JPH10503593A - 感染性化合物の分離および／または検出および／または定量を行うための方法およびこの方法を実施するための支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 a)（β2GPI）n／IC複合体およびb)（β2GPI）n／nVIC（非ウイルスIC）複合体からなる群より選択されるβ2GPI／IC複合体が、分離および／またはスクリーニングおよび／または定量されることに特徴づけられる、生物学的材料中の１つ以上の感染性化合物（IC）を分離および／またはスクリーニングおよび／または定量するための方法である。

Description

【発明の詳細な説明】 感染性化合物の分離および／または検出および／または定量を行うための方法 およびこの方法を実施するための支持体 ／または検出および／または定量を行うための方法、およびこの方法を実施する ための支持体に関する。 本発明によれば、感染性化合物（総体的に、以下、省略型「IC」と称する）は 、特定のタンパク質性化合物において、それが、感染因子の成分であるもの、お よび、感染性化合物を含む構造体であるものの、両化合物を意味することが理解 される。これらの構造体は、特に、完全または不完全な内因性または外因性の感 染因子、それらの代謝物、または他にこれらの感染因子の成分化合物を含む他の 組み立て体である。これらは、上記感染因子のある種の特性、特に、感染性化合 物に特異的である特定の抗体によって検出される特性を示す。ICはまた、既に定 義されたICによってまたは異常様式で発現される遺伝子の発現によって生物にお いて特異的に誘導される化合物であり得る。言及され得るICは、例えば、ウイル ス、細菌、カビ、マイコプラズマ、寄生虫、および異常動物細胞である。ウイル ス感染性化合物は、以下省略型「VIC」と称され、一方、非ウイルス感染性化合 物（すなわち、単ウイルス型以外の感染性化合物）は、「nVIC」と称される。 「生物学的材料」は、本明細書では、生物学的組織、液体または固体標本、あ るいは生物学的組織からの抽出物、あるいは上記の意味での感染性化合物を含有 し得る天然媒体（例えば、ドレナージ水）であることは理解される。材料はまた 、上述の少なくとも２種類の材料の混合物であり得る。従って、このような生物 学的材料は、特に感染（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌またはマイコプ ラズマ感染）患者からの組織、器官、便、あるいは生物学的液体のいずれかから 調製され得るか、または「インビトロ」培養物から得られ得る。このような生物 学的材料はまた、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑液、腹膜液、胸膜液、精液、ま たは腹水であり得る。 β2-糖タンパク質I（以下、「β2GPI」と省略）は、特に、J．LOZIERら、Proc . Natl．Acad．Sci．ISA、第81巻、3640〜3644頁、1984年7月、およびT．KRISTE NSENら、FEBS Letters、第289巻、1991年、183〜186頁の論文において、その配 列が示されている血漿糖タンパク質である。β2GPIはまた、アポリポタンパク質 Hと呼ばれる。このタンパク質が多型性を示すことが示されており、名称β2GPI を、以下全形態に対する属名として見なす。 EP-A-0 600 088において、抗リン脂質抗体症候群では、カルジオリピン-β2GP I複合体に特異的であり、この症候群に出現する抗カルジオリピン抗体が、血清 中に検出されること、およびこれらの抗カルジオリピン抗体が、血清をカルジオ リピン-β2GPI複合体と反応させることによってアッセイされ得ることが指摘さ れている。カルジオリピンは、感染性化合物(Treponema pallidum)と結合し得る が、他の供給源由来であり得、特に病原性のない状態で存在するので、これは、 感染因子によって生物において特異的に誘導され、従って、この感染因子の生物 中での存在を検出するために信頼のおける方法では使用され得ない化合物である 。 国際特許出願WO 94/18569に、ある種のウイルス化合物が、β2GPIの１つの形 態、すなわち、フランス特許出願第2 701 263号に記載される形態であり、この 形態のβ2GPIが、純粋状態であれ、またはタンパク質組成物に含まれていても、 これに特異的に結合することが示された。この形態のβ2GPIは、FR-A-2 690 444 に記載の血漿からのアルブミン精製の方法で使用される、アフィニティークロマ トグラフィーカラムに結合される残留物から単離される。それは、50,000 ± 30 00ダルトンの分子量を有する。本特許出願に関しては、この形態のβ2GPIを、省 略型「β2'GPI」で称した。従って、ウイルス化合物(VIC)(β2'GPIによって結合 されるウイルス化合物)を検出および／またはアッセイする方法が、WO 94/18569 において提案された。従って、このような方法では、β2'GPIが、検出および／ またはアッセイするためにこのように捕捉されたVICを分離するようにして、生 物学的材料に含有されているVICに添加される。 Journal of Virology，68，No.4，1994年4月、2415〜2424頁には、HBsAgが、 インビトロにおいてβ2糖タンパク質と複合体を形成し得ることが報告されてい る。 WO 92/19795は、ヒトβ2糖タンパク質Iと特異的に反応し、これをアッセイし 得るモノクローナル抗体を得ることが可能であることを、指摘している。 一般に、少なくとも１つのICと１つのβ2GPIとの直接あるいは間接的な会合は 、本明細書では一般に「複合体(complexe)」と称し、これらの複合体は、以下、 「β2GPI/IC」の表記によって呼ばれる。WO 94/18569に記載の方法は、VICウイ ルス複合物と、β2'GPI（純粋状態であるかまたはタンパク質組成物に含有され る）とのVIC／β2'GPI複合体を、検出および／またはアッセイされるべきVICを 含有する生物学的材料に添加されるβ2'GPIを用いて、検出および／またはアッ セイする。 下記の方法を実施する前に、生物学的材料中に天然に存在し、そしてこのよう に意図的に添加されるのではないβ2GPIの形態を、本明細書では（β2GPI）nと 称する。以前に定義されたIC/β2GPI複合体を形成するために意図的に添加され るβ2GPIの形態を、（β2GPI）aと称する。 本発明によれば、新規な方法で、WO 94/18569に記載のもの以外の生物学的材 料から、IC/β2GPI複合体を分離、検出、および／または定量し得ることが見出 された。すなわち、 IC部分が、VICウイルスまたはnVIC非ウイルス型であり得、（β2GPI）n 部分が、研究下の生物学的材料に天然に由来する、（β2GPI）n／IC複合体； （β2GPI）a部分が、この目的のために意図的に添加され、異なる純粋 または混合形態で調製され、nVIC部分が、研究下の生物学的材料中の非ウイルス 感染性化合物に由来する、（β2GPI）a／nVIP複合体。 従って、本発明は、 (a)（β2GPI）n／IC複合体 (b)（β2GPI）a／nVIC複合体 よりなる群から選択されるβ2GPI/IC複合体が、分離および／または検出および ／または定量されることによって特徴づけられる、生物学的材料中の感染性化合 物（IC）を、分離および／または検出および／または定量するための方法に関す る。 一般には、β2GPIは、ICと同様に、本方法のいくつかの適用について、動物起 源であり得るか、または遺伝子工学および／または化学工学によって生成され得 る。この方法は、ヒトおよび動物の両方に適用され得る。 本発明に従って、複合体のβ2GPI部分は、この部分に優先的に結合し得るかま たは特異的に結合し得る基質の助けにより認識されることによって同定され、そ して、IC部分は、任意の適切な手段によって同定される。 複合体の形成は、直接的または間接的であり得、そして、ある種の脂質または 界面活性剤、特にリン脂質のような、化学物質、生化学物質、または生物学的物 質であり得る特定の添加物によって、媒介または促進され得る。複合体は、生物 学的材料の調製の間および／または方法の一工程の間に、形成され得る。 既に指摘されたように、ICは、VICおよびnVICを包含する。特に記載され得るV ICは、HIV1、HIV2、HBV、HSV、およびウイルス起源の粒子またはタンパク質から なる群のものであり得る。特に記載され得るnVICは、細菌、寄生虫、カビ、およ びマイコプラズマによりなる群のものであり、より詳細には、細菌の場合はBore lliaであり、そして寄生虫の場合はリーシュマニア属（(Leishmania)(特にinfan tum))、トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)、および赤痢アメーバ(Entamoeba h istolytica)である。 好都合には、複合体中に保持されるβ2GPIは、本方法の実施態様に従って、標 識され得るかまたはされ得ない。この標識は、前もって実施され得るかまたは前 もっては実施され得ず、例えば、抗体、酵素、放射性産物、蛍光産物、または金 属剤によって、実施され得る。 本発明によれば、異なる感染因子を検出し得る多重特異テストは、各因子に対 して異なる検出法、例えば、HIV2p26に対するアルカリホスファターゼ複合体化 抗体およびHBsAgに対するペルオキシダーゼ複合体化抗体を、特に同時または連 続的に使用して、実施され得る。 本発明の実施態様の第一部分（ここでは外来（β2GPI）aが生物学的媒体に添 加される）では、β2'GPIが使用され得る。これは、純粋であるか、または特に 複合体のβ2GPI部分のβ2GPI形態として他の糖タンパク質を含有するタンパク質 組成物の形態である。この組成物は、フランス特許出願第2 701 263号に記載の ように、特に、硫酸基を有するゲルアフィニティーカラムの溶出によって得られ る組成物であり得る。しかし、β2GPIの他の形態もまた、J．ArvieuxらのJourna l of Immunological Methods(1991)，143，223〜229頁により記載のプロトコー ルに従って得られるものが使用され得る。カルバミル化β2GPIは、いくつかの複 合体を形成し得る。 上記の第一部分に属する実施態様では、複合体は、nVICを分離および／または アッセイおよび／または定量するために、（β2GPI）aを生物学的材料に添加す ることによって形成される。 本発明に従う方法の実施態様の第二部分では、生物学的材料中に天然および／ または最初から存在する（β2GPI）nが使用される。WO 94/18569の方法は、生物 学的材料が遊離VICを含有するとき、満足な結果を与えることが知られる。このV ICは、生物学的材料に天然に存在するβ2GPIに付着(fixer)されていないVICであ る。この遊離VICは、結果的に、この方法に従って添加されるβ2'GPIにそれ自身 付着し得る。従って、この方法において、応答シグナルはVICの増加に伴って増 加し、それは、依然遊離しているか、または生物学的材料中に天然に存在する複 合体から競合によって遊離され得る部位を有する。一方、いくつかの場合におい て、例えば感染の初期で、VICは、天然に存在する（β2GPI）nに比較して少ない 量で存在し、そして従ってこのVICは主として、（β2GPI）n／IC複合体の形態で （β2GPI）nに結合されていると仮定することが可能である。出願WO 94/18569で 提案されるテストは、複合体化されたVICはマスクされ得るので、その場合には 重要ではあり得ない。従って、本発明のこの第二部分によれば、それは、生物学 的材料中に存在するICを、特に、これらの化合物が、通常存在する（β2GPI）n と比較して、それらが主として（β2GPI）n形態の少なくとも１つと複合体化さ れる（または複合体化可能である）ような量で存在する場合、または他にこのIC が、（β2GPI）aの導入によって示され得ない場合、観察および／または分離お よび／または検出および／または定量するために提案される。 その事実を考慮して、本発明の実施態様のこの第二部分によれば、β2GPIが添 加されなければ、WO 94/18569の方法のマスキング現象は回避され、そして生物 学的材料中に存在する複合体量の関数、従ってICの関数として増加し得る応答シ グナルが、これらのIC量が非常に少ない場合でさえも、得られる。適切なところ で、その方法は、病変の初期状態を検出することを可能にし得、一方、以前の方 法は、例えば、IC過剰または（β2GPI）n不足、またはICに結合することに関し て非関数性であるβ2GPI形態の天然存在に対応して、確立している病状を調査す るのにより適している。 これらの２つの実施態様部分が、互いに矛盾しないことは、注目されるべきで ある。 本発明に従って方法を実施するために、ICは、β2GPI/IC複合体を前もって支 持体へ付着させることなく、または、複合体に含まれる要素によってこの複合体 を支持体に付着させて、検出され得る。第一の場合には、検出および／または定 量が、複合体が形成される媒体において達成される。この形成は、この媒体が、 例えば、物理的、化学的、または生化学的方法によって表面に付着された後、あ るいはこの媒体を付着させずになされる。第二の場合には、好都合には、支持体 は固体支持体であり得る。 本発明の記載では、用語「支持体への付着」は、複合体が形成される時間を早 まって判断することなく使用される。 本発明の１つの変形によれば、β2GPI/IC複合体は、複合体のβ2GPI部分によ って、すなわち、このβ2GPI部分へ結合する化合物を支持体に提供することによ って、保持される。次に、ICに対応する複合体部分が、適切な手段によって分離 ／検出／定量される。 本発明の他の変形によれば、β2GPI/IC複合体は、該複合体のIC部分によって 、すなわち、後者を、複合体のこのIC部分へ結合する化合物を提供される支持体 に付着させることによって、保持される。次に、この複合体のβ2GPI部分が、任 意の適切な手段によって検出および／または分離および／または定量される。好 都合には、特に、複合体化され、β2GPIに特異的な抗体を用いる。界面活性剤ま た は脂質の天然状態での存在、または添加が、これらの抗体の付着の助けとなり得 る。 本発明によれば、検出は、特に目視または顕微鏡（特に、光学顕微鏡、電子顕 微鏡、またはUV顕微鏡）によって、ICに対して特徴的な構造体を可視化および／ または計測(counting)することによって実施され得る。この検出は、これらの構 造体上でICと会合される（β2GPI）nを、特に、特異標識抗体（例えば、酵素分 子または蛍光分子に複合体化される抗体）の助けによって検出することによる。 生物学的材料のIC（これは、複合体化され得るかまたはされ得ない）は、物理的 、化学的、または生物学的に支持体に付着され得るか、または液相（特に、酸、 ケトン、アルコール、パラフィン、またはアルデヒド液）であり得る。各部分に 特異的な二重標識もまた、各部分に特異的であり、そして２つの異なるトレーサ ー（例えば、異なる波長の蛍光を発するトレーサー）に複合体化される抗体を特 に使用して、複合体を検出するために使用され得る。最後に、生物学的材料中の ICは、粒子または構造体の数、容積、大きさ、または形状のようなシグナルを分 析するための装置の助けによって、例えば、特にフローサイトメトリーによって 、検出またはアッセイされ得る。 本発明の他の変形によれば、β2GPI/IC複合体は、複合体のβ2GPI部分またはI C部分のいずれかに結合する化合物によって、支持体に保持される。その後、こ の支持体に付着される複合体が、この生物学的材料から分離され、そしてこの（ IC/β2GPI）複合体は、複合体の他方の部分の認識により分離および／または検 出および／または定量および／またはアッセイされる。 支持体は、好都合には固体支持体である。これは、膜（例えば、ニトロセルロ ース膜）、あるいはマイクロタイタープレート（例えは、ELISAマイクロタイタ ープレート）、あるいは顕微鏡スライドであり得る。 複合体の部分の一方に結合する化合物（例えば抗体）は、この化合物の反応基 を支持体の反応部位と反応させることによって、支持体に付着される。好ましく は、この反応は、０℃と40℃との間の温度で実施される。複合体の部分の一方に 結合する化合物は、好都合には4.5と10.5との間のpH、好ましくは6.5と7.5との 間のpHを有する緩衝液中に置かれる。この緩衝液は、好都合にはリン酸型または 酢酸型であり得る。支持体は、０℃と40℃との間の温度での30分と24時間との間 のインキュベーション時間の間、化合物を含有する緩衝液と接触されて、好都合 に維持される。インキュベーション後、反応しなかった緩衝液は支持体から分離 され、そして支持体は洗浄される。好ましくは、支持体は、それが上記化合物を 含有しないこと以外は以前の緩衝液と同じ緩衝液で洗浄される。この化合物と反 応しなかった支持体の活性部位を飽和する必要があり得る。この場合、他の活性 基を、これらの活性部位と反応させる。この目的のために、好都合には、血清ア ルブミン（例えばウシ血清アルブミン）溶液またはカゼイン溶液および／または ポリビニルピロリドン溶液および／またはゼラチン溶液および／または界面活性 剤溶液が使用され、これは同時または連続的に使用される。反応後、支持体は、 好ましくはリンスされて、乾燥される。 次に、複合体に結合する化合物が付着される支持体は、探索IC(sought-after IC)を含有する生物学的材料（特に液体）と接触させて置かれる。この生物学的 材料は、好都合には4.5と10.5との間のpH、好ましくは5.6と7.5との間のpHを与 える緩衝液で希釈される。支持体での反応は、好ましくは０℃と40℃との間の温 度で、好都合には約37℃の温度で、継続時間が30分と24時間との間の期間で実施 される。次に、反応しなかったICを含有する溶液が、好都合には支持体から分離 される。適切なところで、次に、支持体が、生理食塩水、好ましくは緩衝化生理 食塩水で洗浄される。 複合体の支持体への付着が、複合体のβ2GPI部分によってなされる場合には、 β2GPIへ結合する化合物は、β2GPIを認識する抗体であり得、または、別のタン パク質(（例えば、ウイルス起源または原核あるいは真核細胞起源のタンパク質 ）（例えば、アルブミン）)、または生物学的化合物（例えば、脂肪酸または脂 質(例えば、リン脂質))、または化学的化合物（例えば、デキストラン硫酸、ヘ パリン硫酸、または界面活性剤）であり得る。支持体のフリーラジカルまたは活 性型ラジカルが、ときには優先的にβ2GPIと結合し得る。 β2GPIによって支持体へ結合されるβ2GPI/IC複合体のICは、感染性、特異酵 素反応、トレーサー（例えば、蛍光または放射性標識トレーサー）、標識プロー ブとのハイブリダイゼーションによる特異核酸の検出、ポリメラーゼ連鎖反応（ 「PCR」）、アッセイ、計測、可視化、または光学または（電子）顕微鏡法のよ うな任意の公知手段によって、分離および／またはアッセイおよび／または定量 され得る。しかし、検出および／またはアッセイは、検出されるべきICのタンパ ク質を特異的に認識する抗体の助けによって好ましく実施される。公知の様式で 、この抗体は、酵素標識（例えばペルオキシダーゼ）に複合体化され得る。抗体 の過剰分は、洗浄によって除去される。次に、抗体に複合体化された酵素に特異 的な基質が添加され、公知の様式で、この基質は、予め決定された条件下で、発 色産物に転換し、この発色産物の形成は、探索ICの存在を示し、このICがアッセ イされることを可能にする。同位体標識に結合され、次に放射分析によって検出 されるICに対する抗体もまた、使用され得る。 支持体への付着が複合体のIC部分によってなされる場合、特に特異検出が望ま れるとき、それは、好都合に標識に複合体化されるβ2GPIによって可視化される 。ICは、支持体に直接または間接に、例えば抗体によって、付着され得る。好都 合には、標識は、酵素、放射性産物、または蛍光産物であり得る。ICは、付着が 直接であるときにはICの反応基を支持体の反応部位と反応させることによって、 または化合物（例えば抗体）を支持体の反応基に付着させ、そして前もって支持 体に付着しておいたこの化合物にICを付着させることによって、支持体に付着さ れ得る。 IC部分に結合する化合物によって複合体が付着された複合体のβ2GPI部分は、 任意の適切な手段によって検出され得るが、それは、β2GPIに特異的であり、そ して例えば複合体化される抗体を使用して、好都合に検出され得る。 本発明はまた、上記の方法を実施するための固体支持体に関連し、これは、β 2GPI/IC複合体の要素の１つ、またはこの複合体の要素の１つを付着するのに適 した基質を付着するのに適していることに特徴づけられる。 下記の実施例は、純粋に例示により、かつ限定ではなく、本発明を説明するこ とを助ける。いくらかは、フランス特許出願第2 701 263号に従って得られたβ2 'GPIを使用して、実施された。実施例１．レーシュマニアの視覚化 a)蛍光β2'GPIの使用 血液寒天上でのインビトロ培養によって得たLeishmania infantumプロマステ ィゴート(promastigotes)の懸濁液を、光学顕微鏡下での観察のためにスライド 上で、アセトンで０℃で10分間固定する。次に、スライドを、リン酸緩衝液中に ５分間浸漬する。この緩衝液は以下「PB」と称し、0.01 Mの濃度のリン酸一ナト リウムおよびリン酸二ナトリウム、および0.15 Mの濃度の塩化ナトリウムを含有 し、7.2±0.1のpHである。β2'GPIをフルオレセインに結合させる。次に、それ を固定化プロマスティゴート懸濁液上に20μg/mlおよび2μg/mlの濃度で堆積さ せ、次に、これを加湿チャンバー中に20℃にて30分間置く。結合されなかった蛍 光β2'GPIを、２つの連続PB浴で５分間、そのスライドを浸漬することにより除 去する。寄生虫の蛍光可視（特にそれらの外面(pourtour))の蛍光は、複合体形 成の証拠を提供し、そしてこれらの複合体が可視化および同定されることを可能 にする。 b)β2'GPIのための別の標識の使用 別の実験では、Avrameas（Immunochem．(1969)8，43〜52頁）に従って、アル カリホスファターゼに結合させたβ2'GPI（以下「DAP」と呼ばれる）は、スライ ドにアセトンで固定した寄生虫と反応した。リン酸緩衝液は、アルカリホスファ ターゼを阻害しないように、取り替えた。 実験室温度で実施したプロトコールは、以下のようであった：生理食塩水中5 分間の寄生虫の再水和；DAP形態のβ2'GPIの37℃30分間のインキュベーションお よび「Triton XI00」の商品名で販売されている界面活性剤0.05％を含有する酢 酸緩衝液中での希釈；50 mM Tris-HCl（pH = 8.2）、50 mM NaCl中10分間の１回 洗浄、生理食塩水中10分間の１回洗浄、および「速読TR／ナフトール（fast rea d TR/naphthol）」の商品名で販売されているシステムを用いるアルカリホスフ ァターゼ活性の検出。これらの条件下では、光学顕微鏡下の観察は、β2'GPIが 、1μg/mlの濃度でまだ有意に反応することを示す。 c)数株のレーシュマニアについての蛍光アッセイ 種々の種のレーシュマニアを、蛍光β2'GPIとレーシュマニアとの相互作用を 示すために使用した。以下をこの内容に関してテストした：L．infantum、L．ma rjon、L．guyanensis、L．tronicer、L．donorium、およびL．braziliensis。全 ての種が、反応の間、0.05％ TX100および0.25M NaClの添加存在下で、蛍光β2' GPIとの有意な反応を示した。実施例２ 実施例１と同じ実験を、トキソプラズマ(Toxoplasma gondji)[sic]を使用して 実施し、寄生虫の蛍光を、少なくとも20μgのβ2'GPI/mlで観察した。 これらの実施例１および２の場合、他の実験は、蛍光β2'GPIによるレーシュ マニアおよびトキソプラズマの検出感度を、インキュベーション緩衝液中に0.05 ％ TX100および0.25M NaClを添加することによって増大させ得た。 寄生虫（レーシュマニア）およびウサギまたはヒト赤血球細胞の混合物をアセ トンでスライドに固定し、次に、上記の改良条件下で反応させた。観察された画 像は、強く蛍光した寄生虫と赤血球（これは非常に弱く標識されている）との間 で鮮明な対照を示す。 コントロールとして、β2'GPI以外の蛍光試薬を、蛍光β2'GPIと同じタンパク 質およびフルオレセイン濃度で、上記の改良条件下で実施した。この試薬は、免 疫精製し、フルオレセインに結合させ、かつヤギIgGに特異的であり、従って先 験的に寄生虫に対して特異性を有さないウサギF(ab')c'から構成される。ところ で、この試薬はまた、匹敵する濃度のフルオレセイン純粋溶液と同様に、同じ条 件で使用されるとき、寄生虫において「バックグラウンドノイズ」程度の非常に 弱い蛍光のみを与えた。実施例３ 実施例１と同じ実験を、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)において実施 し、そして寄生虫の蛍光を、少なくとも20μgの蛍光β2'GPI／mlで観察した。実施例４ ：可溶性Leishmania infantum抗原の検出 使用する支持体は、96ウエルを有し平底であるマイクロ-ELISAマイクロタイタ ープレートであり、これにLeishmania infantum可溶性抗原を付着させる。この 感作支持体に、BIOKEMA-Affinity Products（Switerland）を散布する。 10μg/ml濃度を有するペルオキシダーゼ標識β2'GPI溶液を、0.05mol/l酢酸お よび酢酸ナトリウム、0.01％ウシ血清アルブミン、および0.05重量％「Triton X 100」を含有する酢酸緩衝液（pH 5.6 ± 0.1）中で調製する。この溶液の100μl を各ウエルに加え、プレートを37℃で1時間30分の間インキュベートさせる。こ のインキュベーション後に、プレートのウエル内容物を吸引して取り出す。300 μlリン酸緩衝液を各ウエルに入れ、次に、２分間の接触時間後に、緩衝液を吸 引して取り出す：この洗浄操作を３回繰り返す。 クエン酸ナトリウム緩衝液中のo-フェニレンジアミンOPD2 HClの溶液100μlを 、各ウエルに加える。プレートを常温にて30分間インキュベートさせ、次に、反 応を、各ウエルに50μl 2N H₂SO₄を加えて停止させる。反応の終点で得られる49 2nmでの吸光度を、光学密度単位（ODU）で測定する。この測定は、自動プレート リーダーを使用して実施される。 得られた結果は、Leishmania infantumの可溶性抗原がβ2'GPIにより認識され ることを示す。同じ結果が、未標識β2'GPIを使用するときに得られる。この後 者の場合には、結合は、ペルオキシダーゼ標識抗β2'GPIモノクローナル抗体に よって続いて検出される。実施例５ ：β2'GPIのBorrelia抗原への結合 Borrelia抗原（I．Nilssonからの寄贈）が電気泳動後に移されたニトロセルロ ース膜を用いた。 0.1重量％ゼラチンおよび0.5％「TX100」を含有し、5.6 ± 0.1のpHを有する1 ml酢酸緩衝液（0.05mol/l酢酸/酢酸ナトリウム）の溶液中の約40ngのアルカリホ スファターゼ結合β2'GPIを、常温で１時間30分間、この膜と反応させる。次に 、この膜を、0.05重量％「TX100」を含有し、5.6 ± 0.1のpHを有する0.05mol/l 酢酸緩衝液で１回リンスする。次に、この膜を、0.01mol/lリン酸一ナトリウム および二ナトリウム、0.15mol/l塩化ナトリウム、0.05重量％「TX100」を含有し 、7.00 ± 0.1のpHを有するリン酸緩衝液で２回リンスする。アルカリホスファ タ ーゼ活性は、塩酸で中和してpH 8.8にされた50mM Tris（ヒドロキシメチル）ア ミノメタン（Tris-HCl）、および0.1M NaClを含有する溶液中のニトロブルーテ トラゾリウム（NBT）および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(bomo 4-chloro 3 ondolyl phosphate）（BCIP）の存在下で検出される。β2'GPIが、 Borrelia afzelii抗原、特に、病原性を示すと考えられる抗原（例えば、Ingrid Nilssonら（Serodiagn．Immunother．Infect．Disease，1993，5，245〜250頁 ）による刊行物に使用されている用語に従った、p39、osp B、osp A、およびosp C）の存在を検出することを可能にすることが、膜上で見られる。同じ条件下で 、アルカリホスファターゼ単独との反応はみられない。実施例６ ：B型肝炎ウイルスのHBs抗原の検出 使用する支持体は、96ウエルを有し平底であるマイクロ-ELISAマイクロタイタ ープレートであり、これは、「DYNATECH」によって販売されている。「TRANSGEN E」から供給されたHIV2 p26 ROD組換えタンパク質の2μg/ml溶液を、0.01mol/l リン酸一ナトリウムおよび二ナトリウム、および0.15mol/l塩化ナトリウムを含 有し、7.00 ± 0.05のpHを有するリン酸緩衝液中に調製する。この溶液の100μl を、マイクロプレートの各ウエルの底に堆積させる。次に後者を＋４℃で18時間 インキュベーションする。この後、各ウエルの液体を吸引して取り出す。次に、 0.05重量％界面活性剤（市販商品名「TX100」で販売されている）を含有する上 記リン酸緩衝液300〜400μlを、各ウエルに入れる。この緩衝液を、支持体と３ 分間接触させ、そして吸引して取り出す。この洗浄操作を３回実施する。 健常ドナーからの３つの血清試料およびB型肝炎ウイルス感染患者からの４つ の血清試料を使用した。血清試料を、0.05mol/ml酢酸および酢酸ナトリウム、0. 5重量％TX100、および0.01重量％ウシ血清アルブミンを含有し、5.6±0.1のpHを 有する酢酸緩衝液で、10、100、または1000倍に希釈する。100μl溶液を、上記 のように調製したプレートの各ウエルの底に堆積させる。このプレートを37℃で 90分間インキュベートさせる。このインキュベーション後、0.05重量％TX100を 含有するリン酸緩衝液300μlを各ウエルに入れることにより洗浄を行う。この緩 衝溶液を２分間接触させて、吸引して取り出す。この洗浄操作を４回繰り返す。 次に、B型肝炎ウイルスのHBs抗原に対するペルオキシダーゼ複合体化特異モノ クローナル抗体の溶液100μlを、各ウエルに加える。このプレートを37℃で60分 間インキュベートさせる。このインキュベーション後、プレートの各ウエルの内 容物を吸引して取り出す。0.05重量％TX100を含有するリン酸緩衝液300μlを、 各ウエルに入れ、そして次に、この緩衝溶液を、２分間接触後に吸引して取り出 す。この洗浄操作を５回繰り返す。 クエン酸ナトリウム緩衝液中のo-フェニレンジアミン、2HClの溶液100μlを、 各ウエルに加える。プレートを常温にて30分間インキュベートさせ、次に、反応 を、各ウエルに50μl 2N H₂SO₄を加えて停止させる。反応の終点で得られる492n mでの吸光度を、自動プレートリーダーを用いて測定する。 各患者またはドナーから得た吸光度の平均値を表１に示す（光学密度単位×10 00）。HBsAgは、４人の患者の場合には効率よく検出されたが、３人の健常被検 体の場合には検出されなかった。 実施例７ β2GPIに対して特異的なモノクローナル抗体（「8C3」と呼ばれる：J．Arvieu xからの寄贈）を支持体に付着させること以外は、実施例６と同様に、同じ方法 を使用した。同様の結果が得られた。 これらの２つの実施例６および７の場合には、一方では、β2GPIが支持体に付 着するようになることが、特異抗体によりそれを検出することにより示され、そ して他方では、B型肝炎を患う患者の血清中に存在する（β2GPI/HBsAg）複合体 の付着を、β2GPI付着のために調製した支持体へのその付着を、β2GPIに特異的 な抗体と共に患者の血清を37℃で30分間プレインキュベーションを行うことによ ってブロックすることにより、阻害し得た。これらの結果は、B型肝炎ウイルス のHBsAgが、血漿中に存在するβ2GPIによって認識され得ることを示す。この後 者は、これらのアッセイで、HIV2 p26 RODまたは特異抗体に結合される。実施例８ 実施例６の場合と同じ方法を使用すると、結果は、感染組織から抽出したレー シュマニア（LEISHMANIA）寄生虫によってもたらされる表面抗原を検出するのに ポジティブであった。実施例９ ：β2GPI／不死化リンパ球細胞系細胞複合体の形成 蛍光β2GPIを、PBS緩衝液中で37℃で１時間、２回前もってリンスした「CEM」 細胞系細胞（10⁶/ml）とインキュベートする。PBS緩衝液中３回の洗浄後、細胞 を、２％パラホルムアルデヒドで固定し、次にフローサイトメトリーで分析する 。結合スペクトルの分析は、ほとんどの細胞にβ2GPIが存在することを示す。こ の量は、最初の投与量に依存して存在し、10〜100μg/mlであった。 この結合は、健常ドナーからの正常末梢血リンパ球とは違って、他の不死化細 胞系の場合（例えばT細胞系：SVPT1およびMOLT4、または単球系：TFPIおよびU93 7）において観察された。この不死化細胞系は、市販「Ficoll」溶液の緩衝を介 して遠心分離により単離し、次にPBSでリンスした。実施例１０ ：（β2GPI）n／HBsAg複合体の結合 本実施例では、（β2GPI）n部分に結合する化合物は、WO 93/21228に記載の方 法によって精製されたヒト血清アルブミン（HSA）である。ELISAプレート（Nunc Maxisorb）に0.1M Trisグリシン(pH 8.8)中の１％ HSA溶液を予め添加し、次い でPBS(pH 7.2)で全体的に洗浄する。 HBsAg＋血清または健常ドナー血清を、酢酸ナトリウム（50mM、pH5.6）での10 00倍希釈で、37℃で1時間インキュベートさせ、実施例６と同様に但しTX100非存 在下で実験を実施する。 ドナー血清または血清なしコントロールは、いかなる著しいシグナルをも与え ない（＜0.05 odu）。HBsAg血清は、有意なシグナルを与える（近似1.5 odu）。 従って、HBsAgは捕捉される。血清希釈物がインキュベートされる場合、 (a)800μg HSA/mlの存在下では、シグナルは、80％より大きく減少され、この ことは、支持体に付着されるHSAへの結合が事実であることを示す； (b)4μg β2GPI/mlの存在下、すなわち血清から生じる内部β2の単なる20倍量 で、シグナルはほとんど40％減少され、このことは、内部複合体のいくらかが支 持体へ付着していることを表す。 同様の実験が、プレートへの予備添加を行わずに実施される場合、HBsもまた 可視化され、HSA存在下でのプレインキュベーションで97％阻害され、そして添 加β2GPIの存在下では65％阻害されることが観察される。 実施例１１：Mycoplasma penetransタンパク質との（β2'GPI）aの複合体の形 成 本方法は、２％オクチルグルコシドで処理した数マイクログラムのICを含有し 、EURIS法（14，rue du Chapeau Rouge-34500 BEZIERS(フランス)）によって飽 和されたニトロセルロース細片上で、実施例５と同様に実施した。DAP形態で標 識されたβ2GPIは、免疫特異血清、またはp35（特に、35、40、および45Kdの抗 原に対して強く、そして65Kd抗原に対しては弱い）に特異的な血清によって検出 される特異抗原に明らかに結合される。実施例１２ ：破傷風トキソイドへの（β'2GPI）[sic]の結合 破傷風トキソイド（ELOCORIDE，Behring）を、10％アクリルアミドゲルでの電 気泳動後に、約0.5〜2μg/mm²の速度でニトロセルロースへ移した。 EURIS法により膜を飽和し、50mM Tris-HCl（pH = 8.2）、50mM NaCl溶液で４ 回リンスし、50mM Hepes-NaOH（pH 6.8±0.1）で１回リンスした後、後者の緩衝 液１ml中の100ng DAPを膜に加え、これを、10μgカルジオリピン（「CL」と呼 ぶ）の存在または非存在下で、25℃にて１時間インキュベーションを行った。こ の膜を、50mM Tris-HCl（pH = 7.2）、150mM NaClの１mlで４回リンスした。 実施例５と同様に可視化した後、破傷風抗原を含有する帯が、CLの存在下で着 色される唯一のものである。CLの非存在下では、反応は起こらず、これは、これ らの条件下で複合体を形成させるためにはCLの存在が必要であることを示す。 β2GPI/IC複合体形成での界面活性剤および／または脂質の役割は、以下に報 告されている実験によって、より詳細に説明された。 １リットルあたり7.5g Trisおよび14.4g グリシン、および20％メタノールを 含有する水溶液中の100〜200ngのウイルスタンパク質を、２〜４mm²のニトロセ ルロース膜（「Schleicher and Schull」によって販売されているBA04）にゆっ くりと濾過させる。この膜を、メタノールを含まないが、１％ HSAを含有する同 じ緩衝液で飽和させる。この緩衝液は、実施例１０に示されているようにして得 た。次に、支持体を、50mM Tris-HCl（pH = 8.2）、50mM NaCl中で４回、短時間 予備洗浄し、次に、β2GPIと、反応媒体中で１〜４時間インキュベートさせ、最 後に、アフターリンスで洗浄する。β2GPIは下記に示すように可視化する。 一般には、脂質および／または界面活性剤の非存在下では、β2GPIは、飽和に 使用されるアルブミンに結合し、そして特定のウイルスタンパク質には結合しな いことが観察される。しかし、界面活性剤の存在下では、逆が観察される。すな わち、β2GPIはアルブミンに結合しないが、特定のウイルスタンパク質に結合す る。カルジオリピンのようなリン脂質はこのような結合を誘導する。 より正確には、以下の結果が観察された： A)以下の工程を実施する：１mlあたり50ngのDAPとの反応；50mM Tris-HCl（pH = 8.2）、50mM NaClでの４回アフターリンス；Merck推奨条件に従って、0.1M T ris-HCl（pH = 8.8）、NBT、およびBCIPでのDAPの可視化。 反応媒体（50mM 酢酸ナトリウム、pH = 5.6）中に界面活性剤が存在しない場 合、組換えタンパク質HVI₁ p18およびp25およびHIV₂ p26（TRANSGENE）は、反応 しない（支持体の白色帯）が、一方、組換えタンパク質HIV gp160は、DAPにわず かに結合し、そしてヒトアルブミンもまた反応する（着色バックグラウンド）。 逆に、0.5％ TX100または「Triton 405」または0.2％「Tween 20」の存在下では 、アルブミンはもはやいかなる反応も示さないが、一方、HIV₂ p26およびHIV₁ p 18は、強い反応を示す。HIV₁ gp160は、界面活性剤なしでの反応より強い反応を 示し、そしてHIV₁ p25は、弱い反応を示す。 B)同条件下であるが、50mM Tris-HCl（pH = 8.2）の異なる反応媒体では、HIV₁ p18のみが、界面活性剤の存在下で弱く反応する。 C)以下の工程を実施する：50mM Hepes、NaOH（pH = 6.8）での１回前洗浄；同 じ緩衝液中での、10μgのカルジオリピン／mlの存在または非存在下での100ng D AP/mlとの１時間反応；0.15M NaCl、50mM Tris-HCl（pH = 7.2）、150mM NaClで の４回アフターリンス、および0.15 M NaClでの１回アフターリンス、およびA) と同様の可視化。 ４つのHIVタンパク質はいずれもカルジオリピンの非存在下では反応しないが 、この４つはそれが存在するとき反応する。 D)以下の工程を実施する：50mM Tris-HCl（pH = 7.6）中、および1μgのβ2'G PI/mlおよび20μgのCL/mlの存在下での１時間反応、反応緩衝液での４回洗浄、 ならびに0.15M NaClおよび0.05％「Tween 20」が加えられた同じ緩衝液中での、 溶液中の54μgのアルカリホスファターゼ結合モノクローナル抗体8C3/mlの存在 下での１時間インキュベーションによるβ2'GPIの可視化；次に、同じ溶液での ４回リンスおよび0.15M NaClでの１回リンス、ならびにA)と同様の可視化。 ４つのウイルスタンパク質が反応し、そしてHIV₁ p25が強く反応するが、一方 、β2'GPIのないまたはCLのないコントロールは、眼に見える反応を全く示さな い。 とりわけ、これらの実施例は、界面活性剤およびまたは脂質（特にリン脂質） が、もしこの相互作用に関与しなけれは、ウイルスタンパク質との相互作用を促 進し得ること、およびアルブミンとの結合は、それが使用される界面活性剤に感 受性であるので、異なる特性のものであることを示す。 界面活性剤またはリン脂質は、β2GPIの存在の前の段階で加えられ得ることも また、注目される。HIV₁ウイルスタンパク質におけるリン脂質レベルは高いこと が知られ、そして界面活性剤の存在下でβ2GPIと組換えHBsAgとの間の結合が記 載されたことは、注目される。いくつかのICの場合、およびいくつかの環境条件 下では、界面活性剤または脂質が、β2GPI/IC複合体を形成させるために必要で あることが、このことから分かる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｂ 0276−2Ｊ Ｈ // Ｇ０１Ｎ 33/576 0276−2Ｊ 33/576 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 グラフラン， ユベール フランス国 モンペリエ エフ−34000, アベニュー デュ プロフェスール−グ ラセ， 10 エイ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的材料中の感染性化合物（IC）、特にタンパク質性感染性化合物を 分離および／または検出および／または定量する方法であって、該化合物は、感 染因子の特異構成性化合物、内因性または外因性の完全または不完全な感染因子 を含む構造体、それらの代謝物、該感染因子のある種の特異性を示すこれらの感 染因子の組み立て体、および上述の化合物によるかまたは異常様式で発現される 遺伝子の発現によって生物において特異的に誘導される化合物からなる群より選 択され、β2GPI/IC複合体（ここでβ2GPIはβ2糖タンパク質Iであり、かつICは 感染性化合物であり、該複合体は適切な手段によって同定され得、かつ (a)（β2GPI）n／IC；（β2GPI）nは生物学的材料中に存在するβ2糖タンパク 質Iであり、そしてICはウイルス化合物VICまたは非ウイルス化合物nVICである、 (b)（β2GPI）a／nVIC；（β2GPI）aは生物学的材料中に添加されるβ2糖タン パク質Iであり、そしてnVICは非ウイルス感染性化合物である、 からなる群より選択される）が、分離および／または検出および／または定量さ れることに特徴づけられる、方法。 ２．前記ICが、β2GPIに結合する物質を使用して、β2GPI/IC複合体を認識す ることによって、分離および／または検出および／または定量されることに特徴 づけられる、請求項１に記載の方法。 ３．前記β2GPI/IC複合体が、該複合体が形成される媒体において、該複合体 を支持体へ前もって付着させずに、該媒体を付着させてまたは付着させないで、 分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、請求 項１または２に記載の方法。 ４．前記β2GPI/IC複合体に含まれる要素の１つが、支持体上に保持されるこ とに特徴づけられる、請求項１または２に記載の方法。 ５．前記支持体が固体支持体であることに特徴づけられる、請求項４に記載の 方法。 ６．使用される前記支持体が、膜、マイクロタイタープレート、または顕微鏡 スライドであることに特徴づけられる、請求項５に記載の方法。 ７．前記β2GPI/IC複合体が、複合体のβ2GPI要素によって前記支持体に保持 されることに特徴づけられる、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。 ８．前記β2GPI/IC複合体が、複合体のIC要素によって前記支持体に保持され ることに特徴づけられる、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。 ９．前記IC要素が、前記β2GPI/IC複合体が形成される前に前記支持体に付着 され、次に、該複合体が形成され、そして次に、該複合体の該β2GPI要素が分離 および／または検出および／または定量されることに特徴づけられる、請求項８ に記載の方法。 １０．物理的、化学的、または生化学的に支持体へ付着される、生物学的材料 のICが、前記複合体のβ2GPIに結合する物質を使用して、分離および／または検 出および／または定量されることに特徴づけられる、請求項８または９に記載の 方法。 １１．前記β2GPI/IC複合体が、該複合体のβ2GPI部分またはIC部分のいずれ かに結合する化合物によって支持体に保持され、そこで該支持体に付着される複 合体が、生物学的材料から分離され、そして該複合体が、複合体の他方の部分の 認識により分離および／または検出および／または定量されることに特徴づけら れる、請求項１または４に記載の方法。 １２．前記複合体が、複合体のβ2GPI部分に結合する化合物によって前記支持 体に保持されることに特徴づけられる、請求項１１に記載の方法。 １３．前記複合体が、複合体のIC部分に結合する化合物によって前記支持体に 保持されることに特徴づけられる、請求項１１に記載の方法。 １４．β2GPIに結合する化合物が、β2GPIに特異的である抗体、別のタンパク 質、およびβ2GPIに結合する生物学的または化学的化合物からなる群より選択さ れることに特徴づけられる、請求項２に記載の方法。 １５．β2GPIを認識するタンパク質がHIV₂ p26 RODタンパク質であることに特 徴づけられる、請求項１４に記載の方法。 １６．前記複合体のICが、HIV1、HIV2、HSV、HBV、およびウイルス起源の粒子 またはタンパク質からなる群に属することに特徴づけられる、請求項１に記載の 方法。 １７．前記複合体のICが、細菌、寄生虫、マイコプラズマ、カビ、および異常 動物細胞からなる群に属することに特徴づけられる、請求項１に記載の方法。 １８．支持体に付着される前記β2GPI/IC複合体のICが、感染性、特異酵素反 応、蛍光または放射性標識トレーサー、標識プローブとのハイブリダイゼーショ ンまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸の検出、あるいはICに特異的 である抗体の使用によって、分離および／または検出および／または定量される ことに特徴づけられる、請求項７に記載の方法。 １９．使用されるβ2GPIの形態が、純粋形態であるかまたは純粋形態ではない β2'GPIであることに特徴づけられる、請求項１から１８のいずれか一項に記載 の方法。 ２０．前記ICとの複合体を組み立てるために使用されるβ2GPIが標識され、該 複合体が、該標識により検出および／または定量されることに特徴づけられる、 請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。 ２１．前記β2GPIが、酵素、放射性産物、または蛍光産物によって標識される ことに特徴づけられる、請求項２０に記載の方法。 ２２．前記β2GPI要素が、前記β2GPI/IC複合体が形成される前に前記支持体 に付着され、次に、該複合体が形成され、そして次に、該複合体のIC要素が検出 および／または定量されることに特徴づけられる、請求項６に記載の方法。 ２３．前記複合体の要素の少なくとも１つが、動物起源であるか、あるいは遺 伝子工学および／または化学工学によって生成されることに特徴づけられる、請 求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。 ２４．請求項４または１１のいずれかに記載の方法を実施するための固体支持 体であって、それが（β2GPI）n／IC複合体をその構成性要素の少なくとも１つ によって、直接または間接に、特異的または非特異的に保持するのに適している ことに特徴づけられる、固体支持体。