JPH10503926A - Ｄｎａをマイコバクテリアに挿入するためのシャトルベクター及びこの種のバクテリアのワクチンとしての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＤＮＡをマイコバクテリアに挿入するためのシャトルベクターであって、上記マイコバクテリアにおける最低１つの機能的複製起点と、その他の細菌におけるもう１つの機能的複製起点と、マイコバクテリアに発現され得る蛋白質の遺伝暗号をもつＤＮＡを挿入せしめる酵素切断部位とを含んでなり、重金属含有化合物に対する耐性を上記マイコバクテリアに付与する遺伝子をも含むことを特徴とするシャトルベクター。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡをマイコバクテリアに挿入するためのシャトルベクター及びこの種のバク テリアのワクチンとしての使用 本発明はＤＮＡをマイコバクテリアに挿入するためのシャトルベクターに関す るものである。 本発明は、これらベクターの１つが挿入されたマイコバクテリアをワクチンと して使用することにも関係する。 マイコバクテリウム属は５０以上の種からなり、そのなかにはヒトにおける主 要病原菌、例えば結核の病原菌である結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、 ライ病の病原菌であるライ菌（Mycobacterium leprae）、ＡＩＤＳ過程の主な日 和見感染菌であるとり型結核菌（Mycobacterium avium）などが含まれる。結核 菌及びヒトにおけるその他の病原菌種の毒性の遺伝的メカニズムについては、こ れら細菌の遅い成長速度、及び十分なクローニングベクターの欠如によりほとん ど知られていない；その結果異種ＤＮＡをこれら微生物に挿入することは難しい 。その上マイコバクテリアは多くの抗生物質に特別の耐性を示す；それは、その 壁構造がこれら分子をあまり透過しないためである。しかしながら最近の研究に より、ＢＣＧに異種ＤＮＡを挿入し、この細菌に異種抗原を発現させ得ることが わかった。 ＢＣＧ操作の場合には、これまでに使用できる抗生物質に対する耐性のマーカ ー、例えば高度のカナマイシン耐性を与えるａｐｈ３遺伝子、またはストレプト マイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を与える遺伝子などの使用はす すめられない、なぜならば組換えＢＣＧをヒトまたは動物において治療的または 予防的目的で使用するならば、これら抗生物質に対する耐性を環境に撒き散らす ことになり得るからである。こうして広く使用し得る組換えマイコバクテリアを 選択するために環境に害のない耐性マーカーを開発することが最も重要である。 現在、マイコバクテリアに使用できるマーカーは非常にわずかしか手に入らな い。 例えば、アルドヴィニ（Aldovini）ら（J.Bacteriol.,1993，175巻、7282−72 89ページ）は、うし型結核菌（Mycobacterium bovis）ＢＣＧのオロチジン-５’ −一リン酸脱炭酸酵素（ＯＭＰ−ＤＣａｃｏ）の遺伝暗号をもつ遺伝子を分離し た。 その他のマーカー、ｃＩ遺伝子（Ｌ１ファージリプレッサーをコードする）も 用いられている（特許出願ＷＯ−９０／００５９４）。 これらのマーカーに基礎を置いた、大腸菌（Escherichia coli）とマイコバク テリアとの間のＤＮＡの往き来を可能にするシャトルベクターはすでに報告され ている。例えば特許出願ＷＯ−９１／１３１５７は２つのシャトルベクター、ｐ ＥＰ２及びｐＥＰ３を記載している。これらはそれぞれカナマイシン及びヒグロ マイシン耐性の遺伝子を担う。 これらのベクターの１つ、ｐＥＰ２を、特許出願ＷＯ−９０／１０７０１に記 載のように、マイコバクテリウムの蛋白質プロモータ−ＭＢＰ７０の挿入によっ て変形する。 マイコバクテリアに使用でき、抗生物質耐性マーカー、栄養素要求性マーカー またはｃＩ遺伝子を担持するその他のシャトルベクターが特許出願ＷＯ−９０／ ００５９４に記載されている。 最後に、レーンズ（Ranes）ら（J.Bacteriol.,1990，172巻、2793−2797ペー ジ）は、うし型結核菌ＢＣＧ及びスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）に発 現される、カナマイシン耐性の遺伝子をもつｐＥＰ３と呼ばれるシャトルベクタ ーの構造を報告した。 １１５ＭＤのプラスミドを担う水銀耐性の非病原性、腐生性マイコバクテリウ ムの菌株も知られるに至った（マイスナー（Meisssner）及びファルキンハム（F alkinham）、J.Bacteriol.，157巻、663−672ページ、1384）。しかしこの非常 に大きいプラスミドは特徴づけられなかった。すなわち、水銀耐性に関係する遺 伝子は部位決定もされず、同定もされなかった、したがってこのプラスミドはシ ャトルベクターとして使用することができなかった。その上、腐生性マイコバク テリアは病原性マイコバクテリアには属さない、後者は主として結核菌、うし型 結核菌及びライ菌に含まれる。 その結果、大腸菌におけるクローニングによって得られた、抗原類の遺伝暗号 をもつＤＮＡをマイコバクテリアに伝達したいと考える熟練せる当業者は、ワク チンを作るという観点から、大腸菌とマイコバクテリアに発現されるマーカーを 担い、ヒトまたは動物の健康に危険を及ぼさない、容易に操作できるベクターの 欠如に直面した。治療目的の抗生物質に耐性をもつ遺伝子の使用は実際、前に述 べた理由により除外しなければならない。栄養素要求性突然変異体の使用は、選 択が実際にむずかしく、その上各マイコバクテリウム菌種ごとに突然変異体を得 ることが必要である。 そこで出願人は、シャトルベクターのその他のＤＮＡ断片担持能力を過度に低 下させずにそのシャトルベクターに含まれることができるその他のマーカーを見 いだし、しかもそれらマーカーが発現されるマイコバクテリアに、それらマーカ ーをもつマイコバクテリアとそのマーカーをもたないマイコバクテリアとを明白 に且つ容易に区別すし得る特徴を与えるマーカーを見いだすことを計画した。 こうして出願人は驚くべきことに、無機水銀のような重金属を含む化合物また は水銀化合物類に耐性をもつ遺伝子を担うグラム陰性菌に由来するシャトルベク ターがグラム陽性菌に発現され、大腸菌とマイコバクテリアとの間のＤＮＡ伝達 のために使用できること、及びこれらのシャトルベクターを担う細菌が容易に選 択できることを明らかにした。 本発明はしたがってマイコバクテリアにおける機能的複製起点を少なくとも１ つと、他の細菌、例えば大腸菌における機能的複製のもう一つの起点と、マイコ バクテリアに発現することができる蛋白質の遺伝暗号を持つＤＮＡの挿入を可能 にする酵素切断部位とを含み、上記マイコバクテリアに、無機水銀などの重金属 を含む化合物、水銀化合物または砒素に対する耐性を上記マイコバクテリアに付 与する遺伝子をも担うという特徴をもつ、ＤＮＡを上記マイコバクテリアに挿入 するためのシャトルベクターに関するものである 熟練せる当業者は多年にわたり、遺伝子をマイコバクテリアに伝達するための マーカーを探す問題に直面していたが、現在までこの問題の満足すべき解決法は 見いだされていないことは考慮されるべきである。 出願人が見いだした解決法、すなわちグラム陰性菌に由来し、重金属耐性の遺 伝暗号をもつ遺伝子を選択するという方法は、熟練せる当業者がグラム陽性菌に 発現されるグラム陰性菌の発見を理論的には期待していなかった事実から見て、 特に驚異である。実際に多くの研究は、グラム陰性菌からの遺伝子がグラム陽性 菌に発現することは不可能であることを証明している（ミスラ（Misra）、プラ スミド（Plasmid）、27巻、４−16ページ、1992；ロビンソン（Robinson）及び ツオヴィネン（Tuovinen）、微生物学研究（Microbiological Reviews）、48巻 、２号、95−124ページ、1984）。 出願人はこうして、長年にわたる問題及びさらに一般大衆の健康にも非常に重 要な問題の解決法を見いだした；マイコバクテリア及び特にうし型結核菌ＢＣＧ は、もしもこれらの細菌が異種抗原を発現し得るならば、種々の疾患に対するワ クチン化の良い候補であると考えられる。本発明は効果もあり、一般大衆の健康 に害のないこれら抗原の遺伝暗号を持つ遺伝子を紹介するものである。 したがって本発明は一般大衆保健の分野における重要な技術的進歩に関係する 。 水銀耐性のマーカーが特にマイコバクテリアに存在することはすでに公知であ るとはいえ、熟練せる当業者は決して、水銀または水銀化合物耐性の遺伝子をマ イコバクテリアに使用できるシャトルベクターに組み込もうとはしなかったこと も注目すべきである。これに対して、例えば大腸菌に発現するオペロンはマイコ バクテリアには発現しないことは広く知られている。熟練せる当業者はこうして 、一般に大腸菌に発現する遺伝子をマイコバクテリアに使用する気にはならなか った。 言い換えれば、耐性遺伝子、特に水銀または水銀化合物耐性の遺伝子を、シャ トルベクターを取り込んだマイコバクテリアの選択のための遺伝子として使用す ることを擁護するものは何もなかったのである。 本発明の目的の１つは異種ＤＮＡをマイコバクテリアに伝達することに関係す るが、シャトルベクターはマイコバクテリアのＤＮＡ断片をその他の細菌、例え ば大腸菌に伝達し、マイコバクテリアの遺伝研究をし易くすることができること は注目すべきである。マイコバクテリアは、大部分それらの遅い増殖速度のため に、遺伝的観点から研究することは困難であり、そこでこの研究はマイコバクテ リアのＤＮＡ断片を大腸菌においてクローニングすることによって容易になるこ とは事実である。本発明に関係があるシャトルベクターは、マイコバクテリアの ＤＮＡのクローニングのために、そしてこれらの細菌の研究のためにも好都合に 使用できる。 これらを用いて、トランスポゾンの助力によって、結核菌及びその他の有毒マ イコバクテリアの毒性を減らすこともできる。 こうして本発明はマイコバクテリアの遺伝子分析の進歩をかなり速めるはずで あり、多価ワクチンを作るためのＢＣＧの遺伝子操作も可能にする。 本発明の目的のための“異種ＤＮＡ”とは、それを発現するために選択された マイコバクテリア種には属さないＤＮＡを意味すると理解される。伝達可能の異 種ＤＮＡの例としてはＥＰ９１．４０１．６０１に記載されているものがある。 水銀及びその他の水銀化合物、例えば有機水銀化合物に耐性の遺伝子はオペロ ンに組織化される。 細胞質のＨｇ2+イオンの輸送及びそれらの解毒のために現在までに６種類の遺 伝子ｍｅｒが記載されている。 鍵となる酵素は、Ｈｇ2+イオンをＨｇ0元素水銀─細菌によって容易に排除さ れる比較的毒性の小さい揮発性化合物である─に還元する、ｍｅｒＡ遺伝子にコ ードされた水銀還元酵素である。 遺伝子ｍｅｒＢも公知であり、Ｃ−Ｈｇ結合を切り、水銀をＨｇ2+イオン（こ れはその後上記の水銀還元酵素によって解毒される）に変換することができる有 機水銀脱離酵素の遺伝暗号を持つ遺伝子である。 本発明の範囲内で使用する水銀耐性の遺伝子はすべて、それらの塩基配列と共 に、ミスラ（1992、上記）、ロビンソン及びツオニヴェン（1984、上記）、フェ レイ（Fellay）ら（1987、遺伝子（Gene）、52巻、147−154ページ）、グリフィ ン（Griffin）ら（1987、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84巻、3112−3116ページ） またはヘレロ（Herrero）ら（1990、J.Bacteriol.，172巻、6557−6567ページ） によるレビューに記載されている。 しかしマイコバクテリアにそれ自体を発現する水銀耐性の遺伝子ならばその他 のいかなる遺伝子でも本発明に関係するシャトルベクターに組み込まれ得る。 本発明に関するベクターはそれ自体に遺伝子ｍｅｒＡ、または遺伝子ｍｅｒＡ 及びｍｅｒＢを、遺伝子ｍｅｒＴ及びｍｅｒＰと共に含むのが好都合である。 前者の場合、ベクターはトランスポゾンＴｎ５０１のｍｅｒＡオペロンを含む のが好都合である。後者の場合ベクターは、セラチアマルセッセンス（Serratia marcescens）から分離したプラスミドｐＤＵ１３５８からクローン化され、Ｈ ｇ2+イオン及び有機水銀化合物、例えば酢酸フェニル水銀（ＰＭＡ）などに対す る広い耐性スペクトルを表すオペロンｍｅｒＡ及びｍｅｒＢを含むのが好都合で ある。 好都合なのは、本発明による、オペロンｍｅｒＡを担うシャトルベクターがベ ルギー共同微生物コレクション（Belgian Collection of Coordinated Microorg anisms）（ＢＣＣＭ）にＮｏ．ＬＭＢＰ ３０４６として保管されているプラス ミドｐＭＲ００１であり、２つのオペロンｍｅｒＡ及びｍｅｒＢを担うベクター がＢＣＣＭにＮｏ．ＬＭＢＰ ３０４７として保管されているプラスミドｐＶＮ ２であることである。これら２つのプラスミドは遺伝子ｍｅｒＴ及びｍｅｒＰを も担い、ｐＭＲ００１ではｍｅｒＲをも担う。 水銀耐性の遺伝子が本発明で好都合に用いられるとはいえ、砒素、カドミウム または鉛などの重金属に耐性のその他の遺伝子を用いてもよい。 これらその他の重金属に対する耐性を与える遺伝子は、シルバー（Silver）及 びワルダーホーグ（Walderhaug）（微生物学研究、56巻、1号、195-229ページ、 1992）、カウル（Kaur）及びローゼン（Rosen）（プラスミド、27巻、29−40ペ ージ、1992）及びニース（Nies）（プラスミド、27巻、17−28ページ、1992）が 報告したものであることは注目に値する。 遺伝子ａｒｓを用いて砒素耐性を与えてもよい。このような遺伝子を担うベク ターはＢＣＣＭにＮｏ．ＬＭＢＰ ３０４８として保管されているｐＶＮ３であ る。 トランスポゾンは重金属を含む化合物に耐性を有する遺伝子と、酵素切断部位 とをもつのが好ましい。このような構造は、マイコバクテリアに発現されるのが 望まれる蛋白質の遺伝暗号を持つＤＮＡを挿入しようとする切断部位をもつＤＮ Ａの組込みを容易にする；相同的組換えが非常には効率的でない場合には特にそ うである。 上に述べたように、本発明による上記ベクターはマイコバクテリアに発現し得 る蛋白質の遺伝暗号をもつＤＮＡを挿入させる酵素切断部位を含む。 こうして本発明はこの切断部位を有するベクターのみならず、選択した宿主と は異種の蛋白質の遺伝暗号をもつＤＮＡ断片がこの切断部位に挿入されているベ クターにも関係する。 このような蛋白質は、好適には、ヒトまたは動物において免疫反応を引き起こ すことができる抗原、例えばライ菌の抗原、結核菌の抗原、マラリアベクター、 ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、リーシュマニアの抗原、サルモネラ の抗原、マイコバクテリウム・アフリカン、マイコバクテリウム・イントラセル ラーリス、とり型結核菌の抗原、トレポネーマ属、トキソプラズマ属、住血吸虫 、百日咳トリパノソーマ属の抗原、ヘルペスウィルス、ＨＢＶ、ＨＣＶ、赤痢菌 、ナイセリア属、ボレリア属、ポリオウィルス、ＨＩＶウィルスの抗原、または 蛇−、昆虫毒、またはコレラ菌の抗原、または真核生物細胞に由来し、免疫予防 または免疫治療に有用な抗原を含めたその他の抗原である。 本発明に関するシャトルベクターの複製起点は大腸菌またはマイコバクテリア においてベクターを複製させる起点である。大腸菌及びマイコバクテリアにおけ る複製起点がプラスミドｐＲＲ３において用いられるものであることが好都合で ある。 その他のプラスミド、例えばｐＭＳＣ２６２及びＲＳＦ１０１０などの起点も 好都合に用いられる。 しかし、その起点がマイコバクテリアにおいて機能しない場合、または最適に は機能しない場合は、そのシャトルベクターを例えば転位または組換えによって マイコバクテリアの染色体ＤＮＡに組み込むことができることは注目すべきであ る。 マイコバクテリアに発現させることが所望の蛋白質をコードするＤＮＡ断片を シャトルベクターに組み込ませる切断部位は、スティッキーエンドまたはブラン トエンドを提供し得る制限酵素による切断部位である。このような酵素はその酵 素を使用する場合などの操作条件を考慮して熟練せる当業者によって選択される 。 概して、そして特に本発明に関するベクターの製造及びＤＮＡのこのベクター への組込みに関連して、熟練せる当業者は以下のような一般的技術マニュアルを 参照することができる：マニアティス（Maniatis）ら、1982、分子クローニング 、実験室マニュアル；コールドスプリング ハーバー研究所（Cold Spring Harb or Laboratory）、Cold Spring Harbor N.Y. USA、またはその最近の再訂版のい づれか。 熟練せる当業者はこの発明に関するいかなる事物にもこのマニュアルを参照す ることができる。 本発明は、例えば無機水銀のような重金属を含む化合物、水銀化合物または砒 素に耐性を有する病原性マイコバクテリア、特にうし型結核菌、ライ菌、結核菌 、とり型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーリスにも関係する。 概ね本発明は、上記のようなベクターを担うマイコバクテリア、特に病原性ま たは弱毒化マイコバクテリアに関するものである。 それは重金属耐性遺伝子を担い、異種抗原の遺伝暗号をもつ遺伝子を発現する マイコバクテリアにも関係する。 “異種抗原”とは、或る抗原が発現される細菌においては普通は見いだされな い抗原と理解される。 このベクターは細菌内で組込まれない形で存在することができる。しかし少な くとも１部は細菌染色体に組込まれるのが好都合である。 マイコバクテリアが重金属耐性の遺伝子及びマイコバクテリア中で発現され得 る蛋白質の遺伝暗号をもつ遺伝子を、それらの染色体に挿入された形で含むトラ ンスポゾンを担うことが特に好都合である。このような利用の仕方が特に好都合 であるのは、それは蛋白質の発現喪失（これはそのベクターが組込まれないとき にはよりしばしばおきるかも知れない）のリスクを減らすからである。 本発明は、１つ以上の相容性の、薬物学的に容認される賦形薬と組み合わせて 上記のようなマイコバクテリウムを少なくとも１種類は含む薬物学的組成物、及 びこのようなマイコバクテリアを含むワクチンにも関係する。 最後に本発明は、遺伝子をマイコバクテリウムに挿入する方法において、上記 遺伝子を担う上記のようなベクターを上記マイコバクテリアに挿入する少なくと も１つの段階と、ベクターを挿入したマイコバクテリアを選択する段階とからな る方法に関する。プラスミドを挿入したマイコバクテリアは、水銀または水銀化 合物に対するそれらの耐性のために好都合に選択される。 ベクターはエレクトロポレーションによってマイコバクテリアに挿入するのが 好都合である。しかし同じ結果を与える方法ならばいかなる方法でも同様に成功 裡に用いられる。 本発明は下記の例によって、制限することなく、説明される： −図１及び図２はプラスミドｐＭＲ００１及びｐＶＮ２の地図の線図である。 −図３及び図４は組換え及び非組換えスメグマ菌クローンそれぞれのＰＭＡ及び ＨｇＣｌ2に対する感度を示す、 −図５及び図６は組換え及び非組換えＢＣＧクローンそれぞれのＰＭＡ及びＨｇ Ｃｌ2に対する感度を示す、 −図７及び図８は組換えまたは非組換えＨ３７ＲＡクローンそれぞれのＰＭＡ及 びＨｇＣｌ2に対する感度を示す、そして −図９はプラスミドｐＶＮ３の地図の線図である。 図３ないし図８では、クローンの増殖を、ＰＭＡ−またはＨｇＣｌ2濃度（ｘ 軸）に対する６００ｎｍにおける光学密度（ｙ軸）によって測定する。 例： 例１： 水銀耐性の遺伝子を担うシャトルプラスミドｐＭＲ００１及びｐＶＮ２の構造 及びそれらのマイコバクテリアへの伝達。 オペロンｍｅｒを担う次の２つのプラスミドを用いる： −緑膿菌に初めて見いだされ、単独で無機水銀に対する耐性を発現する、トラ ンスポゾンＴｎ５０１のオペロンｍｅｒを含むｐＨＰ４５−Ω−Ｈｇ（フェレイ ら（1987、遺伝子、52巻、147−154ページ））；ｍｅｒＡによって遺伝暗号がも たらされる。 −水銀及び有機水銀化合物両方に耐性をもつ遺伝子（ｍｅｒＡ及びｍｅｒＢを 含める）を含み、プラスミドｐＤＵ１３５８からクローン化され、最初にセラチ アマルセッセンスから分離され、Ｈｇ2+イオン及び有機水銀化合物、例えば酢酸 フェニル水銀（ＰＭＡ）に対する広い耐性スペクトルを発現するｐＬＯＦ−Ｈｇ （ヘレロら、（1990、J.Bacteriol.、172巻、6557−6567ページ））。 これらプラスミドのｍｅｒオペロンを別々にシャトルベクターｐＲＲ３に挿入 する。 この例で用いる細菌─大腸菌またはマイコバクテリアーは表１に記載される。 １）ｐＭＲ００１の作成 Ｔｎ５０１のｍｅｒオペロンを含むｐＨ４５ΩＨｇの４.３ｋｂ断片ＳｍａＩ をｐＲＲ３の単一部位ＳｃａＩに挿入する。 結合後、混合物を用いて大腸菌ＸＬｉ−ｂｌｕｅをエレクトロポレーションに よって形質転換する。それからトランスフォームド細菌を１２μｇ／ｍｌＨｇＣ ｌ2を補充したルリア−ブイヨン（ＬＢ）上に培養する。 １晩３７℃でインキュベートすると、水銀耐性を発現するいくつかのコロニー があらわれる、他方ｐＲＲ３で形質転換した細菌のみを培養した場合にはコロニ ーは認められない。 水銀耐性を有する１０クローンのプラスミドを抽出し、分析する。期待した制 限プランを有する組換えプラスミドの存在を確認する。 ｐＭＲ００１と命名され、その制限地図が図１に線図であらわされているプラ スミドを用いてマイコバクテリアを形質転換する。 ２）ｐＶＮ２の作成 セラチア・マルセッセンスのｍｅｒオペロンを担うプラスミド、ｐＬＯＦ−Ｈ ｇを用いて、同様なやり方で行う。セラチア・マルセッセンスのｍｅｒオペロン を担うｐＬＯＦ−Ｈｇの３ｋｂ断片Ｍ１ｕをＤＮＡポリメラーゼＩで処理し（Kl enow）、その後ｐＲＲ３の単一部位ＳｃａＩに挿入する。トランスフォームド細 菌は水銀耐性を発現し、組換えプラスミドの再配列は認められない。 ｐＶＮ２と命名されたプラスミドをその後用いてマイコバクテリアを形質転換 した。 このプラスミドは図２に線図で示されている。 ３）ｐＭＲ００１及びｐＶＮ２によるマイコバクテリアのエレクトロポレーシ ョン。 水銀耐性及びカナマイシン耐性を有するｐＭＲ００１及びｐＶＮ２を用いてス メグマ菌、うし型結核菌及び結核菌を電気形質転換した；この際ボーラード（Ba ulard）ら（1992、核酸研究（Nucleic Acid Research）20巻、4105）が報告した ようなエレクトロポレーション器械（Eurogentec S.A.）を用いた。 緑膿菌のｍｅｒオペロンの転写−翻訳シグナルはマイコバクテリアには認識さ れないから、ｐＭＲ００１によって形質転換した細菌を先ず最初に、カナマイシ ン２０μｇ／ｍｌを補充したミドルブルック寒天７Ｈ１０（Difco、デトロイト 、ＭＩ、ＵＳＡ）上で選択した。 受け取るマイコバクテリアに依って５日間か、２または３週間３７℃でインキ ュベートした後、分離組換えコロニーがこの３種類のマイコバクテリアで得られ る。“細菌増殖が認められない最も低い水銀化合物濃度”と定義された最小阻止 濃度（ＭＩＣ）を推定するために、細菌懸濁液（１０8−１０9細菌／ｍｌ）１０ μｌをミドルブルック寒天培地７Ｈ１０（Difco）に滴下するか、または１００ μｌを漸増濃度のＨｇＣｌ2を補充したソートン液体培地１０ｍｌを含むルーの ミドルブルック小瓶に接種する。 培養基を３７℃で５日間（スメグマ菌）または２ないし３週間（結核菌、うし 型結核菌ＢＣＧ）、対照培養基に細菌増殖が検出されるまでインキュベートする 。 対照マイコバクテリアは固体培地上でＨｇＣｌ2 ０.１５μｇ／ｍｌ濃度に顕 著な感受性を示すのに対し、プラスミドｐＭＲ００１を担うマイコバクテリアで はＨｇＣｌ2耐性レベルが非常に著しく上昇する。 細菌増殖の完全阻止は固体培地上における１６０μｇ／ｍｌの濃度で初めて認 められる。ＨｇＣｌ2に関する最小阻止濃度（ＭＩＣ）をソートン液体培地上で 決定する場合は、細菌増殖の完全阻止は非形質転換-対照マイコバクテリアでは ＨｇＣｌ2 １μｇ／ｍｌ濃度で認められる（表２）。 これに対してプラスミドｐＭＲ００１を担うマイコバクテリアはＨｇＣｌ2 ２０μｇ／ｍｌ濃度でも増殖することができる。 ３種類のマイコバクテリア中、１５μｇ／ｍｌのＨｇＣｌ2に耐性を示す１２ クローンのプラスミドＤＮＡをその後、ボーラードが記載したように（1992、上 記）electroductionによって大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに移す。 水銀耐性の大腸菌トランスフォームドプラスミドは正常な消化プランを示す。 期待通り、プラスミドｐＭＲ００１によって与えられる水銀耐性は無機水銀に 制限され、有機水銀化合物には関係しない。 ｐＭＲ００１及びｐＶＮ２の水銀耐性がマイコバクテリアの形質転換のための 直接選択マーカーとして使用できるかどうかを確認するために、２つのプラスミ ドのうち１つでエレクトロポレートしたうし型結核菌ＢＣＧ、スメグマ菌及び結 核菌マイコバクテリアをＨｇＣｌ2 １２μｇ／ｍｌを補充した寒天培地７Ｈ１ ０に直接培養した。菌種に応じて５ないし１５日培養後、ｐＭＲ００１ １μｇ あたり１０3耐性コロニーが得られた。 無機水銀及び有機水銀化合物（ＰＭＡ）に対する耐性を発現するプラスミドｐ ＶＮ２で同じ操作を行う。非形質転換スメグマ菌、うし型結核菌ＢＣＧ及び結核 菌のＭＩＣはＰＭＡに関して０.１５μｇ／ｍｌ以下である。上記のようにエレ クトロポレーションによって得たｐＶＮ２担持マイコバクテリアはＨｇＣｌ2 ４０μｇ／ｍｌ濃度までの、そしてＰＭＡ ５μｇ／ｍｌ濃度までの寒天培地上 で増殖する。ＰＭＡ １０μｇ／ｍｌを含む寒天ボックス７Ｈ１０上で２５日後 に１０3／μｇの耐性コロニーがあらわれる。 ソートン液体培地では３種類のマイコバクテリアの非形質転換細菌でＰＭＡ ０.１５μｇ／ｍｌ濃度で増殖阻止が認められる。 ｐＶＮ２によって形質転換したマイコバクテリアでは水銀耐性レベルはＰＭＡ ５μｇ／ｍｌまたはＨｇＣｌ2 ４０ｍｇ／ｍｌと推定される（表２）。 得られた結果を図３ないし図８にまとめる。 すべての場合に、electroductionによる大腸菌の逆形質転換によって、耐性マ イコバクテリアのクローンに期待のプラスミドが存在することが確認される。 例２： 砒素耐性を有するシャトルベクターの構造 プラスミドｐＬＯＦ／Ａｓは、種々の腸内細菌において分離されたプラスミド ｐＲ７７３に由来する遺伝子ａｒｓＡ及びａｒｓＢを担う。２つの遺伝子はアエ ロバクチン プロモーターのコントロール下におかれている。 ｐＬｏｆ／Ａｓの酵素Ｍ１ｕＩによる消化によって３.４ｋｂ断片が得られた ；それはａｒｓＡ、ａｒｓＢ及びアエロバクチン プロモーターを担う。この断 片 の末端をＤＮＡポリメラーゼＩで塞ぎ、その後その断片をシャトルベクター、大 腸菌−マイコバクテリウムｐＹＵＢ１２の単一部位ＳｃａＩにクローン化した。 このベクターの構造はスナッパー（Snapper）らが報告した（PNAS，1988,85巻、 6987−6991ページ；及びMol.Microbiol.,1990,４巻、1911−1919）。 プラスミドｐＶＮ３はスメグマ菌に１０ｍｇ／ｌ程度の硝酸砒素（ＡｓＮＯ3 ）耐性を与える。 このプラスミドは図９に線図の形で示される。 結論： 得られた結果は、重金属である水銀及び砒素に対する耐性を発現するベクター 類を、組換えマイコバクテリアの選択マーカーとして用いることができることを 示している。 したがって本発明に関係するシャトルベクターは、異種遺伝子を、この異種遺 伝子を発現することができる宿主マイコバクテリアに伝達することができ、この 伝達は直ちに効率があらわれ、利用しやすく、選択しやすい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:325） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:32） (71)出願人 エスティティ パストゥール デ リル フランス国 59019 リル セデックス ベー．ペー． 245 ルー カルメ １番 地 (72)発明者 エスカイア ヴィンセント フランス国 91300 マシー ルー ジョ ルジュ マンデル ３番地 (72)発明者 バーラー アラン ベルギー国 ベー−7500 トルナイ グラ ン プラス ６番地 (72)発明者 ベルシェ パトリック フランス国 92200 サン−クロード ル ー タエール 64番地 (72)発明者 ロシュ カミール フランス国 59830 ワネイン ルー ド ゥ ヴァル プレ 14番地 (72)発明者 アダ ナディア フランス国 75012 パリ ルー デ ラ ンベルヴィラース ６番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．マイコバクテリアにＤＮＡを挿入するためのシャトルベクターであって、上 記マイコバクテリアにおける機能的複製のための少なくとも１つの起点と、他の 細菌における機能的複製のための別の起点と、マイコバクテリアに発現し得る蛋 白質をコードするＤＮＡの挿入を可能にする酵素切断部位とを含み、 上記マイコバクテリアに重金属含有化合物耐性を与える遺伝子をも担うことを特 徴とするシャトルベクター。 ２．上記化合物が無機水銀または水銀化合物であることを特徴とする請求の範囲 第１項記載のベクター。 ３．耐性遺伝子が水銀還元酵素の遺伝暗号をもつことを特徴とする請求の範囲第 １項及び第２項のいずれかの項記載のベクター。 ４．耐性遺伝子が有機水銀リアーゼの遺伝暗号をもつことを特徴とする請求の範 囲第１項及び第２項のいずれかの項記載のベクター。 ５．水銀還元酵素の遺伝暗号をもつトランスポゾンＴｎ５０１のオペロンｍｅｒ Ａを含むことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかの項記載の ベクター。 ６．プラスミドｐＤＵ１３５８のオペロンｍｅｒＡ及びｍｅｒＢを含むことを特 徴とする請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかの項記載のベクター。 ７．Ｎｏ．ＬＭＢＰ３０４６と命名されてＢＣＣＭに保管されている請求の範囲 第１項ないし第３項及び第５項のいずれかの項記載のプラスミドｐＭＲ００１。 ８．Ｎｏ．ＬＭＢＰ３０４７と命名されてＢＣＣＭに保管されている請求の範囲 第１項ないし第４項及び第６項のいずれかの項記載のプラスミドｐＶＮ２。 ９．重金属耐性の遺伝子と酵索切断部位とがトランスポゾンに担持されることを 特徴とする請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかの項記載のベクター。 １０．上記重金属が砒素であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクタ ー。 １１．砒素耐性の遺伝子が遺伝子ａｒｓであることを特徴とする請求の範囲第１ ０項記載のベクター。 １２．Ｎｏ．ＬＭＢＰ３０４８と命名されてＢＣＣＭに保管されている請求の範 囲第１０項及び第１１項のいずれかの項記載のプラスミドｐＶＮ３。 １３．マイコバクテリアにおいてそれ自体を発現する遺伝子であって、ヒト及び 動物において免疫反応を誘起することができる蛋白質の遺伝暗号をもつ遺伝子を 担うことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれかの項記載のベ クター。 １４．無機水銀のような重金属を含む化合物、水銀化合物または砒素に対して耐 性を有する病原性または弱毒化マイコバクテリウム。 １５．請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれかの項記載のベクターを担うこ とを特徴とするマイコバクテリウム。 １６．請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれかの項記載のベクターの少なく とも１部を染色体に組込んで担うことを特徴とするマイコバクテリウム。 １７．染色体中に、無機水銀のような重金属を含む化合物又は水銀化合物に対す る耐性の遺伝暗号をもつ少なくとも１つの遺伝子と抗原の遺伝暗号をもつ遺伝子 とを含むトランスポゾンを担うことを特徴とするマイコバクテリウム。 １８．病原性マイコバクテリウムであることを特徴とする請求の範囲第１５項な いし第１７項のいずれかの項記載のマイコバクテリウム。 １９．うし型結核菌、スメグマ菌または結核菌であることを特徴とする請求の範 囲第１５項ないし１８項記載のマイコバクテリウム。 ２０．請求の範囲第１４項ないし１９項のいずれかの項記載のマイコバクテリウ ムの少なくとも１つを、１つ以上の相容性の、薬物学的に容認される賦形薬と組 み合わせて含む薬物学的組成物。 ２１．請求の範囲第１４項ないし第１９項のいずれかの項記載の細菌を少なくと も１つ含むことを特徴とするワクチン。 ２２．遺伝子をマイコバクテリウムに導入する方法において、 上記遺伝子を担う請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれかの項記載のベクタ ーを導入する少なくとも１つの段階と、そのベクターが導入されたマイコバクテ リアを選択する段階とを含んでなる方法。 ２３．ベクターが導入されたマイコバクテリアを無機水銀などの重金属を含む化 合物または水銀化合物に対する耐性に関して選択することを特徴とする請求の範 囲第２２項記載の方法。