JPH10501984A - 形質転換微生物を用いて製造されるグリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸混合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 改良がグリコレートオキシダーゼを発現する微生物細胞触媒（例えばピチア・パストリス、ハンセヌラ・ポリモルファ、アスペルギルス・ニズランス又はエシェリキア・コリ）及び内因性カタラーゼの使用を含む、アミノメチルホスホン酸の存在下で水溶液中においてグリコール酸及び酸素を反応させるための改良された酵素的方法；可溶性カタラーゼも含まれることができる。得られる混合物はＮ−（ホスホノメチル）グリシンの生産における有用な中間体である。

Description

【発明の詳細な説明】 形質転換微生物を用いて製造されるグリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸混 合物 発明の背景 １．発明の分野： 本発明はグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）の混合物の 製造法に関し、その方法ではグリコール酸及び酸素が水溶液中で、ＡＭＰＡ、な らびにホウレンソウからの酵素グリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロ キシ−酸オキシダーゼ、ＥＣ １．１．３．１５）を発現する遺伝子操作された 形質転換微生物及びカタラーゼ（ＥＣ １．１１．１．６）を含む触媒の存在下 において反応させられる。この方法で製造されるグリオキシル酸／アミノメチル ホスホン酸混合物は、広範囲の発芽後除草剤であるＮ−（ホスホノメチル）グリ シンの製造における有用な中間体である。 ２．関連技術の説明 通常葉の多い緑色植物及び哺乳類細胞中で見いだされる酵素であるグリコレー トオキシダーゼはグリコール酸のグリオキシル酸への酸化を触媒し、過酸化水素 の生産を伴う： ＨＯＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ＋Ｏ₂→ＯＣＨＣＯ₂Ｈ＋Ｈ₂Ｏ₂ Ｎ．Ｅ．Ｔｏｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ． １８１，９０５−９１４（１９４９）は最初にタバコの葉から抽出される酵素を 報告し、それはグリコール酸の、グリオキシル酸の中 間的生成を介した蟻酸及びＣＯ₂への酸化を触媒した。エチレンジアミンなどの ある種の化合物を添加すると中間的グリオキシル酸のさらなる酸化が制限された 。酸化は約８のｐＨで、典型的に約３〜４０ｍＭ（ミリモル）のグリコール酸濃 度を用いて行われた。グリコレート酸化のための最適ｐＨは８．９であると報告 された。シュウ酸（１００ｍＭ）はグリコレートオシシダーゼの触媒作用を阻害 すると報告された。同様に、Ｋ．Ｅ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ａｎｄ Ｎ．Ｅ． Ｔｏｌｂｅｒｔ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２３６，１２８０−１２ ８４（１９６１））は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ） を含有する緩衝液がグリコール酸のグリコレートオキシダーゼ触媒酸化における シュウ酸の生成を阻害することを示した。Ｃ．Ｏ．Ｃｌａｇｅｔｔ，Ｎ．Ｅ．Ｔ ｏｌｂｅｒｔ ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｒｉｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖ ｏｌ．１７８，９７７−９８７（１９４９））は、酸素を用いたグリコール酸の グリコレートオキシダーゼ触媒酸化のための最適ｐＨが約７．８〜８．６であり 、最適温度が３５〜４０℃であると報告した。 Ｉ．Ｚｅｌｉｔｃｈ ａｎｄ Ｓ．Ｏｃｈｏａ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（ Ｖｏｌ．２０１，７０７−７１８（１９５３））及びＪ．Ｃ．Ｒｏｂｉｎｓｏｓ ｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２３７，２００１− ２００９（１９６２））は、グリコール酸のホウレンソウグリコレートオキシダ ーゼ−触媒酸化における蟻酸及びＣＯ₂の生成がＨ₂Ｏ₂とグリオキシル酸の非酵 素的反応から生ずることを報告した。彼らは、Ｈ₂Ｏ₂の分解を触媒する酵素であ るカタラーゼの添加が蟻酸及びＣＯ₂の生成を抑制することによりグリオキシル 酸の収率 を非常に向上させることを観察した。ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の添 加がグリコレートオキシダーゼの安定性を非常に向上させることも見いだされた 。 Ｎ．Ａ．Ｆｒｉｇｅｒｉｏ ａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｈａｒｂｕｒｙ（Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ ．，Ｖｏｌ．２３１，１３５−１５７（１９５８））は、ホウレンソ ウから単離されるグリコール酸オキシダーゼの調製及び性質について報告した。 精製酵素は溶液中で非常に不安定であることが見いだされた；この不安定性はフ ラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の酵素活性部位への比較的弱い結合、及び酵 素の酵素的活性四量体及び／又は八量体の、不可逆的に凝集し、沈澱する酵素的 不活性単量体及び二量体への解離に帰せられた。酵素の溶液へのＦＭＮ（フラビ ンモノヌクレオチド）の添加はその安定性を非常に向上させ、高タンパク質濃度 又は高イオン濃度は酵素を八量体又は四量体として保持した。 グリコレートオキシダーゼにより触媒されるグリコール酸の酸化についての多 数の他の参照文献がある。酵素の単離（及びアッセイ法）は以下の参照文献に記 載されている：Ｉ．Ｚｅｌｉｔｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ ，Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５ ５，ｐ．５２８−５３１（ホウレンソウ及びタバコの葉から）、Ｍ．Ｎｉｓｈｉ ｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｖｏ ｌ．２２２，３９７−４０２（１９８３）（カボチャ子葉から）、Ｈ．Ａｓｋｅ ｒ ａｎｄ Ｄ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ， Ｖｏｌ．７６１，１０３−１０８（１９８３）（ラット肝臓から）、ならびにＭ ．Ｊ．Ｅｍｅｓ ａｎｄ Ｋ．Ｈ．Ｅｒｉｓｍａｎｎ，Ｉｎｔ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．，Ｖｏｌ．１６，１３７３−１３７８（１９８４）（レム ナ・ミノル Ｌ（Ｌｅｍｎａ Ｍｉｎｏｒ Ｌ）から）。酵素の構造も報告され た：Ｅ．Ｃｅｄｅｒｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．１７３，５２３−５３０（１９８８）及びＹ．Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ ａ ｎｄ Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６４，３６ ２４−３６２８（１９８９）。 発明の概略 本発明は水溶液中で酸素を用い、ならびにＡＭＰＡ及び２種の触媒： ホウレンソウからの酵素グリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸 オキシダーゼ、ＥＣ １．１．３．１５）を発現する遺伝子操作された形質転換 微生物及びカタラーゼ（ＥＣ １．１１．１．６）の存在下においてグリコール 酸を酸化することによるグリオキシル酸（又はそれらの塩）及びアミノメチルホ スホン酸（ＡＭＰＡ）（又はそれらの塩）の混合物の製造に関する。そのような グリオキシル酸とＡＭＰＡの混合物は発芽後除草剤であるＮ−（ホスホノメチル ）グリシンの製造に有用である。 生物学的寄託の簡単な説明 出願人等はブタペスト条約の条件の下に以下の生物学的寄託を行った： 本明細書で用いられる「ＮＲＲＬ」は１１８１５ Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｉｏｒｉａ，ＩＬ ６１６０４ Ｕ．Ｓ．Ａ所在のＮｏｒ ｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａ ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ を言う。「ＮＲＲＬ Ｎｏ．」はＮＲＲＬに寄託されている培養物の受け入れ番 号である。 好ましい実施態様の説明 関連特許である米国特許第５，１３５，８６０号（１９９２年８月４日）、“ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｇｌｙｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ ／Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｅｘｔｕｒｅｓ” （ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９４１９）は、酸素、アミノエチルホスホン酸（ＡＭＰ Ａ）、ならびに可溶性酵素グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下に おけるグリコール酸のグリオキシル酸への酵素的転化のための方法を記載してい る。７〜９のｐＨ範囲内におけるグリコール酸の酵素的酸化へのＡＭＰＡの添加 が、得られるグリオキシル酸の高収率を生ずることは予想されず、それはグリオ キシレートとの酸化−抵抗性Ｎ−置換ヘミアミナール及び／又はイミン錯体の生 成には非プロトン化アミンが必要だと思われていたからである。ＡＭＰＡのプロ トン化アミンのｐＫａは１０．８であると報告され（Ｌａｎｇｅ’ｓ Ｈａｎｄ ｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ａ．Ｄｅａｎ，ｅｄ．，ＭｃＧｒａ ｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９，１２ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）、従 ってＡＭＰＡは反応混合物中で主にプロトン化アンモニウムイオンとして存在し 、グリオキシレートと そのような保護錯体を形成することが予想されなかった。本発明はこの方法のた めの触媒としての微生物全細胞の形態で、上記の方法への改良を提供する。 以前に報告されたグリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸混合物の生産のた めの触媒としての可溶性酵素の利用は、いくつかの問題を提起する：再利用のた めの触媒の回収が容易に行われず、酵素活性は固定化酵素又は全細胞触媒系の場 合のように安定ではなく、可溶性グリコレートオキシダーゼは反応混合物への酸 素の散布（酸素の溶解の速度、及びかくして反応速度を増すために必要）に対し て安定ではない。第２の関連特許出願、１９９３年７月１日出願のＵ．Ｓ．Ｓ． Ｎ．０８／０８５，４８８、“Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ Ｐｒｏｄ ｕｃｔｉｏｎ”（ＰＣＴ／ＵＳ９４／ ）は、当該技術分野における熟 練者に通常既知である遺伝子操作法を用いた、内因性カタラーゼと共にホウレン ソウからのグリコレートオキシダーゼを発現するアスペルギルス・ニズランスの いくつかの形質転換体の構築を記載した。本発明における、グリオキシル酸／ア ミノメチルホスホン酸混合物の生産のための可溶性酵素の利用を越えるこれらの 全−細胞触媒の利用の場合のいくつかの利点は： （１）全−触媒触媒は反応の終結時に反応混合物から、再利用のために容易に 回収されるが、可溶性酵素は非常な困難及び活性の損失を伴ってしか回収されな い； （２）それらは、可溶性酵素に対して得られる触媒回転数に関して、ならびに 反応の終結時における回収酵素活性に関しての両方で可溶性酵素より安定である ；ならびに （３）最も重要なことに、それらは酸素又は酸素−含有気体が酸素溶解の速度 及び反応速度を増すために反応混合物にスパージングされる(sparged)反応条件 に対して安定であり、類似の反応条件下で可溶性グリコレートオキシダーゼは急 速に変性する。 形質転換アスペルギルス・ニズランスは、最初にグリコレートオキシダーゼを コードするホウレンソウの遺伝子をクローニングし、次いでこの遺伝子を、すで に内因性カタラーゼを生産するアスペルギルス・ニズランスの株中に導入するこ とにより製造された。得られる形質転換体は震盪フラスコ又は発酵器中の最少培 地又はＳＹＧ濃厚培地中で培養され、さらにグリコレートオキシダーゼ及び／又 はカタラーゼの発現量を増すためにオレイン酸（ＯＬ）、ヒドロキシ酢酸（ＨＡ ）又はコーン浸漬液などの種々の試薬が培地に加えられる。次いで種々の形質転 換体が、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性に関して全細胞（未処理 ）をアッセイし、グリコール酸のグリオキシル酸への酸化のための触媒として細 胞を用いた反応を行うことによりスクリーニングされる。 グリコール酸のグリオキシル酸への酸化のための触媒として用いられる場合、 アスペルギルス・ニズランス細胞は予備処理されないか、又は細胞の内部におけ る酵素への反応混合物の接近性を増すために透過性化され；細胞の透過性化のい くらかはおそらく反応混合物又はその成分のいずれかへの暴露から、あるいは必 要になるまで全細胞触媒を保存するために用いられた凍結及び解凍により行うこ とができる。 グリオキシル酸の生産のための全細胞触媒としての形質転換アスペルギルス・ ニズランスの利用は以前に示され(ＰＣＴ／ＵＳ９３／０００７７，“Ｏｘｉｄ ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｌｉｃ Ａｃｉｄ ｔ ｏ Ｇｌｙｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ ｕｓｉｎｇ ａ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃ ｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ａｓ Ｃａｔａｌｙｓｔ”)、そこではグ リオキシル酸と化学的付加物を形成することができるアミン緩衝液（例えばエチ レンジアミン又はＴＲＩＳ）の利用が９８％もの高いグリオキシル酸の収率を生 じ；その場合、細胞内の内因性カタラーゼの濃度は副産物である過酸化水素によ りグリオキシレートの蟻酸への酸化を制限するのに十分であった。過酸化水素に よる酸化からのグリオキシレートの保護においてＡＭＰＡがあまり有効でない本 発明の場合、細胞内における内因性Ａ．ニズランスカタラーゼの濃度はグリオキ シレートの所望の高収率を与えるためには不十分であった。グリコレートオキシ ダーゼ活性源としてこれらの全細胞を用いるＡＭＰＡ−含有反応混合物に追加の 可溶性カタラーゼ（例えばＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＳ．セレビシアエ （Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から）を加えると、可溶性又は固定化酵素を用い る場合に達成される収率と類似のグリオキシレートの収率を生ずることができる ことが見いだされた。 グレコレート／ＡＭＰＡ混合物の酸化のための触媒として形質転換Ａ．ニズラ ンスを用いる場合、グリコレートオキシダーゼを含有する細胞内でグリオキシレ ート及び過酸化水素の両方が生産され、可溶性カタラーゼが加えられない場合、 グリオキシレートが急速にホルメートに酸化される（例えば：実施例２における ように８７％ホルメート、１．７％グリオキシレート）。グリオキシレートの高 収率が単に反応に可溶性カタラーゼを加えることにより得られ得ることは予期さ れず、それは（１）反応経過を通じて生産されるグリオキシレートと過酸化水素 の相対的濃度が回りの水溶液におけるより細胞内において大きい、（２）Ａ．ニ ズ ランス細胞内における内因性カタラーゼの濃度は典型的に、通常反応混合物に加 えられる可溶性カタラーゼの濃度の２％〜１５％である、及び（３）可溶性カタ ラーゼにより水と酸素に分解されるためには過酸化水素が細胞内から回りの水溶 液中に拡散しなければならないからである。しかし単に可溶性カタラーゼを反応 混合物に、可溶性カタラーゼ及び可溶性グリコレートオキシダーゼのみが触媒と して用いられる場合に以前に用いられていたと同じ濃度で加えることにより（米 国特許第５，１３５，８６０号、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９４１９）、９４％もの 高いグリオキシレートの収率が得られた。 本発明において用いられた第２の微生物細胞触媒はハンセヌラ・ポリモルファ （メチロトローフ性酵母）であり、それは内因性カタラーゼと共にホウレンソウ からのグリコレートオキシダーゼ酵素を発現する。十分なグリコレートオキシダ ーゼ活性を有するいくつかのＨ．ポリモルファの形質転換体が、グリコレートオ キシダーゼのためのＤＮＡを発現ベクター中に、ホルメートデヒドロゲナーゼ（ ＦＭＤ）プロモーターの調節下で挿入することにより製造された。このベクター を用いてＨ．ポリモルファが形質転換され、多量のグリコレートオキシダーゼを 生産する株が選択され、Ｈ．ポリモルファ Ｇ０１（ＮＲＲＬ Ｙ−２１０６５ ）と命名された。 Ｈ．ポルモルファ細胞触媒は典型的に、最初に形質転換Ｈ．ポリモルファの接 種材料を５００ｍｌのＹＰＤ（Ｄｉｆｃｏ）、ｐＨ４．４において増殖させるこ とにより製造された。次いでこの培養物を１０ＬのＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅ ｎ Ｂａｓｅ（ＹＢＮ，Ｄｉｆｃｏ）ｗ／ｏアミノ酸（１４ｇ）、硫酸アンモニ ウム（５０ｇ）及びメタノール（１ ００）をｐＨ５．０において含有する発酵器中に接種した。発酵器を３７℃、４ ００ｒｐｍの撹乱（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）速度、５．０の一定のｐＨ、４０％の 溶解酸素（制御）及び１４ｐｓｉｇの空気において４２．５時間運転した。発酵 の終結時に１．０ｋｇのグリセロールを加え、細胞を遠心分離により収穫し、液 体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。 本発明において用いられた第３の微生物細胞触媒は、内因性カタラーゼと共に ホウレンソウからのグリコレートオキシダーゼ酵素を発現するピチア・パストリ ス（メチロトローフ性酵母）の形質転換体である。ホウレンソウグリコレートオ キシダーゼ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントをＰ．パストリス発現ベクター （ｐＨＩＬ−Ｄ４）中に、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼＩプロモー ターの調節下となるように挿入し、プラスミドｐＭＰ１を生成することにより、 十分なグリコレートオキシダーゼ活性を有するＰ．パストリスのいくつかの形質 転換体を製造した。線状化プラスミドｐＭＰ１の染色体アルコールオキシダーゼ Ｉ遺伝子座中への組み込み及びグリコレートオキシダーゼ遺伝子によるアルコー ルオキシダーゼ遺伝子の置換を可能にするように、Ｐ．パストリス株ＧＴＳ１１ ５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）をプラスミドｐＭＰ１により形質転換し、選択 を行った。そのような形質転換体のプールを次に発現カセットの組み込みコピー の最大数に関して選択した。Ｐ．パストリス株ＧＳ１１５−ＭＳＰ１０と命名さ れる高いコピー数の形質転換体を単離し、ＮＲＲＬ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎ ｏｉｓに寄託した。 Ｐ．パストリス細胞は典型的に、１％のグリセロースを含有する１００ｍＬの ＹＮＢ中で接種材料を増殖させることにより製造した。３０℃ で４８時間増殖させた後、ｙｅａｓｔ ｎｉｇｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ（ＹＢＮ） ｗ／ｏアミノ酸（１３４ｇ）、グリセロース（１００ｇ）及びビオチン（２０ｍ ｇ）を含む１０Ｌの培地を含有する発酵器中に細胞を移した。発酵はｐＨ５．０ （ＮＨ₄ＯＨで制御）、３０℃、２００ｒｐｍの撹乱速度、５ｓｌｐｍのエアレ ーション、５ｐｓｉｇの空気及び５０％飽和以上に保持される溶解酸素において 運転した。グリセロールが枯渇したら、グリセロールをメタノール（５０ｇ）で 置換する以外は同じ培地において増殖させることにより細胞を誘導してグリコレ ートオキシダーゼを発現させた。誘導の間のグリコレートオキシダーゼ活性を酵 素アッセイにより追跡した。誘導の２４時間後、グリセロール（１ｋｇ）を用い た処理の後に細胞を収穫した。収穫に続き、細胞を液体窒素中で凍結し、−８０ ℃において保存した。 Ａ．ニズランスと異なり、Ｈ．ポリモルファ及びＰ．パストリスの形質転換細 胞は、グリコール酸のグリオキシル酸への酸化のための触媒として用いられる前 に透過性化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が必要であった。透過性化の ための多様な既知の方法が十分なグリコレートオキシダーゼ活性を有する細胞の 製造のために有用であった（Ｆｅｌｉｘ，Ｈ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ ，Ｖｏｌ．１２０，２１１−２３４，（１９８２）を参照されたい）；典型 的に１０重量％の湿潤細胞の懸濁液を０．１％（ｖ／ｖ）の“ＴＲＩＴＯＮ”Ｘ −１００／２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に１５分間懸濁させ、次いで 液体窒素中で凍結し、解凍し、２０ｍＭリン酸塩／０．１ｍＭ ＦＭＮ緩衝液（ ｐＨ７．０）で洗浄した。 グリコール酸／ＡＭＰＡ混合物の酸化のための触媒としてＨ．ポリモ ルファ及びＰ．パストリス形質転換細胞のいずれかを用いる場合、やはり可溶性 Ａ．ニゲルカタラーゼの添加が高収率のグリオキシル酸の生産に必要であること が見いだされた。Ｈ．ポリモルファ又はＰ．パストリスの透過性化細胞の接近可 能なカタラーゼ活性は、Ａ．ニズランスのそれより約１０倍高かったが、いずれ のメチロトローフ性酵母の内因性カタラーゼもＡＭＰＡを含有する反応混合物中 の副産物である過酸化水素の分解において、Ａ．ニズランス又はＡ．ニゲルから のカタラーゼより有効性が低かった。補足的カタラーゼ源としての可溶性Ａ．ニ ゲルカタラーゼの、あるいはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の透過性化全細胞の添加は、カタラーゼが 加えられない場合の反応実験と比較してグリオキシル酸の生産における顕著な増 加を生じた。 本発明で用いられた第４の微生物細胞触媒は、内因性カタラーゼと共にホウレ ンソウからのグリコレートオキシダーゼ酵素を発現するエシェリキア・コリ（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｏｌｉ）（バクテリア）の形質転換体である。そのよ うな形質転換Ｅ．コリはＭａｃｈｅｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ，Ｖｏｌ．１１３２，１１−１６（１９９２）に記載 の通りに製造された。グリコレートオキシダーゼ活性を発現する形質転換Ｅ．コ リは、本発明において触媒として用いる前に透過性化しなかった。 本出願において触媒としての可溶性酵素の使用の欠点の多くが、触媒として形 質転換微生物全細胞（非透過性化又は透過性化）を用いることにより除去された 。全−細胞触媒の回収及び再利用は遠心分離し、又は反応混合物から触媒を濾過 し、それを新しい反応混合物に再循環させる ことにより容易に行われた；この方法で１０⁶もの高いグリコレートオキシダー ゼに関する回転数が得られた。グリコレートオキシダーゼを急速に変性させずに （可溶性酵素を用いる場合に観察されるような）反応混合物を通して酸素を泡立 たせられることは、反応混合物を泡立てない場合の反応より少なくとも１０倍反 応速度を増加させ、この速度における増加はこの方法のための製造コストを有意 に低下させる。 反応で用いられるグリコレートオキシダーゼ活性（形質転換微生物全細胞とし て加えられる）は有効な濃度で、通常０．０１〜約１００ＩＵ／ｍｌ、好ましく は約０．１〜約１０ＩＵ／ｍｌの濃度で存在しなければならない。ＩＵ（国際単 位）は、１分当たりに１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量として定 義される。この酵素のアッセイ法はＩ．Ｚｅｌｉｔｃｈ ａｎｄ Ｓ．Ｏｃｈｏ ａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２０１，７０７−７１８（１９５３） に見いだされる。この方法は回収される、又は再循環されるグリコレートオキシ ダーゼの活性のアッセイにも用いられる。カタラーゼの濃度は１ｍＬの反応混合 物当たり５０〜１００，０００ＩＵ、好ましくは５００〜１４，０００ＩＵ／ｍ Ｌでなければならない。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ酵素の両方が 同じ微生物細胞内に存在するのが好ましい（添付の実施例の場合、Ａ．ニズラン ス、Ｈ．ポリモルファ、Ｐ．パストリス又はＥ．コリ）。細胞内における内因性 カタラーゼの濃度が生産される過酸化水素を有効に分解するために不十分である 場合（添付の実施例の場合のように）、追加のカタラーゼ源（例えば可溶性アス ペルギルス・ニゲルカタラーゼ、又はサッカロミセス・セレビシアエの全細胞） を加え、存在する内因性カタラーゼを補足することができる。さらにカタラーゼ 及びグリコレートオキシダーゼ濃度は、カタラーゼ対グリコレートオキシダーゼ の比率（それぞれに関してＩＵで測定される）が少なくとも約２５０：１となる ように上記の範囲内で調節されねばならない。フラビンモノヌクレオチド（ＦＭ Ｎ）は場合により加えられる成分であり、０．０〜２．０ｍＭ、好ましくは０． ０１〜０．２ｍＭの濃度で用いられる。 上記の有効な濃度範囲の観点から、本発明の改良法はこれらの作用性範囲にお いてグリコレートオキシダーゼ及び／又はカタラーゼを発現するすべての微生物 細胞触媒、すなわち全細胞触媒の利用を包含し、又、それを含むことが意図され ていることが認識されるべきである。かくして本発明の目的の場合、「微生物全 細胞触媒」という用語は、例えば実際に上記に示された有効な濃度範囲を与える 好ましい実施態様の遺伝子操作された形質転換微生物、ならびに強い発現能力の 天然の、又は突然変異微生物のいずれかの選択された株及び／又はそれらの混合 物を含むがそれらに限られるわけではない。 グリコール酸（２−ヒドロキシ酢酸）は商業的に入手可能である。本反応の場 合、その初期濃度は０．１０Ｍ〜２．０Ｍの範囲内、好ましくは０．２５Ｍ〜１ ．０Ｍである。それはそのままで、又はその適合性の塩、すなわち水溶性であり 、そのカチオンがグリコール酸のグリオキシル酸への所望の転化、又は続くグリ オキシル酸生成物とアミノメチルホスホン酸のＮ−（ホスホノメチル）グリシン を形成する反応と抵触しない塩として用いることができる。適した、及び適合性 の塩−形成カチオン基は試みることにより容易に決定される。代表的なそのよう な塩はアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、置換アンモニウム、ホ スホニウム及び置換ホスホニウム塩である。 グリコール酸のグリオキシル酸への転化は簡便に、及び好ましくは水性媒体中 で行われる。アミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）又はその適した塩は、０．０ １／１．０〜３．０／１．０、好ましくは０．２５／１．０〜１．０５／１．０ の範囲内のＡＭＰＡ／グリコール酸（出発量）のモル比を与えるように加えられ る。水溶液中でＡＭＰＡ及びグリコール酸を合わせた後、得られる混合物のｐＨ を６〜１０、好ましくは７．０〜８．５の値に調節する。このｐＨ範囲内で、ア ルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩及びリン酸塩を含む適合性の非抵触性塩 基の添加により正確な値を調節して所望のｐＨを得ることができる。反応が進行 すると共に反応混合物のｐＨはわずかに下がり、従って最大酵素活性のｐＨ範囲 の最高近辺、約９．０〜８．５で反応を開始し、反応の間にｐＨが下がるのを許 すのが多くの場合に有用である。酵素活性はｐＨと共に変化するので、場合によ り非抵触性無機又は有機緩衝液を別に添加することによりｐＨを保持することが できる。 グリコール酸及びグリオキシル酸は水中で高度に解離しており、７〜１０のｐ Ｈにおいては、実質的に完全にではないとしても大半がグリコレート及びグリオ キシレートイオンとして存在すると理解される。グリオキシル酸（及びその共役 塩基、グリオキシレートアニオン）は水和物、例えば（ＨＯ）₂ＣＨＣＯＯＨと して、及び／又はヘミアセタールＨＯＯＣＣＨ（ＯＨ）ＯＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨ としても存在し得、その組成物及び対応するそのアニオンは、Ｎ−（ホスホノメ チル）グリシン生成のための適した反応物であるという本目的に関してグリオキ シル酸及びそのアニオンと同等であることも当該技術分野における熟練者に認識 されるであろう。 グリコール酸のグリオキシル酸への添加のための酸化剤である酸素（Ｏ₂）は 気体として反応に、気−液界面において液体を撹乱することにより酸素に対して 透過性である膜を介して、又は反応混合物を通して酸素をスパージングする（泡 立てる）ことにより加えることができる。ほとんどの条件下で反応速度は、酸素 が水性媒体中に溶解できる速度により少なくとも部分的に制御されると思われる 。かくして酸素を空気として反応に加えることができるが、比較的純粋な形態の 酸素を用いる、及び高圧を用いることさえ好ましい。酸素圧の上限は未知である が、最高５０気圧の酸素圧を用いることができ、１５気圧の上限が好ましい。高 い酸素溶解（従って反応）速度を保持するために撹乱は重要である。撹拌などの いずれの簡単な形態の撹乱も用いることができる。 反応温度は反応速度及び酵素の安定性に影響を与える点で重要な変数である。 約０℃〜４０℃の反応温度を用いることができるが、好ましい反応温度は５℃〜 １５℃の範囲である。好ましい温度範囲における運転は反応の最後に回収される 酵素活性を最大にする。温度は水溶液が凍り始める程低くてはならない。温度は ジャケット付き反応容器を用い、ジャケットに適温の液体を通過させることによ るなどの通常の方法により制御することができるが、この方法に限られるわけで はない。反応容器は反応成分に不活性ないずれの材料からも構築することができ る。 反応溶液とＯ₂の接触の停止に続き、微生物細胞触媒をデカンテーション、濾 過又は遠心分離により取り出し、再利用することができる。場合により、溶液を 活性炭と接触させることによりフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を取り出す ことができる。グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸（対応するイミンと の平衡にあると思われる）を含有する 溶液を、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの生産に関する当該技術において既知 のいずれかの方法に従って処理する。 接触水添はグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸を含有する混合物から Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを製造するための好ましい方法である。この目 的に適した水素化触媒は種々の白金族金属、例えばイリジウム、オスミウム、ロ ジウム、ルテニウム、白金及びパラジウム；又、種々の他の遷移金属、例えばコ バルト、銅、ニッケル及び亜鉛を含む（がこれらに限られるわけではない）。触 媒は、例えばラネイニッケル又は酸化白金のように非担持であることができ；あ るいはそれは例えば炭素担持白金、アルミナ担持パラジウム又はキーゼルグール 担持ニッケルのように担持されていることができる。炭素担持パラジウム、キー ゼルグール担持ニッケル及びラネイニッケルが好ましい。水素化は４〜１１、好 ましくは５〜１０のｐＨにおいて行うことができる。水素化温度及び圧力は広く 変えることができる。温度は一般に０℃〜１５０℃、好ましくは２０℃〜９０℃ の範囲であり、Ｈ₂圧は一般に大体大気圧から約１００気圧、好ましくは１〜１ ０気圧の範囲内である。いずれの還元法が用いられても、発芽後除草剤として有 用なＮ−（ホスホノメチル）グリシンを当該技術分野において既知のいずれの回 収法によっても還元溶液から回収することができる。 本発明をさらに例示するのに役立つ以下の実施例において、グリオキシレート 、ホルメート及びオキザレートの収率、ならびにグリコレートの回収収率は、反 応の開始時に存在するグリコール酸の合計量に基づくパーセンテージである。反 応混合物の分析は高圧液体クロマトグラフィーを用いて行い：有機酸分析はＢｉ ｏ−Ｒａｄ ＨＰＸ−８７Ｈカラム を用いて行い、ＡＭＰＡ及びＮ−（ホスホノメチル）グリシンはＢｉｏ−Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓカラムを用いて分析 した。 形質転換微生物細胞は、磁気撹拌棒、ならびに２，６−ジクロロフェノール− インドフェノール（ＤＣＩＰ）に関して０．１２ｍＭ及びＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ ８．３）に関して８０ｍＭである２．０ｍＬの溶液を含有する３−ｍＬの石英の キュベット中に約５〜１０ｍｇの湿潤細胞を正確に量り込むことによりグリコレ ートオキシダーゼ活性に関してアッセイした。キュベットにゴムの隔壁で蓋をし 、窒素を５分間泡立てることにより溶液を脱酸素した。次いで４０μｌの１．０ Ｍグリコール酸／１．０Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．３）をシリンジによりキュベッ トに加え、混合物を撹拌しながら６０５ｎｍ（ε＝２２，０００）において時間 に伴う吸収の変化を測定した。 カタラーゼ活性は、磁気撹拌棒及び２．０ｍＬの蒸留水を含有する３−ｍＬの 石英のキュベット中に約２〜５ｍｇの湿潤細胞を正確に量り込み、次いで５０ｍ Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の５９ｍＭの過酸化水素を１．０ｍＬ加え 、２４０ｎｍ（ε＝３９．４）において時間に伴う吸収の変化を測定することに よりアッセイした。種々の培地中で培養されたＡ．ニズランス湿潤細胞（非透過 性化）のグリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ活性は、グリコレートオキシ ダーゼに関して１グラムの湿潤細胞当たり０．５〜４．０ＤＣＩＰ ＩＵ、なら びに内因性カタラーゼに関して１グラムの湿潤細胞当たり５００〜７０００ＩＵ の範囲であった。種々の培地中で培養されたＨ．ポリモルファ又はＰ．パストリ ス湿潤細胞（透過性化）のグリコレートオキシダーゼ及びカタ ラーゼ活性は、グリコレートオキシダーゼに関して１グラムの湿潤細胞当たり２ ０〜６０ＤＣＩＰ ＩＧ、ならびに内因性カタラーゼに関して１グラムの湿潤細 胞当たり３０，０００〜８０，０００ＩＵの範囲であった。 実施例１ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチル ホスホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及 びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで 調節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。次 いで反応器に２６ｇの凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニズランス ＦＴＩ７ ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（１２４ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び５７，８００ＩＵ カタラーゼ）及び１．０ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラー ゼ（Ｓｉｇｍａ）を加え、５℃において細胞を解凍し、得られる混合物のｐＨを ５０％ＮａＯＨで８．３に再調節した。この混合物を４００ｒｐｍ及び５℃にお いて、１２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立た せながら撹拌した。規則的な間隔で反応混合物の０．４０ｍＬのアリコートを採 取し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ“ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ”−ＭＣ１０，０００ＮＭＷＬ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを用いてアリコートを濾過し、濾液をＨＰＬＣにより 分析することにより反応を監視した。１０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及 び蟻酸の収率はそれぞれ９１％、０％及び７．９％であり、２．５％のグリコー ル酸が回収された。グリコレートオキシダーゼ及びアスペルギルス・ニゲルカタ ラーゼの最終的活性はそれらの初期値の１１％及び８７％であった。 実施例２（比較） アスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）の添加を省略する以 外は実施例１に記載の反応を繰り返した。２２時間後、グリオキシル酸、シュウ 酸及び蟻酸の収率はそれぞれ１．７％、０％及び８７．４％であり、グリコール 酸は完全に転化された。反応の最後にアスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７Ｓ ＹＣＳＬ／ＯＬ細胞中に検出可能なグリコレートオキシダーゼ又はカタラーゼ活 性はなかった。 実施例３ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０.５００Ｍ）、アミノメチル ホスホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及 びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで 調節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。次 いで反応器に２６ｇの凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７ ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（１２４ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び５７，８００ＩＵ カタラーゼ）及び５．６ｘ１０⁵単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラー ゼ（Ｓｉｇｍａ）を加え、５℃において細胞を解凍し、得られる混合物のｐＨを ５０％ＮａＯＨで８．３に再調節した。この混合物を４００ｒｐｍ及び５℃にお いて、１２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立た せながら撹拌した。１０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそ れぞれ８３％、０％及び９．４％であり、４．４％のグリコール酸が回収された 。グリコレートオキシダーゼ 及びアスペルギルス・ニゲルカタラーゼの最終的活性はそれらの初期値の１７％ 及び８８％であった。 実施例４ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器(Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ)に、グリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチル ホスホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及 びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで 調節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。次 いで反応器に１５ｇの凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７ ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（７２ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び３３，３００ＩＵカ タラーゼ）及び１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ （Ｓｉｇｍａ）を加え、５℃において細胞を解凍し、得られる混合物のｐＨを５ ０％ＮａＯＨで８．３に再調節した。この混合物を４００ｒｐｍ及び５℃におい て、１２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立たせ ながら撹拌した。１７時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれ ぞれ７６％、０％及び４．１％であり、１６．８％のグリコール酸が回収された 。グリコレートオキシダーゼ及びアスペルギルス・ニゲルカタラーゼの最終的活 性はそれらの初期値の７％及び４９％であった。 実施例５ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸(０．５００Ｍ)、アミノメチルホ スホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、 ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８． ３（５０％ＮａＯＨで調節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液 を５℃に冷却した。凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７Ｓ ＹＣＳＬ／ＯＬ（２６ｇ）１２４ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び５７，８０ ０ＩＵカタラーゼ）を５℃で解凍し、次いで５℃において２ｘ１００ｍＬのＫＨ₂ ＰＯ₄（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）／ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）緩衝液で洗浄し、洗 浄された細胞を１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ （Ｓｉｇｍａ）と共に反応器に加えた。得られる混合物のｐＨを５０％ＮａＯＨ で８．３に再調節し、４００ｒｐｍ及び５℃において、１２０ｐｓｉｇの酸素下 で、５０ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立たせながら撹拌した。１１．５時 間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ９４％、３．５％及 び２．７％であり、１．３％のグリコール酸が回収された。グリコレートオキシ ダーゼ及びアスペルギルス・ニゲルカタラーゼの最終的活性はそれらの初期値の ７％及び７７％であった。 実施例６ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸(０．５００Ｍ)、アミノメチルホ スホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及び フラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調 節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。新し く収穫されたアスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（３７ｇ 、４４ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び５７，８００ＩＵカタラーゼ）を５℃ において４ｘ １００ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）／ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）緩 衝液で洗浄し、洗浄された細胞を１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル 可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）と共に反応器に加えた。得られる混合物のｐＨ を５０％ＮａＯＨで８．３に再調節し、次いで４００ｒｐｍ及び５℃において、 １２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立たせなが ら撹拌した。１５時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ ８４％、０％及び９．４％であり、６．４％のグリコール酸が回収された。 反応の完了時に反応混合物を５℃において遠心分離し、上澄み液をデカンテー ションした。得られるアスペルギルス・ニズランス細胞のペレットを１００ｍＬ の新しい反応混合物に５℃において再懸濁させ、上記の条件と同じ条件下で反応 を繰り返した。２５時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞ れ５９％、１．１％及び１．６％であり、４３％のグリコール酸が回収された。 この時点における細胞中のグリコレートオキシダーゼのアッセイは残留活性がな いことを示した。 実施例７ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸(０．５００Ｍ)、アミノメチルホ スホン酸（０．３７５Ｍ）、フラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）を含有 し、ＨＰＬＣ内部標準が加えられていない１００ｍＬの溶液（ｐＨ８．３、５０ ％ＮａＯＨで調節）を装填し、溶液を５℃に冷却した。凍結（−８０℃）アスペ ルギルス・ニズランス ＦＴ１７ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（２６ｇ）１２４ＩＵグリコ レートオキシダーゼ及び５７，８００ＩＵカタラーゼ）を５℃において解凍し、 次いで５℃ において４ｘ１００ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）／ＦＭＮ（０． ０１ｍＭ）緩衝液で洗浄し、洗浄された細胞を１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギ ルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）と共に反応器に加えた。得られる 混合物を４００ｒｐｍ及び５℃において、１２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ ／分で混合物を通して酸素を泡立たせながら撹拌した。１１時間後、グリオキシ ル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ８９％、４．５％及び２．０％であり 、グリコール酸は完全に転化された。 実施例８ ３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｒｔｅｒガラスエアゾール反応容器中に磁気 撹拌棒、ならびにグリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（０ ．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノ ヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調節）において 含有する１０ｍＬの水溶液を入れ、溶液を５℃に冷却した。次いで容器に、０． １％“ＴＲＩＴＯＮ”Ｘ−１００／ｌ凍結−解凍で処理することにより透過性化 された０．４７ｇの形質転換ハンセヌラ・ポリモルファＧＯ１（１０ＩＵグリコ レートオキシダーゼ及び２２，１００ＩＵカタラーゼ）、及び１．４ｘ１０⁶単 位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を加えた。得られ る混合物のｐＨを５０％ＮａＯＨを用いて８．３に再調節し、次いで反応容器を 密閉し、反応混合物を５℃に冷却した。撹拌しながら５回、７０ｐｓｉｇに加圧 し大気圧に排気することにより容器に酸素をフラッシし、次いで容器を７０ｐｓ ｉｇの酸素まで加圧し、混合物を５℃で撹拌した。反応の進行を監視するための ＨＰＬＣによる分析のために、 規則的な間隔で試料採取口を介し、シリンジにより（容器中の圧力の損失なしで ）アリコート（０．１０ｍＬ）を取り出した。１６時間後、グリオキシレート、 ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ９０．１％、１．３％及 び５．９％であり、３．０％のグルコースが残った。残留グリコレートオキシダ ーゼ活性及び合計カタラーゼ活性はそれらの初期値のそれぞれ８６％及び１３６ ％であった。 実施例９（比較） １．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ ）の添加を省略する以外は実施例８における反応を繰り返した。１６時間後、グ リオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ５７． ６％、３２．５％及び２．６％であり、８．９％のグルコースが残った。グリコ レートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留透過性化細胞活性はそれらの初期値の それぞれ６０％及び３７８％であった。 実施例１０（比較） １．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ ）の添加を、１．４ｘ１０⁶単位のカタラーゼ活性を有する１．６７ｇの透過性 化（０．１％“ＴＲＩＴＯＮ”Ｘ−１００／ｌ凍結−解凍）サッカロミセス・セ レビシアエ細胞に置換する以外は実施例８における反応を繰り返した。１６時間 後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ ６７．２％、１９．７％及び６．０％であり、グリコレートは残留しなかった。 実施例１１ ３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｒｔｅｒガラスエアゾール反応容器 中に磁気撹拌棒、ならびにグリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホ ン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラ ビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調節） において含有する１０ｍＬの水溶液を入れ、溶液を５℃に冷却した。次いで容器 に、０．１％“ＴＲＩＴＯＮ”Ｘ−１００／ｌ凍結解凍で処理することにより透 過性化された０．７５ｇの形質転換ピチア・パストリスＧＳ１１５−ＭＳＰ１０ （１３．２ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び２１，２００ＩＵカタラーゼ）を 加えた。得られる混合物のｐＨを５０％ＮａＯＨを用いて８．３に再調節し、次 いで反応容器を密閉し、反応混合物を５℃に冷却した。撹拌しながら５回、７０ ｐｓｉｇに加圧し大気圧に排気することにより容器に酸素をフラッシし、次いで 容器を７０ｐｓｉｇの酸素まで加圧し、混合物を５℃で撹拌した。反応の進行を 監視するためのＨＰＬＣによる分析のために、規則的な間隔で試料採取口を介し 、シリンジにより（容器中の圧力の損失なしで）アリコート（０．１０ｍＬ）を 取り出した。１６時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨ ＰＬＣ収率はそれぞれ３０．５％、５９．２％及び１０．７％であり、０．８％ のグルコースが残った。 実施例１２ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｍａｘ Ｉｍｐｅｌｌｅｒが備えられた３００−ｍＬのＥＺ Ｅ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅ ｒｓ）に、グリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（０．３７ ５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノヌクレ オチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８． ３（５０％ＮａＯＨで調節）で含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃ に冷却した。次いで０．１％“ＴＲＩＴＯＮ”Ｘ−１００／ｌ凍結−解凍で処理 することにより透過性化された１０ｇの形質転換ピチア・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−２１００１（３９１ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び４５７，０００ＩＵ カタラーゼ）、ならびに１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カ タラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を容器に加えた。得られる混合物のｐＨを５０％ＮａＯ Ｈを用いて８．３に再調節した。この混合物を１０００ｒｐｍ及び５℃において 、１２０ｐｓｉｇの酸素下で撹拌し、それはタービン羽根車の作用を介して混合 物を通して酸素を泡立てた。規則的な間隔で反応混合物の０．４０ｍＬのアリコ ートを採取し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ“ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ”−ＭＣ１０，０００ ＮＭＷＬ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを用いてアリコートを濾過し、濾液をＨＰＬ Ｃにより分析することにより反応を監視した。１時間後、グリオキシル酸、シュ ウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ８９．８％、６．０％及び２．９％であり、１． ７％のグリコール酸が回収された。透過性化細胞のグリコレートオキシダーゼ及 びカタラーゼの最終的活性はそれらの初期値の１１７％及び７８％であった。 微生物細胞触媒を上記の反応混合物から遠心分離により回収した。さらに処理 することなく、細胞ペレットを１００ｍＬの新しい反応混合物及び追加の１．４ ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼと混合し、反応を繰り 返した。１．０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ８ ７．８％、５．０％及び５．３％であり、２．９％のグリコール酸が回収された 。透過性化−細胞グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの最終的活性はそれ らの初期値の１７２ ％及び６１％であった。 実施例１３ 実施例２に記載の反応を介して生産されるグリオキシル酸及びＡＭＰＡの混合 物を遠心分離してアスペルギルス・ニズランス全細胞触媒を除去し、次いでＡｍ ｉｃｏｎ“ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ”１０濃縮器（１０，０００分子量カットオフ ）を用いて濾過し、可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼを除去した。得ら れる溶液を活性炭（０．５０ｇ）と共に撹拌し、ＦＭＮを除去し、濾過し、３０ ０ｍＬ、３１６ＳＳカップのＡｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ ＥＺＥ −Ｓｅａｌ反応器に、０．５０ｇの活性炭担持１０％Ｐｄと共に入れた。反応器 に窒素をフラッシし、次いで３００ｐｓｉｇにおいて水素を装填し、１０００ｒ ｐｍ及び２７℃において撹拌した。２２時間後、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシ ンの収率（ＡＭＰＡに基づく）は８０％であった。 実施例１４ 実施例４に記載の反応を介して生産されるグリオキシル酸及びＡＭＰＡの混合 物を遠心分離してアスペルギルス・ニズランス全細胞触媒を除去し、次いでＡｍ ｉｃｏｎ“ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ”１０濃縮器（１０，０００分子量カットオフ ）を用いて濾過し、可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼを除去した。得ら れる溶液を活性炭（０．５０ｇ）と共に撹拌し、ＦＭＮを除去し、濾過し、３０ ０ｍＬ、３１６ＳＳカップのＡｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ ＥＺＥ −Ｓｅａｌ反応器に、０．５０ｇの活性炭担持１０％Ｐｄと共に入れた。反応器 に窒素をフラッシし、次いで３００ｐｓｉｇにおいて水素を装填し、１０００ｒ ｐｍ及び２７℃において撹拌した。２２時間後、Ｎ−（ホスホノメチル）グリ シンの収率（ＡＭＰＡに基づく）は８９％であった。 実施例１５ 実施例６に記載の反応を介して生産されるグリオキシル酸及びＡＭＰＡの混合 物を遠心分離してアスペルギルス・ニズランス全細胞触媒を除去し、次いでＡｍ ｉｃｏｎ“ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ”１０濃縮器（１０，０００分子量カットオフ ）を用いて濾過し、可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼを除去した。得ら れる溶液を活性炭（０．５０ｇ）と共に撹拌し、ＦＭＮを除去し、濾過し、３０ ０ｍＬのガラスライナー（ｇｌａｓｓ Ｉｉｎｅｒ）に、０．５０ｇの活性炭担 持１０％Ｐｄと共に入れた。ガラスライナーをオートクレーブにおいて密閉し、 窒素をフラッシし、次いで１０００ｐｓｉｇにおいて水素を装填し、２７℃にお いて揺動することにより混合した。１１時間後、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシ ンの収率（ＡＭＰＡに基づく）は７６％であった。 実施例１６ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｍａｘ Ｉｍｐｅｌｌｅｒが備えられた３００ＭＬのＥＺＥ −Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｓ）に、グリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（０．３７５ Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ）、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノヌクレ オチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調節）で含有する１０ ０ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。次いで３０ｇの形質転換Ｅ．コ リ（２５．２ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び３９，９００ＩＵカタラーゼ） を容器に加え、混合物を１０００ｒｐｍ及び５℃において、１２０ｐｓｉｇの酸 素下で撹拌し、それはタービン羽根車の作用を介して混合物を通して酸 素を泡立てた。規則的な間隔で反応混合物の０．４０ｍＬのアリコートを採取し 、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ“ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ”−ＭＣ１０，０００ＮＭＷＬ Ｆ ｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを用いてアリコートを濾過し、濾液をＨＰＬＣにより分析 することにより反応を監視した。１９時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻 酸の収率はそれぞれ８．６％、８．３％及び１．１％であり、５７．３％のグリ コール酸が残った。微生物グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの回収活性 はそれらの初期値のそれぞれ１０％及び６８％であった。 実施例１７ より高いグリコレートオキシダーゼ活性（７２ＩＵグリコレートオキシダーゼ 及び２９．６００ＩＵカタラーゼ）を有する３０ｇの第２の増殖の形質転換Ｅ． コリを用いて実施例１６に記載の反応を繰り返した。２３時間後、グリオキシル 酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ１８．３％、１．９％及び２．９％であ り、４２．６％のグリコール酸が残った。微生物グリコレートオキシダーゼ及び カタラーゼの回収活性はそれらの初期値のそれぞれ１８％及び７１％であった。 かくして本発明をある程度の特殊性を以て説明し、例示してきたが、以下の請 求の範囲はそのように制限されるべきではなく、請求の範囲の各要素の表現及び それらの同等事項と釣り合った範囲が与えられるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年５月２２日 【補正内容】 第２の関連特許出願、１９９３年７月１日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／０８５ ，４８８、“Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”（ ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７０８１，ＷＯ９５／０１４４４）は、当該技術分野にお ける熟練者に通常既知である遺伝子操作法を用いた、内因性カタラーゼと共にホ ウレンソウからのグリコレートオキシダーゼを発現するアスペルギルス・ニズラ ンスのいくつかの形質転換体の構築を記載した。本発明における、グリオキシル 酸／アミノメチルホスホン酸混合物の生産のための可溶性酵素の利用を越えるこ れらの全−細胞触媒の利用の場合のいくつかの利点は： （１）全−触媒触媒は反応の終結時に反応混合物から、再利用のために容易に 回収されるが、可溶性酵素は非常な困難及び活性の損失を伴ってしか回収されな い； （２）それらは、可溶性酵素に対して得られる触媒回転数に関して、ならびに 反応の終結時における回収酵素活性に関しての両方で可溶性酵素より安定である ；ならびに （３）最も重要なことに、それらは酸素又は酸素−含有気体が酸素溶解の速度 及び反応速度を増すために反応混合物に散布される反応条件に対して安定であり 、類似の反応条件下で可溶性グリコレートオキシダーゼは急速に変性する。 形質転換アスペルギルス・ニズランスは、最初にグリコレートオキシダーゼを コードするホウレンソウの遺伝子をクローニングし、次いでこの遺伝子を、すで に内因性カタラーゼを生産するアスペルギルス・ニズランスの株中に導入するこ とにより製造された。得られる形質転換体は震盪フラスコ又は発酵器中の最少培 地又はＳＹＧ濃厚培地中で培養され、 さらにグリコレートオキシダーゼ及び／又はカタラーゼの発現量を増すためにオ レイン酸（ＯＬ）、ヒドロキシ酢酸（ＨＡ）又はコーン浸漬液などの種々の試薬 が培地に加えられる。次いで種々の形質転換体が、カタラーゼ及びグリコレート オキシダーゼ活性に関して全細胞（未処理）をアッセイし、グリコール酸のグリ オキシル酸への酸化のための触媒として細胞を用いた反応を行うことによりスク リーニングされる。 グリコール酸のグリオキシル酸への酸化のための触媒として用いられる場合、 アスペルギルス・ニズランス細胞は予備処理されないか、又は細胞の内部におけ る酵素への反応混合物の接近性を増すために透過性化され；細胞の透過性化のい くらかはおそらく反応混合物又はその成分のいずれかへの暴露から、あるいは必 要になるまで全細胞触媒を保存するために用いられた凍結及び解凍により行うこ とができる。 種々の培地中で培養されたＨ．ポリモルファ又はＰ．パストリス湿潤細胞（透過 性化）のグリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ活性は、グリコレートオキシ ダーゼに関して１グラムの湿潤細胞当たり２０〜６０ＤＣＩＰ ＩＧ、ならびに 内因性カタラーゼに関して１グラムの湿潤細胞当たり３０，０００〜８０，００ ０ＩＵの範囲であった。 実施例１ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチル ホスホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及 びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで 調節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。次 いで反応器に２６ｇの凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７ ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（１２４ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び５７，８００ＩＵ カタラーゼ）及び１．０ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラー ゼ（Ｓｉｇｍａ）を加え、５℃において細胞を解凍し、得られる混合物のｐＨを ５０％ＮａＯＨで８．３に再調節した。この混合物を４００ｒｐｍ及び５℃にお いて、１２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立た せながら撹拌した。規則的な間隔で反応混合物の０．４０ｍＬのアリコートを採 取し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ“ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ”−ＭＣ１０，０００ＮＭＷＬ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを用いてアリコートを濾過し、濾液をＨＰＬＣにより 分析することにより反応を監視した。１０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及 び蟻酸の収率はそれぞれ９１％、０％及び７．９％であり、２．５％のグリコー ル酸が回 収された。グリコレートオキシダーゼ及びアスペルギルス・ニゲルカタラーゼの 最終的活性はそれらの初期値の１１％及び８７％であった。 実施例２（比較） アスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）の添加を省略する以 外は実施例１に記載の反応を繰り返した。２２時間後、グリオキシル酸、シュウ 酸及び蟻酸の収率はそれぞれ１．７％、０％及び８７．４％であり、グリコール 酸は完全に転化された。反応の最後にアスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７Ｓ ＹＣＳＬ／ＯＬ細胞中に検出可能なグリコレートオキシダーゼ又はカタラーゼ活 性はなかった。 実施例３ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチル ホスホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及 びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで 調節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。次 いで反応器に２６ｇの凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７ ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（１２４ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び５７，８００ＩＵ カタラーゼ）及び５．６ｘ１０⁵単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラー ゼ（Ｓｉｇｍａ）を加え、５℃において細胞を解凍し、得られる混合物のｐＨを ５０％ＮａＯＨで８．３に再調節した。この混合物を４００ｒｐｍ及び５℃にお いて、１２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立た せながら撹拌した。１０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそ れぞれ８３％、０％及び９．４％であり、 ４．４％のグリコール酸が回収された。グリコレートオキシダーゼ及びアスペル ギルス・ニゲルカタラーゼの最終的活性はそれらの初期値の１７％及び８８％で あった。 実施例４ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチル ホスホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及 びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで 調節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。次 いで反応器に１５ｇの凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７ ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（７２ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び３３，３００ＩＵカ タラーゼ）及び１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ （Ｓｉｇｍａ）を加え、５℃において細胞を解凍し、得られる混合物のｐＨを５ ０％ＮａＯＨで８．３に再調節した。この混合物を４００ｒｐｍ及び５℃におい て、１２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立たせ ながら撹拌した。１７時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれ ぞれ７６％、０％及び４．１％であり、１６．８％のグリコール酸が回収された 。グリコレートオキシダーゼ及びアスペルギルス・ニゲルカタラーゼの最終的活 性はそれらの初期値の７％及び４９％であった。 実施例５ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸(０．５００Ｍ)、 アミノメチルホスホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ 内部標準）及びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０ ％ＮａＯＨで調節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に 冷却した。凍結（−８０℃）アスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７ＳＹＣＳＬ ／ＯＬ（２６ｇ、１２４ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び５７，８００ＩＵカ タラーゼ）を５℃で解凍し、次いで５℃において２ｘ１００ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄（ ５０ｍＭ、ｐＨ７．０）／ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）緩衝液で洗浄し、洗浄された 細胞を１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇ ｍａ）と共に反応器に加えた。得られる混合物のｐＨを５０％ＮａＯＨで８．３ に再調節し、４００ｒｐｍ及び５℃において、１２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立たせながら撹拌した。１１．５時間後、グ リオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ９４％、３．５％及び２．７ ％であり、１．３％のグリコール酸が回収された。グリコレートオキシダーゼ及 びアスペルギルス・ニゲルカタラーゼの最終的活性はそれらの初期値の７％及び ７７％であった。 実施例６ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸(０．５００Ｍ)、アミノメチルホ スホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及び フラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調 節）において含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。新し く収穫されたアスペルギルス・ニズランス ＦＴ１７ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（３７ｇ 、４４ＩＵグリコレー トオキシダーゼ及び５７，８００ＩＵカタラーゼ）を５℃において４ｘ１００ｍ ＬのＫＨ₂ＰＯ₄（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）／ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）緩衝液で洗 浄し、洗浄された細胞を１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カ タラーゼ（Ｓｉｇｍａ）と共に反応器に加えた。得られる混合物のｐＨを５０％ ＮａＯＨで８．３に再調節し、次いで４００ｒｐｍ及び５℃において、１２０ｐ ｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ／分で混合物を通して酸素を泡立たせながら撹拌し た。１５時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ８４％、 ０％及び９．４％であり、６．４％のグリコール酸が回収された。 反応の完了時に反応混合物を５℃において遠心分離し、上澄み液をデカンテー ションした。得られるアスペルギルス・ニズランス細胞のペレットを１００ｍＬ の新しい反応混合物に５℃において再懸濁させ、上記の条件と同じ条件下で反応 を繰り返した。２５時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞ れ５９％、１．１％及び１．６％であり、４３％のグリコール酸が回収された。 この時点における細胞中のグリコレートオキシダーゼのアッセイは残留活性がな いことを示した。 実施例７ ３００−ｍＬのＥＺＥ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａ ｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ）に、グリコール酸(０．５００Ｍ)、アミノメチルホ スホン酸（０．３７５Ｍ）、フラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）を含有 し、ＨＰＬＣ内部標準が加えられていない１００ｍＬの溶液（ｐＨ８．３、５０ ％ＮａＯＨで調節）を装填し、溶液を５℃に冷却した。凍結（−８０℃）アスペ ルギルス・ニズランス ＦＴ１７ＳＹＣＳＬ／ＯＬ（２６ｇ、１２４ＩＵグリコ レートオキシダーゼ 及び５７，８００ＩＵカタラーゼ）を５℃において解凍し、次いで５℃において ４ｘ１００ｍＬのＫＨ₂ＰＯ₄（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）／ＦＭＮ（０．０１ｍＭ ）緩衝液で洗浄し、洗浄された細胞を１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニ ゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）と共に反応器に加えた。得られる混合物を ４００ｒｐｍ及び５℃において、１２０ｐｓｉｇの酸素下で、５０ｍＬ／分で混 合物を通して酸素を泡立たせながら撹拌した。１１時間後、グリオキシル酸、シ ュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ８９％、４．５％及び２．０％であり、グリコ ール酸は完全に転化された。 実施例８ ３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｒｔｅｒガラスエアゾール反応容器中に磁気 撹拌棒、ならびにグリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（０ ．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノ ヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調節）において 含有する１０ｍＬの水溶液を入れ、溶液を５℃に冷却した。次いで容器に、０． １％“ＴＲＩＴＯＮ”Ｘ−１００／ｌ凍結一解凍で処理することにより透過性化 された０．４７ｇの形質転換ハンセヌラ・ポリモルファＧＯ１（１０ＩＵグリコ レートオキシダーゼ及び２２，１００ＩＵカタラーゼ）、及び１．４ｘ１０⁶単 位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を加えた。得られ る混合物のｐＨを５０％ＮａＯＨを用いて８．３に再調節し、次いで反応容器を 密閉し、反応混合物を５℃に冷却した。撹拌しながら５回、７０ｐｓｉｇに加圧 し大気圧に排気することにより容器に酸素をフラッシし、次いで容器を７０ｐｓ ｉｇの酸素まで加圧し、混合物を５℃ で撹拌した。反応の進行を監視するためのＨＰＬＣによる分析のために、規則的 な間隔で試料採取口を介し、シリンジにより（容器中の圧力の損失なしで）アリ コート（０．１０ｍＬ）を取り出した。１６時間後、グリオキシレート、ホルメ ート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ９０．１％、１．３％及び５． ９％であり、３．０％のグルコースが残った。残留グリコレートオキシダーゼ活 性及び合計カタラーゼ活性はそれらの初期値のそれぞれ８６％及び１３６％であ った。 実施例９（比較） １．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ ）の添加を省略する以外は実施例８における反応を繰り返した。１６時間後、グ リオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ５７． ６％、３２．５％及び２．６％であり、８．９％のグルコースが残った。グリコ レートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留透過性化細胞活性はそれらの初期値の それぞれ６０％及び３７８％であった。 実施例１０（比較） １．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ ）の添加を、１．４ｘ１０⁶単位のカタラーゼ活性を有する１．６７ｇの透過性 化（０．１％“ＴＲＩＴＯＮ”Ｘ−１００／ｌ凍結−解凍）サッカロミセス・セ レビシアエ細胞に置換する以外は実施例８における反応を繰り返した。１６時間 後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ ６７．２％、１９．７％及び６．０％であり、グリコレートは残留しなかった。 実施例１１ ３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｒｔｅｒガラスエアゾール反応容器中に磁気 撹拌棒、ならびにグリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（０ ．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノ ヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調節）において 含有する１０ｍＬの水溶液を入れ、溶液を５℃に冷却した。次いで容器に、０． １％“ＴＲＩＴＯＮ”Ｘ−１００／ｌ凍結解凍で処理することにより透過性化さ れた０．７５ｇの形質転換ピチア・パストリスＧＳ１１５−ＭＳＰ１０（１３． ２ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び２１，２００ＩＵカタラーゼ）を加えた。 得られる混合物のｐＨを５０％ＮａＯＨを用いて８．３に再調節し、次いで反応 容器を密閉し、反応混合物を５℃に冷却した。撹拌しながら５回、７０ｐｓｉｇ に加圧し大気圧に排気することにより容器に酸素をフラッシし、次いで容器を７ ０ｐｓｉｇの酸素まで加圧し、混合物を５℃で撹拌した。反応の進行を監視する ためのＨＰＬＣによる分析のために、規則的な間隔で試料採取口を介し、シリン ジにより（容器中の圧力の損失なしで）アリコート（０．１０ｍＬ）を取り出し た。１６時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収 率はそれぞれ３０．５％、５９．２％及び１０．７％であり、０．８％のグルコ ースが残った。 実施例１２ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｍａｘ Ｉｍｐｅｌｌｅｒが備えられた３００−ｍＬのＥＺ Ｅ−Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅ ｒｓ）に、グリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（０．３７ ５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ 内部標準）及びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０ ％ＮａＯＨで調節）で含有する１００ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却し た。次いで０．１％“ＴＲＩＴＯＮ”Ｘ−１００／ｌ凍結−解凍で処理すること により透過性化された１０ｇの形質転換ピチア・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−２１ ００１（３９１ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び４５７，０００ＩＵカタラー ゼ）、ならびに１．４ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼ （Ｓｉｇｍａ）を容器に加えた。得られる混合物のｐＨを５０％ＮａＯＨを用い て８．３に再調節した。この混合物を１０００ｒｐｍ及び５℃において、１２０ ｐｓｉｇの酸素下で撹拌し、それはタービン羽根車の作用を介して混合物を通し て酸素を泡立てた。規則的な間隔で反応混合物の０．４０ｍＬのアリコートを採 取し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ“ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ”−ＭＣ１０，０００ＮＭＷＬ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔを用いてアリコートを濾過し、濾液をＨＰＬＣにより 分析することにより反応を監視した。１時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び 蟻酸の収率はそれぞれ８９．８％、６．０％及び２．９％であり、１．７％のグ リコール酸が回収された。透過性化細胞のグリコレートオキシダーゼ及びカタラ ーゼの最終的活性はそれらの初期値の１１７％及び７８％であった。 微生物細胞触媒を上記の反応混合物から遠心分離により回収した。さらに処理 することなく、細胞ペレットを１００ｍＬの新しい反応混合物及び追加の１．４ ｘ１０⁶単位のアスペルギルス・ニゲル可溶性カタラーゼと混合し、反応を繰り 返した。１．０時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ８ ７．８％、５．０％及び５．３％であり、２．９％のグリコール酸が回収された 。透過性化−細胞グリコレー トオキシダーゼ及びカタラーゼの最終的活性はそれらの初期値の１７２％及び６ １％であった。 実施例１３ 実施例２に記載の反応を介して生産されるグリオキシル酸及びＡＭＰＡの混合 物を遠心分離してアスペルギルス・ニズランス全細胞触媒を除去し、次いでＡｍ ｉｃｏｎ“ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ”１０濃縮器（１０，０００分子量カットオフ ）を用いて濾過し、可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼを除去した。得ら れる溶液を活性炭（０．５０ｇ）と共に撹拌し、ＦＭＮを除去し、濾過し、３０ ０ｍＬ、３１６ＳＳカップのＡｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ ＥＺＥ −Ｓｅａｌ反応器に、０．５０ｇの活性炭担持１０％Ｐｄと共に入れた。反応器 に窒素をフラッシし、次いで３００ｐｓｉｇにおいて水素を装填し、１０００ｒ ｐｍ及び２７℃において撹拌した。２２時間後、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシ ンの収率（ＡＭＰＡに基づく）は８０％であった。 実施例１４ 実施例４に記載の反応を介して生産されるグリオキシル酸及びＡＭＰＡの混合 物を遠心分離してアスペルギルス・ニズランス全細胞触媒を除去し、次いでＡｍ ｉｃｏｎ“ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ”１０濃縮器（１０，０００分子量カットオフ ）を用いて濾過し、可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼを除去した。得ら れる溶液を活性炭（０．５０ｇ）と共に撹拌し、ＦＭＮを除去し、濾過し、３０ ０ｍＬ、３１６ＳＳカップのＡｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ ＥＺＥ −Ｓｅａｌ反応器に、０．５０ｇの活性炭担持１０％Ｐｄと共に入れた。反応器 に窒素をフラッシし、次いで３００ｐｓｉｇにおいて水素を装填し、１０００ｒ ｐｍ及 び２７℃において撹拌した。２２時間後、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの収 率（ＡＭＰＡに基づく）は８９％であった。 実施例１５ 実施例６に記載の反応を介して生産されるグリオキシル酸及びＡＭＰＡの混合 物を遠心分離してアスペルギルス・ニズランス全細胞触媒を除去し、次いでＡｍ ｉｃｏｎ“ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ”１０濃縮器（１０，０００分子量カットオフ ）を用いて濾過し、可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼを除去した。得ら れる溶液を活性炭（０．５０ｇ）と共に撹拌し、ＦＭＮを除去し、濾過し、３０ ０ｍＬのガラスライナー（ｇｌａｓｓ ｌｉｎｅｒ）に、０．５０ｇの活性炭担 持１０％Ｐｄと共に入れた。ガラスライナーをオートクレーブにおいて密閉し、 窒素をフラッシし、次いで１０００ｐｓｉｇにおいて水素を装填し、２７℃にお いて揺動することにより混合した。１１時間後、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシ ンの収率（ＡＭＰＡに基づく）は７６％であった。 実施例１６ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｍａｘ Ｉｍｐｅｌｌｅｒが備えられた３００ＭＬのＥＺＥ −Ｓｅａｌ撹拌オートクレーブ反応器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｓ）に、グリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（０．３７５ Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ）、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノヌクレ オチド（０．０１ｍＭ）をｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調節）で含有する１０ ０ｍＬの溶液を装填し、溶液を５℃に冷却した。次いで３０ｇの形質転換Ｅ．コ リ（２５．２ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び３９，９００ＩＵカタラーゼ） を容器に加え、混合物を１０００ｒｐｍ及び５℃において、１２０ｐｓｉｇの酸 素下で撹拌し、それはタービン羽根車の作用を介して混合物を通して酸素を泡立 てた。規則的な間隔で反応混合物の０．４０ｍＬのアリコートを採取し、Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ“ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ”−ＭＣ１０，０００ＮＭＷＬ Ｆｉｌｔｅ ｒ Ｕｎｉｔを用いてアリコートを濾過し、濾液をＨＰＬＣにより分析すること により反応を監視した。１９時間後、グリオキシル酸、シュウ酸及び蟻酸の収率 はそれぞれ８．６％、８．３％及び１．１％であり、５７．３％のグリコール酸 が残った。微生物グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの回収活性はそれら の初期値のそれぞれ１０％及び６８％であった。 実施例１７ より高いグリコレートオキシダーゼ活性（７２ＩＵグリコレートオキシダーゼ 及び２９．６００ＩＵカタラーゼ）を有する３０ｇの第２の増殖の形質転換Ｅ． コリを用いて実施例１６に記載の反応を繰り返した。２３時間後、グリオキシル 酸、シュウ酸及び蟻酸の収率はそれぞれ１８．３％、１．９％及び２．９％であ り、４２．６％のグリコール酸が残った。微生物グリコレートオキシダーゼ及び カタラーゼの回収活性はそれらの初期値のそれぞれ１８％及び７１％であった。 請求の範囲 １．アミノメチルホスホン酸ならびに酵素グリコレートオキシダーゼ及びカタ ラーゼを含有する水溶液中で酸素を用いてグリコール酸を酸化する段階を含み、 ここで改良が （ａ）水溶液中の酸素をスパージングし； （ｂ）混合物に、グリコレートオキシダーゼを発現する形質転換微生物細胞の 形態で触媒を加え、微生物細胞触媒はアスペルギルス・ニズランス（Aspergillu s nidulans）の形質転換体、エシェリキア・コリ（Esherichia coli）の形質転 換体、ＮＲＲＬ−Ｙ−２１００１と指定されたピチア・パストリス（Pichia pas toris）の形質転換体ＧＳ１１５−ＭＳＰ１０及びＮＲＲＬ−Ｙ−２１０６５と 指定されたハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）の形質転換体Ｇ ０１から成る群より選ばれる ことを含むグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸の混合物の製造法。 ２．該微生物細胞触媒が内因性カタラーゼも発現する請求の範囲第１項の方法 。 ３．混合物への可溶性カタラーゼの添加をさらに含む請求の範囲第１項の方法 。 ４．該形質転換微生物細胞がＮＲＲＬ−２１０００と指定されたアスペルギル ス・ニズランスＴ１７である請求の範囲第１項の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:84） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノメチルホスホン酸ならびに酵素グリコレートオキシダーゼ及びカタ ラーゼの存在下に、水溶液中で酸素を用いてグリコール酸を酸化する段階を含み 、ここで改良がグリコレートオキシダーゼを発現する微生物細胞触媒の使用を含 むグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸の混合物の製造法。 ２．該微生物細胞触媒が内因性カタラーゼも発現する請求の範囲第１項の方法 。 ３．可溶性カタラーゼも用いられる請求の範囲第２項の方法。 ４．該微生物細胞触媒がアスペルギルス(Aspergillus)、ハンセヌラ(Hansenul a)及びピチア(Pichia)から成る群より選ばれる請求の範囲第１項の方法。 ５．該微生物細胞触媒がピチア・パストリス(Pichia Pastoris)である請求の 範囲第１項の方法。 ６．該微生物細胞触媒がハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)で ある請求の範囲第１項の方法。 ７．該微生物細胞触媒がアスペルギルス・ニズランス(Aspergillus nidulans) である請求の範囲第１項の方法。 ８．該微生物細胞触媒がエシェリキア・コリ(Escherichia coli)である請求の 範囲第１項の方法。