JPH10503485A

JPH10503485A - 親水性金属錯体

Info

Publication number: JPH10503485A
Application number: JP8505472A
Authority: JP
Inventors: ヘルマン，ルパート; ヨーゼル，ハンス−ペーター; パッペルト，グンター; ヴェグトル，フリッツ; フロムーバーガー，ブルーノ; イッスバーナー，イェルグ
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー
Priority date: 1994-07-25
Filing date: 1995-07-24
Publication date: 1998-03-31
Anticipated expiration: 2015-07-24
Also published as: EP0772616A1; CN1152923A; EP0772616B1; JP3583436B2; ES2143059T3; CN1075817C; US5981286A; DE59507438D1; ATE187732T1; WO1996003410A1

Abstract

(57)【要約】本発明は新規な親水性金属錯体および免疫検定における発光マーカー基としてのこれらの使用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】親水性金属錯体本発明は新規な親水性金属錯体および免疫検定における発光マーカー基としてのこれらの使用に関する。発光性金属錯体は当該技術分野において知られている。EP-A-0 178 450には、免疫学的に活性な物質に結合したルテニウム錯体が開示されており、このルテニウム錯体は窒素を含有する複素環を少なくとも２つ有する３つの同一または異なる２環または多環配位子を含有しており、これらの配位子の少なくとも１つが１以上の−ＳＯ₃Ｈまたは−ＣＯＯＨなどの水溶性化基で置換されており、またこれらの配位子の少なくとも１つが１以上の−ＣＯＯＨなどの反応性基で直接またはスペーサー基を介して置換されており、さらにこれらの配位子が窒素原子を介してルテニウムに結合している。 EP-A-0 580 979には、電気化学発光のマーカー基としてのオスミウムまたはルテニウム錯体の使用が開示されている。ビピリジンなどの窒素含有複素環がこれらの錯体の配位子として示されている。WO 87/06706 には、電気化学発光測定のマーカー基として好適な別の金属錯体が開示されている。当該技術分野で既知の金属錯体の欠点は、酸素消失と光解離とによる電気化学発光測定における低量子収率および／またはタンパク質への高度の非特異的結合である。したがって、本発明の目的は当該技術分野の現状の欠点を少なくとも一部分除去することであった。驚くべきことに、発光金属錯体中にＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオおよび／またはＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位、特にエチレングリコールおよび／またはプロピレングリコール単位を導入すると、免疫学的反応性物質とこれらの錯体との複合体の吸着が減少し、したがって免疫検定におけるこの複合体の安定性および回復性もまた向上することがわかった。さらに量子収率の上昇も達成される。さらに、ポリヒドロキシ単位を導入することによって金属錯体の性質もまた改善されることがわかった。これらのポリヒドロキシ単位を伸展させると数世代の樹枝を有する樹枝状構造を形成することができる。さらにポリアミン構造を取り込むことによって、電気化学発光に必要な電子供与体を錯体の配位子領域中に直接組み込ませることが可能になる。本発明におけるさらに別の改良は、配位子同士が好ましくは親水性スペーサーを介して互いに１つの結合または複数の結合で連結しているカゴ状または半カゴ状形態の金属錯体に関する。これもまた光安定性の実質的改良および酸素消失の減少をもたらす。したがって本発明の主題の１つは、一般式（Ｉ）：［Ｍ(Ｌ₁Ｌ₂Ｌ₃)］_n−Ｘ_mＡ（Ｉ）［式中、Ｍは希土類または遷移金属イオンから選択される２価または３価金属カチオンである。Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は同一または異なっており、窒素を含有する複素環を少なくとも２つ有する配位子であり、Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は窒素原子を介して金属カチオンに結合している。Ｘは配位子Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃の少なくとも１つと共有結合している反応性または活性化し得る官能基である。ｎは１〜 10の整数、ｍは１〜６、好ましくは１〜３の整数である。Ａは荷電のバランスのために必要な１または数個の陰性荷電基を表す。］で示される金属錯体であって、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位およびポリヒドロキシ単位から選択される少なくとも１つの親水性基を含有する錯体である。金属錯体は好ましくは発光性金属錯体、すなわち検出し得る発光反応を生じ得る金属錯体である。この発光反応を例えば蛍光または電気化学発光測定によって検出することができる。この錯体における金属カチオンは、例えば遷移金属または希土類金属である。金属は好ましくはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウムが特に好ましい。ルテニウムが最も好ましい。配位子Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は窒素を含有する複素環を少なくとも２つ有する配位子である。ビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナントロリルなどの芳香族複素環が好ましい。配位子Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は特に好ましくはビピリジンおよびフェナントロリン環系から選択される。錯体の反応性または活性化し得る官能基Ｘは、免疫学的活性物質に結合し得る反応性基または単純な方法でこうした反応性基に変換可能な活性化し得る基である。基Ｘは、好ましくはカルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物などの活性化カルボン酸基または活性エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、イミダゾリルエステル若しくはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステル）、マレイミド、アミン、カルボン酸、チオール、ハロゲン化物、ヒドロキシルまたは光活性化し得る基である。この他に錯体は荷電の平衡化のために必要な１または数個の陰性荷電基Ａを含有する。好適な陰性荷電基の例はハロゲン化物、ＯＨ^-、カーボネート、アルキルカルボキシレート、例えばトリフルオロアセテート、サルフェート、ヘキサフルオロホスフェートおよびテトラフルオロボレート基である。ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロアセテートおよびテトラフルオロボレート基が特に好ましい。本発明の金属錯体は、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位およびポリヒドロキシ単位から選択される少なくとも１つの親水性基を含有する点において、当該技術分野で既知の金属錯体と異なっている。ポリヒドロキシ単位は好ましくは式（IIａ）または（IIｂ）： −ＮＲ−Ｗ（IIａ） −Ｏ−Ｗ（IIｂ）［式中、Ｗは少なくとも２つのヒドロキシ基を有する有機残基を表し、Ｒは水素またはＣ₁−Ｃ₅アルキル、好ましくは水素またはＣ₁−Ｃ₃アルキルを表す。］で示される基から選択される。有機残基Ｗは好ましくは２〜６、および特に好ましくは２〜４のヒドロキシ基を含有する。さらに、Ｗは有利には２〜10、特に３〜６の炭素原子を含むべきである。好適なポリヒドロキシ単位の特定の例として、グリセロールまたはアミノポリアルコールなどのポリアルコールの残基が挙げられる。好ましいアミノポリアルコールは、トリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパントリオール）である。この場合、ポリヒドロキシ単位は式ＮＨ−Ｃ（ＣＨ₂ＯＨ）₃である。ポリアルコールまたはアミノポリアルコールは好ましくはエステルまたはアミドの形態で金属錯体に結合している。本発明の金属錯体のＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオおよびＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位は好ましくはＣ₂単位であり、特にエチレンオキシ単位である。錯体は１金属カチオン当たり好ましくは１〜30、特に好ましくは２〜20のＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオまたはＣ₂−Ｃ₃ アルキレンアミノ単位を含む。これらの単位は金属錯体の複素環配位子の置換基の成分である。これらは配位子の１つと反応性若しくは活性化し得る官能基Ｘとの間のリンカー中、および／または単一置換基中に存在させることができる。アルキレンオキシ、アルキレンチオまたはアルキレンアミノ単位を、場合によっては官能基Ｘを保有していてもよい橋頭を介して互いに連結することもできる。また一方で、いくつかの錯体単位を橋頭を介して互いに連結することもできる。本発明の金属錯体の好ましい態様の例を以下に示す。本発明の最初の態様において、本発明の金属錯体は一般式（III）：［式中、Ｍ、ＸおよびＡは上記のように定義される。Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅ およびＲ₆は同一または異なっており、それぞれ１または数個の置換基を表す。ただし、Ｘは置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅またはＲ₆の中の１つを介して配位子の１つに連結しており、置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅またはＲ₆の中の少なくとも１つがＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位から選択される親水性基の少なくとも１つを含有している。］を有する。錯体の配位子を、破線で示した基の存在または不存在によって、フェナントロリンまたはビピリジン系に置換することもできる。配位子上の置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆は、親水性基を含有しない場合は、好ましくは水素、Ｃ₁−Ｃ₅アルキルおよび特にＣ₁−Ｃ₃アルキルである。全体として、親水性基は好ましくは１〜30、特に好ましくは２〜20のアルキレンオキシ、アルキレンチオおよび／またはアルキレンアミノ単位、特にエチレンオキシ単位を含む。親水性基は結合し得る官能基Ｘと配位子の１つとの間のリンカーの成分であってもよい。この場合、金属錯体は好ましくは一般式（IIIａ）：［式中、Ｍ、ＸおよびＡは上記のように定義される。Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は上記のように定義される。ｓは０〜６、好ましくは１〜４の整数である。ＹはＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位、Ｃ₂−Ｃ₃ アルキレンアミノ単位、特にエチレンオキシ単位から選択される、１〜10、好ましくは２〜６の親水性単位を有する親水性リンカー基を表す。］を有する。しかし、官能基Ｘは親水性リンカーを介して配位子に結合しなくてもよい。この場合、本発明の金属錯体は好ましくは一般式（IIIｂ）：［式中、Ｍ、ＸおよびＡは上記のように定義される。Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は上記のように定義される。ただし、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄および／またはＲ₅が１〜10、好ましくは２〜６のＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位および／またはＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位、特にエチレンオキシ単位をそれぞれ含む親水性置換基を含有する。］を有する。式（IIIｂ）の化合物の例を図１ａおよび１ｂに示す。これらの化合物は基Ｘ −マレイミド（図１ａ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（図１ｂ）−と１つの配位子との間のリンカー中にのみ親水性を有する。しかし、その他の配位子も同様に親水性置換基を有していてもよい。式（IIIｂ）の化合物の例を図１ｂに示す。この場合、基ＸはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。本発明の金属錯体の配位子は互いに連結して金属錯体が半カゴ状またはカゴ状の形態をしていてもよい。本発明の半カゴ状またはカゴ状の形態の金属錯体の好ましい態様は一般式（IV）：［式中、Ｍ、Ｘ、ｎおよびＡは上記のように定義される。Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃ は同一または異なっており、それぞれ、上記定義のような、ビピリジンまたはフェナントロリン配位子上の１または数個の置換基を表す。Ｙはそれぞれの場合において、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位およびＣ₂ −Ｃ₃アルキレンアミノ単位、特にエチレンオキシ単位から選択される、１〜10 の親水性単位を包含する親水性リンカー基を表す。］を有する。式（IV）中の置換基Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃が必要に応じて親水性リンカー基を介して互いに共有結合で連結している場合には、式（IV）の錯体はカゴ状の形態となる。半カゴ状形態の式（IV）の錯体の例を図２および３ａに示す。カゴ状形態の錯体の例を図３ｂに示す。図２中の基Ｘはカルボキシル残基である。図３ａおよび３ｂにおいて金属カチオンおよびアニオンは示されていない。式（IV）の錯体はモノマーとしてのみではなく、好ましくは５個までの個々の金属錯体で構成されるオリゴマーとして存在してもよい。この場合、連結し得る官能基Ｘは、例えばフェニル核などの芳香族核上の置換基でよく、この時、芳香族核に残っている置換位置の２または数個が半カゴ状またはカゴ状形態の金属錯体によって置換されてもよい。式（IV）のオリゴマー金属錯体の例を図４および５に示す。これらの図において、金属イオンおよびアニオンは示されていない。本発明のさらに別の好ましい態様において、金属錯体がポリヒドロキシ単位で置換されており、一般式（Ｖ）：［式中、Ｍ、ＸおよびＡは上記のように定義される。Ｚはリンカー基を表す。Ｒ'₁、Ｒ'₂、Ｒ'₃、Ｒ'₄およびＲ'₅は同一または異なっており、それぞれ１または数個の置換基、例えば水素またはＣ₁−Ｃ₅アルキル、特にＣ₁−Ｃ₃アルキルを表す。Ｒ'₁、Ｒ'₂、Ｒ'₃および／またはＲ'₄がポリヒドロキシ単位を含む親水性置換基を含有している場合には、ｓは０〜６、好ましくは１〜４の整数である。］を有する。金属錯体（Ｖ）の配位子Ｘは親水性リンカー、例えば式（IIIａ）のリンカーまたは式（IIIｂ)のリンカーを介して、配位子に結合することができる。置換基Ｒ'₅は好ましくは水素またはＣ₁-Ｃ₅アルキル基、特にＣ₁−Ｃ₃アルキル基である。式（Ｖ）の錯体の例を図６に示す。基Ｘはカルボキシル残基である。一般式（Ｖ）の金属錯体のポリヒドロキシ単位のＯＨ基は場合によっては親水性基、例えばＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位および／またはＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位によって置換される。本発明の特定の態様において、ポリヒドロキシ単位のＯＨ基の親水性置換基は一般式（VIａ）または（VIｂ）： −Ａ₁−ＮＲ−Ｗ₁（Ａ₂−ＮＨ−Ｗ₂）_n' （VIａ） −Ａ₁−Ｏ−Ｗ₁（Ａ₂−Ｏ−Ｗ₂）_n' （VIｂ）［式中、 −Ａ₁およびＡ₂は同一または異なっており、リンカー基を表し、 −Ｗ₁およびＷ₂は同一または異なっており、少なくとも２つのヒドロキシ基を有する有機残基を表し、 −Ｒは水素またはＣ₁−Ｃ₅アルキル、好ましくは水素またはＣ₁−Ｃ₃アルキルを表し、並びに −ｎ’は０またはＷ₁のヒドロキシ基の数に相当する。］の樹枝状体である。リンカー基Ａ₁およびＡ₂は好ましくは式（ＣＨ₂）_m'Ｃ（＝Ｏ）−、（式中、m 'は１〜５、特に１〜３）である。基Ｗ₁およびＷ₂は好ましくは式（IIａ）、（IIｂ）の基と同様に定義されるポリヒドロキシ単位である。n'が０の場合は、第１世代の樹枝状体が存在する。 n'がＷ₁のヒドロキシ基の数に相当する場合は、第２世代の樹枝状体が存在する。樹枝状体のヒドロキシ末端基は、場合によっては例えば式Ａ₃−Ｒ'（式中、Ａ₃ はリンカー基Ａ₁およびＡ₂と同様に定義され、Ｒ’はＣ₁−Ｃ₅アルキルおよび好ましくはＣ₁−Ｃ₃アルキルを表す）を有するリンカー基によって置換されていてもよい。本発明の金属錯体は、金属塩（例えばハロゲン化金属）を適当な配位子と反応させ、必要に応じて続いてヘキサフルオロホスフェートまたはテトラフルオロボレートアニオンでハロゲン化物イオンを置換することによって製造する。こうした工程は当該技術分野において、例えばEP-B-0 178 450およびEP-B-0 255 534に記載されている。この開示をここに引用する。親水性Ｎ−複素環配位子の製造は、芳香族配位子上での置換（例えばトシレートを介した置換）による単純な方法で実施することができる。官能基Ｘを保有する親水性リンカーもまた、これに相当する方法で連結することができる。半カゴ状またはカゴ状構造を有する式（IV）の金属錯体の製造は、例えば、ビピリジンまたはフェナントロリン配位子にアルキレンオキシ、アルキレンチオおよび／またはアルキレンアミノ単位を接触させること、並びにこれらの単位をエーテルまたはアミド結合を介して橋頭に連結することによって実施することができる。２つの橋頭が使用されれば、カゴ状構造物を得ることが可能である。３つの配位子の３価の橋頭（例えばトリス）への連結が好ましい。錯体自体は上記のように金属塩との反応によって製造される。カゴ状または半カゴ状形態の金属錯体の製造は、反応図III（図９ａおよび９ｂ）によって達成できる。一般式（Ｖ）の金属錯体は、例えば反応図Ｉ（図７）の反応によって製造される。ここでは、好適に置換された配位子を、アミノポリアルコールまたは式（II ａ）若しくは（IIｂ）の親水性基を配位子に結合させた部分的に保護されたポリアルコールと反応させる。樹枝状金属錯体は反応図II（図８）にしたがって製造することができる。本発明のさらに別の主題は、本発明の少なくとも１つの錯体が結合している生物学的物質を含む複合体である。好適な生物学的物質の例は、細胞、ウイルス、非細性胞粒子、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、細胞代謝物質、ハプテン、ホルモン、薬理学的活性物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸および糖類である。金属錯体は好ましくは、生物学的物質の官能基に共有結合し得る、金属錯体の反応性または活性化し得る官能基を介して、生物学的活性物質に結合する。この金属錯体の官能基が活性エステルの場合は、例えば生物学的物質の遊離アミノ基に結合することができる。官能基がマレインイミド残基の場合は、生物学的物質の遊離ＳＨ基に結合することができる。生物学的物質の官能基を同様の方法で活性化して、これらを続いて例えば金属錯体の遊離カルボン酸、アミノまたはチオール基と反応させることもできる。本発明の特に好ましい態様において、金属錯体は好ましくは最大長50アミノ酸、特に好ましくは30アミノ酸を有するペプチドと結合している。金属錯体で標識したこれらのペプチドの製造は、好ましくは、所望のアミノ酸配列を用いてペプチドを固相上で合成し、この時、ａ）合成後、活性金属錯体、好ましくは金属錯体−活性エステル誘導体をペプチドのＮ−末端アミノ基に結合させ、および／またはｂ）合成中に、金属錯体と共有結合したアミノ酸誘導体をペプチドの少なくとも１部位に導入する、ことによって実施される。ペプチドのＮ−末端アミノ酸への金属錯体の結合は、好ましくは、ペプチドの固相からの切断前、およびペプチド合成のために使用するアミノ酸誘導体の反応性側鎖基の保護基を切断する前に実施する。ペプチドは、好ましくは免疫学的反応性エピトープ領域およびスペーサー領域を含んでおり、このスペーサー領域に少なくとも１つの金属錯体マーカー基が結合する。スペーサー領域は好ましくは１〜10アミノ酸の長さを有し、ペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端に位置している。スペーサー領域は、好ましくは荷電しているアミノ酸、および／または水素結合を形成することができるアミノ酸を含有する。このスペーサー領域のアミノ酸は好ましくはグリシン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、リジンおよび構造式ＮＨ₂−[(ＣＨ₂)_yＯ]_x-ＣＨ₂-ＣＨ₂-ＣＯＯＨ（式中、ｙは２または３であり、ｘは１〜10である）の化合物を含む基で形成される。ペプチドのエピトープ領域は好ましくは病原性生物、例えばバクテリア、ウイルスおよび原生動物、または自己免疫抗原由来のものである。エピトープ領域は特に好ましくはウイルス性抗原、例えばＨＩＶ I，ＨＩＶ II またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のアミノ酸配列由来のものである。生物学的物質の別の好ましい例は、ビオチン、核酸、抗体または抗体断片、ポリペプチド抗原、すなわち免疫学的反応性ポリペプチドまたはハプテン、すなわち分子量150〜2000の有機分子、特にカルデノリド、カルデノリド配糖体（例えばジゴキシン、ジゴキシゲニン）、ステロイドアルカロイド、性ホルモン（例えばプロゲステロン）、グルココルチコイドなどのステロイド骨格を有する分子である。ハプテンのさらに別の例は、プロスタグランジン、ロイコ−エン−ジイン、トロンボキサン、薬理学的活性物質などである。本発明のさらに別の主題は、本発明の金属錯体の使用または本発明の複合体の免疫学的検出方法における使用である。この方法において、金属錯体はマーカー基として使用されるもので、このマーカーによって試料溶液中の検体を定性および／または定量測定することができる。金属錯体は好ましくは電気化学発光によって検出され、この場合、発光物質は電極表面に電気化学的に生成される。当技術分野における金属錯体を使用した発光検定の実施の例は、EP-A-0 580 979、WO 90/05301、W0 90/11511 およびWO 92 /14138 中に見られる。そこで開示された発光検定の方法および装置を本明細書に引用する。電気化学発光検定は、好ましくは微小粒子、特に例えばストレプトアビジンで反応性コーティングをした磁性微小粒子で構成された固相の存在下で実施する。この方法によって、固相に結合した、マーカー基として金属錯体を含有する免疫複合体を検出することができる。電気化学発光測定は、好ましくは金属錯体用の還元剤、例えばアミンの存在下で実施する。脂肪族アミンおよび特に一級、二級および三級アルキルアミンであって、そのアルキル基がそれぞれ１〜３個の炭素原子を有するものが好ましい。トリプロピルアミンが特に好ましい。しかし、アミンはアニリンまたは複素環アミンなどの芳香族アミンでもよい。還元剤をあらかじめ錯体の配位子領域に組み込んでおくこともできる。このような系は高度に濃縮された形態で存在する被検体の測定に特に好適である。さらに、増幅剤として非イオン性界面活性剤、例えばエトキシル化フェノールをも存在させてもよい。このような物質は、例えばTriton X100 またはTriton N 401 の名前で市販されている。他方、発光性金属錯体を蛍光によって検出することもできる。この場合、金属キレートが好適な波長の光の放射によって励起され、それに伴う蛍光放射が測定される。蛍光検定の実施の例はEP-A-0 178 450およびEP-A-0 255 534中に見られる。この開示を本明細書に引用する。以下の実施例および図面によって本発明をさらに明らかにする。図１ａは式（IIIａ）の金属錯体を示し、図１ｂは式（IIIａ）の金属錯体を示し、図１ｃは式（IIIｂ）の金属錯体を示し、図２は式（IV）の金属錯体を示し、図３ａは式（IV）の金属錯体を示し、図３ｂは式（IV）の金属錯体を示し、図４は式（IV）の金属錯体を示し、図５は式（IV）の金属錯体を示し、図６は式（Ｖ）の金属錯体を示し、図７は式（Ｖ）の金属錯体の製造のための反応図を示し、図８は式（Ｖ）の金属錯体の製造のためのさらに別の反応図を示し、図９ａおよび９ｂは式（IV）の金属錯体の製造のための反応図を示し、並びに、図10 は金属錯体−プロゲステロン複合体を示す。実施例１親水性ビピリジン配位子（４，４’−ビス（メトキシ−エトキシ−エトキシ） −ビピリジン）の製造シクロヘキサン、エチルベンゼンおよびＴＨＦの混合物中のリチウムジイソプロピルアミド溶液50 ml を−78℃に冷却する。ＴＨＦ中の50 mmol ビピリジン溶液350 mlを一滴ずつ添加する。これを２時間撹拌し、ＴＨＦ中の100 mmolメトキシ−エトキシ−エトキシ−トキシレート溶液を一滴ずつ添加する。−78℃で１時間おいた後、反応混合物を室温で一晩放置する。その後、水性塩化ナトリウム溶液を添加する。続いてロータリーエバポレーターを使用してＴＨＦを除去し、残渣を酢酸エチルで抽出する。生成物をシリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製する。溶出液：酢酸エチル−メタノール−アンモニア 95/4/1 または溶出液として酢酸エチル−石油エーテルを使用したアミノシリカゲル。Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：3.6 ppm（m.ＣＨ₂ＣＨ₂）＝16Ｈ 7.12-8.5 ppm（bpy）＝６Ｈ実施例２ビス（ビス−エチレングリコール−ビピリジン）−ジクロロ−ルテニウム錯体の製造ルテニウム３塩化物を実施例１で合成した２倍モル過剰の配位子および７〜８倍過剰の塩化リチウムとともにＤＭＦ中に溶解し、還流しながら６時間沸騰させる。溶媒を除去し、残渣を水に溶解し、そして酢酸エチルで抽出し、続いてクロロホルムで抽出する。クロロホルム相を集めて乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。生成物をアミノシリカゲル上の薄層クロマトグラフィーによって、アセトニトリル／Ｈ₂Ｏ 10／ｌを使用して精製する（Ｒｆ＝0.58）。実施例３ビス（ビス−エチレングリコール−ビピリジン）−４（４（４’−メチル−２，２’ビピリジル））−酪酸の合成実施例２で合成したルテニウム錯体 3.0 gをアルゴン下でエタノール−水混合物 240 ml に溶解した。ビピリジル−酪酸誘導体 0.82 g を添加し、還流下で３時間加熱する。溶液を濃縮し、酢酸エチルで洗浄し、クロロホルムで抽出する。ロータリーエバポレーターにかけ、残渣をSP-Sephadex 上で精製する（溶出液：水中のＮａＣｌ／ＨＣｌ）。収量： 500 mg、純度（ＨＰＬＣ）：93％ＭＳ（Pos ＬＩＭＳ）：1455.5＝Ｒｕ²⁺錯体ＰＦ₆ ^- 実施例４親水性金属錯体活性エステル誘導体の合成実施例３で合成した錯体 260 mg を塩化メチレンに溶解し、等モル量のジシクロヘキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを混合した。これを12時間撹拌し、濾過によってＤＣＨを除去し、ロータリーエバポレーターにかける。粗生成物を調製用ＨＰＬＣによって精製する。収率は85％である。実施例５親水性金属錯体マレイミド誘導体の合成 EP-A-0 580 979による金属錯体Ｒｕ（ビピリジン）₂（ビピリジン−ＣＯ−Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステル）150gをマレイミド−アミノ−ジオキサオクタン（ＭＡＤＯＯ）100 mg およびトリエチルアミンとともに塩化メチレン中で約12時間反応させる。反応混合物を水で３回振とう分離し、有機相からの残渣をSephadex-LH 20カラム上で塩化メチレン／メタノールを使用して精製する。図１ａに示す化合物Ｒｕ（ｂｐｙ）₂（ｂｐｙ−ＣＯ−ＭＡＤＯＯ）が得られる。ＭＳ：Ｍ⁺＝1025.3（Ｒｕ²⁺ＰＦ₆ ^-錯体に相当する）実施例６親水性金属錯体活性エステル誘導体の調製ジクロロメタン 20 ml中の、実施例５において出発物質として使用したルテニウム錯体 0.5 mmol を、ジクロロメタン 20 ml中のモノ−Ｂｏｃ−ジアミノジオキサオクタン 0.5 mmol およびトリエチルアミン１当量と反応させる。実施例５に記載したように精製を実施する。Ｂｏｃ保護基を標準的な方法（トリフルオロ酢酸／塩化メチレン）にしたがって切断する。得られた生成物を、等モル量のスベリン酸−ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとジメチルホルムアミド中で室温で２時間反応させる。溶媒を除去し、残渣を水に溶解させ、凍結乾燥する。得られた生成物を図１ｂに示す。Ｈ−ＮＭＲ：7.2-8.9 ppm ：ビピリジン（22Ｈ）； 2.8 ppm ＮＨＳエステル（４Ｈ）実施例７金属錯体−ハプテン複合体の調製実施例４のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル 10 mgをプロゲステロン− ３−カルボキシメチル−オキシム−ジアミノジオキシオクタン 3.2 mg とともに塩化メチレン 2 ml 中に溶解し、トリエチルアミン 1.2μl を添加し、室温で12 時間撹拌する。溶媒を除去し、残渣をSephadex上で精製する。生成した複合体を図10に示す。ＭＳ（ｐｏｓＬＩＭＳ）：Ｍ⁺＝1923.0（ルテニウム錯体−プロゲステロン複合体²⁺トリフルオロアセテート）実施例８金属キレート標識ペプチドの製造バッチ式ペプチド合成装置、例えば Applied Biosystems の A431 または A43 3 上でのフルオレニルメチルオキシカルボニル−（Ｆｍｏｃ）−固相ペプチド合成法によって、金属キレート標識ペプチドを製造した。このために、表１に示すアミノ酸誘導体をそれぞれの場合に 4.0当量使用した。変法（ａ）−固相合成完結後の金属錯体の導入−において、活性化親水性ルテニウム（ビピリジル）₃錯体（ＢＰＲｕ）をペプチドのＮ−末端のアミノ酸に結合させた。スペーサー領域のためにリジン誘導体Ｋ１を使用し、エピトープ領域のためにリジン誘導体Ｋ２を使用した。変法（ｂ）においては、金属キレートと結合したアミノ酸誘導体、例えば配列内においてはリジン残基を介してε位に誘導体化した金属キレート活性エステル誘導体、例えばリジン誘導体Ｋ３、またはＮ−末端においてはα位に誘導体化したアミノ酸残基を直接に取り込ませることによって、ペプチド配列中に金属キレート基を導入した。アミノ酸またはアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリドンに溶解させた。４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ樹脂（Tetrahedron Letters 28(1987),2107）400〜500 mg上で、0.4〜0.7 mmol/gを添加して、ペプチドを合成した（JACS 95(1973),1328）。Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体に対して、ジシクロヘキシルカルボジイミド 4当量およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール 4当量を使用し、反応媒体としてジメチルホルムアミド中で、結合反応を20分間実施した。各合成ステップ後20分以内に、ジメチルホルムアミド中の20％ピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ基を切断した。ペプチド配列中にシステイン残基が存在する場合は、合成完了直後に、ヘキサフルオロイソプロパノール／ジクロロメタン中のヨウ素を使用して、固相を酸化した。ペプチドを支持体から遊離させ、トリフルオロ酢酸 20 ml、エタンジチオール 0.5 ml 、チオアニソール 1 ml 、フェノール 1.5 gおよび水 1 ml を室温で40 分使用して、酸−不安定性保護基を切断した。続いて反応溶液に冷却ジイソプロピルエーテル 300 ml を混合し、ペプチドが完全に沈殿するまで40分間０℃に保持した。沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルで再洗浄し、少量の50％酢酸に溶解して凍結乾燥した。得られた粗物質を Delta-PAK RP C18 マテリアル上での調製用ＨＰＬＣ（カラム 50×300 mm、100Å、15μ）を使用し、相応する勾配で（溶出液Ａ：水、0.1％トリフルオロ酢酸、溶出液Ｂ：アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸）約120 分で精製した。溶出物質をイオンスプレーマススペクトロメトリーによって同定した。変法（ａ）において、支持体に結合したペプチドの遊離のＮ−末端アミノ基上に、適当な活性エステル誘導体を介して、金属キレート標識を導入した。このために、遊離の第一級アミノ官能基当たり親水性ルテニウム（ビピリジル）₃錯体（ＢＰＲｕ）４当量を、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール／ジ−シクロヘキシルカルボジイミドで活性化し、少量のＤＭＳＯに溶解し、一滴ずつ添加し、室温で撹拌した。反応を分析用ＨＰＬＣによってモニターした。支持体から切断した後、生成物を調製用ＨＰＬＣによって精製した。溶出物質をイオンスプレーマススペクトロメトリーによって同定した。変法（ａ）および（ｂ）の組合せによってペプチドを合成した。すなわち、配列内に金属キレート結合アミノ酸誘導体を組み込んで、Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基を切断し、遊離のＮ−末端アミノ基に金属キレート活性エステル誘導体を反応させた。変法（ｂ）において、固相合成中に金属キレート結合アミノ酸誘導体のみを直接組み込んだ場合には、それに続いて金属キレート活性エステルを導入する必要はもはやない。ＨＩＶＩおよびＨＩＶ II の領域 gp 120、gp 41および gp 32から表２に示すペプチド−金属錯体複合体を調製した。ＨＣＶのＮＳ５領域、ＮＳ４領域およびCore領域から、以下の表３に示すペプチドを合成した。ビオチン標識ペプチドは、樹脂上で誘導してＮ末端に合成する（ビオチン活性エステル）か、またはビオチン活性エステルがε位に誘導体化したリジン残基（Ｆｍｏｃ−リジン（ビオチン）−ＯＨ）を使用して配列内に合成した。実施例９ジエチル−α，α，α',α'-テトラキス（エトキシカルボニル）−２，２'-ビピリジン−４，４'-ジイル−ジプロピオネート（図７の化合物（１）に相当する）の調製トルエン／ＤＭＦ（３／２）50 ml 中のトリエチル−メタン−トリカルボキシレート 6.85 g（29.5 mmol）および炭酸カリウム 4.1 g(29.7 mmol)の混合物に、十分撹拌しながら50℃において、トルエン／ＤＭＦ（３／２）40 ml 中の４，４'-ビス（ブロモメチル）−２，２'-ビピリジン 2.00 g(5.8 mmol)を一滴ずつ添加する。これを65℃においてさらに４日間撹拌し、濾過し、続いて真空で溶媒を除去する。油状の残渣をトルエン 100 ml に溶解し、水で３回、７％水酸化ナトリウム水溶液で３回および水で３回、順次振とう分離する。有機相を集め、硫酸ナトリウム上で乾燥する。真空中で揮発性成分を除去した後、残渣をシクロヘキサンから再結晶化する。不純物を完全に除去するため、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、ＣＨＣｌ₃/ＭｅＯＨ(10:1)、第１バンド）で分離する。無色結晶（シクロヘキサン）収量： 2.95 g （79％）融点： 116℃¹ Ｈ-ＮＭＲ（250 MHz、ＣＤＣｌ₃，25℃）：δ＝1.21（ｔ，18Ｈ，³Ｊ＝7.2 Hz ），3.57（ｓ，４Ｈ），4.22（ｑ，12Ｈ，³Ｊ＝7.2 Hz），7.25（ｄｄ，２Ｈ，³ Ｊ＝5.1 Hz，⁴Ｊ＝1.2 Hz），8.29（ｄ，２Ｈ，⁴Ｊ＝1.2 Hz），8.51（ｄｄ，２Ｈ，³Ｊ＝5.1 Hz，⁴Ｊ＝1.2 Hz）¹³ Ｃ-ＮＭＲ（75 MHz、ＣＤＣｌ₃，25℃）：δ＝13.96（ＣＨ₃），38.1（ＣＨ₂ ），62.6（Ｈ₂ＣＯ），66.5（ＣＣＯ），123.4，123.6，145.9，149.0，155（ピリジン−Ｃ，ＣＨ），166.5（Ｃ＝Ｏ）．ＩＲ（ＫＢｒ／固体）［cm^-1］：556，610，863，1026，1186，1258，1305，159 4，1737 vs．2988 ＭＳ−50：（180℃，70 eV，300μＡ，ｍ／ｅ）：found：644，2585 Ｃ₃₂Ｈ₄₀Ｎ₂Ｏ₁₂（644，682）実施例10 Ｎ，Ｎ'-ビス（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−エチル）−α，α−ビスヒドロキシ−２，２'-ビピリジン−４，４'-ジイルジプロピオンアミド（図７の化合物（２）に相当する）の調製ＣａＨ₂上で乾燥させたＤＭＳＯ 10 ml中の、実施例７のヘキサエステル（１）752.7 mg（1.17 mmol）およびα、α、α−トリス−（ヒドロキシ−メチル） −メチルアミン 848.6 mg（7.00 mmol）の溶液に、撹拌しながら、炭酸カリウム 967.5 mg（7.00 mmol）を添加する。塩基の添加後、混合物はわずかに黄色になる。25℃で10分間さらに撹拌した後、懸濁液を遠心分離し、固体の炭酸カリウムから溶液をデカントする。30℃において真空（0.001 mbar）で溶媒を除去する。黄色で油状の残渣を少量の水中に懸濁し、乾燥アセトン（Ｐ₄Ｏ₁₀上で蒸留）を徐々に添加して、生成物を沈殿させる。これを冷所で完全に沈殿させる。溶液をデカントし、Ｐ₄Ｏ₁₀上で数日かけて残渣を乾燥する。吸湿性の無色の固体が残り、これをさらに精製することなく使用する。収量： 0.652 g（67％）¹ Ｈ-ＮＭＲ（250 MHz、ＤＭＳＯ−ｄ₆，25℃）：δ＝3.08（ｄ，４Ｈ），3.22（ｓ，8Ｈ），3.47（ｄ，8Ｈ，²Ｊ＝10.8 Hz），3.55（ｄ，8Ｈ，²Ｊ＝11.1 Hz），3.69（ｔ，2Ｈ），4.6-5.1（ｂｓ，ＯＨ），7.27（ｄ，2Ｈ，ピリジル−Ｈ，³ Ｊ＝4.8 Hz），7.4-7.7（ｓ，ＮＨ），8.23（ｓ，2Ｈ，ピリジル−Ｈ），8.51（ｄ，2Ｈ，ピリジル−Ｈ，³Ｊ＝4.8 Hz）¹³ Ｃ-ＮＭＲ（75 MHz、ＤＭＳＯ−ｄ₆，25℃）：δ＝30.7（ＣＨ₂），59.7（ＣＨ₂ＯＨ），61.7（ＣＲ₄），63.34（ＣＲ₄），78.5（ＣＣＯ），122.8，126.0， 146.0，148.7，155.0（ピリジン−Ｃ，ＣＨ₂），170.2（ＣＯＮＨ）ＩＲ（ＫＢｒ／固体）［cm^-1］：3336，2936，2880，1675，1597，1559，1533， 1465，1363，1051（ｖｓ）ＦＡＢ⁺ＭＳ（ｍ−ＮＢＡ，ｍ／ｅ）：833.3，855.3，871.3，965.2（Ｍ＋Ｈ）⁺ ，（Ｍ＋Ｎａ）⁺，（Ｍ＋Ｋ）⁺，（Ｍ＋Ｃｓ）⁺ Ｃ₃₄Ｈ₅₂Ｎ₆Ｏ₁₈（832.3）実施例11 反応図III（図９ａおよびｂ）の半カゴ状またはカゴ状親水性配位子の調製Ａ：準備：ビピリジン−臭化メチル 2.6 g（10 mmol）２−メトキシエチルアミン 80 ml 炭酸カリウム 10 g 手順：２−メトキシエチルアミン中の粉末化炭酸カリウム懸濁液に撹拌しながら臭化物を添加した。その後懸濁液を室温で12時間撹拌した。続いて濾過し、蒸留によって過剰の２−メトキシエチルアミンを除去し、残渣を真空中で乾燥させた。残渣をクロマトグラフィーにかけた（ＳｉＯ₂；ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ／ＮＨ₃，1 00：10：１）。淡黄色の油状物が得られた。収量：1.06 g（3.85 mmol）38％¹ Ｈ-ＮＭＲ（250 MHz、ＣＤＣｌ₃）：1.95（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；2.26（ｓ，３Ｈ，ピリジル−ＣＨ₃），2.7（ｔ，³Ｊ＝5.28 Hz，２Ｈ，ＯＣＨ₂），3.24（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ₃）；3.41（ｔ，³Ｊ＝5.28 Hz ，２Ｈ，ＮＣＨ₂）；3.76（ｓ，２Ｈ，ピリジル−ＣＨ₂），7.5（ｄｄ，³Ｊ＝8.35 Hz ，⁴Ｊ＝2.17 Hz ，１Ｈ，ピリジルＨ）；7.69（ｄｄ，³Ｊ＝8.19 Hz ，⁴Ｊ＝2.24 Hz，１Ｈ，ピリジルＨ）；8.17（ｄ，³Ｊ＝8.02 Hz ，1Ｈ，ピリジル−Ｈ）；8.22（ｄ，³Ｊ＝8.24H z，１Ｈ，ピリジル−Ｈ）；8.39（ｄ，⁴Ｊ＝1.84 Hz，１Ｈ，ピリジルＨ）；8 .85（ｄ，⁴Ｊ＝1.85 Hz，１Ｈ，ピリジルＨ）ｐｐｍ．Ｂ：準備：トリ−アルコール 2.26(10 mmol) トシルクロライド 6.67(35 mmol) 手順：反応混合物の温度が10℃を超えないように冷却および撹拌しながら、保護気体中で徐々に、ピリジン 20 ml中のトリ−アルコール溶液をピリジン 20 ml中のトシルクロライド溶液と混合した。これを室温でさらに24時間撹拌した。続いて、これを水 10ml 、メタノール 20 mlおよび濃塩酸 8 ml の混合物に注意深く注ぎ入れた。沈殿生成物および分離した油分を濾過または分離し、クロマトグラフィー（ＳｉＯ₂；ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＣＨ₃ＯＨ／ＮＨ₃，100：10：１）によって精製した。無色の結晶が得られる。融点：57〜59℃¹ Ｈ-ＮＭＲ（250 MHz、ＣＤ₂Ｃｌ₂）：2.4（ｓ，9Ｈ，Ａｒ−ＣＨ₃）；3.25（ｓ，2Ｈ，ＣＨ₂）；3.88（ｓ，6Ｈ，ＣＨ₂）；4.22（ｓ，2Ｈ，ＣＨ₂）；7.02-7.1 （ｍ，2Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；7.25-7.3（ｍ，3Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；7.31（ｄ，³Ｊ＝6.4 6 Hz，6Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；7.31（ｄ，³Ｊ＝6.46 Hz，6Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；7.67（ｄ，³Ｊ＝6.46 Hz，Ａｒ−Ｈ）ｐｐｍ．¹³ Ｃ-ＮＭＲおよびＤＥＰＴ−135（62.8 MHz、ＣＤＣｌ₃）；145.36；137.20；1 31.75；43.82（Ｃ_q）；130.05；128.39；128.33；127.92；127.75；127.23（ＣＨ）；73.28，66.71；66.31（ＣＨ₂）；21.67（ＣＨ₃）ｐｐｍ実施例13 免疫学的試験における荷電リンカーを有する親水性金属錯体の使用Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する特異的抗体を検出するため、二重抗原ブリッジテストを実施した。このため、ストレプトアビジンでコーテイングした固相の存在下で、測定すべき抗体に対するルテニウム標識抗原およびビオチン化抗原とともに試料液体をインキュベートした。フラッシュシステムによる電気化学発光によって固相中の標識を測定することによって、試料液体中の抗ＨＣＶ抗体の存在を測定する。ＨＣＶの1207-1488 のアミノ酸を含有するＨＣＶポリペプチドを抗原として使用した。このアミノ酸配列およびこうしたポリペプチドの合成は DE-A-44 28 70 5.4 に記載されている。スクシンイミドエステルで活性化したルテニウム錯体を用いてＨＣＶポリペプチドを誘導体化するために、凍結乾燥ポリペプチドを 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ 6.5、0.1％ＳＤＳにタンパク質濃度 10 mg/ml となるように溶解した。5 M の添加によってｐＨ値を8.5 にし、溶液にジチオトレイトールを補充して、最終濃度 2 mM とした。この溶液に、目的とする必要な化学量論量に相当する、ＤＭＳＯ中のスクシンイミドエステルで活性化したルテニウム錯体を添加し、続いて撹拌しながら65℃において60分間インキュベートした。反応混合物にリジンを最終濃度 10 mMとなるように補充し、さらに30分インキュベートすることによって、反応を終了させた。続いて混合物を 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ 6.5、0.1％ＳＤＳに対して透析した。生成したタンパク質溶液にショ糖を添加し（最終濃度 6.5％(w/v)）、分割して凍結乾燥した。マレインイミドで活性化したルテニウム錯体を用いて誘導体化したＨＣＶポリペプチドの生成のために、ポリペプチドを 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ 6.5、0.1％ＳＤＳに溶解した（タンパク質濃度 10 mg/ml ）。この溶液に、目的とする必要な化学量論量に相当する、ＤＭＳＯ中のマレインイミド−活性化ルテニウム錯体を添加し、続いて撹拌しながら25℃において60分間インキュベートした。反応混合物にシステインを最終濃度 10 mMとなるように補充し、さらに 30分インキュベートすることによって、反応を終了させた。その後反応混合物を上記のように透析し、ショ糖を添加して、分割して凍結乾燥した。各回毎に異なるルテニウム化抗原を使用した３つの実験を実施した。実験Ａ（対照）では、実施例５および６において出発物質として使用した EP-A-0 580 97 9 のルテニウム錯体をポリペプチドに化学量論比１：３で結合させた。実験Ｂでは、ポリペプチドを実施例５において製造した親水性ルテニウム錯体に化学量論比１：３で結合させた。実験Ｃでは、ポリペプチドを実施例６において製造した親水性ルテニウム錯体に化学量論比１：１で結合させた。３つの実験すべてにおいて、ビオチン化抗原として、マレイミド活性化ビオチンに化学量論比１：６で結合させたポリペプチドを使用した。各場合において、ルテニウム化およびビオチン化抗原を試験液体濃度 400 ng/mlで使用した。実験Ａ、ＢおよびＣの結果を表２にＥＣＬカウント数で示す。マーカー基として本発明の親水性金属錯体を使用した場合にのみ、陰性血清サンプルと臨界陽性血清サンプル間の信頼し得る差異が得られることがわかる。これは陽性／陰性比がより高いことで示される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年７月１１日【補正内容】５．反応性または活性化し得る官能基Ｘがカルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、活性エステル、マレイミド、アミン、カルボン酸、チオール、ハロゲン化物または光活性化し得る基である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の錯体。 18．一般式（Ｉ）：［Ｍ(Ｌ₁Ｌ₂Ｌ₃)］_n−Ｘ_mＡ（Ｉ）［式中、 −Ｍは希土類または遷移金属イオンから選択される２価または３価金属カチオンであり、 −Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は同一または異なっており、窒素を含有する複素環を少なくとも２つ有する配位子であって、Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃が窒素原子を介して金属カチオンに結合しており、 −Ｘは配位子Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃の少なくとも１つと共有結合している反応性または活性化し得る官能基であり、 −ｎは１〜10の整数であり、 −ｍは１〜６の整数であり、並びに −Ａは荷電のバランスのために必要な１または数個の陰性荷電基を表す。］で示される金属錯体が少なくとも１つ結合している生物学的物質を含有する複合体であって、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位および／またはポリヒドロキシ単位から選択される少なくとも１つの親水性基を含有する前記生物学的物質を含有する複合体。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年８月１日【補正内容】１．一般式（Ｉ）：［Ｍ(Ｌ₁Ｌ₂Ｌ₃)］_n−Ｘ_mＡ（Ｉ）［式中、 −Ｍは希土類または遷移金属イオンから選択される２価または３価金属カチオンであり、 −Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は同一または異なっており、窒素を含有する複素環を少なくとも２つ有する配位子であって、Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃が窒素原子を介して金属カチオンに結合しており、 −Ｘは配位子Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃の少なくとも１つと共有結合している反応性または活性化し得る官能基であり、 −ｎは１〜10の整数であり、 −ｍは１〜６の整数であり、並びに −Ａは荷電のバランスのために必要な１または数個の陰性荷電基を表す。］で示される金属錯体であって、基Ｘがヒドロキシ、メトキシ、４−メトキシ−フェノキシ、ジオキソランまたはＣＯ₂ＣＨ₃基を含まない場合には、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃ アルキレンチオ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位および／またはポリヒドロキシ単位から選択される少なくとも１つの親水性基を含有する前記錯体。 10．１金属カチオン当たり１〜30のＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位またはＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位が存在する、請求項１〜９のいずれか１つに記載の錯体。 13．一般式（IIIｂ）：［式中、Ｍ、ＸおよびＡは請求項１と同様に定義される。Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅は請求項11と同様に定義される。ｓは０〜６の整数である。ただし、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄および／またはＲ₅が１〜10のＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位および／またはＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位をそれぞれ含む親水性置換基を含有する。］で示される、請求項１記載の錯体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｆ 15/00 9450−4ＨＣ０７Ｆ 15/00 ＥＣ１２Ｑ 1/68 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/533 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/533 (31)優先権主張番号Ｐ４４３９３４６．６ (32)優先日 1994年11月４日 (33)優先権主張国ドイツ（ＤＥ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＮ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者パッペルト，グンタードイツ連邦共和国ディー−82319 シュターンベルグフリーデルヴェーク 12番地 (72)発明者ヴェグトル，フリッツドイツ連邦共和国ディー−53347 アルフター−インペコーヴェン，インデルアシュバッハ 10番地 (72)発明者フロムーバーガー，ブルーノドイツ連邦共和国ディー−53123 ボンバーンホフシュトラーセ 169番地 (72)発明者イッスバーナー，イェルグドイツ連邦共和国ディー−53913 スヴィスッタルブレスラウアーシュトラーセ 10番地

Claims

【特許請求の範囲】１．一般式（Ｉ）：［Ｍ(Ｌ₁Ｌ₂Ｌ₃)］_n−Ｘ_mＡ（Ｉ）［式中、 −Ｍは希土類または遷移金属イオンから選択される２価または３価金属カチオンであり、 −Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は同一または異なっており、窒素を含有する複素環を少なくとも２つ有する配位子であって、Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃が窒素原子を介して金属カチオンに結合しており、 −Ｘは配位子Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃の少なくとも１つと共有結合している反応性または活性化し得る官能基であり、 −ｎは１〜10の整数であり、 −ｍは１〜６の整数であり、並びに −Ａは荷電のバランスのために必要な１または数個の陰性荷電基を表す。］で示される金属錯体であって、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位および／またはポリヒドロキシ単位から選択される少なくとも１つの親水性基を含有する、前記錯体。２．金属カチオンＭがルテニウムイオン、レニウムイオン、オスミウムイオン、クロムイオンまたはイリジウムイオンである、請求項１記載の錯体。３．金属カチオンＭがルテニウムイオンである、請求項１または２記載の錯体。４．配位子Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃がビピリジンおよび／またはフェナントロリン環系を含有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の錯体。５．反応性または活性化し得る官能基Ｘがカルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、活性エステル、マレイミド、アミン、カルボン酸、チオール、ハロゲン化物、ヒドロキシル基または光活性化し得る基である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の錯体。６．陰性荷電基Ａがヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロアセテート、テトラフルオロボレート基、またはハロゲン化物イオンである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の錯体。７．ポリヒドロキシ単位が式（IIａ）または（IIｂ）： −ＮＲ−Ｗ（IIａ） −Ｏ−Ｗ（IIｂ）［式中、Ｗは少なくとも２つのヒドロキシ基を有する有機残基を表し、Ｒは水素またはＣ₁-Ｃ₅アルキルを表す。］で示される基から選択される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の錯体。８．ポリヒドロキシ単位が式−ＮＲ−Ｃ（ＣＨ₂ＯＨ）₃である、請求項７記載の錯体。９．Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位またはＣ₂− Ｃ₃アルキレンアミノ単位がそれぞれエチレンオキシ、エチレンチオまたはエチレンアミノ単位である、請求項１〜８のいずれか１つに記載の錯体。 10．１金属カチオン当たり１〜30のＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位またはＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位が存在する、請求項１〜９のいずれか１つに記載の錯体。 11．一般式（III）：［式中、Ｍ、ＸおよびＡは請求項１と同様に定義される。Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄ 、Ｒ₅およびＲ₆は同一または異なっており、それぞれ１または数個の置換基を表す。ただし、Ｘは置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅またはＲ₆の中の１つを介して配位子の１つに連結しており、置換基Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅またはＲ₆の中の少なくとも１つがＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂ −Ｃ₃アルキレンチオ単位、及びＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位から選択される親水性基の少なくとも１つを含有している。］で示される、請求項１〜10のいずれか１つに記載の錯体。 12．一般式（IIIａ）：［式中、Ｍ、ＸおよびＡは請求項１と同様に定義される。Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄ およびＲ₅は請求項11と同様に定義される。ｓは０〜６の整数である。ＹはＣ₂− Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位およびＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位から選択される、１〜10の親水性単位を有する親水性基を表す。］で示される、請求項11記載の錯体。 13．一般式（IIIｂ）：［式中、Ｍ、ＸおよびＡは請求項１と同様に定義される。Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄ およびＲ₅は請求項11と同様に定義される。ｓは０〜６の整数である。ただし、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄および／またはＲ₅が１〜10のＣ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位および／またはＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位をそれぞれ含む親水性置換基を含有する。］で示される、請求項11記載の錯体。 14．一般式（IV）：［式中、Ｍ、Ｘ、ｎおよびＡは請求項１と同様に定義される。Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は同一または異なっており、それぞれ１または数個の置換基を表す。Ｙはそれぞれの場合において、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンオキシ単位、Ｃ₂−Ｃ₃アルキレンチオ単位およびＣ₂−Ｃ₃アルキレンアミノ単位から選択される、１〜10の親水性単位を有する親水性リンカー基を表す。］で示される、請求項１〜10のいずれか１つに記載の錯体。 15．一般式（Ｖ）：［式中、Ｍ、ＸおよびＡは請求項１と同様に定義される。Ｚはリンカー基を表す。Ｒ'₁、Ｒ'₂、Ｒ'₃、Ｒ'₄および／またはＲ'₅は同一または異なっており、それぞれ１または数個の置換基を表す。ただし、Ｒ'₁、Ｒ'₂、Ｒ'₃および／またはＲ'₄がポリヒドロキシ単位を含む親水性置換基を少なくとも１つ含有している。］で示される、請求項１〜10のいずれか１つに記載の錯体。 16．ポリヒドロキシ単位のＯＨ基がさらに別の親水性基で置換されている、請求項15記載の錯体。 17．前記さらに別の親水性基が一般式（VIａ）または（VIｂ）： −Ａ₁−ＮＲ−Ｗ₁（Ａ₂−ＮＲ−Ｗ₂）_n' （VIａ） −Ａ₁−Ｏ−Ｗ₁（Ａ₂−Ｏ−Ｗ₂）_n' （VIｂ）［式中、 −Ａ₁およびＡ₂は同一または異なっており、リンカー基を表し、 −Ｗ₁およびＷ₂は同一または異なっており、少なくとも２つのヒドロキシ基を有する有機残基を表し、 −Ｒは水素またはＣ₁-Ｃ₅アルキルを表し、並びに −ｎ’は０またはＷ₁のヒドロキシ基の数に相当する。］で示される、樹枝状体または樹枝状構造部分を含む、請求項16記載の錯体。 18．請求項１〜17のいずれか１つに記載の金属錯体が少なくとも１つ結合している生物学的物質を含有する複合体。 19．前記生物学的物質がビオチン、抗体または抗体フラグメント、核酸、ポリペプチド抗原、免疫学的反応性ペプチドまたはハプテンである、請求項18記載の複合体。 20．免疫学的検出方法において、請求項１〜17のいずれか１つに記載の金属錯体または請求項18若しくは19記載の複合体の使用。 21．電気化学発光方法における、請求項20記載の使用。 22．電気化学発光測定を金属錯体の還元剤の存在下で実施する、請求項21記載の使用。 23．還元剤を錯体の配位子領域に集積させる、請求項22記載の使用。