JPH10502623A - Ｏ−グリコシル化真正ｉｇｆ−ｉおよびその切断変種、その製造方法、並びに医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個もしくはそれ以上のマンノース残基を有する或いは切断された切断ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース残基を有するＯ−グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉに関するものである。本発明によるＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉは実質的にインシュリンリセプタ親和性を持たず、治療処置に使用するのに価値がある。さらに本発明は、酵母細胞にてＩＧＦ−Ｉを発現させると共に培地から本発明のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉを分離することにより上記ＩＧＦ−Ｉを得る方法、およびこれらＩＧＦ−１を医薬上許容しうるキャリヤ、希釈剤もしくは賦形薬と共に含有する医薬組成物にも関するものである。さらに、たとえば成長不全およびインシュリン耐性状態を処置する薬剤を製造する際のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉの使用にも関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｏ−グリコシル化真正ＩＧＦ−Ｉおよびその 切断変種、その製造方法、並びに医薬組成物 本発明は、ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個もしくは それ以上のマンノース残基を有する或いは切断(truncate)された切断(truncated )ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース残基を 有するＯ−グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉに関するものである。本発明によ るＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉは実質的にインシュリンリセプタ親和性を持たず 、治療処置に使用するのに価値がある。さらに本発明は、酵母細胞にてＩＧＦ− Ｉを発現させると共に培地から本発明のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉを分離する ことにより上記ＩＧＦ−Ｉを得る方法、およびこれらＩＧＦ−Ｉを医薬上許容し うるキャリヤ、希釈剤もしくは賦形薬と共に含有する医薬組成物に関するもので ある。さらに本発明は、たとえば成長不全およびインシュリン耐性状態を処置す る薬剤を製造する際のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉの使用にも関するものである 。序文 インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、プロインシュリンに対し比較 的高い相同性を示す７０個のアミノ酸を単一ポリペプチド鎖として含む成長因子 である。細胞成長および分化を促進すると共にインシュリン様の性質をも示して 、成長ホルモンの作用を部分的に媒介することが知られている。内生ヒト型は非 グリコシル化されていない。 組換ヒトインシュリン様成長因子Ｉ（ｒｈＩＧＦ−Ｉ）は酵母Ｓ．セレビシで 発現させて産生され、分泌システムにより発酵培地中に移される。酵母における 外来蛋白質の発現は翻訳後の修飾をもたらす。酵母にて産生される蛋白質におい て観察された修飾の一つはグリコシル化である。 酵母における蛋白質グリコシル化はＮ−およびＯ−結合の両者が生じうるが、 ＩＧＦ−ＩはＮ−グリコシル化のための認識部位（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔ ｈｒ）を欠くので、ＩＧＦ−Ｉでは新たな（de novo）Ｏ−グリコシル化のみが 予想される。Ｔｈｒ２９におけるＯ−グリコシル化のための１部位が決定されて いる（ＷＯ ９０／０２１９８号、Ｇｅｌｌｅｒｆｏｒｓ，Ｐら（１９８９）、 Isolation and Characterization of a glycosylated vaariant of human insulin-like growth factor I produce d in Saccharomyces cerevisiae，J.Biol.，Chem.，264，11444-11449およびEll iott,S.ら(1990)，Yeast-derived recombinant human insulin-like growth fac tor I：Production, purification,and structural Characterization，J. Prot . Chem,, 9, 95-104)。 酵母はカルボキシペプチダーゼを含有することが知られている（Jones, E. W. , (1990), Tackling the protease problem in Saccharomyces cerevisiae，Met hods Enzymol., 194, 428-453）。したがって、酵母における外来蛋白質の発現 はＣ−末端切断変種の産生をもたらしうる。 ＩＧＦ−Ｉポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に２個もしくはそれ以上のマ ンノース残基を付着させたＩＧＦ−Ｉのグリコシル化ＩＧＦ−Ｉ変種がＷＯ ９ ０／０２１９８号により公知である。このＩＧＦ−Ｉのグリコシル化変種は、真 正ＩＧＦ−Ｉよりも顕著に血中グルコースを低下させる作用を有することが示唆 されている。 ＩＧＦ−Ｉの切断変種がＷＯ ９１／１８６２１号により従来知られており、 これはｄｅｓ（１−３−）−ＩＧＦ−Ｉが糖 尿病の処置に有用であることを開示している。切断変種ｄｅｓ（１−３−）ＩＧ Ｆ−ＩがＣＮＳ損傷の程度を減少させることも知られている（ＷＯ ９３／０２ ６９５号）。 ＷＯ ９３／０８８２６号は（４−７０）ＩＧＦ−Ｉおよび（５４−６７）Ｉ ＧＦ−Ｉを開示しており、これら切断変種は眼薬組成物にて網膜神経細胞の生存 を促進する。 ＷＯ ８７／０１０３８号は、１−５個のアミノ酸残基がＮ−末端から欠損し ているＩＧＦ−Ｉのペプチド類似体を開示している。これらは、たとえば成長不 全および異化作用状態を処置するのに有用である向上した生物学的能力を有する といわれる。位置３におけるグルタミン酸が他のアミノ酸により置換され或いは 欠失している真正ＩＧＦ−Ｉも知られている（ＷＯ ９１／１０３４８号参照） 。 本明細書においては、グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉ（ｇＩＧＦ−Ｉ）の ２種の他の変種および分離されると共に特性化されたＣ−末端切断ＩＧＦ−Ｉの 新規な２種の変種の分離および特性化につき説明する。本発明者等は、ＩＧＦ− ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し４個もしくは５個のマンノース残基 を有する真正Ｏ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉおよび ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個のマンノース残基を有 するＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉを分離した。さらに本発明者等は、Ｃ−末端Ａ ｌａ７０残基を欠如すると共にＴｈｒ２９にてグリコシル化された変種をも分離 した。他の変種はＣ−末端トリペプチドＬｙｓ６８Ｓｅｒ６９Ａｌａ７０を欠如 すると共にＴｈｒ２９にてグリコシル化されている。 ＩＧＦ−Ｉのこれら新規なＯ−グリコシル化変種は、正常なＩＧＦ−Ｉ作用を 有すると予想される一方、特にたとえばインシュリン様作用減少のような悪影響 が少い点で、治療剤として有望である。したがって、これらは成長障害の処置に ヒト真正ＩＧＦ−Ｉよりも高い投与量にて与えることができ、しかも低血糖症に 伴う問題を生ぜしめない。さらにこれらは、ＩＧＦ結合性蛋白質１（ＩＧＦＢＰ −１）に対する結合能が低下しているので、たとえば外傷、インシュリンリセプ タ抗体産生、貧弱に制御された糖尿病または子宮内成長遅延（ＩＵＧＲ）の後の 、インシュリン耐性を有する患者の処置に使用することができる。 第１〜６図は本発明を示す。 第１図はＳ．アウレウスＶ８プロテアーゼ（ＳＡＰ−Ｖ８） で消化した後のＩＧＦ−Ｉペプチドを示す。得られたペプチドはその一次構造に おける形状によりラベルされる。 第２図はｒｈＩＧＦ−Ｉの疎水性相互作用に基づく精製工程を示す。フラクシ ョン８を回収して特性化された新規なＩＧＦ−Ｉ変種を分離した。 第３図はコンカナバリンＡカラムにおける「フラクション８」の親和性クロマ トグラフィーの溶出プロフィルを示す。２種のプール（ｘおよびｚ）を反復調製 物から回収した。 第４図は第３図のフラクション×プールの逆層クロマトグラフィー（ＲＰ−Ｈ ＰＬＣ）の溶出プロフィルを示す。 第５図は真正ｒｈＩＧＦ−Ｉ（ＤＳＱ９３）と比較した２種の主たる変種ｚお よびｘ２のＳＡＰ Ｖ８消化物のペプチド マップを示す。 第６図は真正ｒｈＩＧＦ−Ｉ（ＤＳＱ９３）と比較したｘ３、ｘ４およびｘ５ 変種のＳＡＰ Ｖ８消化物のペプチド マップを示す。 本発明はＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個もしくはそ れ以上のマンノース残基を有する或いは切断された切断ＩＧＦ−ポリペプチド鎖 のＴｈｒ２９アミノ酸に対 し２個のマンノース残基を有するＯ−グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉに関す るものである。本発明によるＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉは実質的にインシュリ ンリセプタ親和性を持たず、治療処置に使用するのに貴重である。 本発明は特にＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し４個および ／または５個のマンノース残基を有する或いはＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個の マンノース残基を有するものに関する。 さらに本発明は、特にＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２ 個のマンノース残基を有するＯ−グリコシル化（１−６７）ＩＧＦ−Ｉ、または ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース残基を有 するＯ−グリコシル化（１−６９）ＩＧＦ−ＩであるＯ−グリコシル化ＩＧＦ− Ｉの切断変種に関するものである。 さらに本発明は、酵母細胞にてＩＧＦ−Ｉを発現させると共に本発明のＯ−グ リコシル化ＩＧＦ−Ｉを培地から分離することにより上記ＩＧＦ−Ｉを得る方法 に関するものである。 さらに本発明は、これらＩＧＦ−Ｉを医薬上許容しうるキャリヤ、希釈剤もし くは賦形薬と共に含有する医薬組成物、およ び本発明のＩＧＦ−Ｉ変種を医薬上許容しうるキャリヤ、希釈剤もしくは賦形薬 と混合することによる医薬組成物の製造方法にも関するものである。本発明のＩ ＧＦ−Ｉの変種は成長不全の処置または同化作用のための薬物を製造する際に有 用である。さらに、ＩＧＦ結合性蛋白質１（ＩＧＦＢＰ−１）に対する結合能が 低下しているので、これらはたとえば外傷、インシュリンリセプタ機能における 遺伝子欠損、インシュリンリセプタに対する自己抗体産生および子宮内成長遅延 （ＩＵＧＲ）の後のインシュリン耐性状態を有する患者の処置、並びに異常上昇 したＩＧＦＢＰレベル（特にＩＧＦＢＰＩ）を有する患者の処置にも使用するこ とができる。 新規なグリコシル化ＩＧＦ変種は２０μｇから１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２０ から２５０μｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与することができる。グリコシル化変種の分離および特性化 α−交配因子リーダーペプチド−ＩＧＦ−１発現プラスミド、すなわちｐ５３ ９／１２を用いて、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子をサッカロミセス・セレビシエで発現させ た。この方法はＷＯ ９０／０２１９８号、第６頁（実施例）から第７頁まで詳 細に記載さ れている。酵母発酵培地は真正ヒトＩＧＦ−Ｉおよびその変種を含有していた。 真正ヒトＩＧＦ−ＩからのＩＧＦ−変種の最初の分離は疎水性相互作用クロマト グラフィー（ＨＩ−ＨＰＬＣ）により行った。真正ｒＩＧＦ−Ｉのピークの前フ ラクション（フラクション８）を回収して、グリコシル化変種を分離した。第２ 図参照。 コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）親和性カラムにおけるクロマトグラフィーが、 天然型からグリコシル化ＩＧＦ−Ｉを分離する効果的方法であった。第３図は、 コンカナバリンＡカラムにおける「フラクション８」の親和性クロマトグラフィ ーの溶出プロフィルを示す。２つの部分分割されたフラクションを２種のプール 、すなわちｘおよびｚとして回収した。これらプールを反復調製物から回収した 。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）に続くＣｏｎＡブロッチングは、ｚが比較的均質であるのに対しｘが２種の 主たるバンドで構成されていることを示した。 ＧＣ−ＭＳを用いる精製された変種の炭水化物分析(KENNE, sis of hexoses in glycoproteins, Carbohydr. Res., 198, 173-179)は、両変種ｘおよびｚが１種のみの糖（すなわちマンノース）を含有す るが、相対量が異なることを示した（データ示さず）。 ｘフラクションをさらにＲＰＶ−ＨＰＬＣにて精製し、主ピークをさらに特性 化した。第４図はピークｘ２、ｘ３、ｘ４およびｘ５を示す。 ＩＧＦ−ＩのＣ−末端に対し特異的な抗体による免疫ブロッチングは、これら 変種間における相違点をさらに示した。すなわち、Ｃ−末端における修飾が予想 された。グリコシル化ＩＧＦ−Ｉ変種間の構造上の相違点をさらに、ＳＡＰ Ｖ ８酵素マッピング法により明かにした。これにより、天然ペプチドとの比較にお ける特定ペプチドに与えた変化を示した。第５図は真正ｒｈＩＧＦ−Ｉ（ＤＳＱ ９３）と比較した２種の主たる変種ｚおよびｘ２のＳＡＰ Ｖ８消化物のペプチ ドマップを示し、第６図は真正ｒｈＩＧＦ−Ｉ（ＤＳＱ９３）と比較したｘ３、 ｘ４およびｘ５変種のＳＡＰ Ｖ８消化物のペプチドマップを示す。ＳＡＰ Ｖ ８マップにおいて、ｚの唯一の修飾断片はＣ−末端ＳＡＰ９であった（命名につ き第１図）。ＳＡＰ９断片のアミノ酸組成は正確であると判明（第Ｉ表：この表 は問題 とするＳＡＰペプチドのアミノ酸分析の結果を示す）したのに対し、質量分析は 理論値１２７９．６よりも４８４．１単位高い分子量を示した（第ＩＩ表：この 表は問題とするＳＡＰペプチドの質量分析の結果を示す）。マンノースの分子量 は１６２．１であり、質量におけるこの差は３個の追加マンノース残基の示唆と 良好に一致した。インタクトポリペプチドの質量分析（第ＩＩＩ表）は、非消化 ＩＧＦ−Ｉ変種の質量分析の結果を示し、前記示唆を裏付ける。 変種ｚの場合と同様に、ｘ２の唯一の修飾ＳＡＰ断片はＳＡＰ９であった（第 ５図参照）。さらに、断片は純粋でないことも観察された。アミノ酸組成はｘ２ の場合にも不変であった（第Ｉ表）。ｘ２のＳＡＰ９断片につき、質量分析は理 論値１２７９．６よりも６４５．９単位高い分子量を与えた（第ＩＩＩ表）。し たがって、この場合は追加マンノース残基の示唆される個数は４である。他方、 未消化ポリペプチドの質量分析は５個のマンノース残基を示したが（第ＩＩＩ表 ）、この数値は完全には正確でない。その説明は、ｘ２がテトラ−およびペンタ −置換ＩＧＦ−Ｉの混合物であったからであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＡＰ ９ピークにおけるショルダー（第５図） の両者によっても不均一性が示される。かくして、異なる調製物は異なる相対量 の２種の変種を含有していると思われる。 ＳＡＰ９断片のアミノ酸配列に関し、Ｏ−グリコシル化を可能にすることが知 られた唯一の残基はＳｅｒ６９であり、したがってこれが提案されるグリコシル 化部位であった。 ＳＡＰ Ｖ８マップにおいて、ｘ３、ｘ４およびｘ５に共通の修飾ＳＡＰ５断 片（第６図）は、Ｔｈｒ２９におけるジマンノース−グリコシル化により生じた 。ｘ４およびｘ５ＳＡＰ９断片の各Ｃ−末端も修飾されていた。 変種ｘ４のＳＡＰ Ｖ８マップは、ＳＡＰ９断片の２種の修飾物、すなわちラ ベルされたＳＡＰ９：１およびＳＡＰ９：２を示した（第１図）。アミノ酸配列 分析（第Ｉ表）によれば、１個のＡｌａ残基（恐らくＣ−末端Ａｌａ７０）が両 断片において喪失していた。断片ＳＡＰ９：１の質量分析はこの修飾を裏付けた 。ＳＡＰ９：２断片については、質量分析は追加２６．６単位を与えた（第ＩＩ 表）。この相違は、未消化ペプチドにつき質量分析を行った場合と一致した（第 ＩＩＩ表）。分子量におけるこの差については合理的説明が見出されなかった。 変種ｘ５のＳＡＰ９に対応する断片は、ｘ４ ＳＡＰ９：２よりも若干長い保 持時間を有した（第４図参照）。この断片のアミノ酸分析（第Ｉ表）は、１個の リジンと１個のセリンと１個のアラニン残基との欠如を示し、Ｃ−末端トリペプ チドＬｙｓ６８−Ｓｅｒ６９−Ａｌａ７０の切断を提案した。この示唆された修 飾は、ＳＡＰ９断片（第ＩＩ表）および未消化ポリペプチド（第ＩＩＩ表）の両 者の質量分析により確認された。 かくして、次のことが確認された： ｘ２はＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し４個もしくは５個 のマンノース残基を有するＯ−グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉを意味する。 ｚはＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個のマンノース残基 を有するＯ−グリコシル化された真正ＩＧＦ−Ｉを意味する。 ｘ４はＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース 残基を有するＯ−グリコシル化（１−６９）ＩＧＦ−Ｉを意味する。 ｘ５はＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース 残基を有するＯ−グリコシル化（１−６７）ＩＧＦ−Ｉを意味する。 生物学的活性 核磁気共鳴データは、ＩＧＦ−Ｉのコアがインシュリンに構造上極めて類似す ることを示す。この領域におけるインシュリンおよびタイプＩリセプタに対する ＩＧＦ−Ｉの結合に関する構造決定因子は重なり合う。したがって、ＩＧＦ−Ｉ は、それ自身のリセプタに結合する他にインシュリンリセプタとも交差 反応するが、大抵の場合親和性は低い。 ＩＧＦ−Ｉリセプタの構造−機能の関係もインシュリンリセプタに類似する。 それらの各リガンドに対する結合親和性が異なるものの、インシュリンリセプタ およびＩＧＦ−Ｉリセプタは少なくともリガンド結合後のシグナル転送における 初期ステップが同一であると思われる。これは、ＩＧＦ−Ｉとインシュリンとの 間の生物作用の相違点が主として異なる標的細胞におけるこれらのリセプタ発現 とシグナル経路の相異に基づくことを示唆する。したがって、ＩＧＦ−Ｉもしく はＩＧＦ−Ｉ変種の標的器官の生物作用に関する重要な決定因子は、２種のリセ プタ種類に対する親和性であって、生物作用はこれら２種のリセプタ種類への結 合により媒介される。 ＩＧＦの生物学的利用性および作用は、特定結合性蛋白質（ＩＧＦ ＢＰ１〜 ６）群との結合によっても影響を受ける。ＩＧＦ ＢＰ３は成人における主たる 循環ＩＧＦ ＢＰ型であり、一般に１５０ｋＤａ三成分複合体にて血清中のＩＧ Ｆ−Ｉの９５％以上を結合する。三成分複合体は比較的長い半減期を有し、イン タクトで循環し続けることができない。遊離した非複合化型のＩＧＦのみが生物 学上活性であると思われるので、 リセプタとの結合のために、ＩＧＦを標的細胞まで循環系からシャトルさせうる 特定メカニズムを与える必要がある。ＩＧＦ ＢＰ１は標的細胞へのＩＧＦ−Ｉ の輸送および標的細胞のＩＧＦ反応性の調節の両者につき重要であると思われる 。幾つかの研究が、グルコース恒常性につきＩＧＦ利用性を調節する際のＩＧＦ ＢＰ１の生理学的役割を裏づけている。ＩＧＦＢＰ−１はインビトロおよびイ ンビボの両者にてＩＧＦ−Ｉのインシュリン様活性を抑制することが示されてい る。ＩＧＦＢＰ−１はグルコース反対制御（counterregulators）に特徴的な所 定の制御パターンを示し、顕著な日周期を以って血清中で急速な変動を示す唯一 のＩＧＦＢＰである。循環インシュリンとＩＧＦＢＰ−１との間には逆の関係が 存在し、インシュリンは肝臓ＩＧＦＢＰ−１の産生を調節することが知られてい る。ＩＧＦＢＰ−１は血糖調節（および他のインシュリン様作用）に関しＩＧＦ 作用を急激に調節するだけでなく、長期にわたり成長を調節する点でも極めて重 要であると思われる。臨床的観察は、循環ＩＧＦＢＰ−１レベルと各種の成長パ ラメータとの間の逆相関を指摘している。最高ＩＧＦ−Ｉレベルおよび加速成長 を伴う思春期にて低レベルが見られる。逆に、貧弱に制御 された糖尿病の成長阻害はＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦ−Ｉの低下を伴う一方、 ＩＧＦＢＰ−１血清レベルが高い。さらにＩＧＦＢＰ−１は胎児成長を調節する と思われ、高いレベルは出産時における低い体重と相関する。 したがって、各種のＩＧＦＢＰ型の間におけるＩＧＦの分布は、ＩＧＦのクリ アランス、組織分布および生物活性につき重要な決定因子であることは明かであ る。その結果、リセプタへの結合の変化を伴うＩＧＦＢＰに対する変化した結合 親和性を有するＩＧＦ変種は著しく異なるバイオプロフィルを示しうる。 グリコシル化ＩＧＦ−Ｉ変種のＩＧＦ−Ｉリセプタ結合能を、ヒト胎盤膜調製 物を用いてリセプタ結合分析で試験した（Hall Kら、A．J．Clin. Endocrinol. Metabol. 39：973-976, 1974）。ｚおよびｘ２変種の両者は、非グリコシル化真 正ＩＧＦ−Ｉ調製物と比較して、ＩＧＦ−Ｉリセプタ結合能が６０〜７０％低下 していた。１−６９ジマンノシルＴｈｒ２９変種（ｘ４）は、真正ヒトＩＧＦ− Ｉと比較して、５０％の能力を示すと共に、１−６７ジマンノシルＴｈｒ２９変 種（ｘ５）は３０％の能力を示した（第ＩＶ表参照）。したがって、タイプＩリ セプタ結合はｐｏｓＴＨＲ２９におけるグリコシル化に より顕著には低下しなかったが、さらにＣ−末端トランケーションと組合せれば リセプタ結合能力の徐々に変化する顕著な喪失をもたらした。 グリコシル化ｒｈＩＧＦ−Ｉ変種のインビトロ骨成長刺激作用を胎児雛大腿骨 分析（Endo Hら、Nalure(London)、286:262-264, 1980）にて試験した。このモ デルにおけるＩＧＦ−Ｉの刺激作用は主として雛ＩＧＦ−Ｉリセプタにより媒介 される。全てのグリコシル化ｒｈＩＧＦ−Ｉ変種は、骨成長刺激に関し非グリコ シル化真正ＩＧＦ−Ｉと同等の能力であると判明した（第ＩＶ表参照）。これは 、雛ＩＧＦ−Ｉリセプタを結合する能力がインタクトであるか或いはこのリセプ タに対する結合能力がヒトＩＧＦ−Ｉリセプタの場合と同様に僅かに影響を受け るが、この作用はたとえばＩＧＦ−Ｉ結合性蛋白質に対する親和性変化によって 補償されていることを示唆する。骨におけるＩＧＦ−Ｉ局在結合性蛋白質が確認 される。グリコシル化された変種の成長促進作用は多かれ少なかれ変化はなかっ た。 ＩＧＦ−Ｉ変種のインシュリン様特性をラット一次脂肪細胞を用いる脂質生成 分析（Small J.ら、J. Biol. Chem. 262：1107-79、1987）にて試験したところ 、脂質生成活性の大きい 低下が示された。全変種の脂質生成能力は非グリコシル化真正ｒｈＩＧＦ−Ｉと 比較して３０％もしくはそれ以下まで低下していた（第ＩＶ表参照）。これは、 これらＩＧＦ−Ｉ同族体のインシュリンリセプタへの結合能が著しく低下してい ることを示す。ラット一次脂肪細胞は僅かながら機能的ＩＧＦ−Ｉリセプタを有 することが知られているので、Ｏ−グリコシル化はインシュリンリセプタ結合の 低下、したがって低下したインシュリン様能力をもたらすことが示唆される。こ れは成長作用につきＩＧＦ−Ｉを必要とする患者に有利である。 大型ＢＰ３（ＢＰ＝結合性蛋白質）および小分子量ＢＰ１に対する親和性をビ アコア（商標）法にて試験した。この方法は Techniques 11：5、1991）によりバイオセンサチップ表面に固定化されたＩＧ ＦＢＰに対するＩＧＦの結合を測定する。zおよびｘ２変種は低下したＩＧＦＢ ＰＩ結合能を示した（非グリコシル化真正ＩＧＦ−Ｉの約６０％）のに対し、こ の２種の変種のＩＧＦＢＰ３への親和性は不変であった（第ＩＶ表参照）。 これらの結果は、投与されたＳｅｒ６９変種が真正ＩＧＦ− Ｉと類似するＢＰ複合体を形成するのに対し、従来特性化されている１−７０Ｔ ｈｒ２９変種は形成しないことを示唆する。全変種について、減少したＩＧＦＢ Ｐ１結合性はより高い生物利用能およびより低い生物活性の阻害を示唆する。 結論として、インビトロのデータは、位置Ｓｅｒ６９におけるＯ−グリコシル 化および切断物の位置Ｔｈｒ２９におけるＯ−グリコシル化により、薬理学的プ ロフィルが変化することを示す。インシュリン様活性低下は、変化したＩＧＦＢ Ｐ１親和性と共に、生物作用選択性および利用能における変化をもたらし、この 変化は臨床にて有利に使用しうると予想される。 結論 ｒｈＩＧＦ−ＩのＯ−グリコシル化の第２番目の部位が断片ＳＡＰ９の残基Ｓ ｅｒ６９に存在している。グリコシル化の程度は３〜５個のマンノース残基の範 囲であると判明した。特性化されたマンノシル化（Ｓｅｒ６９）ｒｈＩＧＦ−Ｉ 変種は他 の部位ではグリコシル化されなかった。 生物学的結果は、すべての変種が、ＩＧＦ−Ｉリセプタへの結合が真正ＩＧＦ −Ｉに類似する（１−７０ Ｔｈｒ２９ＩＧＦ）が或いは減少する（ｚ、ｘ２、 ｘ４、ｘ５変種）にも拘らず、雛胎児大腿骨のインビトロ成長に対し正常な予想 されたＩＧＦ−Ｉ作用を有することを示している。これは予想外であったが、リ セプタ結合能の損失が各変種の他の本質的性質（たとえばＩＧＦＢＰ結合変化） により補償されうることを示すので極めて興味がある。各変種は脂質生成分析に より示されるようにＩＧＦ−Ｉリセプタに対しインシュリンリセプタよりも増大 した選択性を有する。この分析は、各変種が骨および筋肉につき選択性であるが 脂肪もしくは肝臓には選択性でないことを示す。何故なら、後者の組織はＩＧＦ −Ｉにつき低濃度のリセプタと顕著な濃度のインシュリンリセプタとを含有する ことが知られているからである。インシュリン様作用が低下するにつれ、たとえ ば低血糖症のような悪作用が低くなると予想され、投与量をより多量にすること ができる。 全変種は、 １． 細胞増殖および分化に対する従来のＩＧＦ−Ｉ作用の選 択的強化を達成するために、インシュリンリセプタ媒介の「インシュリン様」作 用の負担にて使用しうる段階的リセプタ選択性を提供し、 ２． グリコシル化の存在もしくは不存在のいずれかの結果として、さらにＩＧ Ｆ結合性蛋白質（ＩＧＦＢＰｓ）に対する親和性変化による、動態および生物利 用性における相違を示すと思われる ので臨床的に極めて興味がある。 Ｃ−末端切断およびグリコシル化の両者が重要である。脂質生成の低下と真正 ＩＧＦ−Ｉとの関係が全変種につき示された。ＩＧＦＢＰ１結合は真正ＩＧＦ− Ｉの場合よりも低いが、Ｔｈｒ２９にマンノースを有するグリコシル化変種の場 合ほど低くない。ＩＧＦＢＰ３結合はＩＧＦ−Ｉの場合と同じであって、半減期 が同等であることを示す。Ｔｈｒ２９にマンノースを有する従来同定されたグリ コシル化変種はずっと低いＩＧＦＢＰ３結合能を有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ０７Ｋ 1/22 Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＢＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＰ (72)発明者 レーンホルム，ハリエト スウエーデン国、エス−142 61・トロン シユンド、トーンスリンガン・８ (72)発明者 スコツトネル，アンナ スウエーデン国、エス−178 32・エーケ ーレ、ローブベーゲン・３ (72)発明者 ソーネツソン，カーリン スウエーデン国、エス−122 37・エンシ エーデ、ダーイエベーゲン・32

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個もしくはそれ以 上のマンノース残基を有し、または切断された切断ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴ ｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース残基を有するＯ−グリコシル化された 真正ＩＧＦ−Ｉ。 ２． 実質的にインシュリンリセプタ親和性を持たない請求の範囲第１項に記載 のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉ。 ３． ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し４個もしくは５個の マンノース残基を有する請求の範囲第１項または第２項に記載のＯ−グリコシル 化ＩＧＦ−Ｉ。 ４． ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＳｅｒ６９アミノ酸に対し３個のマンノース残 基を有する請求の範囲第１項または第２項に記載のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉ 。 ５． ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース残 基を有するＯ−グリコシル化（１−６７）ＩＧＦ−Ｉである請求の範囲第１項ま たは第２項に記載のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉの切断変種。 ６． ＩＧＦ−ポリペプチド鎖のＴｈｒ２９アミノ酸に対し２個のマンノース残 基を有するＯ−グリコシル化（１−６９）ＩＧＦ−Ｉである請求の範囲第１項ま たは第２項に記載のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉの切断変種。 ７． 酵母細胞にてＩＧＦ−Ｉを発現させると共に、培地からＯ−グリコシル化 ＩＧＦ−Ｉを分離することにより請求の範囲第１ないし６項のいずれか一項に記 載のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉを得る方法。 ８． 請求の範囲第１ないし６項のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化ＩＧ Ｆ−Ｉを医薬上許容しうるキャリヤ、希釈剤もしくは賦形薬と共に含有する医薬 組成物。 ９． 請求の範囲第１ないし６項のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化ＩＧ Ｆ−Ｉを医薬上許容しうるキャリヤ、希釈剤もしくは賦形薬と混合することを特 徴とする医薬組成物の製造方法。 １０． 成長不全を処置する薬剤を製造する際の請求の範囲第１ないし６項のい ずれか一項に記載のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉの使用。 １１． インシュリン耐性状態、たとえば外傷、インシュリン リセプタ機能における遺伝子欠陥、インシュリンリセプタに対する自己抗体産生 および子宮内成長遅延（ＩＵＧＲ）、の後を処置する薬剤を製造する際の請求の 範囲第１ないし６項のいずれか一項に記載のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−Ｉの使用 。 １２． 異常上昇したＩＧＦＢＰレベル特にＩＧＦＢＰ１を有する患者を処置す る薬剤を製造する際の請求の範囲第１ないし６項のいずれか一項に記載のＯ−グ リコシル化ＩＧＦ−Ｉの使用。