JPH10501981A

JPH10501981A - 熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ

Info

Publication number: JPH10501981A
Application number: JP8502978A
Authority: JP
Inventors: 哲也稲岡; 豊美副島; 利雄小久保
Original assignee: 日本チバガイギー株式会社
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 1998-02-24
Also published as: AU2573395A; US6156554A; US6284511B1; CA2192091A1; EP0772685A1; WO1996000293A1

Abstract

(57)【要約】本発明はバイオテクノロジーの分野に関し、そして熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする組換えＤＮＡ、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼのおよびそれをコードする組換えＤＮＡの生産方法、前記組換えＤＮＡにより形質転換された宿主、並びに前記形質転換された宿主の調製方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ本発明はバイオテクノロジーの分野に関し、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする組換えＤＮＡ、並びに熱安定性プロリルエンドペプチダーゼのおよびそれをコードする組換えＤＮＡの生産方法、前記組換えＤＮＡにより形質転換された宿主、並びに前記形質転換された宿主の調製方法に関する。発明の背景プロリルエンドペプチダーゼは、プロリン残基のカルボキシル末端側でペプチドを開裂させる特異的エンドペプチダーゼとしてヒトの子宮において最初に発見された。この酵素の独特の基質選択性はそれの生理学的機能の研究に大きな注意を引いた。哺乳類プロリルエンドペプチダーゼと同じ基質特異性を示すエンドペプチダーゼが細菌のフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum ）中にも発見された。この発見はプロリルエンドペプチダーゼを商業的に利用可能にし、またペプチドの特異的開裂のための生化学試薬としてのそれの使用を可能にした。しかしながら、Ｆ．メニンゴセプチカムからのプロリルエンドペプチダーゼの調製は細菌から生じる次の２つの重大な欠点を有する。この細菌が病原性であることと、それがプロリルエンドペプチダーゼだけでなく相当量の他の特異的または非特異的ペプチダーゼも生産することである。従って商業用調製物に相当量のトリプシンとアミノペプチダーゼが混入し、それが実際に特異的生化学試薬としての商品の有用性を大きく減らしてしまう。プロリルエンドペプチダーゼは生理的条件下でプロリン残基のＣ末端側でのペプチドの選択的な加水分解的開裂を触媒する。この酵素は、反応条件と基質によって、縮合またはペプチド転移によるペプチド断片のカップリングも触媒することができる。従って、医薬上活性なペプチドの製造において、プロリルエンドペプチダーゼはｉ）医薬上活性なペプチドを遊離させるための前駆体ペプチドの選択的開裂、ii）Ｃ末端のアミド化を含むペプチドの試験管内修飾およびiii）ペプチドのカップリング、を触媒するために使うことができる。本明細書中で使用するペプチドという用語は、その語が短鎖ペプチドのみを意味することを示すのではなく、問題の分子がペプチド結合によって結合したアミノ酸から構成されるということを示す。ペプチドは短鎖ペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドであることができる。上述した３つの反応のうち、最初の２つは組換えＤＮＡ技術を使ったペプチドの製造方法の中の下流プロセシングに特に重要である。組換えペプチドはしばしば前駆体または融合タンパク質の形で発現され、次いで活性形態または成熟形態への変換のために試験管内プロセシングにかけられる。プロリルエンドペプチダーゼは、例えばＡＣＴＨ、コレシストキニン、カルシトニン、エンドルフィン、インスリン、ＬＨ−ＲＨ、オキシトシンおよびバソプレッシン等のような生物活性ペプチドのＣ末端アミド化に有用である。プロリルエンドペプチダーゼ特有の基質特異性のため、該酵素は特異的部位での前駆体の開裂、およびしばしば非特異的ペプチダーゼに関連する副反応を伴わないペプチドの試験管内修飾に非常に有用である。しかしながら、プロリルエンドペプチダーゼはペプチダーゼ触媒反応に通常使われる条件によって阻害または失活を非常に受けやすい。それは前駆体ペプチドの開裂に使われる緩衝液中の変性剤および／または可溶化剤に敏感であり、また加水分解よりもカップリング生成物の形成を有利にするためにペプチダーゼ触媒カップリング反応で通常使われる条件、例えば高濃度の有機溶剤、例えば１，４−ジオキサン、ＤＭＦもしくはＤＭＳＯの存在、極端なｐＨおよび／または高温にも敏感である。従って、プロリルエンドペプチダーゼをペプチドの工業生産用の触媒としてもっと多目的に利用できるようにするためにプロリルエンドペプチダーゼの安定性を改善することが望ましい。発明の目的本発明の目的は、対応する野性型酵素よりも熱安定性であるプロリルエンドペプチダーゼを提供することである。そのようなプロリルエンドペプチダーゼを以後「熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ」と呼ぶことにする。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼはペプチドの工業生産方法に特に有用である。何故なら、その優れた安定性は触媒反応における酵素の寿命を引き延ばし、かくして該エンドペプチダーゼの総代謝回転数（ターンオーバー数）を向上させるからである。それはプロリン残基を含む生物活性ペプチドの製造のための安定で且つ選択的な触媒として有用である。言い換えれば、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼは野性型酵素よりも非常に低い対基質比で使用することができ、これはしばしば製造方法が商業的に実施可能かどうかの決定的要因となる触媒の費用を減らす。本発明の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの高い熱安定性は、触媒反応の効率、収率または変換率を改善する過酷な条件（例えば高い反応温度、極端なｐＨまたは高濃度の有機溶剤の存在）下でのそれの使用も可能にする。本発明において創り出された熱安定性プロリルエンドペプチダーゼは他の形態のタンパク質変性、即ち熱失活以外の別の物理的ストレスに対してもより一層耐性であり、そして化学薬品での処理に対して一層耐性である。従って、本発明の酵素は有機溶剤、変性剤または極端なｐＨを含む溶液中で対応する野性型酵素よりも安定である。本発明の別の目的は、野性型酵素をコードするＤＮＡから出発する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの作製方法、および突然変異誘発とスクリーニングの反復サイクルを含んで成る「分子進化」による熱安定性の改善方法を提供することである。本発明の更なる目的は、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする組換えＤＮＡ、そのような組換えＤＮＡの作製方法、そのような組換えＤＮＡにより形質転換された宿主、および形質転換された宿主を使った熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの生産方法を提供することである。具体的説明以後、プロリルエンドペプチダーゼという用語は任意のプロリルエンドペプチダーゼ、即ちプロリン残基のカルボキシル末端で特異的にペプチドの加水分解的開裂を触媒する任意のセリンプロテアーゼを包含する意図で使われる。そのようなプロリルエンドペプチダーゼのＥＣ番号は3.4.21.26である。この用語の好ましい意味は原核生物、好ましくはフラボバクテリウム（Flavob acterium ）種、より好ましくはＦ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）、最も好ましくはＦ．メニンゴセプチカム株IFO 12535(ATCC 13253)に由来するプロリルエンドペプチダーゼである。本発明の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼを得るために、野性型プロリルエンドペプチダーゼのランダム突然変異誘発およびその後の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼについてのスクリーニングを実施することができる。このために、例えば、野性型プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子をクローニングしそして突然変異誘発させることができる。好結果の突然変異誘発／スクリーニングアプローチへの鍵となるのは、変異型プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の優良ライブラリーの作製および熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの効率的スクリーニング方法の使用である。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼを生産するクローンについての効率的スクリーニングには、変異体のライブラリーを構成する何千ものコロニーの中から所望のクローンのコロニーを同定することができるアッセイ方法、即ちコロニーアッセイ法を使うことが不可欠である。しかしながら、プロリルエンドペプチダーゼのためのコロニーアッセイは未知であった。従って、本発明において、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼのスクリーニングに用いることができる高感度のコロニーアッセイの一例を開発した。突然変異誘発用の出発ＤＮＡの調製プロリルエンドペプチダーゼをコードし従って本発明の出発材料として使うことができる既知のＤＮＡが存在する。しかしながら、熟練技術者は既に既知のプロリルエンドペプチダーゼ配列または入手可能なＤＮＡ調製物に限定されない。プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を含んで成る任意の細胞もしくは組織から、または真核細胞もしくは組織の場合には好ましくはプロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を発現する任意の細胞もしくは組織から、本発明の出発材料、即ち本発明の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする変異型ＤＮＡの調製に使われる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡを調製することも可能である。真核ＤＮＡの場合、好ましくは哺乳類ＤＮＡ、例えばヒトまたはブタ起源の、例えば子宮または脳からのＤＮＡが選択され、該ＤＮＡは好ましくはイントロン不含有ｃＤＮＡである。本発明の好ましい出発ＤＮＡは、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属に属する細菌、特にＦ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）、最も好ましくはＦ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）株IFO 12535(ATCC 13253)に由来する。最も好ましい出発ＤＮＡは配列番号１に示される。本発明の出発ＤＮＡは様々な方法により調製することができる。原核生物由来のＤＮＡはイントロンを含まないので、原核細胞を入手源として選択するならプロリルエンドペプチダーゼをコードするゲノムＤＮＡを出発ＤＮＡとして使用することができる。この場合には、プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を含む細菌、例えばＦ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）をホモジナイズし、そして常用手順に従って全ゲノムＤＮＡを抽出することができる。次いで抽出されたＤＮＡを適当な制限酵素、例えばBgl II，Eco RI，Hinc II，Hind III，Pst I またはBam HIで完全消化もしくは部分消化することができる。好ましくはプロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ断片を富化させるために消化生成物を低融点アガロースゲル上での調製用電気泳動にかけて或る長さのＤＮＡ断片を富化させることができる。次いで、該ＤＮＡ断片を適当なクローニングベクター中にクローニングすることができる。クローニングベクターは遺伝子工学の技術分野において有用な任意のベクター、例えばウイルス、ファージ、コスミド、プラスミドまたは染色体ＤＮＡに由来することができ、例えばSV40、ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、λファージ（例えば NM 989もしくはEMBL4）、M13 ファージ、細菌プラスミド（例えばpBR322，pUC18 ，pSF2124，pBR317もしくはpPLMu）、または酵母プラスミド（例えば酵母２μプラスミド）の誘導体、更には複製開始点または自己複製配列（ＡＲＳ）を含んで成る染色体ＤＮＡに由来することができる。好ましくは、クローニングベクターはpBR322，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pKK 223-3等のような細菌ベクターである。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーはプロリルエンドペプチダーゼを発現する細胞から、例えば細菌細胞から、例えば好ましくはフラボバクテリウム（Flavobac terium ）属に属する細菌、特にＦ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）、最も好ましくはＦ．メニンゴセプチカム株IFO 12535(ATCC 13253)から、またはプロリルエンドペプチダーゼを生産する真核細胞もしくは組織から、例えば哺乳類細胞もしくは組織から、例えば子宮もしくは脳から調製することができる。二本鎖ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを適当なベクター中に組み込むためには様々な方法が当業界で知られている。例えば、対応するデオキシヌクレオシド三リン酸とターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼのような酵素の存在下でのインキュベーションにより、二本鎖ＤＮＡおよびベクターＤＮＡに相補的ホモポリマー末尾を付加する。次いで該ベクターと二本鎖ＤＮＡを相補的ホモポリマー末尾間の塩基対合により接合し、そして最後にリガーゼのような特異的結合酵素により連結する。他の可能性は二本鎖ＤＮＡの末端への合成リンカーの付加、または平滑末端もしくは粘着末端連結によるベクター中への二本鎖ＤＮＡの組み込みである。ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、好ましくはＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを使って達成される。適当なＤＮＡプローブは、少なくとも17ヌクレオチドから成る既知ヌクレオチド配列のＤＮＡ、例えば合成ＤＮＡ、プロリルエンドペプチダーゼをコードするｍＲＮＡから誘導したｃＤＮＡ、または例えば天然源もしくは遺伝子操作した微生物から単離される隣接ＤＮＡ配列を含んで成るゲノムＤＮＡ断片であることができる。上述のゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための合成ＤＮＡプローブをデザインするために、それのＤＮＡコード領域をクローニングする予定であるプロリルエンドペプチダーゼを精製し、常法に従ってそれの部分アミノ酸配列を決定する。次にそうして決定された部分アミノ酸配列に基づいてＤＮＡ配列をデザインする。アミノ酸配列をコードする正確なヌクレオチド配列が未知である場合、遺伝暗号の縮重のために存在し得る可能なヌクレオチド配列を部分的にまたは全体的にカバーするヌクレオチド配列の組合せを使うことができる。あるいは、コドン中の３番目のヌクレオチドをイノシンで置換してもよい。合成ＤＮＡプローブは既知の方法に従って、例えば固相ホスホトリエステル、ホスフィットトリエステルまたはホスホルアミダイト法を使った段階的縮合により、例えばホスホトリエステル法によるジヌクレオチドカップリング単位の縮合により、合成することができる。ハイブリダイゼーションのために、ＤＮＡプローブは周知のキナーゼ反応により標識され、例えば放射能標識される。ハイブリダイゼーションは、既知の手順に従って、即ち、補助剤、例えばカルシウムキレート化剤、粘度調節化合物、タンパク質、非相同ＤＮＡなどを含有する緩衝液および塩溶液中で、選択的ハイブリダイゼーションに好都合な温度、例えば０℃〜80℃、例えば25℃〜50℃で行われる。本発明の好ましい出発ＤＮＡを得るために、Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．men ingosepticum ）のＤＮＡライブラリーを使ってＥ．コリ（E ．coli）細胞のような適当な宿主を形質転換せしめ、次いで該宿主を固形培地上に塗布し培養してコロニーを形成させ、そして上述のＤＮＡプローブを使ったコロニーハイブリダイゼーション法により陽性クローンを選択することができる。ＤＮＡライブラリーを用いた適当な宿主細胞の形質転換並びに形質転換された宿主細胞の選択および増殖は技術の現状で周知である。上述したように選択されたＤＮＡのヌクレオチド配列は、それ自体既知の方法により、例えば末端標識ＤＮＡを使ったMaxam-Gilbert法によりまたはSangerのジデオキシチェーンターミネーション法により、決定することができる。プロリルエンドペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列またはプロリルエンドペプチダーゼのアミノ酸配列が決定されれば、所望のＤＮＡを直接もたらす方法、例えば従来のクローニングもしくはＰＣＲ法によりまたは例えば常法に従った試験管内合成により、該酵素をコードするＤＮＡを調製することもできる。試験管内合成法では、適当に保護されたヌクレオチドを、ホスホジエステル法、より効率的なホスホトリエステル法、ホスフィットトリエステル法またはホスホルアミダイト法により、互いに連結する。ヌクレオチド鎖が適当なポリマーに結合される固相法により、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成の簡素化が可能になる。既知の合成技術では、良好な収率、高純度および比較的短時間で、長さが120塩基までのポリヌクレオチドの調製が可能である。実際の二本鎖ＤＮＡは、両ＤＮＡ鎖から化学的に調製した重複するオリゴヌクレオチドを、塩基対合により正しい配置で一緒にし、次いでＤＮＡリガーゼ酵素により化学的に結合することから酵素的に作製される。別の可能性は、重複する一本鎖オリゴヌクレオチドを、４種の必要なデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩのクレノウ断片もしくはＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共に、またはＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素と共にインキュベートすることを含んで成る。それにより２つのオリゴヌクレオチドが塩基対合によって正しい配置で一緒になり、次いで該酵素により必要なヌクレオチドが補足されて完全な二本鎖ＤＮＡを与える。突然変異誘発とスクリーニング本発明では、ランダム突然変異誘発による熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの作製にプロリルエンドペプチダーゼ発現カセットを含んで成る発現プラスミドを使用する。更に、より詳細に下記に説明するように、本発明は改善された熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの調製に使うことができる突然変異誘発の反復サイクルを含んで成る方法にも関する。従って、本発明は熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする組換えＤＮＡ分子の調製方法に関し、前記方法は (a) プロリルエンドペプチダーゼをコードする出発ＤＮＡを突然変異誘発せしめ、ここで出発ＤＮＡは野性型プロリルエンドペプチダーゼをコードしているか、または２巡目以上の突然変異誘発が所望であるならば、熱安定性「親」プロリルエンドペプチダーゼをコードする変異型ＤＮＡであることができ、 (b) (a)で得られた変異型ＤＮＡ配列のライブラリーを作製し、そして (c) 対応する野性型酵素と比較すると、または２巡目以上の突然変異誘発の後では、対応する野性型酵素とまたは所望により対応する熱安定性「親」プロリルエンドペプチダーゼと比較すると、改善された熱安定性を有するプロリルエンドペプチダーゼをコードする遺伝子について前記ライブラリーをスクリーニングすることを含んで成る。しかしながら、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの配列が一端既知になれば、または熱安定性を改善するためにどのアミノ酸位置を変異させることができるかがわかれば、所望の組換えＤＮＡ配列の作製または変異の作製に適当であるどの方法でも使うことができる。従って、本発明は、ランダム突然変異誘発に基づいた上記方法により得られた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする組換えＤＮＡにだけ限定されるのではなく、他の方法により得られた本発明のＤＮＡ分子も包含する。プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子をランダムに突然変異誘発させようと望むなら、例えば下記に説明するように、ライブラリー中に適当な変異型クローンの集団を得るために各野性型遺伝子に合わせて突然変異誘発の条件をわずかに変更しなければならない。化学的突然変異誘発に使われる通常の条件は、次の通り “A General Method for Saturation Mutagenesis of Cloned DNA Fragments” ［Myers R.M.他，Science 229:242-247(1985)］中に報告されている。ライブラリー中に適当な変異型クローン集団を得るために各遺伝子またはｃＤＮＡに合わせて最適化しなければならない条件の可変パラメーターは、各化学的変異誘発物質の濃度、反応時間および反応温度である。理論上、それらのパラメーターはプロリルエンドペプチダーゼ遺伝子中に限定数の、即ち１個または多くても数個の塩基置換を導入するように調整すべきである。本発明において、(a) 一定の少量の（例えば10ng〜１μg）出発の一本鎖ＤＮＡから得られる変異型プロリルエンドペプチダーゼのライブラリー中の形質転換クローンの数、および(b )活性酵素を発現するクローンの数対形質転換体の総数の比をモニタリングすることにより、該パラメーターを好都合に調整できることがわかった。プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の化学的突然変異誘発に合わせて変更された条件は次の通りである：テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus；Taq）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の忠実度に影響を及ぼすことが知られている幾つかの要因がある。各要因について、ポリメラーゼを高忠実度で機能させる通常条件およびＤＮＡ合成の忠実度を減少させることが知られている条件の典型的範囲は次の通りである〔Leung 他，J．Methods Cell Mol．Bio．1:11-15(1989)およびEckert他，PCR(McPherson 他編)，1991，pp.225-244，IRL Press Oxfordから引用〕。例えば、ランダム突然変異誘発のための化学処理の条件を本発明では限定数（１個または数個）の塩基置換をランダムに導入するようにプラスミドpUK-FPEP-b 中にクローン化されたプロリルエンドペプチダーゼ遺伝子について最適化する。ヌクレオチドの誤取込みによって該酵素遺伝子中に塩基置換を導入する方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）も使われる。ポリメラーゼの忠実度を減少させる幾つかの要因、例えばデオキシリボヌクレオチドプールの不均衡およびMnCl₂ またはDMSOの添加の影響を調べ、そして適当な塩基置換頻度になるように最適化する。特に、EcoRI部位とPstI部位にすぐに隣接する領域に相補的である一対の25ヌクレオチドプライマーを使って、野性型プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子をコードするpUK-FPEP-bの2.3kb EcoRI−PstIＤＮＡ断片を増幅させる。限定数の、即ち１個または多くても数個の塩基置換を効率的にプロリルエンドペプチダーゼ遺伝子中に導入するために、ポリメラーゼの忠実度に対する幾つかの要因の影響を調べる。調べる要因は、MnCl₂またはDMSOの添加、MgCl₂濃度の変更、およびデオキシヌクレオチドプールの不均衡を含む。基本反応混合物は10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01％(w/v)ウシ血清アルブミン，各0.2mMの４種のdNTP，10g/mlの鋳型プラスミド、１μＭの各プライマーおよび25単位／mlのTaqポリメラーゼを含有する。ポリメラーゼの忠実度を減少させる反応条件の変更は次の通りである： 1） 50〜100μＭのMnCl₂を添加しそしてMgCl₂の濃度を5mMに増加させる。 2） 5〜20％のDMSOを反応混合物に添加する。 3）反応混合物中のMgCl₂の濃度を5mMから10mMまで変更する。 4） dGTP，dTTPおよびdCTPの濃度を1mMで一定に保持したまま、 5mMのMgCl₂の存在下でdATPの濃度を0.2mMから0.1mMまで下げる。 5） dATP，dCTPおよびdTTPの濃度を0.1mMで一定に保持したまま、1.5〜2mのMgCl₂の存在下でdGTPの濃度を0.5mMから1 mMまで変更する。ＰＣＲは常法に従って、例えばGene Amp^TM PCRシステム9600(Perkin-Elmer)を使うことによって実施することができる。例えば、鋳型ＤＮＡを94℃で１分間融解させそして50℃で１分間プライマーとアニーリングさせることにより、反応を実施することができる。例えば鎖の伸長を70℃で４分間にて開始し、計25サイクルを行い、そして最後のサイクルの後、70℃での重合を更に７分間延長することができる。化学処理またはＰＣＲ突然変異誘発により調製された変異型構造遺伝子は、次いで常法に従って切り取りそして生来の発現ベクター断片中に再クローニングすることができる。典型的には数万個の独立したクローンから成る再構成された発現プラスミドの集団を使って、Ｅ．コリを形質転換せしめて変異型プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子のライブラリーを作製する。活性酵素を発現するクローンの数：形質転換体の総数の比を塩基置換の頻度の指標として使用する。しかしながら、問題の遺伝子の発現後にスクリーニングすることができる遺伝子ライブラリーの調製に適当である他の任意の発現ベクターを遺伝子ライブラリーの作製に使ってもよい。同様に、その方法はＥ．コリ細胞の使用に限定されない。使用することができるベクターと宿主は下記に例示される。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼを発現するクローンを明らかにするために、プロリルエンドペプチダーゼの活性を検出するコロニーアッセイ法が使われる。該アッセイは、(i)フィルター上でのコロニーの溶解、(ii)フィルターのブロック、および(iii)酵素の活性染色という段階を含んで成る。好ましい態様では、フィルターはニトロセルロースフィルターである。Ｚ−Gly−Pro−β−ナフチルアミド、Fast Garnet GBCおよびTriton X-100を使ったプロリルエンドペプチダーゼの検出方法はずっと以前から知られていた。本発明では、アッセイ混合物から界面活性剤Triton X-100を除去することにより該アッセイ方法を活性染色の手順に改良および変更する。この染色方法により、活性プロリルエンドペプチダーゼを生産するコロニーはフィルター上で赤いスポットとして目に見えるようになる。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ用のスクリーニング方法はコロニーアッセイと熱処理の組合せにより構成される。フィルター上でのコロニーの溶解の後で熱処理が行われ、次いで熱処理したフィルターが活性染色にかけられる。熱処理の条件は、野性型酵素よりも有意に安定な変異体を生産するコロニーの選択的染色を可能にするように調整される。最初のスクリーニングで選択的に染色されたクローンを単離し、そしてより高い温度での熱処理により再スクリーニングして最も有望なクローンにしぼることができる。本発明では、化学的突然変異誘発／スクリーニング方法およびＰＣＲ突然変異誘発／スクリーニング方法によりクローンが作製される。それぞれ化学的およびＰＣＲ突然変異誘発により得られた２つの熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ、PEP-15とPEP-227の熱安定性を定量的に評価し、そして高温での熱失活の一次速度定数の点から野性型酵素と比較する。この評価は、実施例においてより詳細に記載するように、変異型酵素の熱安定性の有意な改善を証明した。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼPEP-15とPEP-227の構造遺伝子の全ヌクレオチド配列を決定しそして野性型酵素のものと比較し、熱安定性の改善の原因となるアミノ酸残基置換を引き起こす点変異を明らかにする。プロリルエンドペプチダーゼの熱安定性の更なる改善のために、分子進化アプローチを採用することができる。即ち、本発明において、突然変異誘発とスクリーニングのサイクルを繰り返すことがプロリルエンドペプチダーゼの熱安定性を改善するのに確かに有効であることが明白に証明された。よって、この突然変異誘発／スクリーニング方法で選択されたクローンから熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする変異型遺伝子を単離することができ、それを再び突然変異誘発にかけて変異型プロリルエンドペプチダーゼの第二世代ライブラリーを調製する。次いでより一層熱安定性のプロリルエンドペプチダーゼを生産するクローンについて第二世代ライブラリーをスクリーニングする。できる限りプロリルエンドペプチダーゼの安定性を改善するために、生体内での分子進化の過程を真似てこの突然変異誘発／スクリーニングサイクルを繰り返すことができる。反復突然変異誘発／スクリーニングサイクルは、酵素分子を相乗的におよび／または付加的に安定化する塩基置換（アミノ酸残基置換）の選択的蓄積を可能にし、しかも各世代において変異を決定する必要はない。反復突然変異誘発／スクリーニングサイクルは、アミノ酸配列を変えないサイレント変異（塩基置換）の蓄積も可能にする。コドン中の単一塩基置換は遺伝暗号の縮重のためにどれもが可能なアミノ酸残基置換を引き起こすとは限らないことはよく知られている。単一コドン中の二重または三重塩基置換はランダム突然変異誘発の通常条件下で同時に起こりにくいので、全てのアミノ酸残基の置換範囲においてランダム突然変異誘発が限定される。しかしながら、反復突然変異誘発／スクリーニングサイクルによるサイレント変異の蓄積は、その後のサイクルにおいてアミノ酸置換のこの限定を拡張するのに役立つ。従って、反復突然変異誘発／スクリーニングサイクル、即ち分子進化アプローチは、率直であるだけでなく可能なアミノ酸残基置換の範囲の中でより徹底的でもある。より熱安定性のプロリルエンドペプチダーゼPEP-361とPEP-407 はそれぞれ突然変異誘発／スクリーニングの二巡目および三巡目のサイクルで選択されたクローンから単離される。それらの安定性を定量的に評価し、そして野性型酵素および第一世代の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの安定性と比較する。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの熱安定性は突然変異誘発／スクリーニングサイクルが進行するにつれて絶えず改善されることが確認され、これは分子進化アプローチの効用を証明する。 PEP-361とPEP-407をコードする変異型遺伝子のＤＮＡ配列の決定は、表３（実施例８）に示されるような塩基置換（および結果として生ずるアミノ酸残基置換）の蓄積を明らかにした。観察されるコンスタントな熱安定性の改善は、明らかに酵素分子中に蓄積する変異（各サイクルで一重または二重変異）と相関関係がある。アミノ酸残基置換をもたらす変異の他に、突然変異／スクリーニングサイクルの反復の間に蓄積するサイレント変異も配列分析により証明される。上述した出発ＤＮＡと同様に、一端ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列がわかりさえすれば、例えば出発ＤＮＡの調製について上述した方法により、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ分子を直接調製することができる。クローニングベクターと発現ベクター突然変異誘発用の出発ＤＮＡの増殖、変異型プロリルエンドペプチダーゼＤＮＡのクローニングおよび調製並びに形質転換された宿主中での熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの生産にハイブリッドベクターを使うことができる。ハイブリッドベクターは、遺伝子工学の技術分野において有用な任意のベクター、例えばウイルス、ファージ、コスミド、プラスミドまたは染色体ＤＮＡに由来することができ、例えばSV40、ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、λファージ（例えばNM 989またはEMBL4）、M13 ファージ、細菌プラスミド（例えばpBR322 ，pUC18，pSF2124，pBR317またはpPLMu）、または酵母プラスミド（例えば酵母２μプラスミド）の誘導体、更には複製開始点または自己複製配列（ＡＲＳ）を含んで成る染色体ＤＮＡ、あるいは欠損ウイルス、ファージまたはプラスミドの複製を可能にするヘルパーウイルス、ファージまたはプラスミドの存在下の欠損ウイルス、ファージまたはプラスミド（例えばM13K07ヘルパーファージの存在下のM13(+)KSベクター）であることができる。本発明に使用することができるバキュロウイルスは、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa calif ornica ）核多角体病ウイルス（AcMNPV）、トリコプルシア・ニイ（Trichoplusia ni ）MNPV、ラキプルシア・オウ（Pachiplusia ou）MNPV、ガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）MNPV、ボンビックス・モリ（Bombyx mori）核多角体病ウイルス（BmNPV）等である。オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica ）核多角体病ウイルスとバキュロウイルス伝達ベクターpAc700，pAc 701，pAc702，pVL1392およびpVL1393の組合せを含んで成るキットがInvitrogen から市販されている。適当なベクターは、ハイブリッドベクターを増殖させるためまたは熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの発現のために選択された微生物宿主細胞中で機能的であるものである。よって適当なベクターは、完全なレプリコンと、表現型特徴によって発現プラスミドにより形質転換された微生物の選択および同定を可能にするマーカー遺伝子とを含有する。独力では複製および／または発現の必要条件を全て満たすことができず、欠けている機能を再構成するヘルパープラスミドを必要とするベクターも適当な場合がある。従って、本発明のハイブリッドベクターは、染色体外要素としてまたは宿主染色体中への組み込みにより、適当な宿主中での所望のプロリルエンドペプチダーゼＤＮＡの複製に備える。幾つかの可能なベクター系が本発明のクローン化ＤＮＡの組み込みと発現に利用可能である。理論上は、選択された宿主中で発現できる組換え遺伝子を複製しそして／または含んで成る全てのベクターが適当である。該ベクターは形質転換をもくろむ宿主細胞に依存して選択される。一般に、そのような宿主細胞は、原核または真核微生物、例えば細菌、真菌、例えば酵母もしくは糸状菌、または高等真核生物起源の細胞、例えば動物、例えば哺乳動物もしくは昆虫細胞であることができる。適当な宿主細胞については下記に詳細に検討することにする。本発明のハイブリッドベクターは、プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ、複製開始点または自己複製配列、所望により優性マーカー配列、および所望により追加の制限部位を含んで成る。複製開始点または自己複製配列（染色体外要素に自己複製能力を付与するＤＮＡ要素）は、シミアンウイルス（SV40）もしくは他のウイルス源に由来するような外因性起点を含むベクターの作製によるか、または宿主細胞の染色体機構により提供される。本発明のハイブリッドベクターは、形質転換し、選択しそしてクローニングする予定の宿主に応じて選択マーカーを含んでもよい。マーカーの表現型発現により形質転換体の選択を容易にする任意のマーカー遺伝子を使うことができる。適当なマーカーは特に、受容生物にとって毒性の化合物に対して耐性を提供するかまたは必須ポリペプチドを欠く変異体の（例えば独立栄養性変異体の）酵素系を補完する遺伝子である。適当なマーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性、例えばテトラサイクリン、アンピシリンもしくはシクロヘキシミドに対する抗生物質耐性を発現するか、または独立栄養性変異体、例えばura3 ，leu2，his3もしくはtrp1遺伝子が欠損している酵母変異体における原栄養性に備える。形質転換させようとする宿主がマーカーにより発現される生成物について独立栄養性であるならば、自己複製セグメントに関連した構造遺伝子をマーカーとして使用することも可能である。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡの発現用のハイブリッドベクターは一般に、ＤＮＡの複製用の上述のハイブリッドベクターと同じ特徴を有するが、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの生産および場合により分泌を可能にする発現調節配列を更に含んで成る。従って、本発明のハイブリッド発現ベクターは、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする構造遺伝子に作用可能に連結されたプロモーター領域、および場合により、所望または必要ならば、リーダーもしくはシグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片、転写エンハンサー、リボソーム結合部位、転写ターミネーター領域および／または他の調節配列を含んで成る。宿主細胞の性質に依存して、広範囲のプロモーター配列を使用することができる。強く且つ同時に良好に調節されるプロモーターが最も有用である。翻訳の開始のための配列は例えばShine-Dalgarno配列である。転写の開始と終結におよびｍＲＮＡの安定化に必要な配列は、ウイルスまたは真核ｃＤＮＡの、例えば発現宿主からの、非コード５′領域および３′領域からそれぞれ一般に入手可能である。適当なプロモーターの例は、λＰ_L，λＰ_R，Ｅ．コリlac，trp，tacもしくはl pp、酵母TRP1-，ADHI-，ADHII-，PHo3-，PHO5-、または解糖系プロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ遺伝子のプロモーター、または真核ウイルス由来のプロモーター、例えばSV40、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルス、パポバウイルス、シトメガロウイルスもしくはバキュロウイルス由来のプロモーター、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Autograp ha californica ）核多角体病ウイルス（AcMNPV）、トリコプルシア・ニイ（Tric hoplusia ni ）MNPV、ラキプルシア・オウ（Pachiplusia ou）MNPV、ガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）MNPV由来のプロモーター、または哺乳動物細胞由来のプロモーター、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシンもしくはβ−グロビン遺伝子のプロモーターである。好ましい真核プロモーターは、バキュロウイルス、特にオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcMNPV）のポリヘドリン遺伝子プロモーターである。真核プロモーターはエンハンサー配列、例えば酵母の上流活性化配列（ＵＡＳ）またはウイルスもしくは細胞性エンハンサー、例えばシトメガロウイルスＩＥエンハンサー、SV40エンハンサー、免疫グロブリン遺伝子エンハンサー等と組み合わせることができる。発現に有用なエンハンサーは、ウイルス、例えばシミアンウイルス、シトメガロウイルス、ポリオーマウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスもしくはモロニー肉腫ウイルス由来の、またはゲノム起源の転写刺激ＤＮＡ配列である。エンハンサー配列は、フィザルム・ポリセファルム（Physarum polycephalum）の染色体外リボソームＤＮＡに由来することもでき、あるいは酸性ホスファターゼPHO5遺伝子からの上流活性化部位、またはPHO5，trp，PHO5-GAPDHハイブリッド等のプロモーターであることができる。本発明において使用することができるシグナル配列は、例えば、ポリペプチドの分泌を指令するプレ配列または分泌リーダー等であることができる。本発明において使用することができるシグナル配列は文献から既知である。別の適当なシグナル配列は、配列番号１のもとに配列表中に記載されたアミノ酸配列のアミノ酸１から19までに及ぶ配列である。リボソーム結合部位（Shine-Dalgarno配列）は使用するプロモーターに自然に連結されるか、または熱安定性プロリルエンドペプチダーゼのコード領域の５′ 末端に共有結合的に連結することができる短いヌクレオチド配列上に置くことができる。リボソーム結合部位は技術の現状において既知である。本発明のハイブリッドベクターの作製のために選択されるプロモーターは調節タンパク質により調節することができ、よって形質転換された宿主細胞中での熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの生産は誘導性または抑制性であることができる。調節タンパク質の遺伝子は宿主株のゲノム中か、または宿主株を同時形質転換することができる追加のプラスミドベクター上か、または本発明のハイブリッドベクター上のいずれかに置くことができる。適当な調節タンパク質遺伝子の選択は使用するプロモーターに依存する。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの生産の誘導または抑制条件も、プロモーターと調節タンパク質に依存する。本発明において使用することができる調節タンパク質は、例えば、リプレッサータンパク質、例えばtrpR，lacI，λcroもしくはλcI遺伝子の生産物、またはそれらの温度感受性変異体である。本発明の好ましいハイブリッドベクターは、配列番号１に示されるアミノ酸配列から誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼのＥ．コリ中での発現に適当な発現ベクター、より好ましくは熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする遺伝子と作用可能に連結されたシグナル配列、好ましくは配列番号１のもとに示されるプロリルエンドペプチダーゼ遺伝子のシグナル配列、を含んで成る発現ベクターである。上記によれば、本発明は熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子に関し、前記ＤＮＡ配列は、野性型プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列から、例えば次の段階： (a) プロリルエンドペプチダーゼをコードする出発ＤＮＡの突然変異誘発、 (b) (a)で得られた変異型ＤＮＡ配列のライブラリーの作製、および (c) 対応する野性型酵素に比較して改善された熱安定性を有するプロリルエンドペプチダーゼをコードする遺伝子についての前記ライブラリーのスクリーニングを含んで成る方法により、誘導することができる。好ましい組換えＤＮＡ分子は、本発明の好ましい熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子である。従って、好ましい組換えＤＮＡ分子は、原核生物のプロリルエンドペプチダーゼ、好ましくはフラボバクテリウム（Flavobacterium）種、より好ましくはＦ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）、最も好ましくはＦ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）株IFO 12535(ATCC 13253)のプロリルエンドペプチダーゼから誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る。より好ましいのは、配列番号１の配列を有するプロリルエンドペプチダーゼから誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子である。より好ましいのは、配列番号１の配列を有するＤＮＡ分子から誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子である。更にもっと好ましいのは、48位のアミノ酸Glu(“Glu48”)，Phe51，Ala129，G ly633および／またはGlu477が別のアミノ酸により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子である。更にもっと好ましいのは、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子であって、前記組換えＤＮＡ分子は48 位のアミノ酸Glu(“Glu48”)，Phe51，Ala 129，Gly633および／またはGlu477のコドンが別のアミノ酸をコードするコドンにより置換されている配列番号１の配列を有する組換えＤＮＡ分子の群より選ばれる。アミノ酸Glu48がGlnにより置換され、Phe51がLeuにより置換され、Ala129がTh rにより置換され、Gly633がValにより置換されそして／またはGlu477がLysにより置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子も同じくより好ましい。アミノ酸Glu48をコードするコドンがGlnをコードするコドンにより置換され、 Phe51をコードするコドンがLeuをコードするコドンにより置換され、Ala129をコードするコドンがThrをコードするコドンにより置換され、Gly633をコードするコドンがValをコードするコドンにより置換されそして／またはGlu477をコードするコドンがLysをコードするコドンにより置換されている配列番号１を有するＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子もより好ましい。更により好ましくは、本発明は、アミノ酸(a)Glu48、(b)Glu48，Ala129および Gly633、(c)Glu48，Ala129，Gly633およびPhe51、および(d)Glu477が別のアミノ酸により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子に関する。更により好ましくは、本発明は、アミノ酸(a)Glu48、(b)Glu48，Ala129および Gly633、(c)Glu48，Ala129，Gly633およびPhe51、および(d)Glu477をコードするコドンが別のアミノ酸をコードするコドンにより置換されている配列番号１を有するＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子に関する。更にもっと好ましいのは、アミノ酸(a)Glu48がGlnにより置換されている(PEP- 227)、(b)Glu48がGlnにより置換され、Ala129がThrにより置換されそしてGly633 がValにより置換されている(PEP-361)、(c)Glu48がGlnにより置換され、Ala129 がThrにより置換され、Gly 633がValにより置換されそしてPhe51がLeuにより置換されている(PEP-407)、および(d)Glu477がLysにより置換されている(PEP-15) 配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子である。更にもっと好ましいのは、(a)アミノ酸Glu48をコードするコドンがアミノ酸Gl nをコードするコドンにより置換されている、(b)アミノ酸Glu48をコードするコドンがアミノ酸Glnをコードするコドンにより置換され、アミノ酸Ala129をコードするコドンがアミノ酸Thrをコードするコドンにより置換されそしてアミノ酸G ly633をコードするコドンがアミノ酸Valをコードするコドンにより置換されている、(c)アミノ酸Glu48をコードするコドンがアミノ酸Glnをコードするコドンにより置換され、アミノ酸Ala129をコードするコドンがアミノ酸Thrをコードするコドンにより置換され、アミノ酸Gly633をコードするコドンがアミノ酸Valをコードするコドンにより置換されそしてアミノ酸Phe51をコードするコドンがアミノ酸Leuをコードするコドンにより置換されている、および(d)アミノ酸Glu477をコードするコドンがアミノ酸Lysをコードするコドンにより置換されている、配列番号１を有するＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子である。更に、本発明は好ましくは、(a)458位の核酸Ｇ（“458Ｇ”）がＣにより置換されている、(b)458ＧがＣにより置換され、701ＧがＡにより置換されそして221 4ＧがＴにより置換されている、(c)458ＧがＣにより置換され、701ＧがＡにより置換され、2214ＧがＴにより置換されそして467ＴがＣにより置換されている、および(d)1745ＧがＡにより置換されている配列番号１を有するＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子にも関する。更にもっと好ましいのは、pUK-FPEP-15中、pUK-FPEP-227中、pUK-FPEP-361中、またはpUK-FPEP-407中の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子である。本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードする単離されたＤＮＡ断片、例えばコード領域のみからなるものまたは相同もしくは非相同ＤＮＡ配列により延長されているもの、であることができる。延長された断片は、例えば、例えばクローニング目的でリンカー配列を含んでもよく、あるいは複製もしくは遺伝子発現のための機能的要素またはマーカー遺伝子を含有する別の断片に連結されてもよい。本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列の増殖および増加のためのハイブリッドベクター、並びに適当な形質転換された宿主中でのそれの発現のための発現ベクターも包含する。好ましい発現ベクターは、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系中でのまたはＥ．コリ中での発現のためのものである。最も好ましいのは、発現ベクターpUK-FPEP-15，pUK-FPEP-227,pUK-FPEP-361およびpUK-FPEP-407である。本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子の調製、好ましくは本発明のハイブリッドベクターまたはハイブリッド発現ベクターの調製にも関する。形質転換された宿主およびそれの調製本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を増殖させるためのまたは特に熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの生産のための形質転換された宿主細胞、並びにそのような形質転換された宿主細胞の調製方法にも関する。ここに言及される宿主は、突然変異誘発に使う出発ＤＮＡの増殖および変異型プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子のライブラリーの作製にも使うことができる。形質転換された微生物宿主株は、微生物細胞により同化できる炭素源および窒素源、並びに無機塩を含有する液体培地中で、当業界において既知の方法を適用して培養される。宿主の培養は常用の栄養培地（普通培地）中で行うことができ、該栄養培地は非形質転換体（即ち、所望のＤＮＡ分子を欠く宿主）からの形質転換体（即ち、選択マーカーと一緒に所望のＤＮＡ分子を含有する宿主）の陰性または陽性選択を可能にする化学化合物が補足されているかまたは欠如していることができる。当該技術において有用な任意の形質転換可能な宿主、例えば、細菌、例えばＥ．コリ（E. coli）、真菌、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyce s cerevisiae ）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、または糸状菌、例えばアスペルギルス種（Aspergillus spec.）、例えばＡ．ニデュランス（A ．nidulans）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．カルボナリウス（A. carbonarius ）、Ａ．アワモリ（A ．awamori）およびＡ．ニガー（A ．niger）を使用することができる。しかしながら、制限酵素または修飾酵素が欠けているかまたは乏しい適当な宿主の使用が有利であるかもしれない。そのような宿主の例は、細菌、例えばバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・ステアロサーモフイラス（Bacillus stearothermophilus）、シュードモナス（Pseu domonas ）、ヘモフィルス（Haemophilus ）、ストレプトコッカス（Streptococ cus ）等、および酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce revisiae ）、および特にエシエリキア・コリ（Escherichia coli）の株、例えばＥ．コリ X1776、Ｅ．コリ Y1090、Ｅ．コリ W3110、Ｅ．コリ HB101/LM1035、Ｅ．コリ JA221、Ｅ．コリ DH5α、または好ましくはＥ．コリ DH5αF’，JM109 ， MH1もしくはHB101、またはＥ．コリ K12株である。他の適当な宿主は、高等生物の細胞、特に確立された連続継代ヒトまたは動物細胞系、例えばヒト胎児肺繊維芽細胞L132、ヒト悪性黒色腫Bowes細胞、HeLa細胞、SV40ウイルスにより形質転換されたアフリカミドリザルの腎細胞 COS-7またはチャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞である。他の適当な宿主細胞は確立された昆虫細胞系、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、例えばSf21または好ましくはSf9(ATCC CRL1711)、マメストラ・ブラッシカ（Mamestra brassicae）、ボンビックス・モリ（Bombyx mori）核多角体病ウイルス(BmNPV)を使ったボンビックス・モリ細胞系、等である。本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主の調製方法にも関する。そのような形質転換された宿主の調製方法は、所望により選択マーカー遺伝子と一緒に本発明の所望の組換えＤＮＡ分子、好ましくは本発明のハイブリッドベクターまたはハイブリッド発現ベクターを使って形質転換条件下で所望の適当な宿主細胞を処理し、そして所望により該形質転換体を選択することを含んで成る。微生物の形質転換は文献中に記載されたような常法に従って実施される。従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換法は、例えば、ＤＮＡの取込みを可能にするための細胞のCa²⁺前処理、およびハイブリッドベクターとのインキュベーションを含んで成る。その後の形質転換された細胞の選択は、例えば、ベクターＤＮＡのマーカー配列の性質に依存して親細胞からの形質転換細胞の分別を可能にする選択増殖培地に細胞を移すことにより達成することができる。好ましくは、ベクターを含まない細胞の増殖を許容しない増殖培地が使われる。酵母の形質転換は、例えば、グルコシダーゼを使った酵母細胞壁の酵素的除去の段階、ポリエチレングリコールとCa²⁺イオンの存在下でのベクターによる得られたスフェロプラストの処理の段階、および該スフェロプラストを寒天中に包埋することによる細胞壁の再生の段階を含んで成る。好ましくは再生用寒天は、上述の形質転換された細胞の再生と選択を同時に可能にするようにしてで調製される。高等真核生物起源の細胞、例えば哺乳動物細胞系の形質転換は、好ましくはトランスフェクションにより達成される。トランスフェクションは、常用技術により、例えばリン酸カルシウム沈澱、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、即ち一時的に細胞膜の透過性を増加させる短い電気パルスによるＤＮＡの導入、またはヘルパー化合物、例えばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメチルスルホキシド、グリセロールもしくはポリエチレングリコールの存在下でのＤＮＡの導入等により実施される。トランスフェクション手順の後、トランスフェクトされた細胞は、選択マーカーの性質に応じて選ばれた選択培地、例えば対応する抗生物質を含有する標準培地、例えばダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、最少必須培地、RPMI 1640培地等の中での培養により同定され選択される。形質転換された宿主細胞は、同化できる炭素源、例えば炭水化物、例えばグルコースまたはラクトース、窒素源、例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質またはそれらの分解生成物、例えばペプトン、アンモニウム塩等、並びに無機塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、リン酸塩および／または炭酸塩を含有する液体培地中で、当業界において既知の方法により培養される。培地は更に例えば増殖促進物質、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等も含有する。培地は、好ましくは、選択圧力を発揮し且つ形質転換されていないかまたはハイブリッドベクターを失ってしまった細胞の増殖を防ぐように選ばれる。例えば、ハイブリッドベクターがマーカーとして抗生物質耐性遺伝子を含む場合、培地に抗生物質が添加される。例えば必須アミノ酸中で独立栄養性である宿主細胞を使用する一方で、ハイブリッドベクターが宿主の欠損を補完する酵素をコードする遺伝子を含む場合、形質転換された細胞を培養するのに前記アミノ酸を欠く最少培地が使われる。哺乳動物細胞のような高等真核生物起源の細胞は、所望により増殖促進物質および／または哺乳動物血清が補足された、市販の培地、例えば上述したようなダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、最少必須培地、RPMI 1640培地等を使って、組織培養条件下で増殖される。組織培養条件下での細胞培養技術は当業界において周知であり、それらの技術としては、例えばエアーリフト反応器中または連続攪拌反応器中での均一懸濁培養、あるいは例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、アガロース微小ビーズ上、多孔質ガラスビーズ上、セラミックカートリッジ上もしくは他の微小担体上での固定化または封入細胞培養が挙げられる。培養は当業界において既知である方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび醗酵時間は、本発明のポリペプチドまたは誘導体の最大発現レベルが得られるように選択される。例えば、Ｅ．コリまたは酵母株は、約20℃ 〜40℃、好ましくは約37℃、および４〜８のｐＨ値、好ましくは約７のｐＨ値において、約４〜30時間、好ましくは本発明のポリペプチドまたは誘導体の最大収量に達するまで、振盪または攪拌しながら深部培養により好気性条件下で培養される。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ従って、本発明は、次の段階： (a) プロリルエンドペプチダーゼをコードする出発ＤＮＡの突然変異誘発、 (b) (a)で得られた変異型ＤＮＡ配列のライブラリーの作製、 (c) 対応する野性型酵素と比較して改善された熱安定性を有するプロリルエンドペプチダーゼをコードする遺伝子についての前記ライブラリーのスクリーニング、および (d) (c)で得られた遺伝子の発現と発現産物の単離を含んで成る方法により得られる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼに関する。好ましい熱安定性プロリルエンドペプチダーゼは、原核生物のプロリルエンドペプチダーゼ、好ましくはフラボバクテリウム種（Flavobacterium spec.）、より好ましくはＦ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）、最も好ましくはＦ．メニンゴセブチカム（F ．meningosepticum）株IFO 12535(ATCC 13253)のプロリルエンドペプチダーゼから誘導できるものである。より好ましいのは、配列番号１の配列を有するプロリルエンドペプチダーゼからランダム突然変異誘発により誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼである。配列番号１の配列のアミノ酸位置48，51，129，477および633のアミノ酸の変更がプロリルエンドペプチダーゼの熱安定性を増大させることが本発明において証明される。従って、本発明は更により好ましくは、48位のアミノ酸Glu(“Glu4 8”)，Phe51，Ala129，Gly633および／またはGlu477が別のアミノ酸により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼに関する。より好ましいのは、アミノ酸Glu48がGlnにより置換され、Phe51がLeuにより置換され、ALa129がThrにより置換され、Gly633が Valにより置換されそして／またはGlu477がLysにより置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼである。更にもっと好ましくは、本発明は、アミノ酸(a)Glu48、(b)Glu48，Ala129およびGly633、(c)Glu48，Ala129，Gly633およびPhe51、および(d)Glu477が別のアミノ酸により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼに関する。アミノ酸(a)Glu48がGluにより置換されている(PEP-227)、(b)Glu48がGlnにより置換され、Ala129がThrにより置換されそしてGly633がValにより置換されている(PEP-361)、(c)Glu48がGlnにより置換され、Ala129がThrにより置換され、Gly 633がValにより置換されそしてPhe51がLeuにより置換されている(PEP-407)、および(d)Glu477がLysにより置換されている(PEP-15)配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼも更にもっと好ましい。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの生産本発明はプロリルエンドペプチダーゼの生産方法にも関する。プロリルエンドペプチダーゼの発現には、上述したように原核または真核宿主細胞のいずれも使うことができ、例えば、プロテアーゼ遺伝子、例えばlon プロテアーゼ遺伝子、および熱ショック誘導性タンパク質合成の調節に関与する遺伝子、例えばhtpR遺伝子が欠損しているＥ．コリ株を使うことができる。好ましくはプロリルエンドペプチダーゼはＥ．コリ中で生産される。この場合、発現を改善するために、コード領域、好ましくは上記の好ましい成熟熱安定性プロリルエンドペプチダーゼのコード領域の全長を維持しながら好ましくはクローン化ＤＮＡの５′末端非コード領域が削除される。該コード領域は、最も好ましくは熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの分泌を可能にするシグナル配列と機能的に連結される。更に、該構造遺伝子は所望のプロリルエンドペプチダーゼコード領域と相同または好ましくは非相同であるＥ．コリ中で機能的なプロモーター領域と機能的に連結される。この連結は常用手段に従って、例えば適当な制限酵素部位を使って、またはＥ．コリエキソヌクレアーゼIIIのようなエキソヌクレアーゼで消化し次いでヌクレアーゼ、例えば大豆ヌクレアーゼで平滑末端にすることによる削除を使って行うことができる。本発明の好ましい態様では、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの全長コード領域のすぐ上流にリンカー配列を有するゲノムＤＮＡが発現ベクター、例えば pUC119由来のプラスミド中の非相同（異種）プロモーター、例えばtac プロモーターと連結される。より好ましくは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）からのゲノムＤＮＡ中のコード領域は本発明の所望のプロリルエンドペプチダーゼのプロ形をコードし、それは熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの成熟形態とシグナルペプチド、例えば配列番号１のもとに示された配列のアミノ酸残基-19〜-1とから成る。そのような形の発現プラスミドを使ってＥ．コリ宿主を形質転換させそして該形質転換体を培養すると、Ｅ．コリ細胞中で熱安定性プロリルエンドペプチダーゼが生産されそして周縁質領域に分泌される。分泌の過程でシグナルペプチドが除去され、封入体に取り込まれない該酵素の成熟形態を与えるため、生産された熱安定性プロリルエンドペプチダーゼが容易に回収される。本発明の別の態様によれば、本発明の酵素をコードするＤＮＡをバキュロウイルス伝達ベクター中に挿入して組換えバキュロウイルス伝達ベクターを作製し、次いでこの組換えバキュロウイルス伝達ベクターをバキュロウイルスＤＮＡと共に昆虫細胞に同時トランスフェクトして相同組換えを行う。バキュロウイルス伝達ベクターは通常、バキュロウイルスＤＮＡのセグメントを含有するプラスミドであり、前記セグメントはバキュロウイルスの複製に必須でない遺伝子を含んで成る。バキュロウイルスの複製に必須でない遺伝子は、例えば、ポリヘドリン構造遺伝子とそれのプロモーターを含んで成るポリヘドリン遺伝子である。技術の現状で既知であるそのようなバキュロウイルス伝達ベクターは、例えば、pAcYM1，pAc311，pAc360，pAc373，pAc380，pAc700，pAc701，pA c702，pVL1392，pVL1393である。本発明に使用することができるバキュロウイルスは、例えば、トリコプルシア・ニイ（Trichoplusia ni）MNPV、ラキプルシア・オウ（Pachiplusia ou）MNPV 、ガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）MNPV等である。好ましくはオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ AcMNPV）が使われる。オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルスとバキュロウイルス伝達ベクターpAc700，pAc701，pAc702，pVL1392およびpVL1393の組合せを含んで成るキットがInvitrogen，Corp.,San Diego，CA，USAから市販されている。本発明において有用である昆虫細胞は確立された昆虫細胞系、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、例えばSf21または好ましくはSf9(ATCC CRL1711)、更にはマメストラ・ブラッシカ（Mamestra bras sicae ）等である。ボンビックス・モリ（Bombyx mori）核多角体病ウイルス(Bm NPV)を使ったボンビックス・モリ細胞系も本発明に使うことができる。相同組換えは、例えば“A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，M.D．Summers 他， Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555”中に記載されたような常用手順に従って実施することができる。トランスフェクトされた昆虫細胞系は常用手順に従って培養することができる。即ち、トランスフェクトされた昆虫細胞は、昆虫細胞が増殖できる任意の組織培養培地、例えば哺乳動物血清が補足されたGrace培地もしくはTC100培地、または無血清培地EX-CELL400等の中で、 20℃〜30℃、好ましくは27℃〜28℃、例えば27℃の温度で、２〜10日間、好ましくは３〜５日間培養することができる。発現されたプロリルエンドペプチダーゼは、微生物細胞例えばＥ．コリ細胞からまたは細胞培養物の上清から、例えば細胞のホモジナイズ、クロマトグラフィー、例えばイオン交換、疎水的またはサイズ排除クロマトグラフィー、沈澱、例えば硫酸アンモニウムまたは酸を使った沈澱、調製用電気泳動、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点電気泳動などを含んで成る常法により、抽出することができる。特に、Ｅ．コリ中で発現されるフラボバクテリウム・メニンゴセブチカム（Flavobacterium meningosepticum）野性型酵素から誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼは、該酵素が周縁質領域に分泌される場合には、浸透圧ショック法を使って容易に且つ選択的に細胞から抽出される。得られた粗製酵素は、常法、例えばクロマトグラフィー、例えばイオン交換、疎水的またはサイズ排除クロマトグラフィー、調製用電気泳動、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点電気泳動などを含んで成る常法を使って、更に精製することができる。Ｃ末端アミド化ペプチドの製造本発明は、プロリルエンドペプチダーゼを使った高温条件下でのＣ末端アミド化ペプチドの製造方法にも関する。プロリルエンドペプチダーゼはプロリン残基のＣ末端側でのペプチドの加水分解的開裂を触媒するだけでなく、加水分解の逆の形でのペプチド結合の形成、即ちプロリン残基で終わる別の断片のＣ末端へのペプチド断片のカップリングも触媒する。制御された条件下では、カップリング反応が優勢であり、２つのペプチド断片のカップリング（またはペプチド断片へのアミノ酸のカップリング）を触媒するのにプロリルエンドペプチダーゼが使われる。カップリングに好ましい条件は、ペプチド断片の一方（またはアミノ酸）の過剰、および高濃度、典型的には50％より高い濃度の有機溶媒、例えばグリセロール、エチレングリコール、ブタンジオール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、アセトニトリル、ＤＭＦまたはＤＭＳＯの存在である。本発明の好ましい態様では、一方の前駆体がアミド化生物活性ペプチドのＮ末端領域を形成しそしてそのＣ末端にプロリン残基を有する前駆体ペプチドであり、そして他方の前駆体がアミド化生物活性ペプチドのＣ末端部分を形成する前駆体ペプチドまたはアミノ酸であってＣ末端がアミド化されている前駆体ペプチドまたはアミノ酸である、前記２つの前駆体から、プロリルエンドペプチダーゼを使って、Ｃ末端がα−アミド化されており且つそれらのＣ末端にまたはその付近にプロリン残基を有する生物活性ペプチドが調製される。プロリルエンドペプチダーゼを使って調製されるα−アミド化生物活性ペプチドとしては、アスパルトシン、ベルモルフィン、カルシトニン、ＣＧＲＰ、ＣＧＲＰII、甲殻類赤色素細胞濃縮ホルモン、ゴキブリ筋活性ペプチドＩ、変色ホルモン、グルミトシン、グラヌリベリンＲ、イソトシン、ＬＨ−ＲＨ、メゾトシン、モルフィネ調節神経ペプチド、α−ＭＳＨ、オキシトシン、フェニプレッシン、ＳＣＰ_A、ＳＣＰ_B、バリトシン、バソプレッシン、およびバソトシンが挙げられる。本発明はプロリルエンドペプチダーゼをコードする組換えＤＮＡ分子の生産方法であって、プロリルエンドペプチダーゼを生産することのできる細胞、好ましくは細菌細胞からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを調製し、プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ断片をクローニングベクター中に挿入し、そしてプロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡを含有するハイブリッドベクターを選択する段階を含んで成る方法を提供する。本発明は特に実施例中に開示される態様に関する。図面の説明図１は、pFPEP02およびpFPEP03中のクローン化挿入断片の制限地図を表す。白抜き部分はプロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の転写解読枠を表し、そして黒塗りの部分はセリンプロテアーゼの触媒部位の共通配列を表す。図２は、発現プラスミドpUK-FPEP-bを略図的に表す。tac プロモーターの後ろにプロリルエンドペプチダーゼの構造遺伝子（暗く陰影が付けられた部分）、多重クローニング部位（ＭＣＳ）およびＥ．コリ rrnB T1転写ターミネーターが続く。このプラスミドは、ヘルパーバクテリオファージの助けによって一本鎖ＤＮＡの調製を可能にするM13 IG領域を含有する。図３は、野性型プロリルエンドペプチダーゼと熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの熱失活曲線を表す。20mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）中の野性型プロリルエンドペプチダーゼ（●）並びに熱安定性プロリルエンドペプチダーゼPEP- 227（○）、PEP-361（■）およびPEP-407（□）の各溶液を様々な温度で30分間インキュベートし、そしてプロリルエンドペプチダーゼの残余活性を測定する。残余活性は温度の関数として示される。本発明を次の実施例により更に説明するが、本発明はそれに限定されない。実施例実施例中、次の材料および方法を一般に使用する。使用する菌株およびプラスミドを表１に列挙する。形質転換、制限マッピング、プラスミドの調製および他の分子クローニング手順は標準法により行われる（Sambrook，J.他，“Molecularc cloning: a labora tory manual,”第２版，1989，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Ha rbor；Silhavy，T.J.他，“Experiments with gene fusions,”1984，Cold Spri ng Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor）。制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は製造業者の推奨に従って使われる。エキソヌクレアーゼIIIによる欠失はKilo- Sequence Deletion Kitを使って行われる（Yanisch-Perron，C.他，Gene，1985 ，33，103-119；Henikoff，S.，Gene，1984，28，351-359）。ヌクレオチド配列はシークエナーゼキットを使うことによって、ジデオキシ法により決定する。Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）からのゲノムＤＮＡはSaitoおよびMiuraの方法（Saito，H．他，Biochim．Biophys．Acta，1963，72，619-629）により単離する。オリゴヌクレオチドはApplied Biosystems Model 381A ＤＮＡ合成装置を使って合成する。トリチル保護合成の終了後、標準プロトコールに従ってオリゴヌクレオチドを支持体から開裂させそして脱保護する。合成されたＤＮＡを次いで製造元のプロトコールに従ってOligonucleotide PurificationCart ridgeを使って精製する。制限酵素、ＤＮＡ修飾酵素、Kilo-Sequence DeletionキットおよびMEGALABEL キットは宝酒造株式会社（京都）から購入した。Sequenase Ver．2.0キットはU. S．Biochemical Corp．（Cleveland,Ohio）の製品である。Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）からのプロリルエンドペプチダーゼおよびエンドプロテイナーゼAsp-Ｎはそれぞれ生化学工業（東京）とBoehringer Mannheim Co． Ltd．（東京）から購入した。 Taq Dye Deoxy Terminator Cycle SequencingキットおよびOlig onucleotide Purification CartridgeはApplied Biosystems，Inc．(Foster Cit y，California)の製品である。QIAGEN tip-100はDIAGEN GmbH（Dusseldorf，FRG ）から得られる。GENECLEAN IIキットおよびCIRCLEGROW培地はBIO 101，Inc．（ Vista，California）の製品である。ニトロセルロースフィルターはSchleicher & Schuell(Keene，New Hampshire)から購入した。YM 30限外濾過膜はAMICONInc. （Beverly，Massachusetts）から得られる。CM52カチオン交換樹脂はWhatman Pa per Ltd．（Maidstone，England）の製品である。酵素基質Ｚ−Gly-Pro-β−ナフチルアミドおよびＺ−Gly-Pro-ｐ−ニトロアニリドはNovabiochem AG（Laeufe lfingen，Switzerland）から得られる。放射性同位体はAmersham Japan Co．Ltd .（東京）から購入した。他の生化学薬品はSigma Chemical Co．(St.Louis，Mis souri)，Wako Pure Chemical Industries，Ltd．（大阪）およびNacalai Tesque Inc．（京都）から購入した。実施例１：Ｆ．メニンゴセプチカムからの出発ＤＮＡの調製商業的に入手したプロリルエンドペプチダーゼを4.6×35mmのTskgel Octadecy l NPRカラム（Tosoh Co.Ltd）上での逆相HPLCにより精製する。0.01％ＴＦＡ／水およびCH₃CNとｉ−プロパノールの３：１混合物を用いて１ml／分の流速でカラムを溶出させる。有機溶剤混合物の35〜70％勾配を40分間に渡り適用し、主ピークを収集する。該エンドペプチダーゼのＮ末端はブロックされているので、それの部分一次構造を決定するためには該酵素をタンパク質分解的開裂にかけなければならない。トリプシンのような開裂に一般に使われるプロテアーゼは十分な結果を与えない。従って、プロテアーゼおよび加水分解的開裂の条件を系統的に調べた結果、エンドプロテイナーゼAsp-Ｎが最良の結果を与えることがわかった。 4mM尿素を含有する10mM 炭酸アンモニウム，pH7.9中の精製酵素（0.5mg）を１ μgのエンドプロテイナーゼAsp-Ｎにより37℃で24時間加水分解する。この消化により得られたペプチド混合物を、0.01％ＴＦＡ／水およびCH₃CNとｉ−プロパノールの３：１混合物の移動相を使った4.6×250mmのVydac C18 カラム（Separa tions Group Corp．）上での逆相HPLCにより分離する。流速は１ml／分である。単離されたペプチドを再クロマトグラフィーにより更に精製する。精製した断片のアミノ酸配列を、KobayashiおよびTarrにより記載された方法〔Kobayashi，R ．他，蛋白質・核酸・酵素，1986，31，991-1002；Tarr，G.E．“Methods in Pr otein Sequencing Analysis”(Elzinga，M．編)，1982，223-232，Humana Press ，New Jersey〕を使った手動エドマン分解により決定する。プローブのヌクレオチド配列は、多重コドン使用のためアミノ酸配列から一つには決定されない。23の部分アミノ酸配列のうち、可能なヌクレオチド配列の比較的少ない組合せを与える６つを選択してＤＮＡプローブを製造する（表２）。Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）中での好ましいコドン使用頻度は知られていないので、ヌクレオチドプローブのデザインに２つのガイドラインを適用する。即ち、６つのプローブのうち３つ（A-12，13および19）は、Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）のゲノムＤＮＡが高ＧＣであるという仮定に基づいて各アミノ酸残基について最もありそうなコドンを選択し、単一オリゴヌクレオチド配列から成るようにデザインされる。その他の３つ（A-3，9および18）は、可能な配列のオリゴヌクレオチドの混合物である。この混合物中の可能な配列の数を更に減らすために、４塩基Ａ，Ｇ，ＣおよびＴのうちの１つであることができる位置にイノシン（Ｉ）を置く。というのは、イノシンは４塩基の全てと安定な塩基対を形成するからである。 Applied Biosystems Model 381A ＤＮＡ合成装置を使ってオリゴヌクレオチドを合成する。合成配列の末端のところのジメトキシトリチル基の除去の後、製造元のプロトコールに従ってオリゴヌクレオチドを脱保護しそして支持体から開裂させる。合成したＤＮＡを次いで７Ｍ尿素中の８％ポリアクリルアミドを使った調製用電気泳動にかける。分離したバンドから精製オリゴヌクレオチドを抽出し、そしてWaters Sep-Pack C-18カラムを使って脱イオンする。Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）から染色体ＤＮＡを単離し、そしてヘキサヌクレオチド配列を認識する４種類の汎用制限酵素、即ちPstI，HindIII，EcoRIおよびBglIIにより消化する。オリゴヌクレオチドプローブをMEGALABELキットを使って〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰで放射能標識し、約１×10⁶ cpm/pmolの比活性を与える。染色体断片を0.7％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてSambrookらにより記載された方法（Sambro ok他，1989，前掲）によりMilliporeニトロセルロースフィルターに移す。標準プロトコール（Sambrook他，1989，前掲）に従った予備ハイブリダイゼーションの後、６×ＳＳＣハイブリダイゼーション溶液中で0.2pmol／mlの標識プローブを使って45℃にて16時間ハイブリダイゼーションを行う。フィルターを６ ×ＳＳＣ中で室温で３分間３回洗浄し、次いで45℃で１分間１回洗浄する。Fuji Bio-image Analyzer BAS 2000を使ってオートラジオグラフィーを行う。A-3プローブだけが、消化されたＤＮＡの各々について明確で且つ特異的なシグナルを与えることがわかった。プロリルエンドペプチダーゼの分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Yoshimono他，1980，前掲）によれば非常に大きい（76,000）。該酵素のサイズはゲノム中のコード領域の2kbに相当する。クローン化ＤＮＡ断片が大きくなればなるほど、転写解読枠の全長を含む見込みが高くなる。従って、長い断片であるが高い形質転換効率を与えるのに十分な位小さい断片が望ましいので、 7kbのBglII断片を選択する。即ち、BglIIにより消化されたゲノムＤＮＡを低融点アガロースゲル上での調製用電気泳動にかけ、7kb断片を含むゲルの部分を切り取る。切り取ったゲル片を連結混合物中で溶かし、抽出された染色体断片をpU C19のBamHI部位の中にクローニングする。この連結混合物によりＥ．コリ HB101 を形質転換せしめ、約4,000クローンを含むゲノムライブラリーを与える。コロニーハイブリダイゼーションによりA-3プローブを使ってゲノムライブラリーをスクリーニングすると、119の陽性クローンが得られる。16の陽性クローンを選択し、制限エンドヌクレアーゼ消化と酵素アッセイにより更に分析する。 7kbの挿入断片を有する１つのクローンが、比較的高いプロリルエンドペプチダーゼ活性を示すことがわかった。このプラスミドをpFPEP02と命名し、更に特徴付ける。pFPEP02の挿入断片の制限地図は図１に示される。2.6kbのHincII−EcoR Iを包含するより大きな断片のいずれかの末端から作製された一連の欠失サブクローン（pFPEP03，FERM BP-3466として寄託）から、2.6kbのHincII−EcoRI断片の全ヌクレオチド配列（配列番号１に示される）をジデオキシ法により決定する。プラスミドpFPEP02をHincIIで消化してプロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を含む3.1kbpのHincII断片を得、それを次いで平滑末端連結によりpUC118のSmaI部位のところにサブクローニングし、pFPEP04を得る。連結後、該断片の両端の挿入箇所はHincIIまたはSmaIのいずれによっても開裂できない。コード領域中のSc aI部位とPvuII部位を削除するために、SmaI部位とPvuII部位の間の配列に相当するが２つの位置が変異されている合成二本鎖オリゴヌクレオチド断片（合成断片Ｉ、配列番号２を参照のこと）を、その５′末端だけがＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより予めリン酸化されている下の鎖と上の鎖をアニーリングすることにより調製する。他方で、プラスミドpFPEP04を転写解読枠中に存在する唯一のSmaI部位のところで開裂させ、そして両端がSmaI部位の線状化された該プラスミドに上述の変異型SmaI−PvuII断片を連結せしめる。次いで連結生成物をSacIで消化し、コード領域の５′部分を含有する長い方の断片をアガロースゲル電気泳動により単離する。単離した断片をリン酸化した後、pFPEP04から別に調製したPvuII部位とSa cI部位の間の欠けている切片を連結せしめてプラスミドpFPEP04'を作製する。合成断片中ではPvuIIにより生じる末端の１つのヌクレオチドが変更されているので、この環化によりPvuII部位は再生されない。次に、プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の開始コドンのすぐ上流に新規EcoR I部位を次の通り造成する。まず４つのオリゴヌクレオチドU1，U2，L1およびL2 （それぞれ配列番号４，５，６および７参照）〔そのうちの２つ（U2とL1）の５ ’末端は予めリン酸化されている〕の連結により合成断片II（配列番号３）を調製する。調製した断片は開始コドンから上流コード領域中のPvuII部位までに相当し、そして連結後にEcoRI部位を導入するために開始部位のすぐ上流に粘着性５′突出末端を有する。次の連結後、調製した断片の両方の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化する。４つのPvuIIのうちの１つが欠失しているプラスミドpFPE04’をPvuIIで消化し、そしてコード領域の大部分を含む断片をアガロースゲル電気泳動により単離し、上述の合成断片IIと連結せしめる。この連結により得られた生成物をEcoRIで消化し、両末端に５′粘着性突出末端を有する完全な転写解読枠を単離し、これを次いでpUC119のEcoRI部位のところでサブクローニングする。得られたプラスミドpFPEP-EEの中の２つの合成領域を配列決定し、変異ヌクレオチド配列を確認する。生成したプラスミドはpFPEP-EEである。ベクターの作製の次の段階で、全コード領域を短い下流非コード領域と一緒に EcoRIによりpFPEP-EEから開裂させる。次いで該断片を発現ベクターpKK223-3のE coRI部位のところに挿入し、プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の転写がtac プロモーターの調節下にあるpKK-FPEPを得る。 pKK223-3の複製開始点はpBR322に由来し、単細胞中でのこの発現ベクターのコピー数は通常低い。遺伝子の一層高い用量効果のために、発現ベクターとして高い発現レベルを与える高コピー数プラスミドが好ましい。従って、a）プロモーターとコード領域のセットまたはb）プロモーター、コード領域およびターミネーターのセットをそれぞれBamHIまたはBbiIIにより切除し、そして高コピー数プラスミドpUC119に移植する。tac プロモーターと一緒にペプチダーゼ遺伝子がpK K-FPEPから転移されるので、二重プロモーターを避けるためにpUC119の元のlac プロモーターをPvuIIにより除去する。このPvuII消化により生ずる平滑末端の間に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより予め平滑末端にしておいた遺伝子セットa)またはセットb)のいずれかを挿入し、それぞれpUK-FPEP-aまたはpUK-FPEP-b（図２）を得る。実施例２：化学処理による出発ＤＮＡのランダム突然変異誘発プラスミドpUK-FPEP-bをEcoRIとPstIで消化する（図２）。プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子を含む2.3kbのＤＮＡ断片をプラスミドの主要断片（ベクター断片）から分離し、そしてpUC118またはpUC119中にサブクローニングする。Ｍ13 ヘルパーファージの助けにより組換えプラスミドの一本鎖ＤＮＡを調製し、そしてMyers他（Science，1985，229，242-247）の方法により、それを20℃にて0.25 Ｍ酢酸ナトリウム，pH4.3中の１Ｍ亜硝酸ナトリウムで15〜20分間、３Ｍ蟻酸で５〜20分間または20％ヒドラジンで５〜20分間処理する。化学的突然変異誘発された一本鎖ＤＮＡをトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素により二本鎖形態にする。得られた2.3kb断片をベクター断片と再連結し、発現プラスミドpUK -FPEP-bを再構成する。実施例３：熱安定性プロリルエンドペプチダーゼのスクリーニング実施例２で得られた連結混合物を用いてＥ．コリを形質転換せしめ、そして60 μg/mlのアンピシリンを含むＴＹ寒天平板（１％バクト−トリプトン、0.1％グルコース、0.8％NaCl、1.5％寒天、pH7.0）上に置いたニトロセルロースフィルターの上に塗抹する。それらの平板を37℃でインキュベートし、フィルター上にコロニーが現れたら、各フィルター上のコロニーのレプリカを別のフィルター上に作る。元のフィルターとレプリカフィルターの両方を寒天平板上で37℃にて数時間インキュベートする。次いで元のフィルターを４℃で保存し、レプリカを細胞溶解にかける。細胞溶解は、フィルターを室温において２つの溶解緩衝液中に順次浸漬することにより行う。最初は50mM Tris-HCl（pH8.0）中の２mg／mlのリゾチームに20分間、次に50mM Tris-HCl（pH8.0）中の１％Triton X-100に５分間。20mM リン酸ナトリウム（pH7.0）中でフィルターの表面から細菌破片を穏やかにこすり落とす。次いで、後でプロリルエンドペプチダーゼの活性染色に使う基質ペプチドが該フィルター上に非特異的吸着するのを防ぐために、20mM リン酸ナトリウム（p H7.0）中の３％ＢＳＡまたは同緩衝液中の５％脱脂粉乳を使ってフィルターをブロックする。20mM リン酸ナトリウム（pH7.0）を使ってブロック用緩衝液を洗い落とした後、フィルターを20mM リン酸ナトリウム（pH7.0）中で50℃で15分間インキュベートする。熱処理後の酵素の残余活性を有するコロニーを同定するために、フィルターを0.1mM Ｚ−Gly-Ala-Pro-β−ナフチルアミドおよび0.01％Fast Garnet GBC 硫酸塩による活性染色にかける。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼを生産するコロニーは、Fast Garnetと基質の加水分解産物β−ナフチルアミンとの不溶性カップリング生成物の形成により、フィルター上に赤色スポットとして目に見える。染色されたコロニーに相当するクローンを、別に４℃で保存してある元のフィルターから単離する。この方法により、24,000のコロニーをスクリーニングし、そして134クローンを熱安定性プロリルエンドペプチダーゼを生産する候補物として選択する。次いで単離されたクローンを寒天平板上に置いた数枚のニトロセルロースフィルター上に画線し、再び各フィルターのレプリカを作製し、２回目のスクリーニングにかける。２回目のスクリーニングでは、最も熱安定性のプロリルエンドペプチダーゼ（PEP-15）を生産するクローンが同定されるまでレプリカを各々徐々に増加する温度で処理する。実施例４：熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの精製精製段階を通して、プロリルエンドペプチダーゼ活性は次のようにしてアッセイする。0.94mlの0.1 Ｍリン酸カリウム（pH7.0）、100μg/mlウシ血清アルブミン、１mM DTTに、40％ジオキサン中の4mM Ｚ−Gly−Pro−ｐ−ニトロアニリド（Ｚ＝Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）0.05mlを添加する。30℃で３分間の予備インキュベーション後、該酵素の希釈溶液0.01mlを混合物に加え、30℃において日立分光光度計U-3210を使って410nmの吸光度の変化を追跡する。酵素活性の１単位は１分あたり１μモルのｐ−ニトロアニリン（この標準手順では8.87ＯＤ／分に相当する）を遊離させる酵素の量として定義される。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼについてのスクリーニングにより得られたＥ．コリクローン（実施例３）を、60μg/mlのアンピシリンを含む500mlのCIR CLEGROW培地中で37℃で増殖させる。12時間後、IPTG（１mM）を加え、更に16時間培養を続ける。Ｅ．コリ細胞を遠心により収得し、冷0.1 M Tris-HCl（pH8.0 ）で洗浄する。その後の精製手順は特記しない限り４℃で実施する。洗浄した細胞を50mlの0.1 M Tris-HCl（pH8.0），0.5 Mショ糖，5mM EDTA中に再懸濁する。そこにリゾチームを160μg/mlの最終濃度になるように添加し、次いで同容量の氷冷水を添加する。氷上で30分間インキュベーションした後、浸透圧ショックとリゾチーム処理により生成したスフェロブラストを10,000×gで2 0分間の遠心により除去する。上清（周縁質画分）を同容量の氷冷水で再び希釈し、1 N HClによりｐＨを７に調整する。20mM リン酸ナトリウム（pH6.2）で平衡化されているCM52カラムに前記希釈溶液を適用する。０→0.25MNaClの直線勾配により酵素を溶出させる。活性画分をプールし、YM30膜を付けたAmicon限外濾過セルを使って濃縮し、そして濃縮物を20mM リン酸ナトリウム（pH6.2）に対して透析する。精製された熱安定性プロリルエンドペプチダーゼPEP-15は、ＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動により均一であると評価される。実施例５：変異型プロリルエンドペプチダーゼの熱安定性 PEP-15の比活性は、野性型酵素（124単位／mgタンパク質）に近い87単位／mg タンパク質であることがわかった。この熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの熱安定性を、熱処理による活性の損失（失活）相対速度の点から野性型と比較する。20mM リン酸ナトリウム(pH7.0)中の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼと野性型プロリルエンドペプチダーゼの各溶液（１mg／ml）を54℃でインキュベートし、そして120分間に渡り様々な時間間隔後にアリコートを取って残余酵素活性についてアッセイする。熱安定性プロリルエンドペプチダーゼと野性型プロリルエンドペプチダーゼの比活性をインキュベーション時間の関数としてプロットすると、両者とも片対数プロットにおいて直線関係を与え、これは活性の損失が一次反応速度論に従うことを示す。直線の傾きから、野性型プロリルエンドペプチダーゼと熱安定性プロリルエンドペプチダーゼについての熱失活の速度定数がそれぞれ2.17×10^-2と6.24×10^-3／分であると見積もられる。この速度定数は、PEP-15が54℃では3.5の係数分安定化されることを明らかに証明する。実施例６：PEP-15 をコードする変異型遺伝子のＤＮＡスクリーニング PEP-15のアミノ酸配列中の変化を確かめるために、変異型遺伝子のヌクレオチド配列を決定する。製造元により推奨される手順に従って、QIAGEN tip-100を使ってPEP-15を生産するクローンから発現プラスミドを単離する。変異型プロリルエンドペプチダーゼ遺伝子の全配列を決定するために、コード領域の全てをカバーする22個の配列決定用プライマーを合成し、そしてTaq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencingキットを使ってApplied Biosystems Model 307A ＤＮＡシークエンサーによりヌクレオチド配列を決定する。PEP-15をコードするヌクレオチド配列を野性型のものと比較すると、アミノ酸位置477のところのGluの代わりにLy sの挿入を引き起こすヌクレオチドＧからＡへの置換が明らかになる。発現ベクターpUK-FPEP-15を調製するためにコード領域を生来のベクター断片中で再クローニングした。実施例７：変形ＰＣＲ法を使ったランダム突然変異誘発本発明の別の態様において、プロリルエンドペプチダーゼの構造遺伝子中にランダム突然変異を作るためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を変更する。ＰＣＲ突然変異誘発は、化学的突然変異誘発とは異なり、Taq ポリメラーゼによるＤＮＡ合成の忠実度を減少させる条件下で変異させようとする遺伝子の領域を増幅する方法である。EcoRI部位とPstＩ部位に直接隣接する領域に相補的である一対の25ヌクレオチドプライマーを使って、プロリルエンドペプチダーゼをコードするpUK-FPEP-bの2.3kb EcoRI-PstI ＤＮＡ断片を増幅させる。限定数の、即ち１個または多くても数個の塩基置換をプロリルエンドペプチダーゼ遺伝子中に効率的に導入するために、ポリメラーゼの忠実度に対する幾つかの要因の影響を調べる。調べた要因はMnCl₂またはDMSOの添加、MgCl₂濃度の変更、およびデオキシヌクレオチドプールの不均衡を包含する。基本反応混合物は、 10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，0.01％(w/v)ウシ血清アルブミン，各0.2mMの４つのdNTP，10ng/mlの鋳型プラスミド，１μＭの各プライマーおよび25単位／mlのTaq ポリメラーゼを含有し、そして本発明において使用した基本反応混合物の変更は次の通りである（変更は５つの別々の実験において行う）： 1）増加したMgCl₂濃度（5mM）を使うと共に50〜100μM Mg Cl₂を添加する。 2）5〜20％のDMSOを添加する。 3）MgCl₂濃度を5mMから10mMまで変更する。 4）dGTP，dTTPおよびdCTPの濃度を1mMで一定に維持しながら、 5mM MgCl₂の存在下でdATPの濃度を0.2mMから0.1mMまで下げる。 5）dATP，dCTPおよびdTTPの濃度を0.1mMで一定に維持しながら、1.5〜2mM MgCl₂の存在下でdGTPの濃度を0.5mMから1mM まで変更する。基本反応混合物の５つの変更はいずれも熱安定性プロリルエンドペプチダーゼを生産する多数のクローンを与える。熱安定性を改善するために、上記変更を繰り返すかまたは異なる上記変更方法を連続して適用する。本発明では、変更3)により野性型からFPEP-227が調製され、変更1)によりFPEP -227からFPEP-361が調製され、そして変更3)によりFPEP-361からFPEP-407が調製された。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡを94℃で１分間融解させそして50℃で１分間プライマーとアニーリングさせることにより、Gene Amp^TM PCR装置9600（Perkin Elmer）を使って行う。74℃で４分間鎖の伸長を開始し、合計25サイクルを実施する。最終サイクルの後、70℃での重合を更に７分間延長する。ランダム変異型ＤＮＡライブラリーを作製するために、増幅させたＤＮＡ断片をEcoRIとPstIで消化し、そしてGENECLEAN IIキットにより精製する。得られた2.3kb EcoRI−PstI断片を、p UK-FPEP-bの完全なベクター断片と再連結させる。ＰＣＲ突然変異誘発の最初のサイクルは野性型遺伝子から出発する。ＰＣＲにより約80,000のクローンを生じさせ、これを実施例３に記載したのと同じであるが熱処理にわずかに高い温度（52℃）を使った方法によりスクリーニングすると、変異体ライブラリー中で最も熱安定性のプロリルエンドペプチダーゼPEP-227 を生産するクローンを与える。実施例８：変形ＰＣＲ法を使った反復ランダム突然変異誘発単一の酵素分子中での安定化突然変異の蓄積はFPEP-15やFPEP-227で観察されるよりも一層大きな熱安定性の改善をもたらすと期待されるので、突然変異を蓄積させるためにＰＣＴ突然変異誘発／スクリーニングサイクルを連続して繰り返す。２巡目のＰＣＲ突然変異誘発の鋳型としてFPEP-227をコードする単離されたクローン（pUK-FPEP-227）を使い、約40,000クローンから成るライブラリーを作製する。同様にして第二世代ライブラリーのスクリーニングを行い、最も熱安定性のプロリルエンドペプチダーゼ（PEP-361）を発現するクローンを得る。３巡目では鋳型としてPEP-361をコードする発現プラスミド（pUK-FPEP-361）から出発して突然変異誘発とスクリーニングをもう一度繰り返す。突然変異誘発／スクリーニングのサイクルが進むにつれて徐々に熱処理温度を増加させ、３巡目で、61℃の熱処理を使ったスクリーニングにより50,000クローンの中から最も熱安定性のプロリルエンドペプチダーゼ（PEP-407）を生産するクローンが同定される。この実施例において単離され特徴づけられたクローンが、調製されそして熱安定性酵素をコードすると同定された唯一のクローンではないことに注意すべきである。ここに明記されたクローンは単に方法の原理を教えるための例として単離されただけである。実施例９：高熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの単離および特徴づけ熱安定性プロリルエンドペプチダーゼPEP-227，PEP-361およびPEP-407を生産するクローンから、発現プラスミドを単離し、それぞれpUK-FPEP-227，pUK-FPEP -361およびpUK-FPEP-407と命名する。該プラスミド上に担持された変異型構造遺伝子のＤＮＡ配列を決定してプロリルエンドペプチダーゼのアミノ酸配列中の構造変化を調べる。各ランダム突然変異誘発／スクリーニングサイクルにおいて１個または数個の塩基置換が導入されることがわかり、連続した突然変異誘発／スクリーニングサイクルにより遺伝子中に突然変異が蓄積されることも確認される（表３）。精製した熱安定性プロリルエンドペプチダーゼPEP-227，PEP-361およびPEP-40 7の比活性は、それぞれ116，87および69単位／mgタンパク質であることがわかった。それらの熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの比活性は野性型のもの（12 4単位／mgタンパク質）と同等であるが、アミノ酸置換が蓄積されるにつれて減少する傾向を示す。最初に、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの熱安定性をＴ₅₀の値（30分間で酵素が50％活性を損失する温度）により評価する。20mM リン酸ナトリウム（pH7.0）中で、Gene Amp^TM PCR装置9600（Perkin-Elmer）を使って0.2mg／mlの野性型プロリルエンドペプチダーゼまたは前記熱安定性プロリルエンドペプチダーゼのうちの１つを46℃〜69℃の範囲の様々な温度で30分間インキュベートする。残余活性を測定し、温度の関数としてプロットする（図３）。野性型のＴ₅₀はこの図から53.5℃であると見積もられるが、熱安定性プロリルエンドペプチダーゼPEP-227，PEP-361およびPEP-407のＴ₅₀はそれぞれ56.5 ，59.5および60.5℃と上にシフトする。熱安定性の指標としてのＴ₅₀の変化は、突然変異誘発／スクリーニングサイクルが進行するにつれてプロリルエンドペプチダーゼの熱安定性が改善されることを明らかに証明する。熱安定性の改善をより定量的に評価するために、酵素溶液を一定温度でインキュベートし、そして残余活性の変化を120分間に渡り追跡する。20 mMリン酸ナトリウム（pH7.0）中の0.2mg／mlの各酵素溶液を60℃でインキュベートする。様々な時間間隔のところでアリコートを取り、残余活性を測定する。野性型プロリルエンドペプチダーゼと３つの熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの熱失活過程はいずれも一次反応速度論に従い、残余活性をインキュベーション時間の関数として片対数でプロットすると直線を示す。野性型、PEP-227、PEP-361およびPEP- 407の失活速度定数は傾きからそれぞれ4.27×10^-1、7.08×10^-2、1.32×10^-2および7.16×10^-3／分であると評価される。速度定数は熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの安定性の大幅な改善を証明する。即ち、この改善は突然変異誘発／スクリーニングの最終サイクルにおいて得られた最も熱安定性のプロリルエンドペプチダーゼで60の係数に達する。寄託微生物Ｅ．コリ TG1／pFPEP03はブダペスト条約のもとにＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 B raunschweig，Federal Republic of Germany）に1994年６月16日にDSM 9250として寄託された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．熱安定性プロリルエンドペプチダーゼであって、次の段階： (a) プロリルエンドペプチダーゼをコードする出発ＤＮＡの突然変異誘発、 (b) (a)で得られた変異型ＤＮＡ配列のライブラリーの作製、 (c) 改善された熱安定性を有するプロリルエンドペプチダーゼをコードする遺伝子についての前記ライブラリーのスクリーニング、および (d) (c)のもとに得られた遺伝子の発現と発現産物の単離を含んで成る方法により得られる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。２．原核生物の野性型プロリルエンドペプチダーゼから誘導できる、請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。３．フラボバクテリウム種（Flavobacterium spec.）の野性型プロリルエンドペプチダーゼから誘導できる、請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。４．Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）の野性型プロリルエンドペプチダーゼから誘導できる、請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。５．Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）株IFO 12535(ATCC 13253 )の野性型プロリルエンドペプチダーゼから誘導できる、請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。６．配列番号１の配列を有するプロリルエンドペプチダーゼから誘導できる、請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。７．アミノ酸Glu48，Phe51，Ala129，Gly633および／またはGlu 477が別のアミノ酸により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼーの群より選ばれる、請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。８．アミノ酸Glu48がGlnにより置換され、Phe51がLeuにより置換され、ALa129 がThrにより置換され、Gly633がValにより置換されそして／またはGlu477がLys により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれる、請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。９．アミノ酸(a)Glu48、(b)Glu48，Ala129およびGly633、(c)Glu48，Ala129， Gly633およびPhe51、および(d)Glu477が別のアミノ酸により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれる、請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。 10．アミノ酸(a)Glu48がGluにより置換されている(PEP-227)、(b)Glu48がGln により置換され、Ala129がThrにより置換されそしてGly633がValにより置換されている(PEP-361)、(c)Glu48がGlnにより置換され、Ala129がThrにより置換され、Gly633がValにより置換されそしてPhe51がLeuにより置換されている(PEP-407) 、および(d)Glu477がLysにより置換されている(PEP-15)配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれる、請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼ。 11．熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子であって、ここで前記ＤＮＡ配列は次の段階： (a) プロリルエンドペプチダーゼをコードする出発ＤＮＡの突然変異誘発、 (b) (a)で得られた変異型ＤＮＡ配列のライブラリーの作製、および、 (c) 改善された熱安定性を有するプロリルエンドペプチダーゼをコードする遺伝子についての前記ライブラリーのスクリーニングを含んで成る方法により野性型プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列から誘導できる、前記組換えＤＮＡ分子。 12．原核生物の野性型プロリルエンドペプチダーゼから誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 13．フラボバクテリウム種（Flavobacterium spec.）の野性型プロリルエンドペプチダーゼから誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 14．Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）の野性型プロリルエンドペプチダーゼから誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 15．Ｆ．メニンゴセプチカム（F ．meningosepticum）株IFO 12535(ATCC 13253 )の野性型プロリルエンドペプチダーゼから誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 16．配列番号１の配列を有する野性型プロリルエンドペプチダーゼから誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 17．配列番号１の配列を有するＤＮＡ分子から誘導できる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 18．48位のアミノ酸Glu(“Glu48”)，Phe51，Ala129，Gly633および／またはGlu477が別のアミノ酸により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 19．熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子であって、48位のアミノ酸Glu(“Glu48”)，Phe51，Ala129 ，Gly633および／またはGlu477をコードするコドンが別のアミノ酸をコードするコドンにより置換されている配列番号１の配列を有する組換えＤＮＡ分子の群より選ばれる、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 20．アミノ酸Glu48がGlnにより置換され、Phe51がLeuにより置換され、Ala129 がThrにより置換され、Gly633がValにより置換されそして／またはGlu477がLys により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 21．アミノ酸Glu48をコードするコドンがGlnをコードするコドンにより置換され、Phe51をコードするコドンがLeuをコードするコドンにより置換され、Alal29 をコードするコドンがThrをコードするコドンにより置換され、Gly633をコードするコドンがValをコードするコドンにより置換されそして／またはGlu477をコードするコドンがLysをコードするコドンにより置換されている配列番号１を有するＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 22．アミノ酸(a)Glu48、(b)Glu48，Ala129およびGly633、(c)Glu48，Ala129， Gly633およびPhe51、および(d)Glu477が別のアミノ酸により置換されている配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 23．アミノ酸(a)Glu48、(b)Glu48，Ala129およびGly633、(c)Glu48，Ala129， Gly633およびPhe51、および(d)Glu477をコードするコドンが別のアミノ酸をコードするコドンにより置換されている配列番号１を有するＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 24．アミノ酸(a)Glu48がGlnにより置換されている(PEP-227)、(b)Glu48がGln により置換され、Ala129がThrにより置換されそしてGly633がValにより置換されている(PEP-361)、(c)Glu48がGlnにより置換され、Ala129がThrにより置換され、Gly633がValにより置換されそしてPhe51がLeuにより置換されている(PEP-407) 、および(d)Glu477がLysにより置換されている(PEP-15)配列番号１を有する熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 25．(a)アミノ酸Glu48をコードするコドンがアミノ酸Glnをコードするコドンにより置換されている、(b)アミノ酸Glu48をコードするコドンがアミノ酸Glnをコードするコドンにより置換され、アミノ酸Ala129をコードするコドンがアミノ酸Thrをコードするコドンにより置換されそしてアミノ酸Gly633をコードするコドンがアミノ酸Valをコードするコドンにより置換されている、(c)アミノ酸Glu4 8をコードするコドンがアミノ酸Glnをコードするコドンにより置換され、アミノ酸Ala129をコードするコドンがアミノ酸Thrをコードするコドンにより置換され、アミノ酸Gly633をコードするコドンがアミノ酸Va lをコードするコドンにより置換されそしてアミノ酸Phe51をコードするコドンがアミノ酸Leuをコードするコドンにより置換されている、および(d)アミノ酸Glu4 77をコードするコドンがアミノ酸Lysをコードするコドンにより置換されている、配列番号１を有するＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 26．(a)458位の核酸Ｇ（“458Ｇ”）がＣにより置換されている、(b)458ＧがＣにより置換され、701ＧがＡにより置換され、そして2214ＧがＴにより置換されている、(c)458ＧがＣにより置換され、701ＧがＡにより置換され、2214ＧがＴにより置換されそして467ＴがＣにより置換されている、および(d)1745ＧがＡにより置換されている配列番号１を有するＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 27．pUK-FPEP-15中、pUK-FPEP-227中、pUK-FPEP-361中、またはpUK-FPEP-407 中の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ分子の群より選ばれた熱安定性プロリルエンドペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る、請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子。 28．請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子を含んで成るハイブリッドベクター。 29．適当な形質転換された宿主中でのコードされる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの発現用のプロモーターの調節下に請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子を含んで成る、請求項28に記載のハイブリッドベクター。 30．コードされる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの発現用の請求項29に記載のハイブリッドベクター。 31．pUK-FPEP-15、pUK-FPEP-227、pUK-FPEP-361およびpUK-FPEP-407から成る群より選ばれる、請求項30に記載のハイブリッドベクター。 32．バキュロウイルス／昆虫細胞発現系中でのコードされる熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの発現用の請求項29に記載のハイブリッドベクター。 33．請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子を含んで成る形質転換された宿主。 34．請求項11に記載のＤＮＡ分子の調製方法であって、次の段階： (a) プロリルエンドペプチダーゼをコードする出発ＤＮＡの突然変異誘発、 (b) (a)で得られた変異型ＤＮＡ配列のライブラリーの作製、および (c) 改善された熱安定性を有するプロリルエンドペプチダーゼをコードする遺伝子についての前記ライブラリーのスクリーニング、を含んで成る方法。 35．請求項１に記載の熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの生産方法であって、次の段階： (a) 請求項29に記載の発現ベクターを用いた適当な宿主の形質転換、および (b) 熱安定性プロリルエンドペプチダーゼの単離を含んで成る方法。 36．前記宿主がＥ．コリ（E ． coli）である、請求項35に記載の方法。 37．バキュロウイルス発現系が使われる、請求項35に記載の方法。 38．請求項33に記載の形質転換された宿主の調製方法であって、適当な宿主細胞を形質転換条件下で請求項11に記載の組換えＤＮＡ分子で処理することを含んで成る方法。