプチド配列であり、そして２つに分かれた塩基性配列でもあり得る(例えば、Garcia-Bustosら、Biochim．Biophys．Acta 1071:83-101，1991；およびRobbinsら、Cell 64:615-623，1991を参照のこと)。核局在化配列は異種タンパク質に融合され、そしてこれらのタンパク質に核局在化特性を与えることが示されている(例えば、Bioccaら、EMBO J．9:101-108,1990を参照されたい)。ヒトエストロゲンレセプターの場合、例えば、融合タンパク質はエストロゲン依存性様式で核へ移動する(Ishibashiら、J．Biol．Chem．269:7645-7650，1994) 。これらの配列は、組換えDNA方法論によりGDD中に容易に取り込まれて所望のGD FP/tNA複合体の核局在化を促進し得る。GAL4もまた、酵母において核局在化特性を有することが示されており(例えば、Silverら、P.N.A.S．81:5951-5955，1984 )、従ってGDFPの成分として、GAL4は輸送/局在化の役割を有するNBDおよびGDDの両方として用いられ得る。(4) レプリコン組込み(RI)成分レプリコン組込み成分は、染色体のような標的細胞のレプリコンへの標的化核酸の組込みを仲介するかまたは増大させる。遺伝子導入および遺伝子治療における多くの例において、標的細胞のゲノムへの導入DNAの安定した組込みを得ることは有利である。GDFPはこのような組込みを促進し得る。また、本明細書に記載されるように、I型GDFPアプローチの特別な利点は、tNAへの送達成分の化学量論的連結を可能にするのみならす、GDFPをtNAに関して所定の位置に配置させ得ることである。インテグラーゼ(integrase)のようなレプリコン組込み成分の場合、以下でさらに詳細に記載されるように、組込みを促進する手段として、GDFPは末端インテグラーゼ認識配列の近傍に配置され得る。 DNA-タンパク質の相互作用は哺乳動物ゲノムへのDNAの組込みを仲介し得る。例えば、全ての公知のレトロウイルスの組込みは、宿主DNAのエンドヌクレアーゼ切断を行い、そして逆転写されたレトロウイルスゲノムを宿主細胞DNAの遊離末端に連結する酵素反応の際に起こる。この反応はレトロウイルスインテグラーゼ(すなわち「IN」)タンパク質により仲介され、そしてINタンパク質は組込み前のウイルスゲノムの末端に存在する最小限の塩基と相互作用し、組込みを達成することは周知である。事実、IN配列認識モチーフを有するDNA配列は、精製INタンパク質によりインビトロで遊離DNA中に挿入され得る(例えば、Bushmanら、Sci ence 249:1555-1558，1990；およびKatzら、Cell 63;87-95,1990を参照のこと； Brownら、Cell 49:347-356，1987；およびRothら、Cell 58:47-54，1989もまた参照のこと)。例えば、MLV、HIV、およびRSV INタンパク質は、それぞれが線状の組込み前ウイルスDNA基質の各末端に存在する別個の短いIN配列認識モチーフと相互作用して、宿主細胞レプリコンへのDNA基質の組込みを仲介することが知られている。精製INタンパク質により仲介されるインビトロでの組込みは、IN認識配列モチーフを有する遊離オリゴヌクレオチド基質または合成DNA基質のどちらかを用いて示されている(例えば、Katzら、前出；およびBushmanおよびCraigi e，J．Virol．64:5648，1990を参照のこと)。合成DNA基質は、適切なIN認識配列に接する唯一の制限酵素部位(代表的にはNdeI)をプラスミドベクター中に挿入することにより容易に操作され得る。NdeIを用いるベクターの消化により、高度に保存される5'CA-OHジヌクレオチドならびに適切なIN認識モチーフの残り部分に続く後退した3'末端を有するDNA基質を生成するが、これは、INが相互作用して組込みを仲介する組込み前ウイルス性DNAの処理された末端に類似する。このアプローチは、精製組換えトリレトロウイルスIN(Katzら、前出),MoMLV IN(Bushma nおよびCraigie，J．Virol.,前出)およびHIV IN(Bushmanら、Science，前出)による、このような線状DNA基質のインビトロの２本鎖DNAへのインビトロでの組込みを示すためにうまく用いられている。これらの実験における基質DNAの末端上に用いられるIN認識配列は短く(10〜30塩基対)、短い末端IN配列認識モチーフを有する異種DNA基質がINにより２本鎖DNA中に取り込まれ得ることを示す。さらに、これらの実験は、基質DNAの一つの末端の組込みについてのみアッセイするオリゴヌクレオチド組込み実験と反対に、標的DNAへのDNA基質の両末端の組込みをうまく裏付けた。これらの実験は、短い末端IN認識モチーフを有する線状DNA基質が精製INタンパク質によりインビトロで２本鎖DNAに取り込まれ得ることを裏付けた。従って、上記の実験は、IN成分がGDFP中に含まれ得、そして(基質)tNAに存在する末端IN認識配列モチーフと共に作用して効率的な組込みを仲介し得るので、本発明の有用性のさらなる証拠を提供する。インテグラーゼと異種タンパク質との間での組換え融合体は既に構築され、発現され、そしてインテグラーゼの酵素活性を保持することが示されている(例えば、Vinkら、J．Virol.，68;1468- 1474，1994を参照されたい)。さらに、Bushman(PNAS 91:9233，1994)は、組換え融合体をインテグラーゼおよび配列特異的DNA結合タンパク質との間で作製し得、このような融合体はインテグラーゼ活性および配列特異的DNA結合を保持することを示した。従って、例えば、GDD中にインテグラーゼタンパク質に由来するRI成分を含み、そしてIN認識部位を有するtNAを用いることにより、GDFPは、組込み認識モチーフを有する標的化核酸(tNA)と共導入され得、従って、標的細胞のレプリコンへのtNAの組込みを達成する。この系はまた、NBD中の適切な結合ドメインと合わさって、RI成分とtNAの自由末端との会合を可能にする。レトロウイルスのINタンパク質は、組込み前ウイルスDNAの自由末端での組込みを仲介するように機能するため、これは有利である。本発明において、末端IN配列認識モチーフ(好ましくはIN配列から500ヌクレオチド未満、さらに好ましくは200ヌクレオチド未満、最も好ましくは50ヌクレオチド未満)を有するtNAの末端(あるいはそのすぐ近傍)にNBDについての同族認識配列(「CRS」)を含む線状tNAと共にI型GDFPを利用することにより、これが達成され得る。遺伝子送達のためのtNAを作製するために、例えば、tNAは、単独のNdeI部位を２つのIN認識モチーフの間に有するように構築され得、NBDに同族認識配列の隣に連結される。次いで、NdeIを用いた消化により、5'CA-OHジヌクレオチド、IN配列認識モチーフの残りの部分およびNBD に対するCRSがこの順で続く後退3'末端を有する線状DNA分子が作製される。この方法において、末端IN認識配列はNBDに対する同族認識配列に接して結合される。代表的には、NdeI部位/IN認識配列/CRSカセットがベクターのプラスミド骨格中に挿入される。しかし、全ての外来配列、あるいは所望でない配列を除外した tNAを構築することが可能である；例えば、全ての細菌性プラスミド配列を除外した tNAは、tNAにおいて哺乳動物発現カセットの各末端をCRS、続いて1/2のIN認識配列、続いてNdeI部位に隣接して連結することにより作製され得る。次いで、NdeI による消化により、線状tNA DNAフラグメントを作製し、これはプラスミド骨格フラグメントから容易に精製され得、各末端にIN認識配列およびCRSを有する。プラスミド骨格配列の除去は、形質導入された細胞中での最適な遺伝子調節を達成するために望ましくある得る。次いで、GDFPの結合により、IN領域を含むRI成分がtNA上の部位のすぐ近傍に位置付けされ、RI成分はtNAと共に効率的な組込みを仲介し得る。類似の方策がAAV Repタンパク質およびウイルスITRを用いて使用され得る(例えば、Owensら、J．Virol．67:997-1005(1993)、およびCarter，B． J.，Current Opinion Biotech．3:533-539(1992)による概説およびそこで概説される刊行物を参照されたい)。さらに、インテグラーゼ融合体について先に記載した様式と類似の様式で、適切なNBD、cis作用レコンビナーゼ認識配列およびCR Sエレメントを用いる融合体を使用する本発明に関連して、バクテリオファージP l creリコンビナーゼ、酵母FLPリコンビナーゼ、酵母SRI由来Ｒリコンビナーゼのような他のリコンビナーゼ系およびTylインテグラーゼ(例えば、Kilbyら、Tre nd Genet.，9:413-421，1993；MooreおよびGarfinkel，PNAS 91:1843-1847，199 4)を使用し得る。 RIドメインの多量体化は、特にRIドメインが由来するタンパク質が多量体形態で機能する状況において、組込み活性を最適化するために必要であり得る。従って、例えば、多くの天然のレトロウイルスINタンパク質が２量体または多量体形態である(例えば、Jonesら、J．Biol Chem 23;16037，1992；Skalka，Gene 135: 175，1993の概説を参照されたい)。INドメインの多量体化は、例えば：(a)GDFP 中のIN成分のタンデムリピート(好ましくはフレクソンにより分離されている)の構築；(b)タンパク質多量体化モチーフ(例えば、ロイシンジッパーモチーフ(例えば、Huら、1990，Science 250:1400を参照のこと))の挿入によるGDFPの二量体化；(c)遊離INタンパク質のINを含有するGDFPへの添加(なぜなら、INタンパク質は多量体化する自然の傾向を有するため)；または(d)複数のGDNP分子がtNAの各末端に結合するようにtNA中のCRSの多量体化により首尾良く達成される。上記方策の組み合わせも使用され得る。これにより、IN成分のさらなる多量体化が得られ、従ってさらに活性な組込み複合体が得られる。 RIドメインの多量体化を達成し、そしてまたtNAのより効率的な共同した組込み(すなわちtNAの両末端をレプリコン中に組み込むこと)のための別の方策は、系を操作して線状tNAの自由末端を会合させることである。これは、本発明に関連して、多くの方法で達成され得る。第１は、GDFPの単量体を、上記のロイシンジッパーまたは他のモチーフを用いて自己２量体化するように設計し得る。従って、tNAに結合するGDFPの２量体化により、tNAの自由末端の近距離の並置が得られる。なぜなら、CRSはこれらの末端の近傍に位置しているからである。第２のアプローチは、tNAの末端の近傍に存在するさらなる同族認識配列を有する第２の別のDNA結合タンパク質を用いてtNAの末端を会合させることである(この目的のために、自由DNA末端を会合させるために適切な同族認識配列を有するtNAと共に、上記の任意のDNA結合ドメインが２量体形態において使用され得る)。このような方策により、tNAの自由末端を互いに近距離で並置するように会合させ、従って共同した組込みの頻度をさらに増強し得る。GDFP/tNA複合体自己組込み(すなわち、それ自体へのtNA分子の末端の組込み)、あるいは一方のtNA分子の他のt NA分子への交差組込みから生じ得る潜在的な問題を回避するために、いくつかのアプローチが用いられ得る。GDFPのtNAとの複合体化は４℃でなされ得るが、このようにIN酵素活性を低下させたまま、複合体を高温で細胞上に配置することにより、このような望ましくない組込み事象を導き得る。好ましいアプローチは条件付きRI部分を使用することである。このような条件付きRI部分は、化学的コファクターまたはタンパク質コファクターに依存し得るか、または温度または他の可変要素(例えば、インヒビターまたはコファクターの存在または非存在)に依存する全活性について条件付きである変異体であり得る。例えば、INの場合において、特定の温度においてのみ活性である温度感受性(ts)IN変異体が作製されている(例えば、Schwartzbergら、Virology 192:673，1993を参照のこと)。tsRI成分の使用は、許容できない温度で行われ得る細胞による複合体への曝露および複合体の取り込みを可能にし(その結果、RI成分は活性ではなくなる)、その後、一旦、許容できる温度に変更することにより、複合体は核内に取り込まれ、宿主細胞レプリコンに関連してRI成分を活性にし、従って所望の取り込みが達成され得る。従って、GDFP中にRI成分を含ませることは、組込みの頻度を強化するために用いられ得る。GDDはRI成分単独からなり得るか、または１つまたはそれ以上の上記の他の成分をさらに含み得る。RI成分がGDDにおける唯一の成分である場合、N BDは、例えば組換え天然INタンパク質の単独の使用により可能なレベルより、安定して、そして/または特異的にtNAの自由末端とRI成分を会合させるよう機能する。NBD結合の利点により、トランスフェクションプロセスの間に、RI部分はさらに強固にtNA末端と会合し、そして宿主細胞レプリコンへの組込みを仲介し得る。RI成分がGDD中の唯一の成分である場合、tNA/GDFP複合体は、リポフェクション、エレクトロポレーションなどのトランスフェクションの標準的な任意の手段により送達され得、そして得られた細胞は、tNAの組込みの増強の結果、安定した遺伝子送達の頻度が増大する。あるいは、例えばウイルスカプシドタンパク質のような自己組立系の使用を包含する他の非ウイルス手段により、複合体は送達され得る。実験による証拠により、ウイルスカプシドタンパク質はDNAを哺乳動物細胞へ導入するために使用され得ることが確認されている(例えば、Forstov aら、Hum．Gene Ther.，6:297-306，1995を参照のこと)。特定の場合において、レトロウイルスINまたはAAV Repタンパク質のようなGDD の成分はまた、効果的なNBD成分として機能し得、従って核酸を結合するその能力の利点によりGDFPにおいて二重機能を果たす(例えば、KrongstadおよびChampo ux，J．Virol．64:2796-2801，1990；Owensら、J.Virol．67:997-1005(1993)；およびCarter，B.J.，Current Opinion Biotech．3:533-539(1992)による概説およびそこで概説される刊行物を参照されたい)。２．標的化核酸(tNA) 標的化核酸(tNA)は、標的細胞に送達されるべきポリヌクレオチド、またはそのアナログである。従って、標的化核酸は、例えば、二本鎖または一本鎖形態にある、DNA、RNAまたはそれらのアナログのオリゴヌクレオチドおよびより長いポリマーを含む。tNAは、環状、スーパーコイルまたは線状であり得る。標的化核酸の好適な例は、単数または複数の転写制御領域に作動可能に連結された目的の単数または複数の遺伝子およびGDFPのNBDドメインにより結合され得る同族認識配列を含むDNA発現ベクターである。転写制御領域は、所望の標的細胞で特異的に活性化されるような、または特定の細胞性または他の刺激に応答性であるように選択され得る。標的化核酸はまた、例えば、ポジティブおよび/またはネガティブ選択マーカーを含み得：それによって、インビトロまたはインビボいずれかで、選択マーカーを安定に発現し得る細胞についての選択および/またはこの細胞に対する選択を可能にする。 RNAを送達するための本発明の使用は、例えば、RNAデコイ(decoy)(Sullenger ら、Cell 63:601-608，1990)；リボザイム(Youngら、Cell 67:1007-1019，1991) ；およびアンチセンス核酸(Vickersら、Nucleic Acid Res.,19:3359-3368)の導入を可能にし得る。Ｉ型GDFPにおいて、標的化核酸は、Ｉ型GDFPの核酸結合ドメイン(NBD)が結合する特異的同族認識配列によりGDFPにより認識および結合される。DNAおよびRNA 結合ドメインの両方が、配列特異的様式で特定の核酸に結合するタンパク質から単離された。標的化核酸にそのような同族認識配列が含まれると、tNAに対するG DFPの特異的結合が可能になる。多くの核酸結合タンパク質の認識部位が同定されている(例えば、MitchellおよびTjian，1989；および本明細書に記載される他の文献を参照のこと)。 DNAに対する配列特異的結合タンパク質の結合は、認識配列モチーフが多量体となる場合により強まる傾向にある(例えば、HochschildおよびPtashne，Cell 4 4:681-687，1986参照のこと)。従って、同族認識配列は、標的化核酸において、 GDFPのその同族tNAに対する結合親和性または選択性を増大するように多量体化され得る。このことはまた、tNAに結合するGDFPの有効量を増加させる、または配列特異的若しくは配列非特異的NBD成分によるtNAの圧縮/凝縮を促進するなどの他の利点を有し得る。かならずしも必要ではないが、代表的には発現ベクター中の同族認識配列は、ベクターのプラスミド骨格中に配置される。これはまた、遺伝子送達を促進するためにtNA中に必要とされるシスに作用するその他の配列に適用される。しかし、転移されるDNAからプラスミド骨格配列を取り除くことが所望され得る。この場合、発現カセットは、制限酵素消化が哺乳類発現カセットから骨格を分離するように制限酵素部位により簡便にフランキングされ得る。次いで、この発現カセットは、形質導入実験で使用するためにプラスミド骨格から精製され得る。明らかに、この場合、CRSは、発現カセットを保持するフラグメント上に位置することが必要があり得る。勿論、１つ以上のtNAに結合するようにGDFPを構築することも可能である。上記で論議したように、tNAはまた、配列特異的相互作用に加えて、配列非特異的相互作用を介してGDFPに結合し得る。Ｉ型GDFPにおいては、そのような配列非特異的相互作用は、上記で論議されたように、配列非特異的結合タンパク質由来の補助成分により仲介され得る。そのような補助非特異的結合成分はまた、標的化核酸を圧縮するかまたはそうでなければ再構築するために供し得る：前述参照。標的化核酸はまた、例えば、標的細胞レプリコンに存在する配列に相同な配列のような非発現DNAを含み得、それによって相同組換えを仲介し得る。これは、標的化核酸またはその所望の部分の、標的細胞中に存在するレプリコン内の特定部位(細胞染色体内の特定部位など)への安定した組み込みを促進するために使用され得る。これは、例えば、所望の染色体部位における組み込みによりtNAの所望の発現レベルを達成するために有用であり得る。相同組換えはまた、標的細胞レプリコン中の特定DNA配列を改変するために用いられ得る(例えば、ThomasおよびCapecchi，Cell 51:503-512，1987を参照のこと)。より長いtNA配列の場合、またはtNA取り込み機構(GDFPの一部分であるか否かを問わず)が公知、またはエンドサイトーシスを含む機構のような、送達される核酸および/または複合体のサイズ、形態または荷電に感受性であると疑われる場合、tNAを凝縮および/または荷電中和することが所望され得る。これは、核酸を凝縮および/または荷電中和し得る(集合的に「圧縮薬剤(compacting agent)」と称する)多くのタンパク質または他の薬剤のいずれかとtNAを混合することにより達成され得る。圧縮薬剤は、例えば、ヒストン(例えばvon Holt，Bioassays 3 :120-124，1986；およびRhodes，Nucleic Acid Res.,6:1805-1816，1979)；またはそれに由来するポリペプチド(Rodriquezら、Biophys．Chem.,39:145-152，199 1)；ならびに非ヒストンの高移動度グループのタンパク質を含む。ポリ-L-リジンまたは他のポリ塩基性アミノ酸がまた、圧縮薬剤として使用され得る(例えば、Liら、Biochemistry，12:1763-1772，1973；およびWeiskopfおよびLi，Biop olymers 16:669-684，1977参照)。同様に、ポリアミンのような他のポリカチオン性ポリマー、例えば、スペルミンおよびスペルミジン、ならびにカチオン性脂質含有ポリマーもまた、核酸を凝縮および/または荷電中和するために用いられ得る(例えば、Feuersteinら、J.Cell.Biochem.,46:37-47，1991；およびBehr，B ioconj．Chem.,5:382，1994参照のこと)。レトロウイルスヌクレオキャプシッドタンパク質もまた、同様の役割を果たし得る(例えば、Gelfandら、J.Biol.Chem. ,268:18450-18456,1993参照のこと)。あるいは、圧縮薬剤は、GDFPの付加成分として取り込まれ得る。また、異なる同族核酸配列に対して所定の範囲の結合親和性を示すGAL4のようないくつかの配列特異的結合タンパク質もまた、この能力のために用いられ得、そしてこの観点から、核酸結合および圧縮特性の両方でNBDとして機能し得る。圧縮試薬はまた、tNAとGDFのNBDドメインとの間の間接結合のメディエーターとして取り込まれ得る(例えば、NBDドメインは圧縮薬剤に結合し得、そして圧縮薬剤はtNAに結合する)。GDFP のアセンブリ好ましくは、GDFPは、組換えDNA法により生成される単一のポリペプチド融合タンパク質として調製される。そのようなGDFPを生成するために、GDFPの所望の成分をコードする配列がアセンブルされ、そしてフラグメントが発現ベクター中に連結される。種々の成分をコードする配列は、所望のタンパク質配列をコードする他のベクターから、鋳型核酸として細胞核酸またはウイルス核酸を用いるPC R生成フラグメントから、または所望の配列をコードする合成オリゴヌクレオチドのアセンブリによりアセンブルされ得る。しかし、そのような好適なGDFPをコードするすべての核酸配列は、好ましくは、コード配列のインフレームの融合によりアセンブルされるべきである。互いに相対的に独立して形態を選択する個々の成分の能力を増大するために、上記のフレクソンを、種々の成分およびドメイン間に含め得る。Ｉ型GDFPは、好ましくはアセンブルされそして単一のペプチド鎖として発現されるが、１つまたはそれ以上のそのドメインまたは成分は分離した鎖として生成され、次いで、例えばジスルフィド結合または化学的結合によりGDFPに連結される得る。NBDおよびGDDのようなドメインまたはそれらの成分が、組換え手段以外の、例えば、非共有結合相互作用により、またはタンパク質様表面または脂質表面上での同時局在化を介して直接にまたは間接に物理的に会合している複合体を調製することもまた実行可能である。 GDFPは、インビトロ、または原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかで発現され得、そして必要な程度まで精製され得る。宿主細胞におけるGDFPの発現の代替えはインビトロ合成である。これは、GDFPの高レベル発現が宿主細胞の代謝を妨害し得る状況では有利であり；そして当該技術分野で公知の種々の無細胞転写/翻訳系のいずれかを用いて達成され得る。GDFPはまた、合成的に調製され得る。GDFPは、GDFPの検出および/または精製を促進し得る成分または配列を所有することが所望されるようである。そのような成分は、上記の種々の成分の１つと同じまたは異なり得る。組換えタンパク質を発現および精製する多くのアプローチが当業者に公知であり、そして組換えタンパク質発現および精製のためのキットが分子生物学産物のいくつかの市販製造者から入手可能である。代表的には、精製度の増加したGDFP が所望される。しかし、核酸結合に対するGDFPの特異性のため、精製の程度は必ずしも高い必要はない。本発明のGDFPは、標的細胞の微生物汚染を避けるために 0.22または0.45μフィルターを通じる簡単な濾過により滅菌され得る。 GDFPのドメインは発現ベクター中でモジュール様式でアセンブルされ得るので、組換えDNA法によるその構築は、GDDが１つまたは多くの成分から構成されることを可能にする。そのような成分は、遺伝子送達を仲介または増大することにおいて相補活性を有し得るか、または密接に関連した機能を有し得る。本質的に、遺伝子送達ドメインは、GDFPに結合したtNAの送達の効率を仲介または増大する任意の機能を有すると見なし得る。GDFP の他の変形他の変形が当業者に明らかである。例えば、GDFPはそれ自体多量体化され得る。多量体化は、NBDまたはGDDのいすれかの結合強度(avidity of binding)を増加するために有利であり得る。所定のtNA分子もまた、別の機能を有する異なるＩ型GDFPを結合する複数の別の同族認識配列を含み得る。あるいはtNAは、Ｉ型およびII型GDFPの混合物で結合され得る。さらに、INタンパク質のようなGDDの特定成分が、最適な活性のために二量体化を必要とし得る。GDFPの二量体化は、GD FPに、例えば、ロイシンジッパーモチーフを含めることにより得られ得る。そのようなモチーフは、DNA結合タンパク質において共通であり、そしてそれらの二量体化の原因となる(KouzaridesおよびZiff，1989)。ロイシンジッパーはDNA結合タンパク質中に挿入され得、そしてそれらを二量体化させる(SellersおよびSt ruhl，Nature 341:74-76，1989)。GDFPの多量体化はまた、例えば、２つまたはそれ以上のGDFPを含む組換え融合タンパク質を作成することにより達成され得る。好ましくは、そのような多量体化GDFPは、本明細書に記載されるように、フレクソンにより分離されている。二量体または多量体タンパク質由来の他のオリゴマー化モチーフを同様に使用し得る。 II 型遺伝子送達融合タンパク質の説明 II型GDFPは配列特異的様式で標的化核酸に結合しない。何故なら、II型GDFPの核酸結合成分はすべて、核酸への結合において配列非特異的である核酸結合タンパク質由来であるからである。II 型GDFPの核酸結合ドメイン II型GDFPの核酸結合ドメイン(NBD)は、上記のように、遺伝子送達ドメイン(GD D)に組換え的に融合された、配列非特異的核酸結合タンパク質由来である結合成分を含む。多くの配列非特異的核酸結合タンパク質が同定され、そして特徴付けされており、例えば、ヒストンまたはそれに由来するポリペプチド(例えばvon Holt，Bio assays 3:120-124，1986；Rhodes，Nucleic Acid Res.,6:1805-1816，1979)；およびRodriguezら、Biophys．Chem.,39:145-152，1991を参照のこと）；レトロウイルスヌクレオキャプシドタンパク質(例えばGelfandら、J.Biol.Chem.,268：18 450-18456，1993を参照)；ヌクレオリンのようなタンパク質(Erardら、Eur.J.Bi ochem.191:19-26，1990)；アビジン(Pardridge＆Boado，F.E.B.S.Lett.288:30-3 2,1991)；およびポリ-L-リジンのようなポリ塩基性ポリペプチド配列(Liら、Bio chemistry，12:1763-1772，1973；WeiskopfおよびLi，Biopolymers 16:669-684, 1977)を含む。本明細書で論議される理由により、本発明のすべてのGDFPは、好ましくは、組換え融合タンパク質として生成される。しかし、宿主細胞におけるII型GDFP中( および配列非特異的核酸結合成分を取り込むI型GDFP中)の配列非特異性核酸結合成分の組換え発現は、発現タンパク質の宿主細胞核酸との抵触により妨害され得る。そのような状況では、GDFPは、当該技術分野で公知である種々の無細胞転写 /翻訳系のいずれかを用いてインビトロで容易に合成され得る。II 型GDFPの遺伝子送達ドメイン II型GDFPの遺伝子送達ドメインを構成する成分の種々の可能な供給源は、Ｉ型 GDFPに対する上記と本質的に同じである(もっとも定義により、II型GDFPは、I型 GDFPについて上記で述べた配列特異的インテグラーゼ成分のような配列特異的結合成分を含み得ない)。II 型GDFPとの使用のための標的化核酸 II型GDFPと組み合わされる標的化核酸は、II型GDFPが非特異的相互作用により核酸を結合するので、特異的認識配列を含む必要がないということを除いて上記の通りである。II 型GDFPのアセンブリ II型GDFPのアセンブリは、好ましくは、組換え融合タンパク質の合成を介する (I型GDFPのアセンブリに関する上記の記載を参照のこと)。本発明のGDFPの使用このように、本発明のGDFPは、インビトロまたはインビボ遺伝子送達に用いられ得る。治療用途には、標的細胞は、エクスビボで形質導入され得、そして患者に戻され、または、tNA/GDFP複合体の生化学的性質が与えられれば、細胞はインビボで直接処理され得る。そのようなインビボ治療には、この複合体は、全身および局所または局在化投与を含む種々の投与様式で処方され得る。技法および処方は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.， Easton，PA.(最新版)に見出され得る。tNA/GDFP複合体は、希釈剤または賦形剤のようなキャリアと組み合わされ得、これらは、投与様式の性質および剤形に依存して、例えば、充填剤、増量剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性薬剤、または潤滑剤を含み得る。投与様式の性質は、例えば、所望の標的細胞の位置に依存する。インビボ投与には、注射が好ましく、筋内、腫瘍内、静脈内、動脈内(二重バルーンカテーテルの使用による送達を含む)、腹膜腔内、および皮下を含む。肺組織への送達は、例えば、エアゾール化により達成され得る。注射には、本発明の複合体は、液体溶液中、好ましくは、Hank's溶液またはリンガー溶液のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。さらに、この複合体は、固体形態で処方され得、そして使用直前に再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態もまた含まれ得る。全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によってであり得、あるいは化合物は経口的に投与され得る。経粘膜または経皮投与には、浸透されるバリアに適切な浸透剤が処方物中に用いられる。局所投与には、本発明の複合体は、当該分野で一般的に公知であるように、外用薬、軟膏、ゲルまたはクリームに処方され得る。このように、GDFPアプローチは、インビトロ、エクソビボまたはインビボで任意の細胞を標的化するために使用され得、唯一の要件は、標的細胞がそれらの表面上にGDFPに対する結合部位を有することである。従って本発明は、多くの遺伝子治療用途に有用である。例示の実施例として、本発明で用いられ得る標的細胞は、リンパ造血細胞を含む。これらは：(i)ゴーシュ病および異常ヘモグロビン症のような遺伝性疾患の治療、およびデコイまたは優性-ネガティブタンパク質のようなHIVに対する細胞内ワクチンを用いた遺伝的改変を含む、遺伝子治療における多くの潜在的な用途を有する幹細胞；および(ii)自殺遺伝子および制御されたプロモーターカセットのような目的の遺伝子を用いたヒト治療において用いるためのCTLのようなエフェクターT細胞の遺伝的改変を可能にし得るリンパ球を含む。本発明の文脈中の使用にはまた、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む血管を配する心臓血管系の細胞が含まれ、それらは遺伝的に改変されて血管形成術後のアテローム硬化または再狭窄を阻害し得る。同様に、本発明は、嚢胞性繊維症を直すためのCFTRのような気道上皮細胞中に遺伝子を導入するために用いられ得る。本発明はまた、腫瘍細胞を変換するために用いられ得、そしてそれによってそれらを遺伝的に改変して、癌患者において腫瘍除去のために自殺遺伝子を発現するか、サイトカインを産生するかまたは腫瘍ワクチンとして使用するために免疫刺激性の分子を発現する。本発明の他の例示の応用は、抗原提示細胞(APC) へのDNAまたはRNAの送達である。これは、例えば、APCによる特定(tNA-コード化 )抗原の発現を可能にするために有用であり得、それによってAPCがCTL応答のような抗原特異的免疫応答を刺激することを可能にする。そのようなアプローチは、GDFP/tNA複合体を用いたAPCの形質導入によりインビトロで使用可能であり得、それによってインビトロでCTLの刺激および生成のための抗原提示を可能にする。あるいは、インビボ送達が用いられ得、インビボでそのような抗原提示を可能にする。本発明を用いるAPCへのRNAの直接送達は、抗原が、APCでは効率的に起こり得ない細胞内輸送またはプロセッシングの特定条件を必要とする転写物によりコードされる場合に特に所望され得る。例示の例は、HIVのrev依存性RNA(例えばHIVgag)であり得る。本発明におけるRNAを用いるAPCの形質導入は、それ故、例えば、rev依存性RNAの核からの輸送に対する必要性を回避するために使用され得る。さらに、本発明は、家族性高コレステロール血症、血友病および他の代謝疾患のような遺伝的欠陥を直すため、または全身送達のための組換え産物を生成するために肝臓の肝細胞中に遺伝子を導入するために用いられ得る。同様に、繊維芽細胞または結合組織細胞は、免疫調整目的のためのサイトカインまたは可溶性酵素の分泌のために、あるいは代謝欠陥を直すために改変され得る。これらの組織標的および疾患は他と共に、Scriverら編、「The Metabolic Basis of In herited Disease」６版、McGraw-Hill、1989、およびMiller,A.D.，Blood 76:27 1-278，1990により詳細に記載されている。本発明は、目的の遺伝子が一般に用いられるウイルスベクターにより移入され得ない場合、または標的細胞がウイルスアプローチにより感染可能でない場合に特に有用である(例えばIsrael & Kauf man，Blood，75:1074-1080，1990; Shimotohno & Temin，Nature 299，265-268 ，1982; Steadら、Blood，71:742-747，1988;およびBodineら、Blood，82:1975- 1980，1993を参照のこと)。本発明のGDFPアプローチは、細胞の遺伝子形質導入のために一般的に有用な方法として用いられ得、そして例えば、昆虫、鳥類、哺乳類、または他の高等真核生物細胞との使用のために遺伝子形質導入のための実験室キットとして提供され得る。本発明における遺伝子の導入はまた、細胞による核酸の取り込みを増大することが知られている他の生化学的物質により促進され得る(例えば、Kawai & Nishi zawa，Mol．Cell．Biol．4:1172-1174，1984; Behrら、P.N.A.S．86:6982-6986 ，1989; Roseら、P.N.A.S．Biotechniques 10:520-525，1991; Pardridge & Boa do，F.E.B.S．Lett．288:30-32，1991; Legendre & Szoka，P.N.A.S．90:893-89 7，1993; Haensler & Szoka，Bioconj．Chem．4:372-379，1993参照のこと)。本発明における使用のためのこれらのおよび他の技法は、当該技術分野で記載されるような(例えば、Kriegler，M．1990(編)「Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual,」(1990)を参照)、(インキュベーションなどのための)条件下で用いられ得る。ジフテリア毒素のTMタンパク質のようなpH依存性M-D成分を含むGDFPの場合(例えばChoeら(1992)Nature 357:216-222参照のこと)、GDFP/tNA 複合体の細胞への進入は、形質導入の間インキュベーション培地のpHを単に下げることにより簡単に達成され得る。以下に提示する実施例は、当業者である実施者へのさらなる指針として提供され、そしていかなる方法でも本発明を制限するものと解釈されるべきではない。実施例１酵母GAL4タンパク質由来の核酸結合ドメイン(NBD)の調製 GAL4のアミノ酸1〜147（LaughonおよびGesteland、Molecular and Cellular B iology 4：260-267、1984；MaおよびPtashne、Cell 48：847-853、1987；および Careyら、J．Mol．Biol．209：423-432、1989）のDNA結合ドメインを、以下のアンプリマーを用いてS. cerevisiae（ATCC 60248）からPCRにより増幅した。 GAL4の５'末端に対するアンプリマーは以下の通りであった： GAL4コード領域に下線を付す。このアンプリマーは、T3 RNAポリメラーゼによるその後の転写を可能にするpBluescript（Stratagene）中にクローン化するためのSpe1部位（ACTAGT）を創製した。アンプリマーはまた、開始メチオニンの上流に位置する、効率的なタンパク質翻訳のためのコンセンサス配列（GCCACC）を含有した（Kozakら、Nucl．Acids Res．15：3374、1987）。 GAL4 NH₂末端（アミノ酸147まで）の３'末端に対するアンプリマーは以下の通りであった： GAL4コード領域に下線を付す。このアンプリマーは、上記のようにpBluescrip t中にクローン化するための３’Asp718部位（GGTACC）を創製した。アンプリマーはまた、可動性ペプチド配列（下記参照）をコードするオリゴマーとのインフレーム(in-frame)融合を可能にするBspE1部位（TCCGGA）を含有した。 GAL4フラグメントを、１つのコロニーのS. cerevisiaeから30サイクルのPCRにより直接増幅した。産物をSpe1およびAsp718を用いて消化し、そしてpBluescrip tのポリリンカー領域に位置するSpe1部位とAsp718部位との間で連結した。構築物をE.coliのDH108株にエレクトロポレーションにより形質転換し、そしてGAL4 フラグメントを含有する１つのコロニーを制限酵素分析により同定した。pT3gGA L4と称する、得られたプラスミドを図2Aに示す。実施例２ヒトIL-2タンパク質由来の遺伝子送達ドメインの調製成熟(mature)可溶性ヒトIL-2（アミノ酸21〜133）をコードするDNAフラグメントを、以下のアンプリマーを用いて全長のヒトIL-2 cDNA（Taniguchiら、Nature 302：305-310、1983）からPCRにより増幅した。成熟ヒトIL-2の５'末端に対するアンプリマーは以下の通りであった： IL-2のコード領域に下線を付す。このアンプリマーはpBluescript中にクローン化するためのSpe1部位（ACTAGT）を創製し、そしてIL-2のアミノ酸21のすぐ上流に開始メチオニンを挿入した。アンプリマーはまた、上記の挿入されたメチオニンの上流に効率的な翻訳のためのコンセンサス配列（GCCACC）を含有した。Na r1部位（GGCGCC）もまた含有し、これにより、GAL4/IL-2構築物（下記参照）においてGAL4ドメインとIL-2ドメインとを隔てるリンカーとのその後のインフレームでの融合を可能にする。成熟ヒトIL-2の３'末端に対するアンプリマーは以下の通りであった：このアンプリマーは、pBluescript中へのクローン化のためのAsp718部位（GGT ACC）を創製し、そしてまたヒトIL-2のための野生型終止コドンを保持した。IL- 2コード領域の３'末端のSca1部位（AGTACT）もまた、アミノ酸変化を導入することなく、このアンプリマーにより創製された。成熟ヒトIL-2タンパク質をコードするDNAフラグメントを、上記に示す全長ヒトIL-2 cDNAから30サイクルのPCRにより増幅した。産物をSpe1およびAsp718を用いて消化し、pBluescript中に連結し、そして上記のようにDH10B細胞に形質転換した。最適な構築物を含有する１つのコロニーを制限酵素分析により同定した。１つのコロニー由来のプラスミドの配列決定により、変化（IL-2の末端付近でのフレームシフトを生じる１塩基の欠失）が、PCRクローニング中に３'アンプリマー内で発生した（それにより、IL-2ムテインを生成する）ことが判明した。特に、Sca1部位の後の最初のＴ（最初のGATトリプレットにおける）が除かれ、早すぎる終止コドンもまた生成するフレームシフトを引き起こした。結果として、通常末端に存在する５つのアミノ酸が３つの異なるアミノ酸に置換された。「pT 3matIL-2m」（pT3matIL-2として図2Aに一般的に示す）と称するこのプラスミドを用いて、実施例３に記載する遺伝子送達融合タンパク質を創製した。IL-2ドメインにおける変化にもかかわらず、このIL-2ムテインに基づくGDFPは、下記に示すIL-2生物活性を示した。２番目のコロニーは、「pT3matIL-2」（図2Aに一般的に示す）と称するプラスミドを含有して、予想される野生型IL-2配列を含有した。プラスミドpT3matIL-2 を用いて、実施例３および４に記載する２つのGDFPを創製した。実施例３フレキソンにより隔てられるGDDおよびNBDを有する遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）をコードするプラスミドの構築 GAL4由来の核酸結合ドメイン（NBD）をコードするDNAフラグメントを、Spe1およびBspE1を用いて消化することによりpT3gGAL4（実施例１）から単離した。ヒトIL-2ムテイン由来の遺伝子送達ドメイン（GDD）をコードするDNAフラグメントを、Nar1およびAsp718を用いて消化することによりpT3matIL-2m（実施例２）から単離した。フレキソン配列(GlyGlyGlyGlySer)₃をコードする以下のオリゴマー対をアニールして、５'BspE1突出（CCGGA）およびNar1突出（CGCC）を創製した： NBDフラグメントおよびGDDフラグメントならびにアニールしたオリゴマーを、 Spe1部位とAsp718部位との間でpBluescript中に連結し、そして上記に示すように、DH10B細胞に形質転換した。３つのすべてのフラグメントを含有する構築物を有する一つのコロニーを、GAL4とIL-2[³²P]標識フラグメントとの両方にハイブリダイズする能力、および制限酵素分析により同定した。「pT3GAL4/IL-2m」（pT3GAL4/IL-2として図2Aに一般的に示す）と称する得られたプラスミドにおいて、GDFPをコードする配列を、センスRNA転写物がT3 RNA ポリメラーゼを用いて合成され得る方向でpBluescript中に挿入した。得られたR NAは、翻訳された場合、この順序で可動性のアミノ酸リンカーにより隔てられた、酵母GAL4タンパク質のDNA結合ドメインおよび成熟型のヒトIL-2ムテインの両者を組み込んでいた。 pT3GAL4/IL-2（図2Aに示す）と称する第２のプラスミドを、pT3GAL4/IL-2mについて記載したのと同様して構築したが、ヒトIL-2由来の遺伝子送達ドメイン（ GDD）をコードするDNAフラグメントをpT3matIL-2（実施例２）から単離したことが異なった。実施例４フレキソンにより隔てられるGDDおよびNBDを有する遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）をコードする第３のプラスミドの構築 IL-2およびGA14由来のGDFPをコードする別の発現ベクターを、以下のようにして構築した。 GAL4のDNA結合ドメイン（アミノ酸1〜147（Careyら、上記））を、以下のアンプリマーを用いてpT3gGAL4から30サイクルのPCRにより増幅した。 GAL4の５'末端に対するアンプリマーは、以下の通りであった：このアンプリマーは、GAL4の前半部において可動性のペプチド配列を有するインフレームでの融合を可能にするMet¹のすぐ上流にBamH1部位（GGATCC）を創製した（下記参照）。 GAL4 NH2末端（アミノ酸147まで）の３'末端に対するアンプリマーは、以下の通りであった：このアンプリマーは、pBluescript中へのクローン化のためのAsp718部位（GGT ACC）を創製し、そしてまたGAL4のDNA結合ドメインのＣ末端で操作された終止コドン（CTA）を含有した。 pT3IL-2/GAL4を構築するために、GAL4 PCR産物をBamH1およびAsp718を用いて消化した。ヒトIL-2をコードするDNAフラグメントを、Spe1およびSca1を用いて消化することによりpT3matIL-2（実施例２参照）から単離した。アミノ酸配列(G lyGlyGlyGlySer)₃をコードする以下のオリゴマー対をアニールして、5’Sca1突出（ACT）および3’BamH1突出（GATCC）を創製した： IL-2フラグメントおよびGAL4フラグメントならびにオリゴマーを、Spe1部位と Asp718部位との間でpBluescript中に連結して、そして構築物をE.coliのDH10B株中にエレクトロポレーションにより形質転換した。３つのすべてのフラグメントを含有する１つのコロニーを、GAL4およびIL-2[³²P]標識フラグメントの両方に対してハイブリダイズする能力、および制限酵素分析により同定した。図2Bに示すpT3IL-2/GAL4構築物において、センスRNAがT3 RNAポリメラーゼを用いて合成され得る方向でGDFPをpBluescript中に挿入した。得られたRNAは、翻訳された場合、この順で可動性のアミノ酸リンカーにより隔てられた、成熟型のヒトIL-2、および酵母GAL4タンパク質のDNA結合ドメインの両方を組み込んていた。実施例５遺伝子送達融合タンパク質の発現 GAL4/IL-2m GDFP構築物（実施例３に記載した）をコードするセンスmRNAを、T 3 RNAポリメラーゼを用いてpT3GAL4/IL-2ベクターからインビトロで転写した。簡潔に記すと、pT3GAL4/IL-2mプラスミドをAsp718を用いて線状化し、そしてこのテンプレートを、リボヌクレオチド混合物（rNTPs）、RNAキャップ構造類似体（m7Gppp）、およびT3 RNAポリメラーゼとをHEPESベースの緩衝液（Promega「Ri boMAX」）中で混合した。37℃でインキュベーション後、DNAテンプレートを、RN ase非含有DNase（Promega）を用いて消化し、そして合成されたmRNAを、G25セフアデックススピンカラム（Boehringer Mannheim）を通すクロマトグラフィーにより取り込まれなかったrNTPと分離し、EtOHを用いて沈澱させ、そしてOD₂₆₀により定量した。得られたmRNAを、無細胞ウサギ網状赤血球溶解物系で翻訳した。mRNAを、網状赤血球溶解物、RNasin、および完全アミノ酸の翻訳混合物（Promega）に添加した。翻訳を、１〜２時間、30℃で行った。その後、溶解物を-70℃で保存した。融合タンパク質の完全性および分子量を、翻訳混合物中に[³⁵S]標識メチオニン（Amersham）を含有させ、そして変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により産物を可視化することにより評価した。図３、レーン２に、14％アクリルアミドゲルで分離される[³⁵S]標識GAL4/IL-2m翻訳産物を示す。GAL4/IL-2m GD FP翻訳産物の位置は、33kDの予想されるMwと一致した。分子量マーカーを図３、レーン１に示し、そしてネガティブコントロールをレーン３に示す。 GAL4/IL-2 GDFP構築物（実施例３に記載した）およびIL-2/GAL4 GDFP構築物（実施例４に記載した）をコードするセンスmRNAを、上記と全く同様にして、それぞれpT3GAL4/IL-2ベクターおよびpT3IL-2/GAL4ベクターからT3 RNAポリメラーゼを用いてインビトロで転写した。図６、レーン３および４は、４〜20％勾配アクリルアミドゲルで分離される[³⁵S]標識IL-2/GAL4およびGAL4/IL-2翻訳産物を示す。IL2/GAL4 GDFPおよびGAL4/IL-2 GDFP翻訳産物の位置は、それぞれ33.3kDおよび33.2kDの予想される分子量と一致した。分子量マーカーを図６、レーン１に示し、そしてルシフェラーゼコントロールをレーン２に示す。実施例６ GDFP の配列特異的DNA結合活性配列特異的DNA結合において関係する実施例５のGDFPの能力を、電気泳動的移動度シフトアッセイ（EMSA）の使用により示した（Ausubelら（編）、「Current Protocols in Molecular Biology」、(1987および1993)）。 GAL4タンパク質が結合する標的オリゴマーは以下であった：以下の標的オリゴマーは、GAL4により結合されず、ネガティブコントロールとして使用した： GAL4標的オリゴマーを、[³²P]-dCTP（Amersham）およびクレノウポリメラーゼ（New England BioLabs）を使用して末端標識した。標識オリゴマーを、G25スピンカラム（Boehringer Mannheim）に対するクロマトグラフィーにより取り込まれなかったヌクレオチドと分離し、そしてシンチレーション計数により定量した。このオリゴマーをHEPESベースの緩衝液を含有する反応物に添加した。反応物には、ポリ(dI-dC)・ポリ(dI-dC)（Pharmacia）、ZnCl₂、グリセロールおよびBSA （Careyら、J．Mol．Biol．209：423-432、1989；Chasmanら、Mol．and Cell．B iol．9：4746-4749、1989）およびGAL4/IL-2m GDFPまたはIL-2のいずれかを含有する種々の量の網状赤血球溶解物が含まれる。反応物を、0.5×TBE中の4.5％ポリアクリルアミド／１％グリセロールゲルで電気泳動した。ゲルをメタノール／酢酸溶液中で固定し、乾燥し、そしてMolecular Dynamicsリン光分析機で分析した。図４に示す結果は、GAL4/IL-2m融合タンパク質（レーン１〜３）の投入量を減らすとGAL4/IL-2m GDFPの標識標的オリゴマーとの特異的相互作用が示されることを示す。DNAサイズマーカーをレーン４に示す。レーン５では、GAL4/IL-2m GDFPを、レーン１でのように、標識標的オリゴマーとともにインキュベートしたが、過剰の非標識標的オリゴマーもまた含まれており、それはGAL4/IL-2m GDFP への結合に対して標識標的オリゴマーと競合した。レーン６では、GAL4/IL-2m G DFPを、レーン１でのように、標識標的オリゴマーとともにインキュベートしたが、過剰の非標識非結合オリゴマーが含まれ、そして標識標的オリゴマーに対するGAL4/IL-2m GDFPの結合について競合がないことを示した。レーン７では、標識標的オリゴマーをヒトIL-2を含有する溶解物とともにインキュベートし、そしてIL-2または網状赤血球溶解物成分のいずれかによる標識標的オリゴマーの特異的結合を示さなかった。従って、GAL4/IL-2m GDFPは、GAL4/IL-2m GDFPのGAL4（ NBD）ドメインにより認識される同族の標的配列に特異的に結合した。図７の結果は、GAL4タンパク質ならびにIL-2/GAL4 GDFPおよびGAL4/IL-2 GDFP の配列特異的結合を示す。標的オリゴマー、結合条件、電気泳動およびゲル処理は、上記と全く同じであったが、分析がオートラジオグラフィーによったことを除く。最初の４つのレーンは、示すように、減少させた量の投入GAL4タンパク質を含み、標識標的オリゴマーとのGAL4の特異的相互作用を示した。その後のレーンは、図７に示すように、減少させた量の投入GAL4/IL-2 GDFPまたは減少させた量の投入IL-2/GAL GDFPのいずれかを含んだ。「+c」なる指示は、GDFPを前記のレーンでのように標識標的オリゴマーとともにインキュベートしたが、過剰の非標識標的オリゴマーもまた反応物中に含んだことを示す。「+m」なる指示は、GD FPを前記のレーンでのように標識標的オリゴマーとともにインキュベートしたが、過剰の非標識非結合オリゴマーもまた反応物中に含んだことを示す。非標識標的オリゴマーはGDFPの結合に対して標識標的オリゴマーと競合したが、非結合オリゴマーは競合しないことを示した。このことは、GAL4認識配列に対するGDFPの特異的結合を示す。「IL2」と称するレーンでは、標識標的オリゴマーをヒトIL-2 を含有する溶解物とともにインキュベートし、そしてIL-2または網状赤血球溶解物成分のいずれかによる標識標的オリゴマーの特異的結合を示さなかった。従って、IL-2/GAL4 GDFPおよびGAL4/IL-2 GDFPは、GDFPのGAL4（NBD）ドメインにより認識される同族の標的配列に対して特異的に結合した。実施例７ GDFP のサイトカイン生物活性インビトロ翻訳によるGAL4/IL-2m、GAL4/IL-2、およびIL-2/GAL4融合タンパク質（実施例５におけるように）を、周知のCTLLバイオアッセイを用いてそれらの IL-2活性についてアッセイした。Gillisら、J．Immunol．120：2027、1978に記載されるように、細胞をGDFPとともにインキュベートし、次いで³Ｈ-チミジンでパルスし、そしてDNAへの放射能の取り込みを細胞増殖の尺度として用いた。 GAL4/IL-2m GDFPからの結果を図５に示す。IL-2標準品は、バイオアッセイにおいて1:3に連続希釈した１ng/ml組換えヒトIL-2を示す。GAL4/IL-2m GDFP曲線を、溶解物の1:10希釈で開始したインビトロ翻訳物質を用いて作製した。バイオアッセイは、GAL4/IL-2m GDFPによるIL-2生物学的活性の保持を示す。 GAL4/IL-2 GDFPおよびIL-2/GAL4 GDFPからの結果を図８に示す。IL-2標準品は上記の通りであった。GDFP曲線を、溶解物の1:50希釈で開始したインビトロ翻訳物質を用いて作製した。バイオアッセイは、GAL4/IL-2 GDFPおよびIL-2/GAL4 GD FPによるIL 2生物学的活性の保持を示す。実施例８ジフテリア毒素膜貫通領域を含有するGDFPの構築および特徴付け C.diphtheriae由来のジフテリア毒素タンパク質の膜貫通（TM）ドメイン（アミノ酸205〜378）（Choeら、Nature 357：216-222、1992）は、感染細胞の細胞質への毒素の触媒ドメインのエンドソーム放出の原因である領域である（Papini ら、JBC 268：1567-1574、1993、Madshus、JBC 269：17723-17729、1994）。この領域はまた、弱酸性環境に応答して細胞膜挿入を可能にすることが示されている（Moskaugら、JBC 263：2518-2525、1988、McGillら、EMBO 8：2843-2848、19 89）。このドメインを先在するGDFPに組み込むために、ジフテリア毒素タンパク質の膜貫通ドメインをコードする２つのDNAフラグメントを、C.diphtheriaeゲノムDNAからPCRにより増幅した。アミノ酸205〜378をコードする、「DT」と名付けた第１のフラグメントを、以下のアンプリマーを用いて増幅した。５'末端に対するアンプリマーは、以下の通りであった：３'末端に対するアンプリマーは、以下の通りであった：毒素TM配列に下線を付す。両方のアンプリマーは、BamH1消化pT3IL-2/GAL4（実施例４）へのPCRフラグメントのその後のクローン化のために末端付近にBamH1 部位を提供した。「DAB」と名付けた第２のフラグメントはアミノ酸176〜378をコードし、そして膜貫通領域のアミノ末端に付加的な残基を提供した。インタクトな毒素タンパク質に関しては、これらの付加的な配列が、膜フソジェニック(fusogenic)活性に必要であり得る酵素切断過程において含まれる（Williamsら、JBC 265：20673 -20677、1990、Ariansenら、Biochemistry 32：83-90、1993）。「DAB」フラグメントを以下のアンプリマーを用いて増幅した。５'末端に対するアンプリマーは、以下の通りであった：３'末端に対するアンプリマーは、上記の「DT」フラグメントをPCRするために用いたものと同一の３'アンプリマーであった。毒素TM配列に下線を付す。得られた「DAB」PCRフラグメントをBamH1を用いて消化し、そしてpT3GAL4/IL-2およびpT3IL-2/GAL4（実施例３および４）の両方の BamH1部位にクローン化した。このようにして、３つのトリプルドメイン融合プラスミドを生成した（pT3IL- 2DTGAL4、pT3IL-2DABGAL4、およびpT3GAL4DABIL-2）。各々は、中央のドメインとして一連のジフテリア毒素膜貫通領域の変形物を含有した。３つのGDFP RNAのそれぞれを翻訳して、得られた融合タンパク質をIL-2生物活性の保持および特異的核酸結合能力についてアッセイした（実施例５、６、および７）。３つのトリプルドメインGDFPのすべては、これらの活性を有することが見出された。実施例９標的核酸（tNA）の構築酵母転写アクチベーター（GAL4）は、いくつかの密接に関連する17bpの２本鎖 DNA配列に対して特異的な親和性を有し、そしてそれはまた、野生型配列と結合するのと同様の親和性で、コンセンサスな合成17bpの標的化配列を結合することを示している（Ginigerら、Cell 40：767-774、1985；BramおよびKornberg、P.N .A.S．82：43-47、1985）。標的化ベクターを、コンセンサスな17bp配列（Webst erら、Cell 52：169-178、1988；Careyら、J．Mol．Biol．209：423-432、1989 ）を含有するオリゴマーをpDC302CAT（Mosleyら、Cell 59：335-348、1989；およびOverellら、J．Imm．Meth．141：53-62、1991）の骨格中の唯一のSal1部位中に連結することにより作製した。pDC302CATは、哺乳動物宿主細胞においてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）の発現を導くプラスミドである。以下のオリゴマーを使用した：オリゴマー対は内部のSca1部位（TCATGA）を有し、この部位を用いてオリゴマーの存在について得られる形質転換体をスクリーニングする。さらに、５'末端および３'末端の両端にSal1に相補的な突出が存在し、そのうちの１個のみが、連結においてSal1部位を再生し得た。この特徴は、プラスミドの特徴付けのためのオリゴマー多重体（multimers）の遊離を可能にするために組み込まれた。オリゴマー対は、中性の塩緩衝液中でそれぞれを等量煮沸し、次いで反応物をゆっくり冷却することによりアニールさせた。次いでアニールしたオリゴマーをT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer Mannheim）を用いてリン酸化し、Sal1を用いて線状化したpDC302CATに連結した。構築物をE.coliのDH10Bにエレクトロポレートし、そして得られたコロニーを、標的オリゴマー、またはその多重体の存在について[³²P]標識標的オリゴマープローブに対するハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。標的オリゴマーを有するコロニーは、制限酵素分析および配列決定によりコピー数についてさらに特徴付けがなされた。実施例１０ IL-2 レセプター産生CTLLに対して結合するGDFPの能力インビトロ翻訳（実施例５）によるGAL4/IL-2 GDFPおよびIL-2/GAL4 GDFPはさらに、以下のアッセイを介してCTLLと結合すること（実施例７参照）を示した。 CTLLを、IL-2非含有培地中で２時間以上インキュベートした。[³⁵S]標識したGAL 4/IL-2、IL-2/GAL4、IL-2、およびGAL4（実施例５）を、CTLLとともに１時間、４℃で、20mM HEPESで緩衝化したRPMI-1640において25mg/ml BSAおよび２mg/ml アジ化ナトリウムを含有する結合培地中でインキュベートした。結合培地を、最終pHを7.2に調製した後に使用した。結合後、細胞を氷冷PBS中で３回洗浄し、そして最終的な細胞ペレットを、150mM NaCl、５mM EDTA、0.02％アジ化ナトリウム、および0.5％ Triton X-100を含有するTris緩衝液中で再懸濁して細胞を穏やかに溶解した。溶解物を短くスピンし、そして上清を４〜20％勾配ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した。図９に、CTLL溶解物に存在し、それ故、CTLLと会合する標識タンパク質を示す。レーン１は分子量標準を示す。レーン２は未反応の網状赤血球溶解物中に存在するヒトIL-2タンパク質（実施例５）を示し、そしてレーン３はIL-2との結合後のCTLL溶解物である。レーン４は未反応の網状赤血球溶解物中に存在するGAL4/IL-2 GDFPを示し、そしてレーン５はGAL4/IL-2 GDFPとの結合後のCTLL溶解物である。レーン６は未反応の網状赤血球溶解物中に存在するIL-2/GAL4 GDFPを示し、そしてレーン７はIL-2/GAL4 GDFPとの結合後のCTLL溶解物である。レーン８は未反応の網状赤血球溶解物中に存在するGAL4を示し、そしてレーン９はGAL4との結合後のCTLL溶解物である。従って、GAL4/IL-2 GDFPおよびIL-2/GAL4 GDFPおよびIL-2はCTLLと特異的に結合するが、GAL4は結合しない。これは、GDFPのCTLL特異的結合はIL-2ドメインにより仲介され、そしてGAL4ドメインによらないことを示す。実施例１１ IL-2 レセプター産生CTLLに対する標的オリゴマーの結合を仲介する GAL4/IL-2 GDFP およびIL-2/GAL4 GDFPの能力イントロ翻訳によるGAL4/IL-2融合タンパク質およびIL-2/GAL4融合タンパク質（実施例５におけるような）を、実施例６に示す[³²P]-dCTP末端標識GAL4標的オリゴマーに結合させた。GDFP-tNA複合体を、実施例１０に記載するように、１時間、４℃で、20mM HEPESで緩衝化させたPRMI-1640において25mg/ml BSAおよび２ mg/mlアジ化ナトリウムを含有する結合培地中でCTLLに結合させた。結合培地を、最終pHを7.2に調整後に使用した。細胞に結合したGDFP-tNA複合体を、フタル酸塩油層を通じる結合混合物の遠心分離により遊離GDFP-tNAから分離した（Dowe rら、J．Exp．Med．162：501-515、1985）。細胞と会合したカウントをシンチレーション計数により定量化した。図10に、GAL4/IL-2 GDFP、IL-2/GAL4 GDFP、GA L4、および「Bg」と称するネガティブコントロールの網状赤血球溶解物により仲介されるCTLLと会合した標識オリゴマーのカウントを示す。結合アッセイは、CT LLへのオリゴマーtNAの結合を仲介するGAL4/IL-2 GDFPおよびIL-2/GAL4 GDFPの両方の能力を示す。実施例１２ IL-2 レセプター産生CTLLへの標的プラスミドの結合を仲介する GAL4/IL-2 GDFP の能力 GAL4/IL-2 GDFP（実施例５）を、実施例６に示す結合条件を用いて標的プラスミドに結合させた。プラスミドは、実施例８に示すように、８コピーのGAL4 17 マーの標的オリゴマーを含有した。GDFP-tNA複合体を、実施例10に示す結合培地中で、１時間、４℃で、CTLLと結合させた。次いでCTLLを氷冷PBS中で３回洗浄し、そして最終的な細胞ペレットを、150mM NaCl、５mM EDTA、0.02％アジ化ナトリウム、および0.5％ Triton X-100を含有するTris緩衝液中に再懸濁し、細胞を穏やかに溶解した。細胞溶解物を短くスピンし、上清を0.4Ｎ NaOHにし、そしてサンプルを60℃で１時間、変性した。次いでサンプルを、スロットブロットを介してGeneScreen Plus膜（NEN）上に載せた。ブロットを、[³²P]標識CATプローブに対するハイブリダイゼーションにより標的プラスミドの存在についてスクリーニングした。膜を洗浄し、そして細胞会合プラスミドからのシグナルをリン光分析機（Molecular Dynamics）により定量化した。図11に、GAL4/IL-2 GDFPまたは「Bg」と称するネガティブコントロールの網状赤血球溶解物のいずれかにより仲介されるCTLLへのプラスミドの会合を示す。結合アッセイは、プラスミドtNA のCTLLへの結合を仲介するGAL4/IL-2 GDFPの能力を示した。有用性本発明の遺伝子送達融合タンパク質は、標的細胞にポリヌクレオチドを送達するための非ウィルス性の遺伝子送達系を創出する工程において有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウェイザー，カレンイー. アメリカ合衆国ワシントン 98144，シアトル，19ティーエイチアベニューサウス 3413

Claims

【特許請求の範囲】１．標的細胞に標的化核酸を送達することにおいて有用な融合タンパク質であって、該融合タンパク質は遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）を含み、該GDFPは該標的化核酸に結合する核酸結合ドメイン（NBD）、およびそれが融合される該標的化核酸の該標的細胞への送達を仲介する遺伝子送達ドメイン（GDD）を含む、融合タンパク質。２．前記標的化核酸が二本鎖核酸である、請求項１に記載の融合タンパク質。３．前記標的化核酸が一本鎖核酸である、請求項１に記載の融合タンパク質。４．前記標的化核酸がDNAまたはそのアナログである、請求項１に記載の融合タンパク質。５．前記標的化核酸がRNAまたはそのアナログである、請求項１に記載の融合タンパク質。６．前記標的化核酸が、前記標的細胞中で発現されるべきヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターの形態にある、請求項１に記載の融合タンパク質。７．前記発現されるべきヌクレオチド配列が、通常は前記標的細胞中で発現されないヌクレオチド配列である、請求項６に記載の融合タンパク質。８．前記発現されるべきヌクレオチド配列が、前記標的細胞中に存在するヌクレオチド配列のアンチセンスコピーである、請求項６に記載の融合タンパク質。９．前記GDFPが、前記核酸結合ドメインと前記遺伝子送達ドメインとの間または該ドメインの１つの中に可動性ポリペプチドリンカー配列（「フレキソン」）をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。１０．前記NBDが、配列特異的核酸結合タンパク質の核酸結合成分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。１１．前記NBDが、配列非特異的核酸結合タンパク質の核酸結合成分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。１２．前記NBDが、１つ以上の標的化核酸に結合する複数の核酸結合（NB）成分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。１３．前記NBDが、異なる結合特異性を有する少なくとも２つのNB成分を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。１４．前記NBDが、前記標的化核酸中に存在する特異的同族認識配列に結合し得る第１のNB成分および該標的化核酸に非特異的に結合し得る第２のNB成分を含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。１５．前記NBDが、前記標的化核酸の凝縮および/または電荷中和を仲介し得る成分をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。１６．前記遺伝子送達ドメイン（GDD）が標的化核酸の標的細胞への送達を促進する１つ以上の成分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。１７．標的化核酸の標的細胞への送達を促進する前記成分が、結合/標的化成分、膜破壊成分、輸送/局在化成分およびレプリコン組込み成分からなる群から選択される、請求項１６に記載の融合タンパク質。１８．前記GDDが標的化核酸の標的細胞への送達を促進する２つ以上の成分を含み、該成分が結合/標的化成分、膜破壊成分、輸送/局在化成分およびレプリコン組込み成分からなる群から選択される、請求項１６に記載の融合タンパク質。１９．前記GDDが結合/標的化成分を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。２０．前記GDDが膜破壊成分を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。２１．前記GDDが輸送/局在化成分を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。２２．前記GDDがレプリコン組込み成分を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。２３．前記レプリコン組込み成分がインテグラーゼ酵素またはインテグラーゼ活性を保持するその誘導体である、請求項２２に記載の融合タンパク質。２４．標的細胞に標的化核酸を送達することにおいて有用な高分子複合体であって、該複合体が標的化核酸に会合した請求項１に記載の遺伝子送達融合タンパク質（GDFP）を含む、複合体。２５．前記GDFPがレプリコン組込み成分を含む、請求項２４に記載の高分子複合体。２６．前記レプリコン組込み成分がリコンビナーゼ酵素またはリコンビナーゼ活性を保持するその誘導体を含み、そして前記標的化核酸が末端のリコンビナーゼ認識配列に近接してNBD同族認識配列を含む、請求項２５に記載の高分子複合体。２７．前記リコンビナーゼがインテグラーゼ酵素またはインテグラーゼ活性を保持するその誘導体であり、そして前記標的化核酸が末端のインテグラーゼ認識配列に近接してNBD同族認識配列を含む、請求項２６に記載の高分子複合体。２８．遺伝子送達融合タンパク質を調製することにおいて有用な組換えポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが請求項１に記載のGDFPをコードするコード配列を含む、ポリヌクレオチド。２９．前記ポリヌクレオチドが、前記コード配列に作動可能に連結された転写制御領域を含む発現ベクターの形態にある、請求項２８に記載の組換えポリヌクレオチド。３０．遺伝子送達融合タンパク質を調製することにおいて有用な細胞であって、該細胞が請求項２９に記載の発現ベクターを含有する、細胞。３１．GDFPを生産するために請求項２９の組換えポリヌクレオチドを使用する方法であって、該方法が組換えポリヌクレオチドを転写および翻訳させる工程ならびにGDFPを回収する工程を包含する、方法。３２．標的細胞に前記標的化核酸を送達するために請求項１に記載のGDFPを使用する方法であって、該方法が該GDFPを該標的化核酸と接触させてGDFP/核酸複合体を生成させる工程および該GDFP/核酸複合体を該標的細胞と接触させる工程を包含する、方法。３３．請求項３２の方法により生成される細胞およびその子孫。３４．前記標的化核酸が、RNA転写物、アンチセンスRNA、RNAデコイおよびリボザイムからなる群から選択されるRNA分子として、前記細胞で発現される、請求項３３に記載の細胞。３５．標的細胞に前記標的化核酸を送達するために請求項２３に記載のGDFPを使用する方法であって、該方法が該GDFPを該標的化核酸と接触させてGDFP/核酸複合体を生成させる工程および該GDFP/核酸複合体を該標的細胞と接触させる工程を包含する、方法。３６．請求項３５に記載の方法により生成される細胞およびその子孫であって、該細胞が前記標的化核酸の組込まれたコピーを含む、細胞。