JPH10502667A

JPH10502667A - 活性薬剤の制御放出に用いる多小胞リポソームの調製

Info

Publication number: JPH10502667A
Application number: JP8510312A
Authority: JP
Inventors: ビー．サンカラム，マントリプラガダ; キム，シニル
Original assignee: デポテックコーポレーション
Priority date: 1994-09-13
Filing date: 1995-09-13
Publication date: 1998-03-10
Anticipated expiration: 2015-09-13
Also published as: NO323581B1; FI971037L; FI971037A0; AU3511595A; EP0781123B1; JP3026271B2; DE69535297T2; CA2199004A1; WO1996008235A1; MX9701856A; EP0781123A4; KR100387561B1; EP0781123A1; US5993850A; CA2199004C; DE69535297D1; NO971149L; NO971149D0; BR9508913A; FI119621B

Abstract

(57)【要約】生物学的活性物質を含む多小胞リポソーム（ＭＶＬ）を開示し、前記多小胞リポソームは、一定のサイズ分布、調整可能な平均サイズ、調整可能な内部隔室サイズと数、及び生物学的活性物質の制御されかつ変更可能な放出速度をもつ。これを製造する方法は、少なくとも１つの生物学的活性物質と場合により浸透圧スペーサーとを、リポソーム中に封入される第１水性成分中に封入することを含む。リポソームが導入される周囲環境中への活性物質の放出速度は、第１水性成分の浸透圧を増加することにより低下し、浸透圧を減少することにより上昇する。

Description

【発明の詳細な説明】活性薬剤の制御放出に用いる多小胞リポソームの調製技術分野本発明は、生物学的活性物質を封入するリポソームの多小胞（multivesicular ）リポソーム組成物に関する。さらに特定すると、本発明は、封入した物質の放出速度が制御可能な多小胞リポソームの製造法及び使用に関する。背景技術多くの医薬を用いて最適の治療を行うには、医薬濃度が長期間にわたって維持されることが必要であることが多い。例えば、細胞周期特異的代謝拮抗物質を用いて最適の抗癌治療を行うには、長期間にわたって細胞毒性薬の濃度を維持することが必要である。シタラビンは極めて時期依存性の抗癌剤である。この医薬はＤＮＡ合成時にのみ細胞を殺すので、細胞を最適に殺すには治療的濃度の医薬に長期間暴露することが必要である。このような薬剤は静脈内又は皮下投与後の半減期が数時間と短いという事実のために、薬剤の治療有効性はさらに複雑になることが多い。シタラビンのような細胞周期特異的医薬を用いて癌細胞を最適に殺すには、次の２つの主要な要求を満たさなければならない：まず第１に、宿主に不可逆的な有意な害を与えることなく、高濃度の医薬に癌細胞を暴露しなければならない；そして第２には、細胞増殖のうちで感受性なＤＮＡ合成期にある癌細胞の数を最大にするために腫瘍を長期間医薬に暴露しなければならない。時期依存性である別のクラスの医薬の例としては、アミノグリコシドクラスの抗生物質が挙げられる。例えば、アミカシンはグラム陽性及びグラム陰性細菌に対して臨床的に重要な活性をもつアミノグリコシド抗生物質である。従来の治療法では、この医薬は通常１日１回又は２回、静脈内又は筋肉内経路で投与される。最も普通に用いられる臨床用量は、１日１ｇの最大推奨日用量と同等な１５ｍｇ／Ｋｇ／日である。しかしながら、この方法では患者に全身投与することになり、医薬によっては毒性の副作用の危険が増加する。従って、柔組織又は骨の局所領域に限定されるような感染治療用の局所デポ除放性製剤が、治療的な全身用量と比較して医薬の局所組織濃度増加に有利であり、一方遊離医薬の全身性毒性を減少又は回避する。特に、数時間、数日又は数週間にさえ及ぶ長期間にわたって治療的濃度の医薬を送達するのに使用できる制御放出製剤が有用である。医薬送達のための制御放出組成物を提供するのに用いられてきた１つのアプローチはリポソーム封入である。多くのリポソーム型のうち、多重小胞（multives icular）リポソーム（Kim，et al.，Biochim．Biophys．Acta; 728:339-348，19 83）は、単ラメラ（unilamellar）リポソーム（Huang，Biochemistry，8:334-35 2，1969; Kim，et al.，Biochim．Biophys．Acta; 646:1-10，1981）、多重ラメラ（multilamellar）リポソーム（Bangham，et al.，J．Mol．Bio.，13:238-252 ，1965）、及び安定な多ラメラ（plurilamellar）リポソーム（米国特許第４，５２２，８０３号）とは異なってユニークである。単ラメラリポソームとは対照的に、多小胞リポソームは複数の水性隔室（chamber）を含む。多重ラメラリポソームとは対照的に、多小胞リポソームの複数の水性隔室は同心円状でない（no n-concentric）。各種の型の単ラメラ及び多重ラメラリポソームを製造する多数の方法が文献に記載されている：例えば、Lenkに付与された米国特許第４，５２２，８０３号；Baldeschwielerに付与された米国特許第４，３１０，５０６号； Papahadjopoulosに付与された米国特許第４，２３５，８７１号；Schneiderに付与された米国特許第４，２２４，１７９号；Papahadjopoulosに付与された米国特許第４，０７８，０５２号；Taylorに付与された米国特許第４，３９４，３７２号；Marchettiに付与された米国特許第４，３０８，１６６号；Mezeiに付与された米国特許第４，４８５，０５４号；及びRedziniakに付与された米国特許第４，５０８，７０３号；Szoka，et al.，1980，Ann．Rev．Biophys．Bioeng.，9 :465-508; Liposomes，Marc J．Ostro編集，Marcel-Dekker，Inc.，New York，1 983，Chapter 1; Poznansky and Juliano，Pharmacol．Rev.，36:277-236，1984 ）。先行技術はさらに多小胞リポソームの製造法を記載する（Kim，et al.，Bio chim．Biophys．Acta，728:339-348，1983）。 Kim らの方法（Biochim．Biophys．Acta，728:339-348，1983）では、シタラビン又はＡｒａ−Ｃとしても知られるシトシンアラビノシドのようないくつかの小さい分子の封入効率は比較的低く、生物学的流体中への封入分子の放出速度は高かった。従って、生物学的流体への封入分子の放出速度を遅くするために塩酸塩を用いる組成物が開発された（Kimにより１９９３年２月２１日出願の米国特許出願第０８／０２０，４８３号の一部継続出願）。さらなる研究の結果、ヒト血漿中における多小胞リポソームからの物質の放出速度は、多小胞リポソーム形成前に物質を溶解する酸溶液の性質を変更することによって制御できることが示された（Sankaram及びKimにより１９９３年１１月１６日出願の米国特許出願第０８／１５３，６５７号）。これらの研究では、塩酸、硝酸及び過塩素酸のようなある種の鉱酸が最も遅い放出速度をもたらし、一方その他の酸、例えば酢酸、トリフルオロ酢酸、及びトリクロロ酢酸などは即時の放出速度をもたらした。最も速い放出速度は硫酸及びリン酸などの二−又は三 −プロトン酸によって得られた。この方法で製造されたリポソームの組成物は、所望の医薬放出動力学をもつ多小胞リポソームを製造するのに酸を使用する必要があるという欠点をもつ。さらに、多小胞リポソームからの所望の医薬放出速度を提供する酸のいくつかは、製造に用いる金属容器及び部品の腐食のような薬動力学的プロセスにおける問題を生じる。また、もしもin vivo環境で実用に供される多小胞リポソームを酸を用いないで製造する場合には、酸不安定物質の安定性についての問題点が回避されるであろう。水性環境中へのリポソームからの封入された生物学的物質の放出速度は、リポソーム中にプロトノファア又はイオノフォアを導入して膜ポテンシャルを作り出すことによって調節できることが示された（米国特許第５，０７７，０５６号）。さらに、小胞組成物からの医薬の放出速度を制御する方法がヨーロッパ特許出願第０１２６５８０号に開示されている。この後者の方法では、一定の浸透圧を与えるために十分な溶質を含む溶液中に懸濁した小胞中に封入された治療薬の溶液を含む組成物を提供する。この浸透圧は小胞内の溶液の浸透圧に関して少なくとも実質的に等張であり、またこの小胞内の溶液の浸透圧は生理的食塩水よりも大きい浸透圧をもつ。小胞内の溶液の浸透圧は一定に保たれ、一方小胞が懸濁される溶液の浸透圧は変化する。このような条件下では、懸濁媒質が小胞内の溶液に関して等張又は高張な関係に達するにつれて、放出速度が低下する。しかしながら、この方法の欠点は、放出速度を制御するために、その中に治療薬を放出する媒体の浸透圧が変化しなければならない点である。その結果、医薬送達システムの投与部位における生物学的流体の浸透圧は実質的に固定しており変更できないので、これらの組成物は医薬用途などの実際の使用に関しては厳しく限定されてしまう。例えば、血漿などの生物学的流体は生理食塩水（normal saline:水中０．９重量％ＮａＣｌ）に関して等張に近く、これは３１０ｍＯｓｍの浸透圧をもつ。従って、懸濁媒体の浸透圧は理想的には３１０ｍＯｓｍ近くであるべきである。従来のリポソーム組成物及びその製造法についての公知の限定に鑑み、酸を用いることなく安定な多小胞リポソームを製造する技術が求められている。本発明はこのような需要に答えるものである。発明の要約本発明は、生物学的活性物質の制御放出のできる多小胞リポソーム（ＭＶＬ）を提供する。生理的環境、例えばin vivoでのヒト組織中への生物学的活性物質の放出速度は、リポソーム中に封入される第１水性成分の浸透圧を変えることによって制御される。こうすることによって、本発明のＭＶＬは、in vivo部位に導入されたときに薬物の治療的放出を維持することによって大きな改良された結果をもたらす。予期せぬことに、リポソーム中に封入される第１水性成分の浸透圧が増加するにつれて、放出速度が低下する。第１水性成分の浸透圧は、生物学的活性物質の濃度を増加するか、あるいは浸透圧スペーサーを加えることによって増加できる。本発明はまた、長期間のin vivo治療用途を提供する制御放出性をもつ多小胞リポソームを製造するための酸を用いない（non-acidic）方法を提供する。本発明の多小胞リポソームは、高い封入効率、封入物質の制御された放出速度、一定の再生可能なサイズ分布、球形状、容易に調節可能な平均サイズ及び調節可能な内部隔室サイズ及び数をもつ。多重小胞性脂質小胞又は多小胞リポソームを製造する本発明の方法は、（ａ）１以上の有機溶媒中に少なくとも１つの両親媒性脂質及び１つの中性脂質を含む脂質成分を溶解し、（ｂ）前記脂質成分を、封入すべき１以上の生物学的活性物質を含む非混和性の第１水性成分と混合し、（ｃ）前記２つの非混和性成分から油中水型エマルジョンを形成し、（ｄ）前記油中水型エマルジョンを、第２の非混和性の水性成分中に移して浸漬して溶媒小球を形成し、そして（ｅ）前記溶媒小球から蒸留などによって有機溶媒を除去することを含む。両親媒性脂質は正味の負電荷をもつ両親媒性脂質；ステロール；及び双性イオン脂質から選択できる。生物学的流体及びin vivoへの封入分子の放出速度は、生物学的活性物質の濃度を増加するか、あるいは浸透圧スペーサーを用いるか、又は物質の増加と浸透圧スペーサーの使用を組み合わせることによって、低下することができる。発明を実施するための好ましい態様本発明は、生物学的流体中における治療的活性物質の制御された放出を可能にする多小胞リポソーム（ＭＶＬ）組成物に関する。これらの組成物では、塩酸塩又は酸の不在下に、封入された治療的活性物質の維持された放出を達成するために、封入された水性相の浸透圧を新規な方法で操作する。本発明の方法を行うことによって、当業者は物質の広範な放出速度をもつＭＶＬを選択的に製造することができる。 ”多小胞リポソーム”の語は、複数の同心円状でない水性隔室を囲む人工の顕微的脂質小胞を意味する。これとは対照的に、従来のその他のリポソームでは、例えば単ラメラリポソームでは１つの水性隔室をもち、多重ラメラ及び多ラメラリポソームは、水性成分を含むスペースをそのあいだにもつ複数の同心円状の” タマネギの皮”様の膜をもつ。 ”溶媒小球”は、有機溶媒の顕微的球状小滴を意味し、その中に生物学的活性薬剤を含む、水性成分の複数のより小さい小滴が存在する。溶媒小球は第２水性成分中に懸濁され完全に浸漬している。 ”中性脂質”の語は、それ自体が小胞形成能をもたず、荷電した又は親水性の ”頭部”基をもたない油脂又は脂肪を意味する。中性脂質の例としては、荷電した又は親水性の”頭部”基をもたないグリセロールエステル、グリコールエステル、トコフェロールエステル、ステロールエステル、ならびにアルカン及びスクアレンを含むが、これに限定されない。 ”両親媒性脂質”の語は、親水性の”頭部”基と疎水性の”尾部”基をもち、膜形成能をもつ分子を意味する。本明細書では、両親媒性脂質には、正味の負電荷、正味の正電荷をもつ両親媒性脂質、双性イオン脂質、及びステロールを含む。 ”双性イオン脂質”の語は、等電点でゼロの正味電荷をもつ両親媒性脂質を意味する。本明細書では、多小胞リポソームの隔室中に存在する物質を記載するときに用いる”生物学的活性”の語は、小胞中に存在する形で生物学的活性を有する物質、ならびに小胞隔室から放出された後に活性となる物質（すなわち、”静止状態の”生物学的活性を有する）、例えば酵素との相互作用によって治療活性をもつ活性成分に変換されるプロドラッグのような物質を含む。さらに、導入される生物学的活性物質には間接的に作用する物質を含む。あるいは、このような物質は本明細書で記載する浸透圧スペーサーとして作用する。例えば、各種賦形剤及び安定化剤が存在する。このような物質は、例えば特定医薬の保存寿命又は生物学的適合性を増加する作用をする。あるいは、一般に賦形剤として分類される物質の多くは、ごくわずかなものからかなり重要なものまで直接的生物学的活性を実際にもっている。例えば、よく使う賦形剤であるマンニトールは利尿剤としても生物学的に作用するし、水でさえも生物学的に作用して脱水に影響する。このような間接的に活性な物質には水性又は非水性の溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非水性溶液の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エステルなどの注射可能な有機エステルを含む。水性担体には、食塩水及び緩衝化媒体を含む水、アルコール−水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む。非経口的ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロース、及び乳酸加リンゲル液を含む。静脈内ビヒクルには、液体及び栄養補充物、電解質補充物（リンゲル・デキストロースに基づくものなど）などを含む。保存剤及びその他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなど（Remingtons Pharmaceutical Sciences，16th Ed.，A．Olso,編集，Mark，East on，PA，1980参照）が存在していてもよい。当業者は過度の実験を行うことなく、本発明の小胞に用いることのできる化合物の各種組み合わせを容易に確認し想到することができる。浸透圧は水性溶液中に存在する溶質のモル濃度の合計として定義される。もしも溶質が解離、イオン化又は凝集した形で存在するならば、浸透圧は解離、イオン化又は凝集した形のモル濃度の合計として定義される。溶質には、生物学的活性薬剤及び浸透圧スペーサーを含むが、これに限定されない。 ”浸透圧スペーサー”の語は、生物学的活性物質でない、水溶液中の全ての生物学的に適合性の溶質分子を意味する。電解質及び非電解質の両方が浸透圧スペーサーとして機能する。特定の分子が浸透圧スペーサーとして機能するかどうかを決定するにあたって、あるいは多小胞リポソーム中に封入する浸透圧スペーサーの濃度を決定するにあたっては、多小胞リポソーム内の条件（例えばｐＨ）下で、その分子が完全に又は部分的にイオン化しているかどうか、そしてこのようなイオンが脂質膜を透過するかどうかを考慮に入れなければならない（The Bimo lecular Lipid Bilayer Membrane，Mahendra K．Jain，van Nostrand Reinhold Co.，1972，470pp.）。当業者であれば、本発明の使用にあたって、本発明のＭＶＬの使用による治療を受ける被験者に毒性又は有害なことが証明されている物質を避けて浸透圧スペーサーを選ばなければならないことが理解されよう。当業者は過度の実験を行うことなく、本発明で使用する特定の浸透圧スペーサーが適当なものであるかを容易に評価できる。 ”第１水性成分”の語は、多小胞リポソームを製造する工程で使用する、場合により浸透圧スペーサーの存在下に生物学的活性物質を含む水性相を意味する。 ”第１水性成分の浸透圧”の語は、多小胞リポソームを製造する工程で使用する生物学的活性物質を含む水性成分の浸透圧を意味する。 ”生理学的に関連のある水性環境”の語は、血漿、血清、脳脊髄、筋肉内、皮下、腹膜、眼内、又は滑膜液などの生物学的流体、ならびに生物学的流体とほぼ等張な０．９％食塩水又は緩衝塩溶液などの貯蔵媒質を意味する。水性環境中への封入された生物学的物質の放出速度を制御する従来の方法は、１）リポソーム内の酸溶液の性質、又は２）リポソーム内の水性成分の浸透圧について、リポソームがその中に導入される外部水性環境の浸透圧を増加することに依っていた。後の方法の論理的結論として、リポソームがその中に導入される水性媒体の浸透圧を一定に保ちながら、第１水性成分の浸透圧が増加するにつれて封入される物質の放出速度が増加しなければならないことになる。しかしながら、本発明による知見は驚くべきことに従来法の教示に基づいて予想されることとは反対であった。すなわち、たとえ外部の水性媒体の浸透圧が一定に保たれていても、ＭＶＬ内の内部水性成分の浸透圧が増加するにつれて封入される物質の放出速度は実際には低下する。従って、本発明の方法は多小胞リポソーム内に封入される第１水性成分の浸透圧を用いて放出を制御し、このとき外部媒質の浸透圧強度はほぼ生理的である。さらに、一定濃度の生物学的活性物質で、浸透圧スペーサーを含むＭＶＬを製造するときは、浸透圧スペーサーの濃度が増加すると、予期せぬことに物質の放出速度が低下する。第１水性成分の浸透圧増加を伴う放出速度の低下は、治療薬剤の長期間放出によって恩恵を受ける全ての型の治療に多小胞リポソームを用いる機会を多くする。本発明の多小胞リポソームからの封入された治療薬又はその他の活性薬剤の放出速度を低下させるには、活性物質の濃度を増加するか、あるいは浸透圧スペーサーの使用により、ＭＶＬ内の第１水性成分の浸透圧を、ＭＶＬが貯蔵される（０．９重量％食塩水など）又はその中にＭＶＬを導入する（in vitro及びin viv oの両方で）生理学的に関連のある水性環境の浸透圧と比較して増加させる。逆に、活性物質の濃度を減少するか、あるいは浸透圧スペーサーの濃度を減少するか又はその使用を除去することにより放出速度は増加できる。第１水性成分の浸透圧は、リポソームからの生物学的活性物質の放出速度を最適に低下させるために生理学的に関連のある水性環境に関して高張にすることもでき、これによって等張条件下よりも封入工程の収率が高くなる。従って、本発明では、第１水性成分を、貯蔵媒体又は生物学的活性薬剤がその中に放出される水性環境に関して低張、等張又は高張にすることを含む。その結果、当業者は、特定の治療に最適な生物学的活性物質の予め選択した放出速度をもつＭＶＬを日常的に製造することができる。生理食塩水の浸透圧はヒト血漿及び脳脊髄液、滑膜液、ならびに皮下や筋肉内空間などのその他のin vivo環境の浸透圧とほぼ同じであるので、このような環境中のＭＶＬ医薬放出の予測されるモデルとして食塩水を用いることができる。本発明のＭＶＬの好ましい使用は、in vivo注射又は組織や体空洞への移植用（例えば、デポ剤として）のものであり、これらは生理食塩水、リン酸緩衝化塩溶液などの媒体、又はその他の浸透圧的に同様の媒体中に貯蔵するのが好ましい。簡単に述べると、本発明に含まれる方法においては、ＭＶＬはまず両親媒性脂質及び中性脂質を前記脂質成分のための揮発性有機溶媒中に溶解し、前記脂質成分に、封入すべき生物学的活性物質を含む非混和性の第１水性成分を加え、次いで例えば混合、震盪、超音波処理により、超音波エネルギー、ノズル霧状化により、又はこれらの組み合わせにより作られる撹流によって混合物を乳化する。次いで全エマルジョンを第２水性成分中に浸漬し、上述したようにして機械的に撹拌して、第２水性成分中に懸濁した溶媒小球を形成する。得られる溶媒小球は、その中に生物学的活性物質が含まれる多数の水性小滴からなる（水中油中水の二重エマルジョン）。例えば、水蒸気又はガスを懸濁液の上又は中を通すことによって溶媒を蒸発させて揮発性の有機溶媒を小球から除去する。溶媒が完全に蒸発したとき多小胞リポソームが形成される。溶媒を蒸発させるのに使用できるガスの代表としては、窒素、ヘリウム、アルゴン、酸素、水素及び二酸化炭素を含む。あるいは、例えば上記のガスのスパージング、減圧下での蒸発、及びスプレードライなど一般に使用される溶媒除去システムによって有機溶媒を除去してもよい。これに限定するものではないが、グルコース、スクロース、トレハロース、コハク酸塩、シクロデキストリン、アルギニン、ガラクトース、マンノース、マルトース、マンニトール、グリシン、リシン、クエン酸塩、ソルビトール、デキストラン及びその組み合わせを含む浸透圧スペーサーを用いて多小胞リポソームを形成し、多小胞リポソームからの封入された物質の放出速度を制御することができる。封入された生物学的活性物質の濃度は、約数ピコモルから約数百ミリモルまでの範囲で変更しうる。生物学的活性物質の濃度は、治療すべき疾患の性質、患者の年齢や症状、ならびにその物質の特定の性質によって変更される。物質が毒性などの副作用を通常もつ場合には、低濃度の物質をもつＭＶＬを製造し、また高濃度の浸透圧スペーサーを用いるのが望ましい。一定のＭＶＬ組成物を選択し製造するにあたって、当業者はこれらの各種パラメーターの相互関係を過度の実験を行うことなく容易に評価することができる。多数の異なる種類のエーテルなどの揮発性の疎水性溶媒、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、ＣＯ₂、ＮＨ₃、フレオンを含む（ただしこれに限定されない）超臨界流体を脂質相溶媒として使用できる。例えば、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル及びその他のエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ハロゲン化エーテル、エステル及びその組み合わせが満足のいくものである。少なくとも１つの中性脂質及び少なくとも１つの両親媒性脂質が含まれる限り、各種の型の脂質を多小胞リポソームの製造に使用できる。両親媒性脂質は（１）正味の負電荷をもつ両親媒性脂質；（２）ステロール、及び（３）双性イオン脂質からなる群より選択できる。例えば、脂質成分は中性脂質と正味の負電荷をもつ両親媒性脂質からなる。別の態様では、脂質にはさらにステロールを含んでいてよい。さらに別の態様では、脂質にはさらにステロールとと双性イオン脂質の両方を含んでもよい。双性イオン脂質の例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、及びその組み合わせが挙げられる。中性脂質の例としては、トリオレイン、トリカプリリンなどのトリグリセリド、ダイズ油などの植物油、ラード、牛脂、トコフェロール、スクワレン及びその組み合わせが挙げられる。正味の負電荷をもつ両親媒性脂質の例としては、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びホスファチジン酸が挙げられる。正味の正電荷をもつ両親媒性脂質の例としては、ジアシルトリメチルアンモニウムプロパン、ジアシルジメチルアンモニウムプロパン及びステアリルアミンが挙げられる。多小胞リポソーム中には封入によって各種の生物学的活性物質を導入できる。これらの物質には、医薬、ならびにＤＮＡ、ＲＮＡ、各種の型のタンパク質、タンパク質ホルモン、例えばインスリン、成長因子、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、及び予防接種の免疫源として作用するタンパク質や炭水化物などの医薬材料を含む。化粧用途に用いるのに有効な生物学的活性物質も多小胞リポソーム中に封入によって導入できる。これには湿潤剤、ビタミン、酵素及び香料を含む。さらに、除草剤、殺虫剤、殺菌剤などは多小胞リポソーム中に封入できる農業用途をもつ生物学的活性物質の例である。表１は、本発明の多小胞リポソーム中に封入できる生物学的活性物質の代表的クラスを含む。本発明の多小胞リポソーム中の生物学的活性物質のヒトにおけるin vivo使用のための適当な投与量範囲は、０．００１−６０００ｍｇ／ｍ²体表面積を含む。上記の範囲外の投与量を与えてもよいが、この範囲は実質的に全ての生物学的活性物質に使用できる広さを包含する。しかしながら、特定の治療剤には上述したように好ましい濃度を容易に確かめることができる。多小胞リポソームはあらゆる所望の経路で投与することができ、例えば、腫瘍内、体節内（関節内）、筋肉内、莢膜内、腹腔内、皮下、静脈内、リンパ内、経口及び粘膜下で投与できる。多小胞リポソームは、器官又は細胞標的特異性を与えるために、スペーサー分子又はペプチド、標的特異的リガンド、例えば抗体及びその他の受容体特異的タンパク質リガンドなどを当業者に公知の方法で直接又は間接に結合して修飾することができる（Malone et al.，Proc．Natl．Acad．S ci．USA，86:6077，1989; Gregoriadis，Immunology Today，11(3):89，1990;これらを参照として包含する）。以下の実施例は本発明を実施する方法を説明する。しかしながら、実施例は説明のためのものであり、本発明は実施例の特定の材料又は条件のいずれによっても限定されるものではない。実施例１Ａ．多小胞リポソームの製造工程１）清浄なガラス円筒（内径２．５ｃｍｘ高さ１０．０ｃｍ）中に、クロロホルム中にジオレオイルホスファチジルコリン（Avanti Polar Lipids，Birming ham，AL）４６．５μモル、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（Avant i Polar Lipids，Birmingham，AL）１０．５μモル、コレステロール（Sigma Ch emical Co.，St．Louis，MO）７５μモル、トリオレイン（Avanti Polar Lipids ，Birmingham，AL）９．０μモルを含む溶液５ｍＬを入れた。この溶液を脂質成分と呼ぶ。工程２）シタラビン（Upjohn，Kalamazoo，MI）又は硫酸アミカシン（Bristol M yers Squibb，Syracuse，NY）を水に溶解したいずれかの第１水性成分５ｍＬを、脂質成分を含む上記のガラス円筒中に加えた。シタラビンの場合、濃度は４１ｍＭ、８２ｍＭ、１６４ｍＭ、２４６ｍＭ、３６９ｍＭ及び４１０ｍＭを用いた。硫酸アミカシンの場合、濃度は１３ｍＭ、２６ｍＭ、５２ｍＭ及び８８ｍＭを用いた。硫酸アミカシンはアミカシン１分子当たり１．８硫酸イオンを含む。従って、濃度を２．８倍すると浸透圧が得られる。工程３）油中水型エマルジョンを作るために、工程２の混合物をホモジェナイザー（AutoHomoMixer，Model M．Tokushu Kika，Osaka，Japan）で９０００ｒｐｍの速度で８分撹拌した。工程４）水中に懸濁したクロロホルム小球を作るために、４％デキストロース及び４０ｍＭリシンを含む溶液２０ｍＬを、油中水型エマルジョンの上に層としてのせ、４０００ｒｐｍの速度で６０秒混合してクロロホルム小球を形成した。工程５）多小胞リポソームを得るために、ガラス円筒中のクロロホルム小球懸濁液を、水３０ｍＬ、グルコース（３．５ｇ／１００ｍＬ）及び遊離−塩基性リシン（４０ｍＭ）を含む１０００ｍＬのエーレンマイヤーフラスコ中に注いだ。フラスコ中の懸濁液に窒素ガスを７Ｌ／分を通して、３７℃で２０分かけてゆっくりとクロロホクムを蒸発させた。生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）６０ｍＬをフラスコに加えた。次に６００ｘｇで１０分遠心することによりリポソームを分離し、上清を捨てて、ペレットを生理食塩水５０ｍＬ中に再懸濁した。６００ｘｇで１０分遠心することによりリポソームを分離した。上清を捨てて、ペレットを食塩水中に再懸濁した。Ｂ．多小胞リポソームの平均直径の測定上述したようにして製造した多小胞リポソームの平均直径を、Horiba，Inc．（Irvine，CA）から販売されているモデルＬＡ−５００粒子サイズ分析計を用いるレーザー光回折法によって測定した。得られるリポソームの平均直径は５〜２０μｍの範囲であった。Ｃ．シタラビンの血漿放出アッセイこの実施例では、３７℃でヒト細胞質中におけるシタラビン及びアミカシンの放出速度が、第１水性成分中の医薬濃度の増加につれて低下することを示す。シタラビンを含む多小胞リポソーム懸濁液５００μＬを、Ｏ型のスクリーニングしたヒト血漿１．２ｍＬに加えた。混合物を３７℃でインキュベートした。所望の間隔で少量を取り出し、６００ｘｇで遠心して多小胞リポソームをペレットとして分離し、ペレットをイソプロピルアルコール中に溶解し、ペレット分画中のシタラビンの量を高圧液体クロマトグラフィー（例えば、U.S．Pharmacopeia ，XXII，p.376，1990）によってアッセイした。Ｄ．アミカシンの血漿放出アッセイアミカシンを含む多小胞リポソーム懸濁液５００μＬを、Ｏ型のスクリーニングしたヒト血漿１．２ｍＬに加えた。混合物を３７℃でインキュベートし、所望の間隔で少量を取り出した。６００ｘｇで遠心して多小胞リポソームをペレットとして分離した。ペレットをイソプロピルアルコール中に溶解し、ペレット分画中のアミカシンの量をポリスチレンビーズを用いる蛍光免疫アッセイによってアッセイした（Varma-Nelson et al.，Therapeutic Drug Monitoring，13:260-262 ,1991）。保持されたアミカシンの割合を、この方法で得られた量から計算した。表２に示すように、種々の当初濃度又は浸透圧で第１水性成分中に用いた全薬剤の％として表す封入率は、半減期として示すヒト血漿中への多小胞リポソームからの放出速度に顕著な影響を及ぼした。薬剤放出の半減期は単純な指数関数減衰モデルを推定して計算した。表２のデータは３つの実験の平均及び標準偏差を示す。シタラビンのヒト血漿への放出の半減期は、等張条件と比較しての高張条件下で本質的に変化しなかった。このデータはまた、製造中の多小胞リポソーム中に封入される生物学的活性物質の濃度（ｍＯｓｍとして示す）を約２４６ｍＯｓｍまで増加すると、シタラビン及びアミカシンの半減期値が増加することを示す。多重小胞性小胞内に封入される第１水性成分の浸透圧を増加すると、予期せぬことに、ヒト血漿に長期間わたって薬剤を徐放するのに増強された用途をもつリポソームを製造することができた。実施例２本実施例は、血漿中でのシタラビンの放出速度が、生物学的活性物質の濃度を固定した場合に、第１水性成分の浸透圧が増加するにつれ低下することを示す。多小胞リポソームは実施例１の工程１から工程５で記載したようにして製造したが、工程２は以下のように改変した。工程２）水、又は３重量％グルコース、又は５重量％グルコースのいずれかに８２ｍＭ濃度で溶解した第１水性成分であるシタラビン（Upjohn，Kalamazoo，MI ）５ｍＬを、脂質成分を含む上記のガラス円筒中に加えた。得られる溶液の計算した浸透圧は、それぞれ８２、２２０及び３３５ｍＯｓｍである。種々のグルコース濃度におけるヒト血漿中、３７℃でインキュベーションした後の多小胞リポソーム中に保持されるシタラビンの％を、インキュベーション時間の関数として測定した。表３は、０、３及び５重量％グルコースを含む組成物について、平均直径、シタラビンの封入率、及び３７℃におけるヒト血漿への放出の半減期を示す。各場合につき３回の実験の平均及び標準偏差を示す。生物学的活性物質を固定濃度に維持しておいて、浸透圧スペーサーであるグルコースを種々の濃度で導入すると、ヒト血漿中でインキュベートした多小胞リポソームからの放出速度に顕著な影響を与えた。表３のデータが示すように、ヒト血漿への多小胞リポソームからのシタラビンの放出半減期は、第１水性成分の浸透圧が増加するにつれ増加する。約２４８ｍＯｓｍまでは第１水性成分の浸透圧の増加につれ封入率も増加する。実施例３この実施例では、生理食塩水溶液を第２水性成分として用いて多小胞リポソームが製造できることを示す。多小胞リポソームは以下のようにして製造した。工程１）清浄なガラス円筒（内径２．５ｃｍｘ高さ１０．０ｃｍ）中に、クロロホルム中にジオレオイルホスファチジルコリン（Avanti Polar Lipids，Birming ham，AL）４６．５μモル、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（Avant i Polar Lipids，Birmingham，AL）１０．５μモル、コレステロール（Sigma Ch emical Co.，St．Louis，MO）７５μモル、トリオレイン（Avanti Polar Lipids ，Birmingham，AL）９．０μモルを含む溶液５ｍＬを入れた。この溶液を標準脂質成分と呼ぶ。工程２）シタラビン（Upjohn，Kalamazoo，MI）を水に２４６ｍＭの濃度で溶解した第１水性成分５ｍＬを、標準脂質成分を含む上記のガラス円筒中に加えた。工程３）油中水型エマルジョンを作るために、ホモジェナイザー（AotoHomoMixe r，Model M，Tokushu Kika，Osaka，Japan）を用いて９０００ｒｐｍの速度で８分混合した。工程４）水中に懸濁したクロロホルム小球を作るために、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）２０ｍＬを、油中水型エマルジョンの上に層としてのせ、４０００ｒｐｍの速度で６０秒混合してクロロホクム小球を形成した。これによって水中油中水の二重エマルジョンが構成される。工程５）ガラス円筒中のクロロホルム小球懸濁液を、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）３０ｍＬを含む１００ｍＬのエーレンマイヤーフラスコ中に注いだ。フラスコ中の懸濁液に窒素ガスを７Ｌ／分を通して、３７℃で２０分かけてゆっくりとクロロホルムを蒸発させた。５０μｍのフィルターを通してリポソームを濾過した。６００ｘｇで１０分遠心することにより懸濁液からリポソームを分離した。上清を捨てて、ペレットを食塩水中に再懸濁した。水中の２４６ｍＭシタラビン溶液、及び第２水性成分として生理食塩水を用いて製造される多小胞リポソームからのシタラビンの放出の半減期は、１５．７± ４．８日であった。この値は、水中の２４６ｍＯｓｍシタラビン溶液、及び第２水性成分としてグルコース−リシン溶液を用いて製造される多小胞リポソームからの放出の半減期と同様であった（１４．１±１．５日、表２参照）。実施例４本発明の多小胞リポソームのin vivoでの徐放性を試験するために薬動力学的研究をマウスで行った。実施例１に記載するようにして多小胞リポソームを製造した。第１水性成分として８２ｍＭ又は２４６ｍＭ濃度の水中シタラビン溶液を用いた。得られた多小胞リポソームを生理食塩水で２回洗浄し、６００ｘｇで１０分遠心し、生理食塩水中に懸濁液１ｍＬ当たり１０ｍｇシタラビン濃度で保存した。２．５５±０．２５ｍｇシタラビンを含む多小胞リポソームをマウス（ＣＤｌＩＣＲ、異系交配、雌）に腹腔内注射した。注射前に、注射しようとするシタラビンと同じ量を含む多小胞リポソームの懸濁液の少量をゼロ時サンプルとして取り出した。注射の１０８時間後までの種々の時点で、マウスを頸部脱きゅうによって殺した。生理食塩水２００μＬを含む試験管中に、未希釈腹腔液２０μＬを腹腔から回収した。試験管をEppendorf Microfuge(Brinkman Instruments，Westbury，NY )中で、最大速度で１分遠心した。上清とペレットを分離した。上述のようにして腹腔液２０μＬを回収した後、腹腔を２〜３ｍｌの０．９％ＮａＣｌ溶液で入念に洗浄した。全てのサンプルを分析まで−２０℃に保存した。ペレットと上清分画、及び洗浄分画をイソプロピルアルコールで可溶化した。可溶化分画中のシタラビンの量を高圧液体クロマトグラフィーでアッセイした（ U.S．Pharmacopeia，XXII:376，1990参照）。ペレット分画中のシタラビン濃度（μｇ／ｍＬ）を表４に示す。同じく表４に示す腹腔中にあるシタラビンの全量（μｇ）は、未希釈腹腔液サンプル２０μＬのペレット及び上清分画中の量、及び腹腔洗浄分画中の量を加えて得られた。薬動力学的データ、すなわちペレット及び上清分画中、ならびに全量中のシタラビン濃度の時間依存的減少を、シングルコンパートメントモデル及び重みゼロを用いるＲＳＴＲＩＰプログラム（MicroMath Scientific Software，Salt Lake City，Utah）で分析した。減衰半減期を表４に示す。表４に示すデータの８２ｍＭ（初期シタラビン濃度）製剤と、２４６ｍＭ（初期シタラビン濃度）製剤とを比較すると、２４６ｍＭ製剤よりも８２ｍＭ製剤の方がシタラビンの全量が迅速に減少していた。ペレット分画中の濃度も２４６ｍＭ製剤よりも８２ｍＭ製剤の方が迅速に減少する。従って、この研究では、生理学的関連環境、すなわち実施例１で示すようなヒト血漿においてのみでなく、in vivoにおいても、シタラビン放出速度は、第１水性成分の浸透圧が増加するにつれて低下することを示す。本発明の現時点における好ましい態様を開示目的のために記載したが、付属の請求の範囲で定義される本発明の精神の範囲内で変更が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を含む多小胞リポソームの製造方法：（ａ）少なくとも１つの有機溶媒、少なくとも１つの両親媒性脂質及び中性脂質を含む脂質成分と、少なくとも１つの生物学的活性物質を含む第１水性成分との２つの非混和性成分から油中水型エマルジョンを形成し；（ｂ）前記油中水エマルジョン型を第２水性成分中に分散させて溶媒小球を形成し；（ｃ）前記溶媒小球から有機溶媒を除去して多小胞リポソームを形成し；ここで、第１水性成分の浸透圧は、多小胞リポソームから生理学的に関連のある水性環境への放出速度を調節するように選択される、前記製造方法。２．両親媒性脂質が正味の負電荷をもつ両親媒性脂質である請求項１記載の方法。３．両親媒性脂質がカルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びホスファチジン酸からなる群より選択される請求項２記載の方法。４．脂質成分がステロールをさらに含む請求項２記載の方法。５．脂質成分が双性イオン脂質をさらに含む請求項４記載の方法。６．両親媒性脂質が双性イオン脂質である請求項１記載の方法。７．双性イオン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン及びリソホスファチジルコリンからなる群より選択される請求項５記載の方法。８．両親媒性脂質が正味の正電荷をもつ請求項１記載の方法。９．両親媒性脂質がジアシルトリメチルアンモニウムプロパン、ジアシルジメチルアンモニウムプロパン及びステアリルアミンからなる群より選択される請求項８記載の方法。１０．第１水性成分が、第１水性成分の浸透圧を増加するための浸透圧スペーサーをさらに含む請求項１、２、４、６又は８記載の方法。１１．脂質成分がリン脂質及びリン脂質混合物からなる群より選択される請求項１、２、４、６又は８記載の方法。１２．生理学的に関連のある水性環境が貯蔵媒体である請求項１又は６記載の方法。１３．生理学的に関連のある水性環境が、生理食塩水、緩衝塩溶液、ヒト血漿、血清、脳脊髄液、皮下液、滑膜液、眼内液、腹腔内液、筋肉内液、又はその組み合わせを含むがこれに限定されない群より選択される請求項１又は６記載の方法。１４．少なくとも１つの両親媒性脂質が正味の負電荷をもつ請求項１記載の方法。１５．両親媒性脂質をコレステロールとの混合物として提供する請求項１記載の方法。１６．親油性の生物学的活性物質を脂質成分との混合物として提供する請求項１記載の方法。１７．中性脂質がトリオレイン、トリカプリリン、ダイズ油、ラード、牛脂、トコフェロール、スクワレン及びその組み合わせからなる群より選択される請求項１１記載の方法。１８．有機溶媒がエーテル、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル、ＣＯ₂、ＮＨ₃、フレオン及びその組み合わせからなる群より選択される請求項１記載の方法。１９．生物学的活性物質が親水性である請求項１記載の方法。２０．前記２つの成分の乳化を機械的撹拌、超音波エネルギー及びノズル霧状化からなる群より選択される方法を用いて行う請求１記載の方法。２１．小胞内の水性隔室の平均サイズ及び数を、選択した乳化方法の時間及び持続によって決定する請求項２０記載の方法。２２．第１水性成分が実質的に水と生物学的活性物質とからなる請求項１記載の方法。２３．第２水性成分が遊離−塩基性リシン、遊離−塩基性グリシン及び遊離−塩基性ヒスチジン及びその組み合わせからなる群より選択される物質と；グルコース、スクロース、トレハロース、コハク酸塩、シクロデキストリン、アルギニン、ガラクトース、マンノース、マルトース、マンニトール、グリシン、リシン、クエン酸塩、ソルビトール、デキストラン、塩化ナトリウム及びその組み合わせからなる群より選択される物質とを含む請求項１記載の方法。２４．第２水性成分が単糖、二糖、多糖及びその他のポリマーからなる群より選択される物質を含む請求項１記載の方法。２５．有機溶媒の除去を、スパージング、蒸発、溶媒小球上へのガス通気、スプレードライ及びその組み合わせからなる群より選択される溶媒除去システムによって行う請求項１記載の方法。２６．生物学的活性物質が抗アンギナ剤、抗生物質、抗ヒスタミン剤、抗新生物剤、モノクローナル抗体、放射線核種、トランキライザー、抗不整脈剤、抗糖尿病剤、抗高血圧剤、抗ウイルス剤、ホルモン、神経伝達物質、抗喘息剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、グリコシド心臓剤、免疫調節剤、核酸及び類似体、放射線造影剤、ステロイド、血圧上昇剤、ワクチン、鎮静剤及び鎮痛薬並びにその組み合わせからなる治療カテゴリーから選択される請求項１又は６記載の方法。２７．生物学的活性物質がシタラビンである請求項１又は６記載の方法。２８．生物学的活性物質がアミカシンである請求項１又は６記載の方法。２９．生物学的活性物質が治療的タンパク質及びペプチドからなる群より選択される請求項１又は６記載の方法。３０．生物学的活性物質が除草剤、殺虫剤、殺菌剤、殺昆虫剤及びその組み合わせからなる群より選択される請求項１又は６記載の方法。３１．生物学的活性物質が核酸からなる群より選択される請求項１又は６記載の方法。３２．生物学的活性物質が化粧品、香料、湿潤剤及びその組み合わせからなる群より選択される請求項１又は６記載の方法。３３．結合された標的特異的リガンド又は親水性コーティングをもつ請求項１又は６記載の多小胞リポソーム。３４．請求項１又は２記載の多小胞リポソーム中に封入された生物学的活性化合物を患者に投与することを含む、生物学的活性化合物で患者を治療する方法。３５．請求項２５、２６、２９又は３０記載の多小胞リポソームを患者に投与することを含む、生物学的活性化合物で患者を治療する方法。３６．持続した放出のためにその中に封入された生物学的活性物質を含む第１水性成分をもつ多小胞リポソームであって、前記多小胞リポソームは生理学的に関連のある水性環境中にあり、また活性物質を生理学的に関連のある環境中に放出させる速度を低下させるために第１水性成分の浸透圧を増加するか、あるいは前記放出速度を上昇させるために第１水性成分の浸透圧を減少する、前記多小胞リポソーム。３７．第１水性成分が所望の浸透圧を得るために十分な生物学的活性物質を含む請求項３４記載の多小胞リポソーム。３８．第１水性成分が所望の浸透圧を得るために十分な浸透圧スペーサーをさらに含む請求項３５記載の多小胞リポソーム。３９．生理学的に関連のある水性環境中への多小胞リポソームからの活性薬剤の放出速度を制御する方法であって、リポソームからの活性薬剤の放出速度を低下させるために第１水性成分の浸透圧を調節することを含み、浸透圧の増加は放出速度の低下をもたらす前記方法。４０．第１水性成分の浸透圧を変更するために第１水性成分中に浸透圧スペーサーを導入する請求項３９記載の方法。