JPH10501973A

JPH10501973A - シュウ酸塩検出のための物質及び方法

Info

Publication number: JPH10501973A
Application number: JP8502576A
Authority: JP
Inventors: アモンビー．ペック
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1994-06-20
Filing date: 1995-06-20
Publication date: 1998-02-24
Also published as: CA2193674A1; WO1995035377A2; KR20040000399A; US5837833A; KR100415912B1; EP0802978A2; AU710652B2; US5604111A; KR100387107B1; MX9700078A; US20010011130A1; WO1995035377A3; AU2905595A

Abstract

(57)【要約】本発明は、初めて、生物試料中のシュウ酸塩の検出及び測定のために、オキサリル-CoA脱炭素酵素とともにホルミル-CoAトランスフェラーゼ酵素を使用することに関する。本発明による酵素系を利用すると、シュウ酸塩は二酸化炭素及びギ酸に転化する。ギ酸の産生は、試料中に存在するシュウ酸塩の濃度と直接的に相関するため、産生されたギ酸濃度の測定により、低レベルのシュウ酸塩をも検出するための、正確で、高感度で、かつ迅速な方法が提供される。さらに、本発明は、オキサロバクターホルミジェネスのホルミル-CoAトランスフェラーゼ及びオキサリル-CoA脱炭素酵素をコードする遺伝子のクローニング、配列決定、及び発現に関する。本発明はまた、試料中のオキサロバクターホルミジェネス生物の存在を検出する方法、及び該検出方法で用いられるポリヌクレオチド・プローブ及びプライマーに関する。

Description

【発明の詳細な説明】シュウ酸塩検出のための物質及び方法本発明は、国立衛生研究所研究奨励番号DK20586（National Institutes of He alth Grant No.DK20586）の下で、政府の助成を受けて行なわれた。本発明において、政府は一定の権利を有する。関連出願に対する相互参照本願は、1994年6月20日に出願された同時係属中の出願番号08/262,424の一部継続出願である。発明の背景本発明は、試料中のシュウ酸塩の存在、またはその濃度を測定するための新しい測定法に関する。さらに、本発明は、シュウ酸塩検出のための新しい測定法において用いられる酵素、ホルミル-CoAトランスフェラーゼのクローニング、配列決定及び発現に関する。シュウ酸（シュウ酸塩）は、脊椎動物及び多くの消費用作物において強い毒性をもつ、天然の代謝副産物である。残念ながら、かなりの割合の人がシュウ酸塩を適切に代謝することができず、そのような状態にある人には腎臓結石が形成されることがある。全腎臓結石のうち70%は、ある程度の量のシュウ酸塩を含むと推定されている。合衆国の人口の約12％が、一生のある時期に腎臓結石を患うことになり、この発病率は合衆国だけでなく、スウェーデン及び日本でも増加している(Curhan，1993)。さらに、健康な人は、組織の中にシュウ酸塩が過剰に蓄積するのを避けるために十分な量のシュウ酸塩を分解するかまたは排出するが、ピリドキシン欠乏症、腎不全、及び、腎臓へのシュウ酸塩の過剰沈着を引き起こす遺伝的代謝障害である原発性高シュウ酸塩尿症などを含む、多くの疾病状態が、シュウ酸塩代謝機能の不全に関連していることが知られている。脂質吸収不良という問題(例えば、スプルー、膵臓不全、炎症性腸疾患、腸切除など)を抱えている患者と同じように、腎臓結石を患っているか、それを発生させる危険にある人は、尿内シュウ酸塩のレベルを上昇させている傾向にあるが、この事実は、危険性のある患者を同定するための方法として利用されてきた。シュウ酸塩レベルの上昇は尿中に現われるかもしれないが、血清中に存在する低レベルのシュウ酸塩を検出することは困難であるために、血清中でシュウ酸塩レベルの上昇を検出することは日常的な方法にはなっていなかった。生物試料中のシュウ酸塩を測定するための従来の方法の大部分においては、まず、沈殿、溶媒抽出またはイオン交換吸着によってシュウ酸塩を単離する必要がある(Hodgkinson,1970)。単離されたシュウ酸塩の量は、比色定量法、蛍光定量法、ガス液体クロマトグラフィーまたは同位体希釈技術を含む幾つかの方法のいずれか一つによって決定されうる。これらの分析方法で用いられる、シュウ酸塩単離技術の多くは定量的でないため、通常は、¹⁴Cで標識したシュウ酸塩内部標準を加えることによって、シュウ酸塩の回収量の低さを補正する必要があり、これがさらに分析方法を複雑なものにしている。これらの方法はすべて、手がかかるため、熟練した研究技術者が費やさなければならない時間量を考えると当然費用がかかる。さらに、シュウ酸塩を分離するためには、出発材料として、比較的大量の試料が必要になる。最近、(a)シュウ酸塩分解酵素及び(b)高速液体クロマトグラフィーを用いることによって、シュウ酸塩の検出及び定量にいくつかの進展が見られた。ある市販の酵素試験(シグマ化学社(Sigma Chemical Company)、ミズーリ州セントルイス）では、シュウ酸塩を二酸化炭素及び過酸化水素に酸化するために、シュウ酸塩酸化酵素を用いる。そして、ペルオキシダーゼ存在下で二次的な酵素反応を行なって、産生される過酸化水素を比色定量法的に測定することができる。シュウ酸塩を測定するための別の酵素による方法においては、シュウ酸塩を二酸化炭素及びギ酸に転化させるために、シュウ酸塩脱炭素酵素が用いられる。生じた二酸化炭素を、二酸化炭素捕獲用緩衝液におけるpHの変化またはpH指示緩衝液における比色変化によって、検圧定量的に測定することができる。二酸化炭素測定においていかなる方法を採用しても、二酸化炭素の拡散及び平衡に必要な時間は、迅速な解析方法として望ましい時間よりもはるかに長い。代替法として、コステロ（Costello）（1976年）及びイリベリ（Yriberri）（ 1980年）に開示されているように、シュウ酸塩脱炭素酵素の作用によって産生されるギ酸を、NAD/NADH共役反応におけるギ酸脱水素酵素によって測定することができる。シュウ酸塩脱炭素酵素及びギ酸脱水素酵素では至適pH要求性が異なるために、解析の間にpH調整が必要となり、この方法は手間も時間もかかる。別の市販の酵素試験法(ベーリンガーマンハイム社(Boehringer Mannheim))では、シュウ酸塩をギ酸及び二酸化炭素に分解してから、ギ酸脱水素酵素の存在下でNADによって重炭酸塩にギ酸を酸化させる。334、340、または365 nmにおける吸光度法によってNADHの量を測定する。別の検査法(ミッションファーマカル社( Mission Pharmacal)の「STONE RISK」)では、腎臓結石に関する一連の試験の一部として、シュウ酸塩を測定する。以上に示したように、現在存在するシュウ酸塩測定法は、費用、不正確さ、信頼性、複雑さ、及び感度の低さといった、多くの問題を抱えている。したがって、生物試料中の低レベルのシュウ酸塩を検出するための、簡便、正確、高感度の測定法を提供することが、本発明の目的である。発明の概要本発明は、オキサロバクター・ホルミジェネス（Oxalobacter formigenes）のホルミル-CoAトランスフェラーゼ及びオキサリル-CoA脱炭素酵素の遺伝子のクローニング、配列決定及び発現に関し、さらに、試料中にシュウ酸塩が存在することを検出するためのこれらの酵素の使用に関する。本発明の測定法は、生物試料において、非常に低濃度のシュウ酸塩ですら、迅速に高感度に検出する方法を初めて提供する。利点としては、シュウ酸塩を検出しうる生物試料に、尿及び血清試料の両方が含まれることである。本発明によって用いられる酵素系は、シュウ酸塩を二酸化炭素及びギ酸に転化させる。本発明の好ましい態様において、その後、ギ酸の産生が比色定量的に測定される。この測定法は、シュウ酸塩を検出するための高感度、正確、及び便利な方法を提供する。本発明のさらにもう一つの面は、ホルミル-CoAトランスフェラーゼ及びオキサリル-CoA脱炭素酵素をコードする、O．ホルミジェネス（O.formigenes）の遺伝子の発見である。これらの遺伝子の発見により、本発明にかかる測定法またはその他の適当な応用法に用いるために、純粋なホルミル-CoAトランスフェラーゼ及びオキサリル-CoA脱炭素酵素を大量に効率的に産生することが可能なる。本発明はまた、試料中にオキサロバクター・ホルミジェネスの生物体が存在することを検出するための方法を提供する。本明細書において提供された検出法には、特定のオキサロバクターの生物体を同定するために用いることができるポリヌクレオチドプローブが含まれる。本発明はまた、ポリヌクレオチドプライマー、及びオキサロバクターホルミジェネスのヌクレオチド配列のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅のための該プライマーの使用に関する。次に、本発明のポリヌクレオチドプローブを用いて、増幅されたオキサロバクターの配列を検出することができる。図面の簡単な説明図1Aから1Eは、試料中の様々な濃度のシュウ酸塩の検出を示す。各試料について比色吸光度を時間(分)毎にプロットした。陽性対照及び陰性対照の図も示されている。図２は、ホルミル-CoAトランスフェラーゼ遺伝子の部分ヌクレオチド配列及びホルミル-CoAトランスフェラーゼポリペプチドの部分アミノ酸配列を示す。太字は、N末端の蛋白質配列決定により決定されたアミノ酸残基を表している。図３は、オキサリル-CoA脱炭素酵素遺伝子のヌクレオチド配列及び隣接領域を示している。推定翻訳開始コドン(位置1から3)から約10塩基上流に、リボソーム結合部位に一致する配列がある(二重下線を施した文字の部分)。ロー因子非依存性の終結配列が、1758位から1790位(二重下線を施した文字の部分)に存在する。推定TPP結合部位が、1351位から1437位の間に見られる。配列の簡単な説明配列番号1〜3は、ホルミル-CoAトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の既知の部分である(図２にも示されている)。配列番号4は、配列番号1にコードされているポリペプチドであり、本発明によって用いることができる。配列番号5は、配列番号2にコードされているポリペプチドであり、本発明によって用いることができる。配列番号6は、オキサリル-CoA脱炭素酵素遺伝子のヌクレオチド配列である(図 3にも示されている)。配列番号7は、配列番号6にコードされているポリペプチドであり、本発明によって用いることができる。配列番号8は、オキサリル-CoA脱炭素酵素のプローブの配列であり、本発明によって用いることができる。配列番号9は、オキサリル-CoA脱炭素酵素のプローブの配列であり、本発明によって用いることができる。配列番号10は、オキサリル-CoA脱炭素酵素の5'-プライマーであり、本発明によって用いることができる。配列番号11は、オキサリル-CoA脱炭素酵素の3'-プライマーの配列であり、本発明によって用いることができる。発明の詳細な説明本発明は、尿及び血清などの生物試料中のシュウ酸塩の、正確で高感度の測定法を提供する。シュウ酸塩レベルの上昇は、尿路結石の形成、及びその他の健康問題と相関する。高レベルのシュウ酸塩を早期に検出すれば、適切な薬物治療及び食事の変更によって、健康に対する有害な結果を回避、遅延または減少させることができる。本明細書において開示される診断系においては、シュウ酸塩を二酸化炭素及びギ酸に分解するために、二つの酵素を用いる。特に、オキサリル-CoA脱炭素酵素及びホルミル-CoAトランスフェラーゼの二つの酵素の組み合わせの作用によって、測定される試料に存在しうる、いかなるシュウ酸塩もギ酸及び二酸化炭素(CO₂ )に転化する。次に、当技術分野において知られている様々な技術を用いて、ギ酸を検出することができる。好ましい態様において、ギ酸の異化を検出可能な比色変化の呈示と結びつけることによって、ギ酸の産生を比色定量的に測定する( 例えば、特定の光波長を吸収する化合物の形成)。ギ酸の産生量は、試料中に存在するシュウ酸塩の量と直接的な相関関係にある。したがって、本酵素系を用いて既知の量のギ酸を生成させれば、試料中に存在するシュウ酸塩の量を容易に定量することができる。好ましい態様において、本発明に用いられる酵素は、細菌オキサロバクターホルミジェネス由来の遺伝子によって発現される。オキサリル-CoA脱炭素酵素(Lun g，1994)をコードする遺伝子及びホルミル-CoAトランスフエラーゼ酵素をコードする遺伝子はいずれも、クローニングされ発現されているため、容易に利用可能な試薬材料源が供給される。本測定法によれば、シュウ酸塩レベルが0.00025〜0 .0005 mMという低範囲のものであっても検出することができる(図1A〜1E)。この程度の感度があれば、本測定法によって、容量が10μlというほんの少量を含んでいる、血清試料中のシュウ酸塩を直接検出することができる。開示される系は、当技術分野において知られている標準的な系を用いて容易に自動化することができる。本測定法の好ましい態様において、酵素反応を、96穴の平底の微量滴定用プレートのウエルの中で行い、自動プレート読み取り器によって読み取らせることができる。適当な濃度の測定用試薬のオキサリル-CoA脱炭素酵素、オキサリル-CoA 、β-NAD、ギ酸脱水素酵素、及び、測定すべき試料を微量滴定用のウエルに加える。次に、この反応液を平衡化させ(プレート読み取り器中で37℃で2分間インキュベートする)、試料中に存在する可能性のある残余のギ酸を減成させておく。次に、反応を開始するために、ホルミル-CoAトランスフェラーゼ酵素を反応混合液に加え、15秒間隔でプレートを読み取る。340 nmにおける試料の吸光度の変化を検出して、ギ酸脱水素酵素存在下でNADの還元を測定することにより、ギ酸産生量を決定する(Baetz及び Allison，1989)。未知の試料を、既知のシュウ酸塩量を有する標準と比較することにより、シュウ酸塩量を決定する。さらに、本測定法における酵素反応は、ホルミル-CoAトランスフェラーゼ、オキサリル-CoA脱炭素酵素、及びオキサリル-CoAのすべてが反応混合液中に存在し、初めて開始する。このため、上記の試薬の一つを反応混合液に加えないでおくことによって、酵素反応の開始を回避することができる。好ましくは、オキサリル-CoA脱炭素酵素及びオキサリル-CoAを最初に加え、混合液にホルミル-CoAトランスフエラーゼを加えることによって反応を開始させる。しかし、望ましい測定開始点の直前まで試薬の一つを加えないでおく限り、3つの試薬を加える順序はこの測定法の機能にとって重要ではない。本発明で用いられるホルミル-CoAトランスフェラーゼ及びオキサリル-CoA脱炭素酵素は、オキサロバクター・ホルミジェネスの天然産物として採取し、精製することができる(Baetz及びAllison，1989及び1990)。また、酵素は、該酵素をコードする、本発明の組み換えポリヌクレオチド分子を発現しいる宿主細胞から採取することができる。本測定法で用いられる他の試薬は、ミズーリ州セントルイスのシグマ化学会社（Sigma Chemical Company）など、通常の供給者から入手することができる。さらに、当業者は、本明細書に開示される測定法で用いる試薬の至適濃度を容易に決定することができる。本発明のさらにもう一つの面は、本発明の目的である測定法で用いられるホルミル-CoAトランスフェラーゼをコードするオキサロバクター・ホルミジェネス遺伝子のクローニング、配列決定、及び発現に関する。オキサロバクターのゲノム DNAライブラリーをスクリーニングするための縮重オリゴヌクレオチドのプローブ(トリプシン処理したペプチドの部分的なアミノ酸配列分析に基づいている)を用いて、遺伝子をクローニングした。この遺伝子は、約40 kDの分子量をもつポリペプチドをコードしている。本発明は、さらに、オキサロバクター・ホルミジェネス由来のオキサリル-CoA脱炭素酵素をコードする遺伝子のクローニング、配列決定、及び発現に関する。ホルミル-CoAトランスフェラーゼ及びオキサリル-C oA脱炭素酵素のcDNAのヌクレオチド配列が、それぞれ図2及び3に示されている( 配列番号1〜3及び6)。遺伝子コードの縮重のため、様々な異なるポリヌクレオチド配列が、本明細書において開示されるホルミル-CoAトランスフェラーゼのポリペプチドをコードすることができる。本発明のポリペプチドと同一、または実質的に同一のポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチド配列を作出することは、熟練した当業者技術の範囲内にある。これらの変異または代替ポリヌクレオチド配列は本発明の範囲内にある。本明細書において用いられるように、「実質的に同一な」配列とは、コードされているポリペプチドの機能的な酵素活性を本質的に変化させることなく、アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入をコードする配列を意味する。さらに、本発明は、図2及び3(配列番号1〜3及び6)に示されたDNA配列と十分な相同性を有するために、これらの配列と標準的な高厳密度条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド分子を含む。このようなハイブリダイゼーションの条件は、当技術分野において通常のものである(例えば、Maniatis et a l.，1989参照)。当業者が理解しているように、酵素の機能活性を変化させることなく、ポリペプチドのアミノ酸配列中に一定のアミノ酸置換を生じさせることができる。例えば、アミノ酸は、非極性、電荷を持たない極性、塩基性及び酸性に分類できる。一つの分類に属するアミノ酸が、同じ分類に属する別のアミノ酸に置き換わる保存的置換は、この置換によってポリペプチドの酵素反応性が実質的に変化しない限り、本発明の範囲に含まれる。組み換えホルミル-CoAトランスフェラーゼ酵素を発現させるために、本発明のポリヌクレオチドを用いることができる。それらはまた、関連する酵素を検出するためのプローブとして用いることもできる。また、該ポリヌクレオチドは、DN Aのサイズを決定する標準として用いることもできる。該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ホルミル-CoAトランスフェラーゼ酵素に対する免疫反応を起こさせるために用いることができる。また、分子量標準、または測定法における不活性タンパク質として用いることもできる。また、この酵素と免疫反応性がある抗体が存在することを検出するために、このポリペプチドを用いることができる。本発明のポリヌクレオチド配列は、RNAまたはDNAのいずれからなっていてもよい。より好ましくは、ポリヌクレオチド配列はDNAからなる。本発明の別の面は、シュウ酸塩の酵素測定を実施するためのキットに関する。一つの態様において、キットは、パッケージ化されて組み合わされ、説明されている測定方法の感度を最も効果的にするような相対的容量になっており、(a)オキサリル-CoA脱炭素酵素、オキサリル-CoA、β-NAD及びギ酸脱水素酵素、ならびに(b)ホルミル-CoAトランスフェラーゼを含む。キットには、特定のシグナル発生系に必要とされうる他の試薬とともに、緩衝剤および安定化剤のような、他の試薬または溶液が随意に含まれていてもよい。測定法の簡便性および標準化を提供するために、陽性対照、及び陰性対照といった他の試薬をキットに含ませることもできる。本発明は、さらに、オキサロバクターホルミジェネスの生物体が試料中に存在することを検出するための方法に関する。オキサロバクターホルミジェネスのオキサリル-CoA脱炭素酵素遺伝子またはホルミル-CoAトランスフェラーゼ遺伝子の配列のいずれかのヌクレオチド配列に基づいて、特異的なポリヌクレオチドプローブを調製することができる。好ましい態様において、ポリヌクレオチドプローブは、オキサリル-CoA脱炭素酵素遺伝子配列に基づいている。本発明のポリヌクレオチドプローブを、このプローブとハイブリダイズするに足りる相同性を有する他のポリヌクレオチド配列を特異的かつ選択的に検出するために、標準的な実験手順及び条件に従って用いることができる。本発明の一つの態様において、当業者に既知の標準的な技術を用いて、生物試料中(例えば、生検、糞便、切屑など)の細菌生物からDNAを単離する。次に、単離したDNAを、オキサロバクターのオキサリル-CoA脱炭素酵素に特異的なポリヌクレオチドのプローブを用いてハイブリダイゼーションするために、スクリーニングする。どのようなハイブリダイゼーション技術を用いるかは、本発明を実施する上で重要ではない。例えば、ハイブリダイゼーションに用いるプローブの量、プローブと検出する標的DNA断片との間の相補性(すなわち相同性)の程度によって、ハイブリダイゼーションの間に様々な厳密度を用いることができる。厳密度の度合いは、ハイブリダイゼーションと洗浄の過程における温度、イオン強度、pH、及び、ホルムアミドのような変性剤の存在によって調節することができる。ハイブリダイゼーションの方法と条件は、当技術分野において既知であり、一般的には、「核酸のハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）：実用的な研究方法（A Practical Approach）(Hames，B.D.，S.J．Higgins編)、IRLプレス(1985) 」において開示されている。本発明のポリヌクレオチドプローブには、例えば、本明細書において特に例示されているオキサリル-CoA脱炭素酵素プローブA(配列番号8)、及びプローブB(配列番号9)が含まれる。プローブA及びプローブBのヌクレオチド配列を下に示す。また、本発明で用いられるポリヌクレオチドプローブには、本明細書において開示されているオキサリル-CoA脱炭素酵素またはホルミル-CoAトランスフェラーゼ遺伝子と特異的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含むあらゆるポリヌクレオチド分子が含まれる。本明細書において用いられるように、「実質的な相同性」または「実質的に相補的な」という用語は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と100％の相同性を有する、本発明のポリヌクレオチドプローブまたはその断片だけでなく、標的遺伝子にハイブリダイズするのに十分な相同性をもつポリヌクレオチド配列も意味する。好ましくは、相同性の程度は100％であるが、ハイブリダイゼーションを検出するのに必要な相同性の程度は、ハイブリダイゼーション及び洗浄において用いられる厳密度の程度によって異なる。したがって、オキサリル-CoA脱炭素酵素またはホルミル-CoAトランスフェラーゼのヌクレオチド配列に対する相同性が100％より低いプローブは、適当な厳密度条件の下で本方法において用いることができる。好ましい態様においては、高厳密度条件を用いる。さらに、ポリヌクレオチドプローブ中に本来存在するヌクレオシドをヌクレオシドの類似体に置き換えてもよい。100％より低い相同性を有するか、またはヌクレオシド類似体を含むプローブは、本発明の範囲内に含まれる。熟練した当業者は、本明細書に含まれている開示を利用して、本発明に含まれるプローブを容易に調製することができる。さらに本発明は、オキサロバクターホルミジェネスのヌクレオチド配列のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅に用いることができるポリヌクレオチドプライマーにも関する。PCR増幅法は当技術分野において周知であり、米国特許第4,683,195 号、第4,683,202号、及び第4,800,159号で開示されている。好ましい態様において、ポリヌクレオチドプライマーは、オキサリル-CoA脱炭素酵素遺伝子配列に基づいており、この遺伝子の全部または一部を増幅するために用いることができる。本発明のプローブを用い、当技術分野において既知の標準的な手順にしたがって、増幅されたオキサロバクター配列を検出することができる。本発明のポリヌクレオチドプライマーには、例えば、本明細書で特に例示する、オキサリル-CoA脱炭素酵素PCRプライマー1(配列番号10)及びPCRプライマー2( 配列番号11)が含まれる。PCRプライマー1及び2のヌクレオチド配列を以下に示す。当業者は、本明細書に含まれている開示を利用し、オキサリル-CoA脱炭素酵素遺伝子を増幅するために用いることができるヌクレオチドの長さ及び配列を変化させた他のプライマーを容易に調製することができる。本発明のポリヌクレオチドプローブ及びプライマーは、化学的に合成するか、または標準的な方法及び装置を用いた組み換え実験法によって調製することができる。ポリヌクレオチドプローブ及びプライマーは、一本鎖状または二本鎖状のどちらでもよい。プローブまたはプライマーが二本鎖ならば、二本鎖状から一本鎖状を調製することができる。ポリヌクレオチドプローブ及びプライマーは、天然のヌクレオチド塩基または天然のヌクレオチド塩基の既知の類似体を含みうる。本発明のプローブ及びプライマーには、プローブもしくはプライマーまたは増幅された遺伝子断片を検出するため、標識物質に結合するよう改変が施してあるヌクレオチドも含まれてもよい。本発明のポリヌクレオチド分子は、当技術分野において既知の方法を用いて標識することができる。³H、³⁵S、¹⁴Cまたは³²Pなどの同位体を用いて、該ポリヌクレオチドを放射性標識してもよい。また、蛍光担体、化学発光化合物または酵素で標識することもできる。例えば、ポリヌクレオチド分子をフルオロセインもしくはローダミンと結合させてもよいし、またはルシフェリンもしくはルミノールに結合させてもよい。同様に、ポリヌクレオチド分子に西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素を結合させることができる。間接的な方法で、ポリヌクレオチド分子を検出することもできる。例えば、リガンド、ハプテン、または抗原決定基と、ポリヌクレオチドを結合させてもよい。次に、結合ポリヌクレオチドをそれぞれ、リガンドレセプター、リガンドに結合する抗リガンド分子、またはハプテン／抗原決定基に結合する抗体に接触させる。リガンドレセプター、抗リガンド分子、または抗体を、蛍光担体、化学発光分子、放射性同位体または酵素といった、検出可能なシグナル系を用いて直接的に標識してもよい。標識された部分を調製し、検出する方法は当技術分野において既知である。本発明はまた、試料中のオキサロバクターホルミジェネスを検出するためのキットにも関する。本発明により考案されたキットは、ポリヌクレオチドプローブ、陽性対照、及び陰性対照試薬、ならびにプローブ検出用試薬などを一つまたは複数の容器に含んでもよい。また、キットには、オキサロバクターホルミジェネスの特定の遺伝子をPCR増幅するためのポリヌクレオチドプライマーも含まれていてもよい。好ましい態様において、ポリヌクレオチドプローブ及びプライマーは、O.ホルミジェネスのオキサリル-CoA脱炭素酵素遺伝子に対して特異的である。以下は、本発明を実施するための、最適な方法を含む手順を示す実施例である。これらの実施例は、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。別記されない限り、パーセントはすべて重量により、溶液混合物の比率はすべて容量による。実施例1-酵素測定系の感度レベルの判定 0.004 mMから0.00025 mMの範囲内の濃度のシュウ酸塩を含む試料を10μl容で調製した。そして、本発明の酵素系を用いて、96穴微量滴定用プレートで試料を評価した。次に、以下の濃度で試薬を加えた。KH₂PO₄(pH 6.7)，50 mM; MgCl₂， 5 mM; チアミン PPi(TPP)，2 mM; オキサリル-CoA，0.375 mM; β-NAD，1.0 mM; ギ酸脱水素酵素，0.25 IU; 及びオキサリル-CoA脱炭素酵素，0.03 U。次に、試料混合液中に残っている可能性があるギ酸をすべて分解させるために、反応混合液を37℃で2分間インキュベートした。そして、ホルミル-CoAトランスフェラーゼを試料混合液に加えることにより、反応を開始した。37℃で15秒ごとにA₃₄₀の変化を測定した(図1A〜1E)。同時に、適当な陽性対照及び陰性対照を用いて測定を行った。実施例２- 試料中のオキサロバクターホルミジェネスの検出オキサロバクターホルミジェネスの存在を検査すべき試料(例えば、生検、糞便、切屑)を患者から採取し、当技術分野において既知の標準的な技術を用いて、標本からDNAを単離する。例えば、アルカリ溶液の中で細胞を溶解し、フェノール:クロロホルムで核酸を抽出してから、エタノールで沈殿させることができる。次に、制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いて、DNAをさまざまなサイズに断片化する。そして、DNA断片を0.7〜1.0％アガロースゲルで電気泳動してサイズによって分離する。これに変わる態様において、オキサリルCoA脱炭素酵素遺伝子を特異的に増幅するために、ゲル電気泳動の前にDNA断片をPCRにかける。ポリヌクレオチドプライマー1(配列番号10)及び2(配列番号11)を用いて、PCR法で585 bpの増幅産物を生成する。ゲルでDNA断片を分離した後、サイズ分画したDNA断片を、サザンブロッティングによってニトロセルロース、ナイロン、またはポリビニリジンジフルオリド(P VDF)といった膜基質に移動させる。膜基質上に固定化されたDNAは一本鎖である。次に、膜上に固定されたDNAに、本発明のポリヌクレオチドプローブをハイブイダイズさせる。一つの態様において、ジゴキシゲニンのような、ハプテンまたは抗原で標識したプローブA(配列番号8)またはプローブB(配列番号9)をハイブリダイゼーションの過程で用いる。ハイブリダイゼーションは、当技術分野において既知の条件の下で行われる。膜上のDNA断片にプローブをハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズしなかったプローブを除去するために膜を洗浄する。標準的な洗浄条件は当技術分野において既知であり、用いられる洗浄の厳密度及び回数は変えてもよい。次に、ハイブリダイズしたプローブの存在について膜を検査する。プローブに結合させたハプテンまたは抗原に結合する抗体を用いて、ハイブリダイズしたプローブを検出することができる。検出可能な蛍光担体、化学発光分子、放射性同位体または酵素を用いて、抗体を直接、標識することができる。または、抗免疫グロブリン、プロテインA、プロテインGなど、抗体に結合する二次試薬を用いて抗体を検出することができる。二次試薬は、検出可能な蛍光担体、化学発光分子、放射性同位体または酵素を用いて標識することができる。検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの存在は、検査試料中にオキサロバクターホルミジェネスが存在していることを示す。本明細書において開示された実施例及び態様は例示することのみを目的とすること、及びさまざまな修正または変更が当業者に対して示唆されるであろうが、これらも、本願の本旨及び範囲、ならびに添付の請求の範囲に含まれていることが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ホルミル-CoAトランスフェラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子またはその断片もしくは変異体。２．ヌクレオチド配列がオキサロバクターホルミジェネスに由来する、請求の範囲1記載のポリヌクレオチド分子。３．ヌクレオチド配列が、配列番号4及び5に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求の範囲1記載のポリヌクレオチド分子。４．配列番号1〜3に示されているヌクレオチド配列を含む、請求の範囲1記載のポリヌクレオチド分子。５．標準的な高厳密度条件下で、配列番号1、配列番号2及び配列番号3からなる群より選択されるポリヌクレオチド分子とハイブリダイズする、請求の範囲1 記載のポリヌクレオチド分子。６．試料をオキサリルCoA脱炭酸酵素と接触させ、続いてホルミルCoAトランスフェラーゼと接触させる段階、および産生されたギ酸量に相関してシグナルを発生させる系を用いて、該反応におけるギ酸の存在の有無を検出する段階、を含む液体試料中のシュウ酸塩の存在または濃度を測定する方法。７．液体試料中のシュウ酸塩の存在または濃度を測定するための方法であって、 (a) 試料をオキサリル-CoA脱炭素酵素、オキサリル-CoA、β-NAD及びギ酸脱水素酵素と接触させる段階、 (b) 段階(a)の混合物を約37℃で約2分間インキュベートする段階、 (c) 混合物をホルミル-CoAトランスフェラーゼと接触させる段階、及び (d) ギ酸の有無を比色定量的に検出する段階、を含む方法。８．334 nm、340 nm、または365 nmにおける吸光度を測定することによりギ酸が検出される、請求の範囲6記載の方法。９．一つまたは複数の容器に、 (a) 試薬のオキサリル-CoA脱炭素酵素、オキサリル-CoA、β-NAD、及びギ酸脱水素酵素、ならびに (b) 試薬のホルミル-CoAトランスフェラーゼ、を含む液体試料中のシュウ酸塩の存在または濃度を検出するための測定法に用いるためのキット。 10．オキサリル-CoA脱炭素酵素ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子。 11．ヌクレオチド配列がオキサロバクターホルミジェネスに由来する、請求の範囲10記載のポリヌクレオチド分子。 12．ヌクレオチド配列が配列番号7に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求の範囲10記載のポリヌクレオチド分子。 13．配列番号6に示されているヌクレオチド配列を有する、請求の範囲10記載のポリヌクレオチド分子。 14．ポリヌクレオチド分子が標準的な高厳密度条件下で配列番号6に示されているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子とハイブリダイズする、請求の範囲10記載のポリヌクレオチド分子。 15．オキサロバクターホルミジェネスのゲノムに存在するポリヌクレオチド配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブ。 16．オキサロバクターホルミジェネスのゲノムに存在するポリヌクレオチド配列が、ホルミル-CoAトランスフェラーゼ遺伝子及びオキサリル-CoAトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択される遺伝子である、請求の範囲15記載のポリヌクレオチド・プローブ。 17．プローブが配列番号8及び配列番号9からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求の範囲15記載のポリヌクレオチド・プローブ。 18．オキサロバクターホルミジェネスのゲノムに存在するポリヌクレオチド配列のPCR増幅のプライマーとなりうる、該オキサロバクターホルミジェネスのゲノムに存在するポリヌクレオチド配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドPCRプライマー。 19．試料中のオキサロバクターホルミジェネスを検出するための方法であって、 (a) プローブがオキサロバクターホルミジェネスに特異的なDNA断片と選択的にハイブリダイズするのに十分な条件下で、試料を請求の範囲15記載のポリヌクレオチド・プローブと接触させる段階、および (b) 該DNA断片にハイブリダイズした該プローブを検出する段階、を含む段階。 20．一つまたは複数の容器に、 (a) 請求の範囲15記載のポリヌクレオチド・プローブ、及び (b) 適当な調節試薬、を含む、試料中のオキサロバクターホルミジェネスの存在を検出するためのキット。