JPH10503012A - Ｎ−末端タンパク質配列決定試薬と、アミノ酸誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なアルコキシチオカルボニルイミダゾールは少量のポリペプチドサンプルのＮ−末端配列決定のための新規な試薬を形成する。これらの試薬はアルコキシチオ尿素誘導体を形成し、このアルコキシチオ尿素誘導体は酸によって切断されて、チオヒダントインに転位しない安定なチアゾリノンとしてＮ−末端アミノ酸を除去する。このチアゾリノンは誘導体化されて、例えば蛍光基又は質量分光法によって検出可能なイオン化可能基のような、検出可能な基を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎ−末端タンパク質配列決定試薬と、アミノ酸誘導体の製造方法 本発明はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｇ ｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって授与される助成金Ｎｏ．ＧＭ４６０２ ２下での政府の支援を受けてなされた。政府は本発明にある一定の権利を有する 。 発明の分野 本発明はタンパク質及びペプチドのＮ−末端からの逐次分解に関する。さらに 詳しくは、本発明は小ペプチドサンプルの逐次Ｎ−末端分解に関する。蛍光性基 又は特定の検出方法に対して適当な官能基を含有する求核試薬によって誘導体化 されたチアゾリノン誘導体としてペプチド Ｎ−末端アミノ酸を除去することに よって、配列決定の感度は強化される。 発明の背景 タンパク質化学者の主要な目標の１つはタンパク質の機能をその構造に関連づ けることである。この目標に留意して、タンパク質の構造特徴づけの初期段階は タンパク質の一次構造の決定又は配列決定である。現在、一次構造決定は逐次分 解(successive degradation)に関するＥｄｍａｎ化学を用いる自動化シークエン サーでのタンパク質の配列決定によって又はタンパク質の遺伝子の、確立された ＤＮＡ配列決定法による配列決定によって達成することができる。タンパク質の 配列決定はＤＮＡの配列決定よりも困難でかつ緩慢であると見なされることがで きるが、タンパク質の配列決定は後者の方法によっては得られない情報をしばし ば与える。タンパク質の配列決定は遺伝子配列からは予測不能な情報、例えばタ ンパク質分解切断部位の位置のような、翻訳後修飾に関する情報を与える。さら に、これは予測された遺伝子配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの設計 に用いることができるタンパク質配列の情報を知るための重要な方法である。多 くの場合に、タンパク質配列分析から得られる、これらのオリゴヌクレオチドプ ローブは特定の遺伝子のクローニングへの唯一のルートである。 現在、タンパク質配列分析は４０年以上前にＥｄｍａｎによって開発された化 学（１）（引用した参考文献は本明細書末尾の引用文献表に列記する）（図１） を用いる自動化シークエンサーの使用によって主として達成されている。このと き以来、機器の改良（２、３）がますます少量（ミリモル〜ピコモル）のサンプ ルの配列決定を可能にしているが、本来の化学的原理は本質的に無変化のままで ある。現在の自動化機器は１０〜５０ピコモルのサンプルに基づく１０〜２０サ イクルの配列決定を可能にする。 最近、タンパク質の単離方法の進歩は、ピコモル未満量で組織中に存在する生 物学的に重要なタンパク質の単離を可能にしている。一次元及び二次元電気泳動 （膜へのエレクトロブロッティングによる）、マイクロカラム液体クロマトグラ フィー及び毛管電気泳動のような方法が１０〜１００フェムトモルレベルまでの タンパク質とペプチドの精製を可能にしている。これらのタンパク質の多くはヒ ト疾患の発生と治療とに重要な役割を有することが判明している。サンプルの少 量を必要とするに過ぎない、タンパク質配列決定の改良方法はこれらのタンパク 質をクローン化し、発現させるために必要な配列情報を得ることを可能にし、そ れによって、これらの重要なタンパク質の構造機能面を研究することを可能にす ると考えられる。この情報が合理化された薬物設計と遺伝子療法とによってヒト 疾患の治療の進歩の段階を設定することができると一般に予想される。 フェトモルレベルまでのタンパク質配列決定の感度の向上に対する主要な制限 要因には、放出されるフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の固有の検 出可能性がある。２６９ｎｍにおける吸収によって検出されるＰＴＨアミノ酸は 、比較的低い吸光係数を有する。この波長における吸光度測定に関連した固有バ ックグランドノイズ及び配列決定に用いられる試薬からの化学的バックグランド も検出限界の一因になる。ＰＴＨアミノ酸の分離のためにＨＰＬＣではなく毛管 電気泳動による吸光度検出の使用を含む最近発表された方法はフェムトモル検出 を示しているが（４）、この方法はナノリットル未満量の注入を必要とする。現 在の自動化シークエンサーテクノロジーでは、注入のためにＰＴＨアミノ酸は５ ０〜２００μｌ量に溶解される。この量の小画分（例えば、０．１ナノリットル のサンプルサイズ）のみの使用が必要なことは、毛管電気泳動を用いる検出感度 を向上することの価値を否定する。 放射性標識した、又は発色団を有する、又は蛍光性のイソチオシアネート試薬 の使用によるＥｄｍａｎ分解の感度を向上させるために非常に多くの試みがなさ れている。４−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−イソチオシ アネート（ＤＡＢＩＴＣ）、最初にＣｈａｎｇ等によって述べられた（５）高度 に発色性を有する試薬は主としてＤＡＢＩＴＣ／ＰＩＴＣ二重カップリング方法 （６）によって手動配列決定用試薬として用いられているが、これは自動化固相 配列決定（７）にも用いられている。さらに最近では、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ等（ ８、９）は、ＤＩＴＣ誘導体化アミノプロピルガラス繊維シート上にタンパク質 を固定して行うＤＡＢＩＴＣ固相配列決定方法を報告した。配列分析は２０〜５ ０ピコモルレベルにおいて行われ、これは従来の方法を凌駕する実質的な改良で あるが、現在の気相配列分析よりもまだ低い感度である。例えばフルオレセイン イソチオシアネート（１０、１１）及びダンシル含有イソチオシアネート（１２ 〜１６）のような、蛍光試薬も感度強化試薬として評価されている。これらの試 薬を用いて製造された合成アミノ酸誘導体はＨＰＬＣ分析によってピコモル未満 の感度を示すが、自動化配列分析中の気相Ｅｄｍａｎ分解の感度を凌駕していな い。一般に、イソシアネート試薬への大きい嵩のある発色団の使用はＥｄｍａｎ 分解の誘導体化反応と切断反応との効率を妨害する。これらの試薬によるカップ リング反応と切断反応との阻害は立体効果と電子効果との組合せによって惹起さ れると仮定される。放射性標識した試薬はオートラジオ分解を受けて生成物収量 の減少と標識副生成物の増加とを生じるので、放射性標識した試薬の使用も好結 果を生じないことが判明している。ポストカラム(postcolumn)蛍光試薬と反応す るように設計された、例えば４−（Ｂｏｃ−アミノメチル）−ＰＩＴＣのような 修飾フェニルイソチオシアネートも研究されているが（１７）、切断反応中に副 反応を受けてアミノ基の欠損を生じることが判明している（１４）。 修飾Ｅｄｍａｎ試薬の使用の代替え手段はアニリノチアゾリノン（ＡＴＺ）− アミノ酸中間体と感度強化性求核試薬との反応である。放射性アミンの使用はフ ェムトモルレベルで検出されることができるアミノ酸誘導体を生じたが（１８、 １９）、放射性物質の取り扱いが不便であった。Ｈｏｒｎ等（２０）は転化試薬 としてのＭｅＯＨ／ＨＣｌの使用に関する初期の研究（２１）を、フェニルチオ カ ルバミルアミノ酸エステルの形成を生じる、発色団を有する又は蛍光性のアルコ ールを包含するように拡張している。Ｔｓｕｇｉｔａ等（２２）は最近、ＡＴＺ アミノ酸を４−アミノフルオレセインと反応させて、高度に蛍光性のフェニルチ オカルバミルアミノ酸アミノフルオレセインアミド（ＰＴＣＡＦ−アミノ酸）を 生じる、Ｅｄｍａｎ分解スキームの修飾を報告している（図２）。ＰＴＣＡＦア ミノ酸が逆相ＨＰＬＣによって分離され、０．１〜１フェムトモルレベルにおい て検出可能であった。幾つかの既知及び未知のタンパク質サンプルがＡｐｐｌｉ ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ４７７Ａシークエンサーを用いて１００フェムトモル 〜１０ピコモルで配列決定されると報告された。ある一定のアミノ酸（例えば、 Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ）が対処されるときには、不良な収率が得られ る。Ａｓｐを通して配列決定する場合には、収率が全く得られない。 このアプローチは機能することができるが、幾つかの問題を欠点として有して おり、これらの問題がこのアプローチをより高感度の配列決定という目的に対し て殆ど価値のないものにしている。この方法に関するその現在の形態における最 も重要な困難性は親水性アミノ酸、特にスレオニン、ヒスチジン、グルタメート 、リシン及びグルタミンによって得られる低い収率と、アスパルテートによって 生じる収率の完全な欠失とである。これらの低い収率はＥｄｍａｎ反応中に得ら れるチアゾリノンの非反応性チオヒダントイン誘導体への制御されない転位に起 因することが判明した（３３）。Ｐａｖｌｉｋ等によるＡＴＺアミノ酸のアミノ リシスに関する最近の研究（２３）は、ＡＴＺアミノ酸の多く、特に親水性アミ ノ酸が非常に迅速により熱力学的に安定なＰＴＨアミノ酸に転位しうることを示 しているので、ＡＴＺアミノ酸が自動化機器の転化フラスコに移されるときまで に、５〜７０％のいずれかのアミノ酸が既に転化されている。ＡＴＺアミノ酸が ひと度ＰＴＨに転化されたならば、もはやアミノフルオレセインと反応すること ができない。この説明は出願人が上記で示したデータと一致する。上記データと の類似によって、例えばＡＴＺ類似体とアルコールとの反応（２０）のような、 ＡＴＺ類似体を蛍光性分子によって標識することに基づく化学スキームがＮ−末 端ミクロ配列決定(microsequencing)の感度を実質的に高めないことが予想され る。 エレクトロスプレイ(electrospray)質量分光法による検出に最適な正に荷電し たアミノ酸類似体を生成するＥｄｍａｎ型試薬が、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ等によっ て述べられている（３４、３５）。この化学は配列決定すべきサンプルの共有結 合カップリングを必要とする。 ミクロ配列分析、タンパク質とペプチドとの精製及びその他の関連技術の現在 の状況は、最近のレビュー（２４）及び幾つかの最近のモノグラフ（２５〜３０ ）の対象である。既知の精製方法の能力に適合するためには例えばミクロ配列分 析のような分析方法の改良が必要であることが結論された。ミクロ配列分析の改 良は広範囲に及ぶ効果を有する可能性があった。例えば脳脊髄液のような複雑な 生物学的サンプルの相違を２次元−電気泳動（３１）によって検出し、有意義な 配列情報をも得ることができることは、種々な病的な状態を理解するために非常 に重要である。 発明の概要 本発明は、Ｎ−末端ポリペプチド配列決定に有用な試薬を合成するためのある 一定のチオカルボニル化合物とアルコールとの新規な使用法を含む。Ｎ−末端ア ミノ酸を試薬によって誘導体化して、配列決定すべきポリペプチドのＮ−末端に おけるアルコキシチオ尿素誘導体を得る。次に、誘導体化ポリペプチドを酸によ って処理して、チオヒダントインに転位することができないチアゾリノン誘導体 としてＮ−末端アミノ酸を特異的に取り出す。このチアゾリノン誘導体は別の分 子とさらに反応して、エレクトロスプレイ質量分光法を包含する多くの方法のい ずれかによって最適に検出可能な誘導体を形成することができる。このような代 替え検出方法は配列決定の感度をピコモル範囲からフェムトモル範囲にまで改良 する手段を提供する。本発明の方法は現在入手可能な機器を用いて容易に自動化 される。 図面の説明 図１（先行技術）は、Ｎ−末端タンパク質配列決定のＥｄｍａｎ化学を示す。 図２（先行技術）は、Ｔｓｕｇｉｔａ等によって述べられているＥｄｍａｎ化 学の改良を示す（１９）。 図３は、本発明によって提供されるＮ−末端タンパク質配列決定の１実施態様 を示す。 図４は、実施例１１に述べるサンプルの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。ピークＡは 出発ペプチドＤＹＭである。ピークＢは予想されるＮ−末端メトキシチオカルボ ニル誘導体である。 図５は、トリフルオロ酢酸との反応後のピークＢの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。 ピークＡはメトキシチオカルボニルアミノ酸である。ピークＢは短縮化されたペ プチドである。 図６は、実施例ＩＩＩに述べた配列決定反応の逆相ＨＰＬＣ分析を説明する。 図７は、実施例ＩＶに述べた配列決定反応の逆相ＨＰＬＣ分析を説明する。図 ７はまた、ＭＴＺアスパルテートとダンシルエチレンジアミンとの反応中に形成 される蛍光性生成物の逆相ＨＰＬＣ分析（実施例Ｖ）を説明する。 図８は、質量分光法によって検出可能なアミノ酸誘導体を生成するためのメト キシチアゾリノン（ＭＴＺ）アミノ酸誘導体とジメチルアミノプロピルアミンと の反応を説明する。 図９は、ＹＧＧＦＬとＭＴＣＩとの反応の逆相ＨＰＬＣ分析（実施例ＶＩ）を 説明する。 図１０は、ＹＧＧＦＬのメトキシチオカルボニル誘導体とトリフルオロ酢酸と の反応の逆相ＨＰＬＣ分析（実施例ＶＩＩ）を説明する。 図１１は、ＭＴＺアスパルテートとジメチルアミノプロピルアミンとの反応中 に形成される生成物の逆相ＨＰＬＣ分析（実施例ＶＩＩＩ）を説明する。 図１２Ａは、ダンシルエチレンジアミンの式である。 図１２Ｂは、５−（アミノメチル）フルオレセインの式である。 図１３は、ダンシルエチレンジアミンとの反応後のアスパルテートとアラニン とのＭＴＺ誘導体の蛍光検出を伴う逆相ＨＰＬＣ分析（実施例ＩＸ）を説明する 。 図１４、９−（アミノメチル）フルオレセインとの反応後のアラニンのＭＴＺ 誘導体の蛍光検出を伴う逆相ＨＰＬＣ分析（実施例ＩＸ）を説明する。 発明の詳細な説明 放出されるチオヒダントインアミノ酸に蛍光性又は高度発色団タグを与えるた めに今まで用いられている試薬の大部分が、カップリング反応を仲介するために 用いられる求電子性基としてのイソチオシアナト基に基づいている。イソチオシ アネートはＮ−末端アミノ酸とチオ尿素基を形成する。このように、チオ尿素の 硫黄原子が完全に配置されるので、酸性化時に、速度論的に好ましい五員チオゾ リノン環が形成されることができ、これはＮ−末端アミノ酸のみを特異的に切断 する。大抵の発色団を有する及び蛍光性の化合物はフェニルイソチオシアネート （ＰＩＴＣ、Ｎ−末端タンパク質配列決定に一般に用いられる試薬）のフェニル 環に比べるときに比較的大きい。典型的に、反応性イソチオシアナト基を含有す る大きい発色団を有する化合物をＰＩＴＣの代わりに用いる場合には、カップリ ング及び／又は切断反応は立体効果と電子効果との組合せによって速度論的に不 利に影響される。これは配列決定の不良な初期及び反復収率を生じる。 放出されたアミノ酸に蛍光性又は発色団タグを導入するための代替え手段は、 通常のＥｄｍａｎ分解中に形成されたアニリノチアゾリノン（ＡＴＺ）類似体（ 図１）と求核性アミン（２２）又は蛍光性アルコール（２０）との反応に基づい ている。これらの方法の両方は、配列決定中に形成されるチアゾリノン類似体が 求核性発色団を添加するために充分に長く安定であることを想定する。しかし、 実際の実施では、この想定は完全には真実ではないことが判明している。最近の 研究（２３）は、ＡＴＺアミノ酸の有意な割合が実際はそれらの熱力学的により 安定なチオヒダントイン類似体に直ちに転位することを実証している。チオヒダ ントイン類似体がひと度形成されたならば、チオヒダントイン類似体はもはや求 核性タグと反応して、所望の蛍光性誘導体を形成することはできない。熱力学的 により安定なチオヒダントインへのこの転位はより親水性のアミノ酸によるとさ らに顕著であることが観察された。この観察は出願人の研究室から、自動化配列 決定をＴｓｕｇｉｔａ等が述べたアミノフルオレセイン手段（２２）によって実 施したときに観察されたデータと一致する。親水性アミノ酸によって得られる配 列決定の収率は不良であり、アスパラギン酸に関しては無である。これとは対照 的に、疎水性アミノ酸によって得られる収率は良好であることが観察された。通 常のＥｄｍａｎ化学中に得られるチアゾリノン誘導体と、蛍光性又は発色団タグ を含有する求核性アミン又はヒドロキシル分子との反応は、親水性アミノ酸（特 にアスパルテート）のチアゾリノン誘導体があまりにも迅速に非反応性チオヒダ ントイン誘導体に転位し、したがって、これらのアミノ酸の効果的な標識(tagg ing)を阻止するので、Ｎ−末端配列分析の感度を高めるために（分析のために少 量のサンプルを必要とするに過ぎない）実際的な方法ではないと結論することが できる。この問題を解決するための１つの方法は、チオヒダントイン誘導体に転 位することができず、したがって、発色団基又は蛍光性基を含有するアミン又は ヒドロキシル求核試薬によって定量的に誘導体化されることができるチアゾリノ ン誘導体を配列決定中に得ることである。このような安定なチアゾリノンの形成 と、それに続く、種々な検出方法に最適な基による標識とが本発明の課題である 。 したがって、本発明の重要な態様は、配列決定すべきポリペプチドのＮ−末端 にアルコキシチオ尿素誘導体を形成するために有用な配列決定試薬を含む。この ような試薬は式Ｉ： ［式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖若しくは分枝鎖アルキル基又はフェニル基であ る］を有する。Ｒによって表示されるアルキル基は非限定的にメチル、エチル、 プロピル、イソプロピル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、 ヘプチル、イソヘプチル、オクチル及びイソオクチル基を包含する。好ましいＲ は、式Ｉ試薬がメトキシチオカルボニルイミダゾール（ＭＴＣＩ）であるように 、メチル基である。 式Ｉ化合物は炭素数１〜８のアルカノール又はフェノールとチオカルボニルジ イミダゾールとの反応によって合成することができる。例えば、ＭＴＣＩはメタ ノールとチオカルボニルジイミダゾールとの反応によって合成することができる 。この反応は好ましくは２５℃〜７０℃の温度において、アルコールとチオカル ボニルジイミダゾールとを１．５：１．０の比で含有する溶液にアルカノール又 はフェノールを加えることによって達成される。 安定なチアゾリノンを形成することができる化学を図３に示す。誘導体化のた めに用いる例えばメトキシチオカルボニルイミダゾール（ＭＴＣＩ）のような式 Ｉ試薬を、メタノールとチオカルボニルジイミダゾールとの反応によって最初に 合成する。このように形成された、例えばＭＴＣＩのような、イミダゾールは例 えばアセトニトリルのような溶媒中で室温において少なくとも１週間安定である 。次に、これらの試薬を、配列決定すべきポリペプチドのＮ−末端との反応に用 いる。誘導体化したペプチドを既知の方法で、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ ）、ヘキサフルオロ酪酸又は塩酸によって切断して、チアゾリノン誘導体を形成 する。このように形成されたチアゾリノン誘導体を次に、例えば蛍光検出のため の蛍光団、又は紫外線若しくは可視光線吸光度検出のための高度発色団、又は質 量分光法検出のための容易にイオン化される若しくは永久的にイオン化される基 を含有するアミノ求核試薬のような、検出のための最適な基を含有するアミノ含 有求核試薬によって処理する。 本発明の好ましい実施では、１００ピコモル〜０．５マイクロモルの配列決定 すべきポリペプチドを含有する溶液を２５℃〜７０℃において０．５マイクロモ ル〜１００ミリモルの特定の(selected)式Ｉ試薬を含有する溶液と反応させる。 ３種類の適当な溶媒はジメチルホルムアミド、アセトニトリル及びメタノールで ある。 この方法は任意の所望の又は必要な回数のサイクルを通して実施することがで きる。配列決定することができるポリペプチドのサイズに制限はない。しかし、 多くの場合に、ポリペプチドは２〜５００アミノ酸残基を含有する。 配列決定すべきタンパク質又はペプチドはこの分野において現在用いられる種 々な固体サポートに共有結合的に又は非共有結合的に結合することができる。例 はＰＶＤＦ、ガラス繊維フィルター、シリカビーズ、ポリエチレン、カルボキシ ル修飾ポリエチレン又はＰＶＤＦ、及び多孔質ポリテトラフルオロエチレン（Ｚ ｉｔｅｘ）を包含する。ペプチド又はタンパク質を次に、図３に示す試薬によっ て誘導体化して、ペプチジル誘導体を形成する。次に、切断反応を液体又は気体 のトリフルオロ酢酸又は他の酸（例えば、塩酸）によっておこなって、チアゾリ ノンアミノ酸を形成する。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が好ましい。このように 形成されたチアゾリノンを次に蛍光性アミン又は他の適当な試薬によって処理す る。この化学によって形成されたチアゾリノンと反応することが判明している適 当な蛍光性アミンの例は、ダンシルカダベリン及びアミノメチルフルオレセイン を包含する。 本発明によると、形成されたチアゾリノンを、蛍光又は紫外線の他に多くの種 々な種類の検出を可能にするために次に用いることができる幾つかの基のいずれ かによって誘導体化する。このような例は質量分光法、化学ルミネセンス及び電 子捕捉(electron capture)を包含する。 実施例Ｉ メタノールとチオカルボニルジイミダゾールとの反応によるメトキシチオカル ボニルイミダゾール（ＭＴＣＩ）の合成 メタノール（７．６ミリモル）を１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（ １５ｍｌのアセトニトリル中の５ミリモル）に加えた。この反応を５０℃におい て１時間撹拌した。ＭＴＣＩの存在と構造をＦＡＢ質量分光法によって確認した 。予測どおりＭＨ＋＝１４３が得られた。 本発明において有用な試薬化合物は、炭素数２−８の直鎖又は分枝鎖アルカノ ール（ＲＯＨ（式中Ｒは炭素数２−８のアルキル基である））をチオカルボニル ジイミダゾールと反応させることによって合成されることができる。 本発明は、また、炭素数１−８のアルカノールと、種々な脱離基を与えるチオ カルボニル化合物との反応生成物の使用をも含む。このようなチオカルボニル類 は、下記のものを包含する： １，１’−チオカルボニルジ−（１Ｈ）−ピリドン： これは、ＲＯＨと反応してアルコキシ（２−ヒドロキシピリジル）チオカルボ ニルを与える、 これは、ＲＯＨと反応して、アルコキシ（２−ピリジルチオノカルボネート） を与える、及び ビス（カルボキシメチル）トリチオカルボネート これは、ＲＯＨと反応して、アルコキシ（２−チオカルボキシメチル）チオカ ルボニルを与える。 実施例ＩＩ トリペプチドＤＹＭとＭＴＣＩとの反応 １００μｌのアセトニトリル中のＭＴＣＩ（１０μｌ）を１００μｌのジメチ ルホルムアミド（ＤＭＦ）中のトリペプチド、ＤＹＭ（１００ｎｍｏｌｅ）に加 えた。この反応を５０℃において３０分間インキュベートした。次に、サンプル を真空遠心機で乾燥させ、水中０．１％トリフルオロ酢酸（１００μｌ）中に再 溶解させ、逆相ＨＰＬＣによって分析した（図４）。予測ペプチド生成物（Ｎ− 末端メトキシチオカルボニル誘導体；ピークＢ）は、ＦＡＢ／ＭＳ（ＭＨ＋＝５ ０２）によって同定され、約９５％収率で得られた。ピークＡは、出発ペプチド ＤＹＭ（ＭＨ＋＝４２８）である。次に、ピークＢを、１００μｌの無水トリフ ルオロ酢酸（ＴＦＡ）で５０℃において１５分間処理し、真空遠心機で乾燥させ 、水中０．１％トリフルオロ酢酸（１００μｌ）中に再溶解させ、逆相ＨＰＬＣ によって分析した（図５）。短縮化された(shortened)ペプチド（ＤＹＭ、ピー クＢ）（ＭＨ＋＝３１３）及びメトキシチオカルボニルアミノ酸（ピークＡ、Ｍ Ｈ＋＝２０８）が定量的収量で検出された。 実施例ＩＩＩ メトキシチオカルボニルチアゾリノンアスパルテートとジメチルアミノプロピ ルアミンとの反応 別の実験において、ＤＹＭペプチドの乾燥ＴＦＡ切断反応を、５μｌのジメチ ルアミノプロピルアミンを含有する１００μｌのＤＭＦに溶解させ、この反応を 乾燥させ、５０℃において３０分間インキュベートした。この反応を乾燥させ、 水中０．１％トリフルオロ酢酸（１００μｌ）中に再溶解させ、逆相ＨＰＬＣに よって分析した（図６）。短縮化されたペプチド（ＹＭ）（ピークＢ、ＭＨ＋＝ ３１３）及びメトキシチオカルボニルアスパルテート（ジメチルアミノプロピル ）アミド（ピークＡ、ＭＨ＋＝２９２）が定量的収量で検出された。ジメチルア ミノプロピルアミノ基は、質量分光法による検出のために有用であることが以前 に発見されている（３２）。 実施例ＩＶ メトキシチオカルボニルチアゾリノンアスパルテートとダンシルエチレンジア ミンとの反応 別の実験において、ＤＹＭペプチドの乾燥ＴＦＡ切断反応を、５μｍｏｌｅの ダンシルエチレンジアミンを含有する１００μｌのＤＭＦに溶解させ、５０℃に おいて１５分間インキュベートした。この反応を乾燥させ、水中０．１％トリフ ルオロ酢酸（１００μｌ）中に再溶解させ、逆相ＨＰＬＣによって分析した（図 ７）。短縮化されたペプチド（ＹＭ）（ピークＣ、ＭＨ＋＝３１３）及びメトキ シチオカルボニルアスパルテート（ダンシルエチレンアミン）アミド（ピークＡ 、ＭＨ＋＝４８３）が定量的収量で検出された。ピークＢは、過剰なダンシルエ チレンジアミンである。ダンシルエチレンアミノ基は、蛍光によるアミノ酸類似 体の検出のために適する。 実施例Ｖ ＭＴＺ−アスパルテートとダンシルエチレンジアミンとの反応中で形成された 生成物のＨＰＬＣ分析 ＤＹＭペプチドの乾燥ＴＦＡ切断反応を、５μｍｏｌｅのダンシルエチレンジ アミンを含有する１００μｌのＤＭＦに溶解させ、５０℃において１５分間イン キュベートした。この反応を乾燥させ、水中０．１％トリフルオロ酢酸（１００ μｌ）中に再溶解させ、逆相ＨＰＬＣによって分析した。図７に関しては、短縮 化されたペプチド（ＹＭ）（ピークＣ、ＭＨ＋＝３１３）及びメトキシチオカル ボニルアスパルテート（ダンシルエチレンアミン）アミド（ピークＡ、ＭＨ＋＝ ４８３）が定量的収量で検出された。ピークＢは、過剰なダンシルエチレンジア ミンである。 ＭＴＣＩによって上首尾に誘導化され、次に、同様にＴＦＡによって切断され たペプチドは、ＤＹＭ、ＬＡＰ、ＴＶＬ、ＧＷ、ＡＦＰ、ＹＧＬＤＶＦ及びＹＧ ＧＦＬを包含する。 質量分光法による放出アミノ酸の検出 最近の進歩は、放出アミノ酸の検出手段として、クロマトグラフィー法（実行 可能なオプション）の代わりに質量分光計を使用している。考えられる有利な点 には、検出は質量に基づき保持時間に基づかないので、翻訳後修飾アミノ酸を分 析する、速度、感度及び能力がある。好結果を得るためには、容易にイオン化さ れる官能基を、検出すべきアミノ酸上に配置されなければならない。イソチオシ アネートを基本とするいくつかの試薬が、この目的のために開示されている。こ れらは、４−ニトロフェニルイソチオシアネート（３６）、３−［４’（エチレ ン−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ）フェニル］−２−イソシアネート（３４） 及びジメチルアミノプロピルイソチオシアネート（３２）がある。チオベンゾイ ル化化学に基づく代替え法も、提案されている（３７）。ジメチルアミノプロピ ルイソチオシアネートに関する以前の研究は、チオヒダントインアミノ酸がジメ チルアミノプロピル基によって容易に合成されること、及びそれらがエレクトロ スプレイ(electrospray)質量分光法により２０−５０フェムトモルレベルにおい て検出されることができることを示した。しかし、この化学の自動化を目的とし た初期の研究は、ＴＦＡ切断反応により形成された正に荷電したアミノ酸類似体 を抽出することができる溶媒が配列決定すべきサンプルの洗い流しも生じること を示した。この問題への一つの解決法は、配列決定すべきサンプルを固体サポー トに共有結合させることである。 本発明は、質量分光法のために必要な正に荷電した基が抽出反応後まで導入さ れない、より魅力的な解決法を提供する。図３において形成されたチアゾリジノ ンは、自動化シークエンサーの転化フラスコへ抽出され、次に、図８によって示 すように質量分光計へ導入される前にジメチルアミノプロピルアミンと反応され る。 この化学は質量分光法による検出のための他の既述された化学を凌駕する幾つ かの利点を有する。これらの利点は下記を包含する： １．面倒な試薬合成が不要である。 ２．アミノ酸類似体の形成後の荷電官能基の添加が非常に多様な荷電基の使用 を可能にし、試薬、副生成物とアミノ酸類似体との間のより広範囲の質量分離を 可能にする。質量とイオン化とに関して最適な荷電基を選択することができる。 ３．サンプルの非共有結合添加がルーチンの自動化配列分析を可能にする。 実施例ＶＩ ＹＧＧＦＬとＭＴＣＩとの反応の速度論 ２．５μｌのアセトニトリル中のＭＴＣＩ（１．３μｍｏｌｅ）をペンタペプ チド、ＹＧＧＦＬ（１０μｌのメタノール中の３５ｎｍｏｌｅ）に加えた。この 反応を５０℃においてインキュベートした。指定時間にアリコートを取り出し、 逆相ＨＰＬＣによって分析した（図９）。予測されたペプチド生成物（Ｎ−末端 メトキシチオカルバミル誘導体；ピーク２）がＦＡＢ／ＭＳによって同定された （ＭＨ＋＝６３０）。ピーク１は出発ペプチド、ＹＧＧＦＬ（ＭＨ＋＝５５６） である。これらの条件下で反応は５０℃において３０分間以内に完了する。ＭＴ ＣＩのペプチドに対するより高い比はより速い反応速度を生じる。 実施例ＶＩＩ ＹＧＧＦＬのメトキシチオカルバミル誘導体とトリフルオロ酢酸との反応 ＹＧＧＦＬのＭＴＣ誘導体（ピーク２、図９）を５０℃において無水トリフル オロ酢酸（ＴＦＡ）によって処理した。指定時間にアリコートを取り出し、２０ ０μｌの水を加えて、反応を停止させた(quenched)。サンプルを真空遠心機内で 乾燥させ、水中０．１％トリフルオロ酢酸（１００μｌ）中に再溶解し、逆相Ｈ ＰＬＣによって分析した（図１０）。短縮化されたペプチド（ＧＧＦＬ、ピーク １）（ＭＨ＋＝３９３）とメトキシチオカルバミルアミノ酸とがクロマトグラフ ィーに用いた条件下で同時に溶出した。ピーク２は未切断ＭＴＣ−ＹＧＧＦＬ（ Ｍ Ｈ＋＝６３０）である。反応は１０分間以内に完了することが判明した。 実施例ＶＩＩＩ ＭＴＺ−アスパルテートとジメチルアミノプロピルアミンとの反応中に形成さ れる生成物のＨＰＬＣ分析 ＤＹＭペプチドのＴＦＡ切断反応の乾燥物を５μｌのジメチルアミノプロピル アミンを含有する１００μｌのＤＭＦ中に溶解し、５０℃において３０分間イン キュベートした。反応を乾燥させ、水中０．１％トリフルオロ酢酸（１００μｌ ）中に再溶解し、逆相ＨＰＬＣによって分析した。図１１において短縮化された ペプチド（ＹＭ）（ピークＢ、ＭＨ＋＝３１３）とメトキシチオカルボニルアス パルテート（ジメチルアミノプロピル）アミド（ピークＡ、ＭＨ＋＝２９２）と が定量的収量で検出された。 蛍光による放出アミノ酸の検出 配列決定中に形成されるアミノ酸誘導体への蛍光基の導入は問題を有すること が実証されている。最も一般的に用いられるアプローチはイソチオシアナト官能 基を高度に発色団を有する又は蛍光性の分子に配置することに基づくものであっ た。大抵の発色団を有する又は蛍光性の化合物は、ＰＩＴＣ上のフェニル環に比 べた場合に、比較的大きいので、カップリング及び／又は切断反応は立体効果と 電子効果との組合せによって速度論的に(kinetically)不利に影響される。この 問題は低い初期収率とサイクル毎の大きい遅延とを生じる。 蛍光基を導入するための代替え方法は、Ｅｄｍａｎ化学中に通常形成されるＡ ＴＺ誘導体と蛍光性アミンとの反応を包含した（２２）。このアプローチは親水 性アミノ酸（特にアスパラギン酸）の誘導体化の低収率という欠点を有する。こ れは自動化配列決定条件下での非反応性のチオヒダントイン誘導体への制御され ない転化に起因することが判明した（３３）。 本発明はこの問題を、チオヒダントインに転位することがありえずかつ蛍光性 アミン試薬によって定量的に誘導体化されることができるチアゾリノン誘導体を 形成する配列決定化学を用いて解決する（図３）。ダンシルエチレンジアミン（ 図１２Ａ）と５−（アミノメチル）フルオレセイン（図１２Ｂ）とが代表的であ る。 実施例ＩＸ ダンシルエチレンジアミンとの反応後のアスパルテートとアラニンとのＭＴＺ 誘導体の蛍光検出を伴う逆相ＨＰＬＣ メトキシチオカルボニルアスパルテート（ダンシルエチレンアミン）アミド（ １１．５ｐｍｏｌ）とメトキシチオカルボニルアラニン（ダンシルエチレンアミ ン）アミド（１４ｐｍｏｌ）誘導体との逆相ＨＰＬＣをＣ−１８（５μ、３００ Å）Ｒｅｌｉａｓｉｌカラム（２．０ｍｍＸ２５０ｍｍ）上でＢｅｃｋｍａｎ１ ２６ポンプモジュールに基づいてＳｈｉｍａｄｚｕ（ＲＦ−５３５）蛍光検出計 を用いて実施した。図１３を参照のこと。このカラムを溶媒Ａ（１０％アセトニ トリル含有水中の１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０）から溶媒Ｂ（５０％ｎ−プロパ ノール含有水中の１０ｍＭリン酸、ｐＨ７．０）までの不連続勾配によって３５ ℃において０．２５ｍｌ／分の流速度で溶出した。用いた勾配は次の通りであっ た：４分間３０％Ｂ、３０分間にわたって３０〜４０％Ｂ、１５分間にわたって ４０〜５０％Ｂ、６分間にわたって５０〜８０％Ｂ。蛍光の励起と放出とを３３ ４ｎｍと５２０ｎｍとにおいてそれぞれモニターした。範囲設定(range setting )は８においてであった。図１３はピークＡ（アラニン）とＤ（アスパルテート ）とを包含する。 実施例Ｘ ５−（アミノメチル）フルオレセインとの反応後のアラニンのＭＴＺ誘導体の 蛍光検出を伴う逆相ＨＰＬＣ メトキシチオカルボニルアラニン（アミノメチルフルオレセイン）アミド（５ ｆｅｍｔｏｍｏｌ）誘導体の逆相ＨＰＬＣをＣ−１８（５μ、３００Å）Ｒｅｌ ｉａｓｉｌカラム（２．０ｍｍＸ２５０ｍｍ）上でＢｅｃｋｍａｎ１２６ポンプ モジュールに基づいてＳｈｉｍａｄｚｕ（ＲＦ−５３５）蛍光検出計を用いて実 施した。このカラムを溶媒Ａ（１０％アセトニトリル含有水中の１０ｍＭリン酸 、ｐＨ８．０）から溶媒Ｂ（５０％ｎ−プロパノール含有水中の１０ｍＭリン酸 、ｐＨ８．０）までの直線勾配によって３５℃において０．２５ｍｌ／分の流速 度で溶出した。用いた勾配は次の通りであった：４分間２％Ｂ、３０分間にわた って２〜６０％Ｂ。蛍光の励起と放出とを４９１ｎｍと５１６ｎｍとにおいてそ れ ぞれモニターした。範囲設定は１６においてであった。ｐＨ８．０におけるこの 研究のためにＲｅｌｉａｓｉｌカラムを選択したが、この理由はこれらのシリカ に基づくカラムがこのような高いｐＨにおいて安定であるからである。図１５に 関して、ピークＡはメトキシチオカルボニルアラニン（アミノメチルフルオレセ イン）アミド（５−フェムトモル）である。 まとめ １．本発明は、質量分光法又は蛍光のいずれかによる検出のために最適な基を 含有するアミン求核試薬によって定量的に標識されることができるチアゾリノン 誘導体を形成する、Ｎ−末端配列決定のための新規な試薬を提供する。 ２．エレクトロスプレイ質量分光法によるジメチルアミノプロピル基含有チオ ヒダントイン誘導体の検出に関する今までの経験（３２）に基づくと、感度の予 測レベルは約２０〜５０フェムトモルであると考えられる。 ３．この研究で形成されるアミノ酸誘導体の５−（アミノメチル）フルオレセ インによる蛍光測定に基づくと、蛍光検出を伴う逆相ＨＰＬＣ（２ｍｍ内径カラ ムによる）による検出感度は１〜５フェムトモルであると予想される。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９５年５月２日 【補正内容】 １．ポリペプチドのＮ−末端分解方法であって、次の工程： （ｉ）前記ポリペプチドをアルコキシチオカルボニルイミダゾールと反応させ て、前記ポリペプチドのＮ−末端にチオ尿素誘導体を生成する工程と； （ii）前記誘導体を酸と反応させて、前記ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸の チアゾリノン誘導体を得る工程と； （iii）前記チアゾリノン誘導体を試薬と反応させて、検出可能な化合物を得 る工程と を含む方法。 ２．工程（ｉ）の前記アルコキシチオカルボニルイミダゾールが式： ［式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分枝鎖アルキル基又はフェニル基である］ で示される、請求項１記載の方法。 ３．各工程（ｉ）を２５℃〜７０℃の温度において行う、請求項１又は請求 項２に記載の方法。 ４．工程（ｉ）の前記アルコキシチオカルボニルイミダゾールがメトキシチ オカルボニルイミダゾールである、請求項１記載の方法。 ５．工程（ii）の前記酸がトリフルオロ酢酸、ヘキサフルオロ酪酸又は塩酸 である、請求項１又は請求項２に記載の方法。 ６．工程（ｉ）の前記ポリペプチドと、工程（ii）の前記チオ尿素誘導体と 、工程（iii）の前記チアゾリノン誘導体とがジメチルホルムアミド又はアセト ニト リル又はメタノール中の溶液状態である、請求項１又は請求項２に記載の方法。 ７．工程（ｉ）の前記ポリペプチドをサポートに結合させる、請求項１又は 請求項２に記載の方法。 ８．工程（ｉ）の前記ポリペプチドと工程（ｉ）の前記アルコキシチオカル ボニルイミダゾールとがジメチルホルムアミド又はアセトニトリル又はメタノー ル中の溶液状態であり、前記溶液が１００ピコモル〜５ナノモルの前記ポリペプ チドと、０．５マイクロモル〜１００ミリモルの前記アルコキシチオカルボニル イミダゾールとを含有する、請求項１又は請求項２に記載の方法。 ９．工程（iii）の前記試薬が蛍光基又は質量分光法によって検出可能な、 イオン化可能な基を含有する、請求項１又は請求項２に記載の方法。 １０．前記ポリペプチドが２〜５００アミノ酸残基を含有し； 前記アルコキシチオカルボニルイミダゾールがメトキシチオカルボニルイミダ ゾールであり； 検出可能な化合物を得るための前記試薬が蛍光基又は質量分光法によって検出 可能な、イオン化可能な基を与える、請求項１又は請求項２に記載の方法。 １１．炭素数１〜８の直鎖若しくは分枝鎖アルカノール又はフェノールを１ ，１’−チオカルボニルジイミダゾールと反応させて、式： ［式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分枝鎖アルキル基又はフェニル基である］ で示される化合物を得ることを含む方法。 １２．前記アルカノールがメタノール又はエタノール又はプロパノール又は イソプロパノールである、請求項１１記載の方法。 １３．アルカノールと１，１’−チオカルボニルジイミダゾールとの前記反 応を２５°〜７０°において行う、請求項１１又は請求項１２記載の方法。 １４．ポリペプチドのＮ−末端分解方法であって、次の工程： （ｉ）前記ポリペプチドをアルコキシチオカルボニルイミダゾールと反応させ て、前記ポリペプチドのＮ−末端にアルコキシチオ尿素誘導体を生成する工程と ； （ii）前記誘導体を酸と反応させて、前記ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸の チアゾリノン誘導体を得る工程と； （iii）工程（ii）で形成された反応混合物から前記チアゾリノン誘導体を抽 出する工程と； （iv）前記抽出チアゾリノンを質量分光法によって検出可能な、イオン化可能 な基を有する試薬と反応させる工程と を含む方法。 １５．前記工程（iv）のイオン化可能な基を有する試薬がジメチルアミノプ ロピルアミンである、請求項１４記載の方法。 １６．工程（ｉ）の前記ポリペプチドがポリビニルジフルオリド又はポリテ トラフルオロエチレンに非共有結合的に結合される、請求項１又は請求項２に記 載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ポリペプチドのＮ−末端分解方法であって、次の工程： （ｉ）前記ポリペプチドをアルコキシチオカルボニルイミダゾールと反応させ て、前記ポリペプチドのＮ−末端にチオ尿素誘導体を生成する工程と； （ii）前記誘導体を酸と反応させて、前記ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸の チアゾリノン誘導体を得る工程と； （iii）前記チアゾリノン誘導体を試薬と反応させて、検出可能な化合物を得 る工程と を含む方法。 ２．工程（ｉ）の前記アルコキシチオカルボニルイミダゾールが式： ［式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分枝鎖アルキル基又はフェニル基である］ で示される、請求項１記載の方法。 ３．各工程（ｉ）を２５℃〜７０℃の温度において行う、請求項１又は請求 項２に記載の方法。 ４．工程（ｉ）の前記アルコキシチオカルボニルイミダゾールがメトキシチ オカルボニルイミダゾールである、請求項１記載の方法。 ５．工程（ii）の前記酸がトリフルオロ酢酸、ヘキサフルオロ酪酸又は塩酸 である、請求項１又は請求項２に記載の方法。 ６．工程（ｉ）の前記ポリペプチドと、工程（ii）の前記チオ尿素誘導体と 、工程（iii）の前記チアゾリノン誘導体とがジメチルホルムアミド又はアセト ニトリル又はメタノール中の溶液状態である、請求項１又は請求項２に記載の方 法。 ７．工程（ｉ）の前記ポリペプチドをサポートに結合させる、請求項１又は 請求項２に記載の方法。 ８．工程（ｉ）の前記ポリペプチドと工程（ｉ）の前記アルコキシチオカル ボニルイミダゾールとがジメチルホルムアミド又はアセトニトリル又はメタノー ル中の溶液状態であり、前記溶液が１００ピコモル〜５ナノモルの前記ポリペプ チドと、０．５マイクロモル〜１００ミリモルの前記アルコキシチオカルボニル イミダゾールとを含有する、請求項１又は請求項２に記載の方法。 ９．工程（iii）の前記試薬が蛍光基又は質量分光法によって検出可能な、 イオン化可能な基を含有する、請求項１又は請求項２に記載の方法。 １０．前記ポリペプチドが２〜５００アミノ酸残基を含有し； 前記アルコキシチオカルボニルイミダゾールがメトキシチオカルボニルイミダ ゾールであり； 検出可能な化合物を得るための前記試薬が蛍光基又は質量分光法によって検出 可能な、イオン化可能な基を与える、請求項１又は請求項２に記載の方法。 １１．式： ［式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分枝鎖アルキル基又はフェニル基である］ で示される化合物。 １２．Ｒがメチル基、エチル基又はプロピル基若しくはイソプロピル基であ る、請求項１１記載の化合物。 １３．式： で示される化合物。 １４．炭素数１〜８の直鎖若しくは分枝鎖アルカノール又はフェノールを１ ， １’−チオカルボニルジイミダゾールと反応させて、式： ［式中、Ｒは炭素数１〜８の直鎖又は分枝鎖アルキル基又はフェニル基である］ で示される化合物を得ることを含む方法。 １５．前記アルカノールがメタノール又はエタノール又はプロパノール又は イソプロパノールである、請求項１３記載の方法。 １６．アルカノールと１，１’−チオカルボニルジイミダゾールとの前記反 応を２５°〜７０°において行う、請求項１３又は請求項１５記載の方法。 １７．ポリペプチドのＮ−末端分解方法であって、次の工程： （ｉ）前記ポリペプチドをアルコキシチオカルボニルイミダゾールと反応させ て、前記ポリペプチドのＮ−末端にアルコキシチオ尿素誘導体を生成する工程と ； （ii）前記誘導体を酸と反応させて、前記ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸の チアゾリノン誘導体を得る工程と； （iii）工程（ii）で形成された反応混合物から前記チアゾリノン誘導体を抽 出する工程と； （iv）前記抽出チアゾリノンを質量分光法によって検出可能な、イオン化可能 な基を有する試薬と反応させる工程と を含む方法。 １８．前記工程（iv）のイオン化可能な基を有する試薬がジメチルアミノプ ロピルアミンである、請求項１７記載の方法。 １９．工程（ｉ）の前記ポリペプチドがポリビニルジフルオリド又はポリテ トラフルオロエチレンに非共有結合的に結合される、請求項１又は請求項２に記 載の方法。