JPH10504181A - 保存されたｔ細胞レセプター配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ４つの独特の転写物を、慢性関節リウマチ患者の滑液組織Ｔ細胞のＴ細胞レセプターのβ鎖から単離した。これらの転写物のうちの二つは、新鮮な滑液組織から単離され、二つは、滑液組織から誘導されたＴ細胞系から単離された。４つの転写物の配列は、高度に相同であり、高度に多様なＶ−Ｄ連結部に、保存されたＩＧＱ＿Ｎのアミノ酸配列を備えている。Ｔ細胞系誘導転写物のα鎖および抗原特異性についても調べた。

Description

【発明の詳細な説明】 保存されたＴ細胞レセプター配列 この発明は、１９９１年９月２７日に出願された０７／７６６７５１の一部継 続出願である。この研究は、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス（ the National Institutes of Health）からの補助に支えられたものである。発明の背景 Ｔリンパ球は、Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）複合体を介して抗原を認識し する。ＴＣＲは、Ｔ細胞上のクローン特異的ヘテロダイマーであり、その標的抗 原を主要組織適合抗原と組み合わせて認識する。さらに、ＴＣＲは、異なるＴ細 胞において高度に多型的である。約９０％の末梢血液Ｔ細胞が、αポリペプチド とβポリペプチドからなるＴＣＲを発現し、少量の％のＴ細胞が、γポリペプチ ドとδポリペプチドからなるＴＣＲを発現する。DavisとBjorkman．1988，Natur e 334:395-402; MarrackとKappler，1986，Sci．Amer．254:36; Meuerら，1984 ，Ann．Rev．Immunol．2:23-50; Brennerら，1986，Nature 322: 145-159; Kran gelら，1987，Science 237:1051-1055; Hataら，1987，Science 238:678-682; H ochstenbackら，1988，J．Exp．Med．168:761-776を参照。 Ｔ細胞クローンのＴ細胞抗原レセプターの鎖は、いずれも、可変部（Ｖ）、多 様部（Ｄ）、連結部（Ｊ）、および定常部（Ｃ）と呼ばれるドメインの独特な組 み合わせからなる（Siuら，1984，Cell 37:393; Yanagiら，1985 Proc．Natl．A cad．Sci．USA 82:3430）。超可変領域も同定された（Pattenら，1984，Nature 312:40; Beckerら，1985，Nature 317:430）。各Ｔ細胞クローンにおける、αお よびβ鎖の両方、もしくはδおよびγ鎖の両方のＶ、ＤおよびＪドメインの組み 合わせが、各Ｔ細胞の独特の抗原結合部位を定義する。対照的に、Ｃドメインは 、抗原結合に関与しない。 ＴＣＲ遺伝子は、イムノグロブリン遺伝子のように、Ｔ細胞の個体発生の間に アレンジする領域からなる（Chienら，1984，Nature 312:31-35; Hedrickら，19 84，Nature 308:149-153; Yanagiら，1984，Nature 308:145-149）。ゲノムＤＮ Ａでは、各ＴＣＲ遺伝子は、Ｖ、ＪおよびＣ領域を備えているが、ＴＣＲβおよ びδポリペプチドはＤ領域を備えている。Ｖ、Ｄ、Ｊ、およびＣ領域は、ＤＮＡ 中でスペーサー領域によって互いに分けられている。通常は、多くの可変領域セ グメントと、幾分少な目の多様、連結および定常領域セグメントがある。リンパ 球が成熟する際に、上記の種々のセグメントはスプライスを受け、一つのＶ、（ Ｄ）、Ｊ、およびＣ領域からなる連続的な遺伝子配列を作る。ＴＣＲ多様性、し かしてＴ細胞の特異性は、生殖系列(germline)遺伝子セグメントの多重性(multi plicity)（Chienら，1984，Nature 309:322-326; Malissenら，1984，Cell 37:1 101-1110; Gascoigneら，1984，Nature 310:387-391; Kavalerら，1984，Nature 310:421-423; Siuら，1984，Nature 311:344-349; Pattenら，1984，Nature 31 2:40-46）、異なるＶ、Ｄ、Ｊ、およびＣセグメントの組み立てを介した組み合 わせの多様性（Siuら，1984，Cell 37:393-401; Govermanら，1985，Cell 40:85 9-867）、並びに、連結柔軟性（junctional flexibility）、Ｎ領域多様性、お よび複数のＤ領域もしくはＤβセグメントに対する３つの翻訳読み枠の使用を含 むいくつかの原因から誘導される(Barthら，1985，Nature 316:517-523; Finkら ，1986，Nature 321:219-225)。上記メカニズムの結果、Ｎ末端（可変、もしく はＶ領域と称され、Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの組み合わせから構成さ れる）においては異なるが、Ｃ末端を含む別の箇所（定常領域）では同一なＴＣ Ｒが構成される。それゆえ、無限の数のＴＣＲが構成される。 ＴＣＲのＶβ遺伝子は、イムノグロブリンＶ遺伝子に密接に類似しており、三 つの遺伝子セグメントＶβ、Ｄβ、およびＪβを備え、これらは連続的なＶβ遺 伝子を形成するように再構成する（Siuら，1984，Cell 37:393-401）。β座(loc us)は、マウスでよく調べられており、７００−８００キロベースのＤＮＡにわ たるものであって、二つのほぼ同一のＣ領域を含み、これらの５’側に一つのＤ 部と一塊の５−６のＪ部が縦に並んでいる（Kronenbergら，1986．Ann Rev．Imm unol．3:537-560）。約２０〜３０のＶβ領域がＤ、Ｊ、およびＣ部の上流（５ ’）に位置する（Behlkeら，1985，Science，229:566-570）が、Ｖβ遺伝子はマ ウスＣβ遺伝子の３’側に位置することもある（Malissenら，1986，Nature 319 :28） 。ヒトＴＣＲ β鎖可変領域遺伝子の構造および多様性の研究により、局所的な( district)Ｖβサブファミリーに遺伝子が組分けされた（Tillinghastら，1986， Science 233:879-883; Concannonら，1986，Proc．Natl.，Acad．Sci．USA 83:6 598-6602; Borstら，1987，J．Immunol．139:1952-1959）。 γＴＣＲ遺伝子は、最初にマウスで同定され（Saitoら，1984，Nature 309:75 7-762; Kranzら，1985，Nature 313:762-755; Haydayら，1985，Cell 40:259-26 9）、次いでヒトで同定された（Lefrancら，1985，Nature 316:464-466; Murre ら，1985，Nature 316:549-552）。ヒトγＴＣＲ座は、５〜１０の間の可変領域 遺伝子、５つの連結領域遺伝子、および２つの定常領域遺伝子からなるらしい（ Dialynasら，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:2619）。 ＴＣＲαおよびδ座は、ヒトクロモソーム１４上で互いに隣接している。セグ メントをコードする多くのＴＣＲδは、完全にα遺伝子座内に位置する（Satyan arayanaら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:8166-8170; Chienら，1987 ，Nature 330:722-727; Elliotら，1988，Nature 331:627-631）。最低でも４５ 〜５０のＶα領域があると推定されるが（Beckerら、Nature 317:430-434）、Ｖ δ領域はたったの１０個程度である（Chienら、1987，上掲）。ＴＣＲα遺伝子 の核酸配列が報告されている（Simら，1984，Nature 312:771-775; Yanagiら、1 985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:3430-3434; Berkoutら，1988，Nucl．Aci ds Res．16:5208）。 慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、慢性の、再発性の、主に関節に関係する炎症疾 患であり、北米の１−３％が罹患している。男性に比べて、３倍の数の女性がＲ Ａに罹患している。深刻なＲＡ患者は、脈管炎、筋萎縮、皮下小結節、リンパ節 症、巨脾腫症および白血球減少症を含む外関節症状発現を示しがちである。自然 緩解が起こることもあるが、そうでない患者は、短期間の急性関節炎と長期間の 低レベルの活性を発現し、さらに別の場合には、深刻な関節の変形にまで進行す る。約１５％のＲＡ患者が、完全に動けなくなると推定されている（“Primer o n the Rheumatic Disease”，8th edition，1983，Rodman，G.P．& Schumacher ，H.R．Eds.，Zvaifler，N.J.，Assoc．Ed.，Arthritis Foundations，Atlanta ，Ga.）。 免疫応答の開始を刺激する抗原性の刺激および結果として生じる炎症は未知で ある。あるＨＬＡタイプ（ＤＲ４、ＤＷ４、ＤＷ１４およびＤＲ１）は、ＲＡの 普及を増大させ、おそらく、疾患の進行を開始する未同定のファクターに対する 遺伝的な罹りやすさへと導く。エプスタイン-バーウイルスとＲＡとの間の関係 が、示唆されている。 多くの細胞型、特にマクロファージ、シノビオサイト（synoviocytes）および 多形核白血球は、ＲＡにおける関節破壊に影響する複合炎症反応に関与する。し かしながら、Ｔリンパ球が中心的役割をなすことが、１）ＲＡ疾患の主要部位、 滑液組織(the synovial tissue)における活性化Ｔ細胞の豊富な浸潤（van Boxel ，J.A.ら，1975; N．Engl．J．Med.，293:517; Panayi，J.S.ら，1992，Arthrit is Rheum．35:729）；２）ＲＡ疾患への罹りやすさと主要組織適合複合体（ＭＨ Ｃ）クラスII分子のＤＲβ鎖の第三の超可変領域に定義されたアミノ酸配列とを 結びつける遺伝学的研究（P．Gregersen，J．Silver，R.J．Winchester，1987， Arthritis Rheum．30:1205）；３）抗原特異的Ｔ細胞が罹患しやすい動物に疾患 を移入できる慢性関節炎の動物モデル（R.Holmdahl，L．Klareskog，K．Rubin， E．Larsson，H．Wigzell，1985，Scand．J．Immunol．22:295; W．van Edenら， 1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985，82:5117）；および４）ＣＤ４⁺Ｔ細 胞サブセットと反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の投与による、自己免疫 疾患のマウスモデルとＲＡ患者の両方における関節炎の改善（G．E．Rangers，S ．Sriram，S．M．Cooper，1985，J．Exp．Med．162:11104; G．Horneff，G．R． Burmester，F．Emmrich，J．R．Kalden，1991，Arthritis Rheum．34:129）によ って示唆されている。 ＴＣＲ構造と抗原−ＭＨＣ分子複合体認識とを関連づけるように設計された先 の研究は、α鎖とβ鎖の両方の３つの多様性ＣＤＲ領域のいずれかの臨界アミノ 酸残基の重要性を強調し、ＣＤＲ３は優性的役割を演じる。マウスとヒトの両方 のシステムにおいて、特定のペプチド−−ＭＨＣ複合体に特異的なＴ細胞は、し ばしば、ＣＤＲ３領域の特徴的なアミノ酸または配列クラスターを利用する（S ．M．Hedrickら，1988，Science 239:1541）。最近の研究により、よく明らかに された抗原ペプチドにおけるアミノ酸を変えるチャージの導入が、α鎖とβ鎖の 両 方のＣＤＲ３アミノ酸残基に相互のチャージ変化を導入した抗原特異性ＴＣＲに よって特徴付けられたＴ細胞応答を導くことが証明された（J．L．Jorgensenら ，1992，Nature 355:224）。この結果は、これらのＴＣＲ残基が直接抗原ペプチ ドに結合することを示唆する。関連した研究では、自己に高度に相同な外的ペプ チドを認識するマウスＴＣＲレパートリーは、ＴＣＲ ＶαおよびＶβ遺伝子の 使用、ＣＤＲ３の長さ、およびＣＤＲ３ドメインにおける標準的なアミノ酸残基 の存在に関して、かなり不自然であることが見出された（J．-L．Casanovaら，1 991，J．Exp．Med．174:1371）。これらのデータは、自己免疫疾患を仲介する病 原性Ｔ細胞が、重要な構造上の特徴を共有するＴＣＲを発現することを示唆する 。 この仮説のさらなる支持は、他の自己免疫疾患の研究に見られる。ミエリン塩 基性タンパク質（ＭＢＰ）特異的Ｔ_h細胞は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（Ｅ ＡＥ）を誘発する（S．S．Zamvilら，1988，J．Exp．Med．167:1586; J．L．Urb anら，1988，Cell 54: 577; F．R．Burnsら，1989，J．Exp．Med．169:27）。起 脳炎Ｔ細胞クローンは、ＶβおよびＶα遺伝子の使用とＣＤＲ３領域構造とに関 して強力に偏っている（D.P Goldら，1992，J．Immunol．148:1712）。最近、多 発性硬化症（ＭＳ）の患者の中枢神経系の病変から単離されたＴＣＲ Ｖβ転写 物（transcripts）が、起脳炎ＭＢＰ反応性マウスＴ細胞クローンによって発現 されたものと相同なＣＤＲ３領域の配列モチーフを示すことが証明された（R．M artinら，1991，J．Exp．Med．173:19; J．R．Oksenbergら，1993，Nature 362: 68）。 ＲＡにおけるＴ細胞の重要性は明らかのようであるが、疾患誘発Ｔ細胞によっ て発現されたＴＣＲの抗原特異性もその構造も明らかにされていない。炎症を起 こした関節に存在する莫大な数のＴ細胞の中から病原性Ｔ細胞を同定する試みに おいて、研究者は、１）ＴＣＲの構造的特徴を共有する、すなわち特定のＴＣＲ 可変遺伝子部の制限された使用、もしくは２）ＴＣＲの高度に多型的な抗原結合 ＣＤＲ３領域に関して“オリゴクローナル”である、病原部位で抗原誘導された 増大を示唆するＴ細胞を検出する分子技術を用いた。これまで、この試みは、矛 盾する結果を得てきた。いくつかの研究室が、ＲＡ関節誘導Ｔ細胞の中で特定の ＴＣＲ Ｖ遺伝子産物のオリゴクローナリティー（oligoclonality）と過剰使用 の証拠を報告している（M．D．Howellら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 8: 10921; X．Paliardら，1991，Science 253:325; W．V．Williamsら，1992，J．C lin．Invest．90:326）。しかしながら、関連するＴＣＲ Ｖ遺伝子ファミリーは 研究によって変わり、別の研究者等は、ＲＡにおけるＴＣＲのゆがみ(TCR skewi ng)の証拠を何も見出していない（Y．Uematsuら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 88:8534; J．M．van Laarら，1991，Clin．Exp．Immunol．83:353）。発明の概要 ＲＡ患者のＴ細胞レセプターの保存されたＣＤＲ３領域をコードする４つの独 特のＶβ１７転写物が見出された。これらの独特な転写物は、同一ではないが、 ＴＣＲの可変領域において高度に相同である。また、これらの転写物の内部には 、高度に保存された配列ＩＧＱ＿Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）がある。これら の転写物は、ＲＡ患者の滑液組織および滑液組織Ｔ細胞から増大した細胞系から 単離された。 保存されたＣＤＲ３配列を備えた二つの独特なα鎖が、独特なＴ細胞クローン に利用されることも見出した。 転写物がコードするペプチドおよび／またはこのペプチドに特異的なモノクロ ーナル抗体を用いてＲＡを診断および治療する方法も、本発明の一部である。図面の説明 図１は、Ｖβ１７ＴＣＲ遺伝子産物の発現を間接的な免疫蛍光法によって分析 した、健康な被験者、セロポジティブＲＡの患者、非ＲＡ炎症性関節炎の患者、 および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の単核細胞（ＭＮＣ）を図示し ている。末梢血液（ＰＢ）の結果は上のパネル、滑液（ＳＦ；synovial fluid） の結果は下のパネルに示されており、抗ＴＣＲ Ｖβ ｍＡｂと反応する細胞の％ ／抗ＣＤ３ ｍＡｂと反応する細胞の％で表されている。 図２は、滑液から単離し、提示されたＴ細胞表面エピトープの発現を間接的免 疫蛍光法で分析したＭＮＣを図示したものである。各サイトフルオログラフヒス トグラムにおいて、蛍光は横座標に示され（対数目盛り）、細胞数は縦座標に示 されている（均等目盛り）。 図３は、ＳＦ Ｔ細胞の二つのカラー免疫蛍光分析を図示したものである。Ｓ Ｆ Ｔ細胞は、抗Ｖβ（左のパネル）または抗Ｖβ１７（右のパネル）ｍＡｂで 染色された。 図４は、新鮮に単離された滑液Ｔ細胞（Ｖβ１７ｓｅｑ１およびｓｅｑ２）お よびin vitroで増大した培養５誘導Ｔ細胞クローン（Ｖβ１７ｓｅｑ３およびｓ ｅｑ４）から同定された優性Ｖβ１７転写物のＣＤＲ３配列を図示したものであ る。Ｎ−Ｄ−Ｎ領域における保存されたアミノ酸残基は、太字で示されている。 図５は、Ｖα２．３（Ａ）とＶα３．１（Ｂ）のＣＤＲ３領域におけるヌクレ オチドと推定されるアミノ酸配列を図示している。Ｊα（ＩＧＲＪａ０９）セグ メントを含むＶα２．３はＶβ１７ｓｅｑ３を伴い、Ｊαｋセグメントを用いた Ｖα３．１はＶβ１７ｓｅｑ４に結合され、培養５−誘導Ｔ細胞クローンに発現 する。 図６は、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系によって誘発された滑液組織Ｔ細胞クローン の増殖を示す。発明の詳細な説明 本発明は、ＲＡ患者の滑液組織に保存される、独特のα／βＴ細胞レセプター （ＴＣＲ）配列に向けられている。これらの４つの配列は、通常はＴＣＲの高度 に可変な領域とされる相補性決定部位（ＣＤＲ３）において、配列相同性を示す 。これらの転写物のαおよびβの両方は、その抗原特異性および特徴が調べられ ている。 これらの転写物を単離する第一段階は、ＲＡに病原性のＴ細胞のタイプを同定 し、その慢性的な活性化を維持する関連抗原の特徴を調べることであった。これ は、特定のＴＣＲ Ｖβ遺伝子ファミリーの産物と反応するマウスのｍＡｂのパ ネルを用いて行われた。この結果は、ＲＡ患者の末梢血液（ＰＢ）と滑液（ＳＦ ）におけるＶβ１７ ＴＣＲ配列を帯びているＴ細胞のパーセントの選択的増加 を示した。 オリゴクローナルＶβ１７滑液Ｔ細胞の病原可能性を評価するために、in vit roにおけるこれらの細胞の単離、およびＴＣＲ α／β鎖構造および抗原性の特 徴 を調べた。これをなすために、一人の“模範的な(classic)”ＲＡ患者を１８ヶ 月間観察し、次いでＴ細胞を滑膜から体外移植した。独特の転写物を、新鮮な滑 膜Ｔ細胞および滑液組織Ｔ細胞から生じた細胞系の両方から単離した。 これらの二つの転写物は、Ｖβ１７ｓｅｑ１（アミノ酸配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ ．Ｎｏ．１； ヌクレオチド配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２）およびＶβ１７ ｓｅｑ２（アミノ酸配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．３； ヌクレオチド配列−ｓ ｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．４）と称され、新鮮な滑液組織から誘導されたＶβ１７ｃ ＤＮＡクローンから単離された。他の二つの上記配列は、Ｖβ１７ｓｅｑ３（ア ミノ酸配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．５； ヌクレオチド配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ ．Ｎｏ．６）およびＶβ１７ｓｅｑ４（アミノ酸配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ． ７； ヌクレオチド配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．８）と称され、滑液組織Ｔ細 胞からin vitroで生成された細胞系から単離された。 これらの４つの転写物は、同一ではないが、高度に相同な配列を含む。ＣＤＲ ３領域におけるヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列は、図４に示されて いる。 配列の比較は、９５位のアミノ酸残基“Ｉ”と９９位の“Ｎ”が４つの全ての 転写物に見られることを示している。＃９９位の残基Ｎは、Ｖβ１７ｓｅｑ２、 ３および４の生殖系列Ｊβ２．１セグメントによってコードされているが、Ｖβ １７ｓｅｑ１における同じ残基は、生殖系列にコードされていないものの、抗原 結合ＶＤＴ領域に多様性を生じるＮ領域ヌクレオチド添加の工程の結果であるこ とに注意するべきである。Lieber，M．R.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，198 8，85:8588を参照。 さらに、ＣＤＲ３における転写物Ｖβｓｅｑ１およびＶβｓｅｑ３領域の配列 の相同性は、ヌクレオチドレベルで７８．５％であり、アミノ酸レベルで８６． ４％である。また、高度に多様なＶ−Ｄ連結における残基＃９５−９９の５つの アミノ酸のうちの４つ、すなわちＩＧＱ＿Ｎ（ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１３）も 、両方の転写物において保存されている。 理論と結びつけることなく、４つの優性転写物が同じ連結局部化抗原（joint- localized antigen）を認識し、ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３領域における保存された ア ミノ酸である＃９５位の“Ｉ”および＃９９位の“Ｎ”が抗原認識に重要性を与 えると信じられる。 抗原認識がＴＣＲαおよびβの機能であることから、Ｔ細胞クローンが引き出 された細胞系のα鎖の使用も調べられた（図５）。Ｖβ１７ｓｅｑ３は、Ｖα２ ．３を発現し、Ｖα２．３−Ｊγ（ＩＧＲＪａ０９）−Ｃα（アミノ酸配列−ｓ ｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．９およびヌクレオチド配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１０ ）のα再構成（α rearrangement）を備える。最近の報告が、ＲＡ患者の滑液に おけるＶα２．３Ｔ細胞の選択的増加を証明したことから、Ｖα２．３の発現に は興味を引くものがある。Pluschke，G.ら，Eur．J．Immunol.，1991，21:749; Broker，B．M.ら，Arthritis Rheum.，1993，9:1234.参照。Ｖβ１７ｓｅｑ４は 、Ｖα３．１−ＪαＫ−Ｃα（アミノ酸配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１１；ヌ クレオチド配列−ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１２）を発現した（図５）。 最後に、Ｔ細胞クローンを誘導した培養の抗原特異性を調べた。保存されたＣ ＤＲ３配列を発現する滑液Ｔ細胞は、ＤＲ４分子に関連するＲＡの対立遺伝子に 反応する。 同じＶβ遺伝子を利用するこれらのＴ細胞クローンは、抗原結合ＣＤＲ３領域 において高度に相同であり、おそらくリウマチの進行に病原的可能性を備えたＨ ＬＡ ＤＲ４抗原と反応、もしくはこの抗原に制限される。これは、１）他の関 節症ではなくＲＡのみが、Ｖβ１７⁺Ｔ細胞の増大によって特徴付けられるｍＡ ｂ染色結果；２）ＲＡ滑液Ｔ細胞からＶβ１７、１４および３の選択的再提示を 示す他の研究室からのデータ（Howell，M．D.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，1991，88:10921; Paliardら，Science，1991，90:326）；および、最も決定的 なことに、３）我々のＶβ１７ｓｅｑ２の配列（“ＩＱＧ＿Ｎ”）に高度に相同 なＣＤＲ３配列が、幼若慢性関節リウマチのＤＲ４＋、ＲＦ＋患者の滑液および 組織Ｔ細胞から単離された増大したオリゴクローナルＶβ１４ＴＣＲ転写物に同 定されたことによって支持される。Gromら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1993 ，90:11104を参照。 新鮮な滑膜に同定された優性Ｖβ１７配列に相同なＴＣＲ配列を発現するクロ ーンの単離およびin vitroにおける生育により、潜在的に病原性のＲＡ Ｔ細胞 に よって発現されるαβＴＣＲの完全な構造が説明された。これらのクローンは、 例えばタイプIIコラーゲン、プロテオグリカン、熱ショックタンパク質、および ＲＡ関連ＤＲ分子によって共有された配列、ＱＫＲＡＡ（ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ ．１４）を含む合成ペプチドの並び等の、自己免疫攻撃の標的と仮定される関節 に制限された抗原を含む潜在的に重要な自己抗原のパネルに対する反応性を評価 するために使用することもできる。 これらの配列は、ＲＡの確認的診断の道具として用いることもできる。ＲＡの 診断は、臨床的特徴に基づいてなされ、保存されたＴＣＲ配列に相同なプローブ を用いたin vitroアッセイにより、関節に影響する他の疾患に対して、患者が確 かにＲＡに罹患しているかを確かめることができる。このような方法は、必然的 に、ＲＡに罹患している疑いのある被験者の体液を、保存されたＴＣＲ配列に相 同なプローブと接触させる。体液は、これに限定されるものではないが、滑液を 含む。保存されたＴＣＲ配列の存在は、当業者に知られているあらゆる方法を用 いて調べられる。特別な実施態様は、Ｖβ１７ｓｅｑ１、Ｖβ１７ｓｅｑ２、Ｖ β１７ｓｅｑ３、およびＶβ１７ｓｅｑ４のＣＤＲ３配列のいずれか一つ、もし くはこれらの他の部位に相同なプローブを含む。他の好ましい実施態様は、保存 されたＣＤＲ３α鎖配列に相同なプローブを含む。さらに他の好ましい実施態様 は、アミノ酸配列ＩＧＱ＿Ｎをコードするヌクレオチド配列に相同なプローブで ある。 独特なＴＣＲ配列は、例えば、“ブロッキング”抗原ペプチドとしての使用、 免疫制御細胞の活性化、抗ＴＣＲ抗体の誘発、もしくはＴ細胞を発現する病原性 Ｖ遺伝子のｍＡｂ仲介欠失にそれらを用いることにより、ＲＡの免疫治療のため に用いることもできる。独特のＴＣＲ配列に相同なアミノ酸からなる断片を、直 接患者に投与することができる。このような配列は、患者の抗原を攻撃できない Ｔ細胞を作り出す、Ｔ細胞のＴＣＲをブロッキングすることで作用する。このよ うな方法で用いられる特異的なペプチドは、Ｖβ１７ｓｅｑ１、ｖβ１７ｓｅｑ ２、Ｖβ１７ｓｅｑ３、またはＶβ１７ｓｅｑ４のアミノ酸配列に相同である。 さらに、配列ＩＧＱ＿Ｎに相同なペプチドも使用することができる。 免疫治療の別の方法では、当該技術分野で通常用いられる方法によって、独特 のＴＣＲ配列に向けられたｍＡｂを作製することができる。独特のＴＣＲ配列に 向けられたこれらのｍＡｂは、病原性であるとみられる独特のＴＣＲ配列を標的 とする。 上記方法で用いられる特異的なモノクローナル抗体は、Ｖβｓｅｑ１、Ｖβｓ ｅｑ２、Ｖβｓｅｑ３、またはＶβ１７ｓｅｑ４のＣＤＲ３配列、もしくはこれ らの部位を認識するｍＡｂを含む。ＩＧＱ＿Ｎに向けられたｍＡｂも使用できる 。 ペプチドまたはｍＡｂのいずれも、例えば、滑液中、全身的、もしくは経口的 に、適切なキャリアでＲＡ患者に投与することができる。実施例１ ＲＡ Ｔ細胞レパートリーにおけるＴＣＲ Ｖ遺伝子の使用を直接的に評価する ために、ヒトＴＣＲ Ｖβ遺伝子産物に特異的なモノクローナル抗体のパネルを 利用した。対照被験者は、２５人の健康的な志願者（女性／男性=２．４、平均 年齢=４３．３）を含む。疾患対照者は、全身性エリテマトーデス（女性／男性= １０．０；平均年齢=４０）もしくは、変形性関節症、通風、ライター症候群、 およびモノアーティキュラー関節炎(monoarticular arthritis)を含む非ＲＡ炎 症性関節炎の１９人の被験者（女性／男性=２．０；平均年齢=５９．５）を含む 。ＲＡ患者は、米国リウマチ協会（American Rheumatism Association）の基準 を用いて定義した（Arnettら，1988，Arthritis Rheum.，31:315-324）。被験者 は、アスピリン、非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド、メトトレキサ ート、金、ヒドロキシクロロキン、またはスルファサラジンを含む薬学的治療に 関して選択されなかった。被験者がＲＦに対してセロポジティブであるか否かを 調べるために、ＲＡ患者の血清サンプルを、ラテックス固定によってアッセイし た。ある被験者からのＰＢ単核細胞（ＭＮＣ）を、標準的な血清学の試薬を用い てＨＬＡ ＤＲハプロタイプについて調べた。 末梢血液サンプルを静脈穿刺によって得て、ＳＦサンプルを治療的関節穿刺の 際に得た。ＳＴ標本を、特殊外科病院の病理学局（the Department of Patholog y at The Hospital for Special Surgery）から得て、治療的関節鏡滑膜切除、 切 開滑膜切除(open synovectomy)、または全体的な関節のリプレースメント(total joint replacement)を行った。滑液組織を無菌的な条件下で細かく刻み、ＲＰ Ｍ１１６４０（GIBCO Laboratories，Grand Island，NY）、２０％の胎児性ウシ 血清（Whittaker Bioproducts，Inc.，Walkersville，MD）、１％のペニシリン およびストレプトマイシン、１％のグルタミン（GIBCO）、０．５ｍｇ／ｍｌの コラゲナーゼ、０．１５ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼ、および０．１ｍｇ／ｍｌのヒ アルロニダーゼ（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）を含む２０ｍｌの酵素 調製物に、３７℃、５％ＣＯ₂で、２−４時間インキュベートした。次いで、組 織をピンセットと外科用メスで機械的に破砕し、メッシュのふるいを通した。 ＭＮＣを、Ficoll-Hypaque（Pharmacia，Uppsala，Sweden）勾配でＰＢ、ＳＦ もしくはＳＴ分解物から単離した。ある場合には、Ｔ細胞を、ヒツジ赤血球細胞 （ＳＲＢＣ）を用いたＭＮＣのロゼット形成によって選択的に富ませ、４℃で１ ６時間インキュベートし、ロゼット形成したと否とに関わらず細胞のその後のフ ラクションをFicoll-Hypaqueにかけた。 Ｔ細胞を以下のモノクローナル抗体、すなわちＯＫＴ３（抗ＣＤ３、ｐａｎ− Ｔ）；ＯＫＴ４（抗ＣＤ４、ヘルパー／インデューサーサブセット）；ＯＫＴ８ （抗ＣＤ８、サプレッサー／細胞障害性サブセット、American Type Culture Co llection，Rockville，MD）；βＶ３（ＴＣＲ Ｖβ３と反応性、T Cell Diagnos tics，Cambridge，MA）；Ｃ３７（ＴＣＲ Ｖβ５．２／５．３と反応性、Wangら ，Hybridoma，1986，5:179）；ＯＴ１４５（ＴＣＲ Ｖβ６．７ａと反応性、Li ら，J．Exp．Med.，1990，171:221）；１６Ｇ８（ＴＣＲ Ｖβ８と反応性、T Ce ll Diagnostics）；Ｓ５１１（ＴＣＲ Ｖβ１２と反応性、Biglerら，J．Exp．M ed.，1983，158:1000）；Ｃ１（ＴＣＲ Ｖβ１７と反応性、Freedmanら，J．Exp ．Med.，1991，174:891）およびＦ１（ＴＣＲ Ｖα２．３と反応性、Jansonら， Cancer Immunol．Immunother.，1989，28:225）を用いて染色した。 １−２ｘ１０⁵ＭＮＣまたはＴ細胞を、バッファーのみ、もしくは飽和濃度の ｍＡｂと、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を３回洗浄し、飽 和濃度のヤギの抗マウスＩｇＧ（Tago，Inc.，Burlingame，CA）の蛍光ラベルさ れたＦ（ａｂ’）２フラグメントと４℃で３０分間インキュベートした。バッフ ァ ーで３回洗浄した後、細胞をサイトフルオログラフ（cytofluorograph）で分析 した。ある場合には、二つのカラー免疫蛍光(color immunofluorescence)分析を 行った。不適切なマウスｍＡｂ（抗トリニトロフェノール）で４℃で３０分間イ ンキュベートした細胞を用いて、上記工程後にブロッキング段階を行った。３回 洗浄した後、細胞をフィコエリスリン標識したマウスｍＡｂでインキュベートし 、洗浄し、サイトフルオログラフで分析するために調製した。細胞蛍光を、小さ い非顆粒性リンパ球集団を選択する（Gating on）Ortho IIsサイトフルオログラ フで分析した。バッファーまたは不適切な対照マウスｍＡｂおよび蛍光ラベルさ れたヤギの抗マウスＩｇＧのみで処理した細胞蛍光のパーセントは減少した。抗 ＴＣＲ ｍＡｂで染色された細胞のサイトフルオログラフヒストグラムは、ネガ ティブピークとは別の蛍光のピークを示し、抗ＣＤ３ｍＡｂで染色された細胞に 近い蛍光強度を示した。実施例２ 健康的な被験者、並びに、セロポジティブＲＡ、非ＲＡ炎症性関節炎もしくは ＳＬＥの患者のＰＢ ＭＮＣを単離し、抗ＴＣＲ ｍＡｂのパネルを用いて同定さ れたＴＣＲ Ｖβ遺伝子産物を発現するＣＤ３陽性細胞のパーセントを、間接的 な免疫蛍光分析によって調べた。ｍＡｂ Ｃ３７（Ｖβ５．２、５．３）、ＯＴ １４５（Ｖβ６．７ａ）、１６Ｇ８（Ｖβ８）、またはＳ５１１（Ｖβ１２）と 反応性のＴ細胞の平均のパーセントは、試験したグループのいずれも似ており（ 表１）、結果はこれらのモノクローナル試薬を用いた自己免疫疾患のＴ細胞レパ ートリーの先の研究と一致した（Posnettら，J．Immunol.，1988，141:1963; Gu dmundssonら，Scand．J．Immunol.，1992，36:681）。対照的に、Ｖβ１７ＴＣ Ｒ遺伝子産物に特異的な、最近利用できるｍＡｂ Ｃ１と反応性のＣＤ３陽性Ｐ Ｂ細胞の分析は、正常な被験者または対照の被験者と比べて、ＲＡ患者における Ｖβ１７陽性細胞の平均のパーセントの顕著な増加を示した（ｐ=０．００２） （表１および図１）。正常の対照と比べて、非ＲＡ関節炎またはＳＬＥの患者で は、Ｖβ１７陽性細胞のほとんど重要でない増加が観察された。従って、以上の 結果は、ＲＡ患者のＰＢ中のＶβ１７陽性Ｔ細胞の選択的な増大を証明する。 実施例３ ＲＡ患者における病原性の部位におけるＴ細胞レパートリーを調べるために、 滑液(synovial fluid)、ＳＦ Ｔ細胞を、セロポジティブＲＡ患者４９人から単 離し、間接的免疫蛍光染色によってＴＣＲ Ｖβ遺伝子の使用を分析した（表１ および図１）。非ＲＡ炎症性関節炎の患者の１９のＳＦ標本におけるＶβ１７陽 性細胞のパーセント（５．３％＋２．０）と比較して、Ｖβ１７特異的ｍＡｂ Ｃ１と反応性のＣＤ３陽性細胞の平均のパーセントは、ＲＡ患者において顕著に 上昇した（８．５％＋４．１）（ｐ=０．００１）。目立って、３１％（１５／ ４９）のＲＡ流体サンプルおよび０／１９の対照サンプルが、１０％以上のＶβ １７陽性Ｔ細胞を含む（図１）。対照的に、Ｖβ５．２／５．３、Ｖβ６．７ａ 、Ｖβ８、またはＶβ１２陽性Ｔ細胞のパーセントにおいては、ＲＡと対照ＳＦ との間に顕著な差異は認められなかった。 Ｖβ１７陽性Ｔ細胞の上昇したパーセントを有するＲＡ患者のＳＦ Ｔ細胞の 代表的な研究が、図２に示されている。この被験者におけるＴＣＲレパートリー の研究は、Ｖβ１７遺伝子産物を発現する１７．３％の細胞を示すが、Ｖβ５． ２／５．３、Ｖβ６．７ａおよびＶβ１２産物をそれぞれ２．８％、２．４％お よび１．９％しか発現しない。しかして、研究された５つのＴＣＲＶβ遺伝子フ ァミリーのうち、ＲＡ患者の疾患部位における発現では、Ｖβ１７のみが顕著に 増加している。全ての被験者のＨＬＡ分類データを調べていないが、ＲＡ ＳＦ のＶβ１７陽性Ｔ細胞の増大したパーセントは、これらの被験者のＤＲ４ ＲＡ 感受性対立遺伝子の発現と直接的に関連しないように考えられる。これまで、＞ １０％Ｖβ１７陽性ＳＦ Ｔ細胞を有する１５人の被験者のうちの４人が、ＨＬ Ａ分類されており、そのＤＲハプロタイプは、ＤＲ４，７；ＤＲ２，３；ＤＲｗ １３；およびＤＲ５，７である。実施例４ 二つのカラー免疫蛍光分析を、５つのＲＡ ＳＦサンプルと３つの非ＲＡ炎症 性関節炎のＳＦサンプルに行が、いずれも１０％未満のＶβ１７陽性Ｔ細胞を含 むものであった（表２）。ＳＦ細胞を抗Ｖβ３もしくは抗Ｖβ１７ｍＡｂおよび Ｆ ＩＴＣヤギの抗マウスＩｇＧで染色し、フィコエリスリン抗ＩＬ-２レセプター 抗体（抗−ｐ５５−ＴＡＣ）で処理し、サイトフルオログラフで免疫蛍光を評価 した。Ｔａｃ陽性細胞は、ＲＡ患者のＣＤ４陽性ＳＦ Ｔ細胞からほぼ独占的に 見出される。さらに、Ｔａｃ陽性Ｔ細胞は、ＲＡ ＳＦのＶβ１７陽性Ｔ細胞の 間で豊富であるが、非ＲＡ関節炎のＳＦではそうではない。Ｖβ３陽性Ｔ細胞で はなく（１０％未満）、ＲＡ ＳＦ標本の高い割合のＶβ１７陽性Ｔ細胞（約４ ５％）におけるＴａｃ発現を示すサイトフルオログラフヒストグラムは、図３に 示されている。しかして、顕著に増大したＶβ１７陽性Ｔ細胞の集団を含まない ＲＡ ＳＦでさえ、他のＶβ遺伝子産物を発現するＴ細胞と比較して、Ｔ細胞フ ラクションの優先的な活性化の証拠を示す。実施例５ Ｖβ１７⁺滑液組織Ｔ細胞の病原的潜在性を調べるために、有益なＲＡ患者を 調べた。この被験者は、“模範的な”リウマチ因子陽性（ＲＦ⁺）多関節の、対 称な関節炎を有し、ＲＡ関連ＭＨＣクラスII抗原ＤＲ４を発現し、増大したＶβ １７⁺Ｔ細胞集団を示す。１８ヶ月間の研究の後、Ｖβ１７⁺Ｔ細胞の絶え間なく 上昇したパーセント（すなわち、平均的正常値の５．３と比べて１３．２−１５ ．７％）によって特徴付けられた非対称な末梢血液Ｔ細胞レパートリーを保有し ていた。 １８ヶ月後、滑液組織を、関節鏡滑膜切除によって被験者から摘出し、滑液Ｔ 細胞を、１）細胞表面抗原発現の分析；２）α／Ｂ ＴＣＲ再配列の分子的特徴 決定；および３）Ｖβ１７⁺Ｔ細胞クローンのin vitroの繁殖およびクローニン グに使用するために単離した。 細胞表面抗原発現を分析するために、滑液組織Ｔ細胞をリン酸バッファー食塩 水（ＰＢＳ）で洗浄し、実施例１に記載したようにしてモノクローナル抗体のパ ネルで染色した。Ｔ細胞をバッファーのみ、あるいは飽和濃度のｍＡｂと、４℃ ３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、飽和濃度のヤギの抗マウスＩ ｇＧのフルオレセイン標識化Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント（Tago，Inc.，Burling name，CA）で、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、 細胞をサイトフルオログラフで分析した。Coulter Immunology(Hialeah，FL)か ら得られたフィコエリスリン標識化抗ＣＤ４および抗ＣＤ８ｍＡｂを用いて、二 つのカラー免疫蛍光分析を行った。上記工程の後に、不適切なマウスｍＡｂ（抗 トリニトロフェノール）と４℃で３０分間インキュベートした細胞を用いてブロ ッキング段階を行った。３回洗浄した後、細胞をフィコエリスリンで標識したマ ウスｍＡｂとインキュベートし、洗浄し、小さい非顆粒性リンパ球集団を選択す るOrtho IIsサイトフルオログラフで分析した。バッファーまたは不適切な対照 マウスｍＡｂおよび蛍光ラベルされたヤギの抗マウスＩｇＧのみで処理した細胞 蛍光のパーセントは減少した。この結果を表３に示す。 表に示すように、この被験者の末梢血液におけるＶβ１７⁺Ｔ細胞の分布は、 全体にわたるＣＤ４／ＣＤ８の比率（１／４）を反映するが、ｍＡｂを用いた滑 液組織ＴＣＲレパートリー分析は、Ｖβ１７⁺Ｔ細胞が相対的に大量であること と、ＣＤ４⁺サブセットにおいて選択的に提示することを示す。実施例６ ＲＡの病理学の面からＶβ１７⁺Ｔ細胞のオリゴクローナリティ（oligoclonal ity）を評価するために、Ｖβ１７転写物のＣＤＲ３領域に結合する高度に多型 的な抗原の配列を調べた。Ｖβ１７転写物を、実施例５に記載したように末梢血 液から誘導した。これらの転写物を、鋳型として細胞性ＲＮＡの全体を用いた逆 転写酵素−ポリメラーゼ・チェーン反応（ＲＴ-ＰＣＲ）を用いて分析した。 全体の細胞性ＲＮＡは、マニュアル（RNazol^TM，TEL-TEST，INC.，Texas）に 記載されているように、グアニジニウム／セシウムクロリド遠心法または酸性化 グアニジニウム／フェノール／クロロホルム法を用いて末梢血液または滑液組織 Ｔ細胞から単離した。一次鎖ｃＤＮＡをｃＤＮＡ合成キット（cDNA Cycle Kit， Invitrogen，San Diego，California）を用いて逆転写した。ＴＣＲ Ｖβ遺伝子 セグメントを、Ｖβ１７（５’-ＡＣＡＧＣＧＴＣＴＣＴＣＧＧＧＡＧＡ-３’） （ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１５）、Ｖβ６．７（５’-ＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴＧ ＣＡＣＣＡＧＡＣ-３’）（ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１６）、Ｖβ１（５’-ＧＣ ＡＣＡＡＣＡＧＴＴＴＣＣＣＴＧＡＣＴＴ-３’）（ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１ ７）に特異的な５’センスオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＴＣＲβ定 常領域配列に相補的なアンチセンスプライマー（５’-ＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧ ＡＴＣＴＣＴＧＣＴ-３’）（ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１８）に関連して、ポリ メラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物をInvitrogen ，San Diego，CAから提供されている指導マニュアルによってＴ／Ａクローニン グベクターにサブクローン化した。リゲーション混合物を、適格のＤＨ５α細胞 を形質転換するために用いた。プラスミドＤＮＡサンプルを調製し、シークエン シングキット（Sequenase version 2.0，United States Biochemical，OH）を用 いて配列決定した。 滑液組織Ｔ細胞の全部で２９のＶβ１７ ｃＤＮＡクローンを配列決定した。 ２９クローンのうちの１２は、同一の配列を含んでいる。２９クローンのうちの １１は、区別できるが構造的に関連した配列を含む。二つの優性な滑液組織配列 は、それぞれＶβ１７ｓｅｑ１およびＶβ１７ｓｅｑ２と称される。ＣＤＲ３領 域におけるヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を図４に示す。これらの 配列の比較は、長さの同一性、並びに＃９５位のイソロイシン（Ｉ）と＃９９位 のアスパラギンを含む、ＣＤＲ３領域を備えたいくつかのアミノ酸の保存を示す 。 対照的に、ＲＡ患者の末梢血液からのＶβ１７転写物は、不均一であった。２ ８のｃＤＮＡクローンを配列決定し、ＣＤＲ３配列の２２の区別できるパターン が存在した。末梢血液ｃＤＮＡクローンは、いずれも優性滑液組織Ｖβ１７配列 を含んでいなかった。実施例７ 実施例６の滑液ＲＮＡサンプルのクローン優性(clonal dominance)が、ＰＣＲ 増幅の態様でないことを確かめるために、Ｖβ６．７ａとＶβ１遺伝子サブファ ミリーの再構成も評価した。 表３に示すように、Ｖβ６．７ａ⁺Ｔ細胞は、１．５％のみの滑液Ｔ細胞示し 、６つの区別できる再構成が、８つの配列決定されたクローンに観察された。配 列決定された９つのＶβ１ Ｔ細胞クローンの３つの区別できる再構成が見出さ れた。これらの再構成は、ＣＤＲ３配列およびＪＢセグメントの使用に関して全 く不均一であった。 この実施例に記載された結果は、先の実施例と併せて、Ｖβ１７⁺Ｔ細胞が構 造的に関連したＣＤＲ３配列を発現し、ＲＡ患者の滑液組織において選択的に増 大することを証明する。実施例８ リウマチの進行における上記優性Ｖβ１７配列を発現するＴ細胞によって演じ られる可能性のある役割を調べるために、滑液組織Ｔ細胞を単離し、in vitroで 発現した。滑液組織細胞を、終濃度が１／２０００のＶβ１７選択性微生物超抗 原マイコプラズマ・アースリティディス（Mycoplasma arthritidis）マイトジェ ン（ＭＡＭ，Dr．B．Cole，University of Utah School of Medicine，Salt Lak e City，Utahから入手）、もしくは１０μｇ／ｍｌの抗Ｖβ１７ｍＡｂ Ｃ１を 含む、ＲＰＭＩ１６４０、１０％の胎児性ウシ血清、１％のペニシリンおよびス トレプトマイシン、１％のグルタミン（培地）中で、１ｘ１０⁶／ｍｌとしてイ ンキュベートした。 Friedmanら，J．Exp．Med．174，891(1991)に記載されているように、３７℃ で４日間培養した後に、生成されたインターロイキン２（ＩＬ−２）（Schiappa relli，Columbia，MD）を、終濃度が１０％となるように各培養に添加した。Ｘ 線照射した過ヨウ素酸ナトリウム処理した異系間の末梢血液非Ｔ細胞およびＩＬ -２を毎週添加することにより、ＴＣＬをさらに増大させた。 発生したＴ細胞系（ＴＣＬ）の中に、多数の区別できるＶβ１７ ＴＣＲ配列 が示されたが、培養５と称される一つのＴＣＬの二つのＶβ１７転写物を実施例 ６の方法を用いて分析した。図４に示すように、Ｖβ１７ｓｅｑ３と称する培養 ５からの最初の転写物は、Ｖβ１７−Ｄβ２−Ｊβ２．１−Ｃβ２と利用する。 この配列は、優性滑液組織配列、Ｖβ１７ｓｅｑ１およびＶβ１７ｓｅｑ２と高 度に相同である。 培養５からの第二のＶβ１７転写物であるＶβ１７ｓｅｑ４は、＃９５位のア ミノ酸残基“Ｉ”と＃９９位の“Ｎ”を、Ｖβ１７ｓｅｑ１、２および３と共有 している（図４）。実施例９ Ｖβ１７ｓｅｑ３と４を発現する培養５誘導Ｔ細胞クローンによるα鎖の使用 を分析した。培養５ＴＣＬ細胞を、５ｘ１０⁴のＸ線照射した過ヨウ素酸処理さ れた異系間支持細胞およびＩＬ-２を用いた限定希釈(limited dilution)によっ てクローン化し、さらにエプリオダート(epriodate)処理した支持細胞およびＩ Ｌ-２を用いて増大させた。 ＴＣＲ α再構成を、ＰＣＲ、並びに、Ｖα２サブファミリーおよびＴＣＲ α 鎖定常領域配列に対するプライマーを除く、ＴＣＲ α定常領域プライマーから Ｖ α特異的プライマーのパネル（J．R．Oksenbergら，Nature 345:344(1990)）を 用いて分析した。Ｖα２に対するセンスオリゴヌクレオチドプライマー、５’- ＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧ-３’（ｓｅｑ ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１９）は、Ｖα２コード配列の５’リーダーに位置し、さらな るサブクローニングのためのＳａｌ Ｉ部位を内在している。ＴＣＲ α定常領域 配列に相補的な３’アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’-ＡＡＴＡＧＧＴ ＣＧＡＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧ-３’（ｓｅｑ．Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２０） であり、さらなるサブクローニング用のＳａｌ Ｉ部位を形成するために、二つ のヌクレオチドが変化している。 この分析は、Ｖβ１７ｓｅｑ３を発現するＴ細胞クローンによってＶα２．３ のみが提示されることを示した。正式な配列決定を行ったところ、Ｖα２．３− Ｊα（ＩＧＲＪａ０９）−Ｃαからなる配列が得られた（図５）。このＶαの構 造は、Ｖα２．３特異的ｍＡｂ Ｆ１によるこのＴ細胞クローンの陽性染色と一 致する（Jansonら，1989，Cancer Immunol．Immunother．28:225）。Ｖβ１７ｓ ｅｑ４を発現するＴ細胞に係る同様の分析から、Ｖα３．１−Ｊα−ＣαのＴＣ Ｒ α再構成が得られた（図５）。しかして、優性滑液組織Ｖβ１７転写物に相 同なレセプターを発現するＴ細胞クローンのＴＣＲ αおよびβ鎖の両方の特徴 が調べられた。実施例１０ 培養５誘導Ｔ細胞クローンを、エプスタイン-バーウイルス（ＥＢＶ）形質転 換ＤＲホモ接合リンパ芽球Ｂ細胞系（ＢＣＬ）のパネルに対する増殖反応につい てアッセイした。コントロールとして、培養１０と称するクローン化されていな い滑液組織Ｖβ１７⁺、ＣＤ４⁺Ｔ細胞系を同時にアッセイした（図６）。培地の み、もしくはセシウム源から４０００ｒａｄｓでＸ線照射した５ｘ１０⁴ＥＢＶ 形質転換ＨＬＡ ＤＲホモ接合Ｂ細胞系細胞（Dr．S．Y．Yang，Sloan Kettering Institute，New York，NYから入手）と共に、９６ウェル丸底組織培養プレート を用いて、２ｘ１０⁴Ｔ細胞系細胞を３例培養した。培養に５％ＩＬ-２を補足し 、９６時間後に２μＣｉの³［Ｈ］-チミジンを各培養に添加し、１６時間後に自 動細 胞回収装置を用いてフィルターペーパーに移し、βカウンターでカウントした。 ｖα２．３／Ｖβ１７ｓｅｑ３を発現するクローンは、弱い成長特性、並びに超 抗原および抗ＴＣＲ ｍＡｂを含むあらゆる刺激に対して低レベルの増殖を示し た。しかしながら、図６の上のパネルに示したように、ＤＲ４、Ｄｗ４およびＤ ｗ１４のＲＡに関連する対立遺伝子を発現するＢＣＬ細胞に対して選択的に増殖 する。Ｖα３．１／Ｖβ１４ｓｅｑ４を提示するＴ細胞は、ＤＲ４、Ｄｗ１０を 有するＢＣＬ細胞に高度に反応性である（図６の下のパネル）。保存されたＣＤ Ｒ３配列を提示する滑液Ｔ細胞によるＤＲ４の認識のこの予備的な証拠は、興味 深いものである。しかしながら、上記クローンが、このＭＨＣクラスII抗原の対 立遺伝子と併せて未定の抗原ペプチドを認識するのか、あるいは、ＤＲ４対立遺 伝子自体に特異的なのかは、明らかでない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クロウ，メアリー ケイ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10128 ニューヨーク イースト 89ス ストリー ト 17 (72)発明者 リー，イシン アメリカ合衆国 ニューヨーク 10028 ニューヨーク イースト エンド アヴェ ニュー 30 アパートメント ４エム (72)発明者 トゥマン，ジョーセフ アール アメリカ合衆国 ニューヨーク 11421 ウッドヘイヴン 75ス ストリート 85− 41 (72)発明者 サン，クァン−ロン アメリカ合衆国 ニューヨーク 10028 ニューヨーク イースト 93ド ストリー ト 333

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＲＡ患者の滑液組織に見られるＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域をコード するＤＮＡ配列を含む、精製され単離されたＤＮＡ。 ２． 図３に示したＣＤＲ３のＶβ領域であるＶβ１７ｓｅｑ１をコードするＤ ＮＡ配列を含む、請求項１記載の精製され単離されたＤＮＡ。 ３． 図３に示したＣＤＲ３のＶβ領域であるＶβ１７ｓｅｑ２をコードするＤ ＮＡ配列を含む、請求項１記載の精製され単離されたＤＮＡ。 ４． 図３に示したＣＤＲ３のＶβ領域であるＶβ１７ｓｅｑ３をコードするＤ ＮＡ配列を含む、請求項１記載の精製され単離されたＤＮＡ。 ５． 図３に示したＣＤＲ３のＶβ領域であるＶβ１７ｓｅｑ４をコードするＤ ＮＡ配列を含む、請求項１記載の精製され単離されたＤＮＡ。 ６． 図４に示したＣＤＲ３のＶα領域であるＶα２．３−Ｊα（ＩＧＲＪａ０ ９）−ＣαをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項１記載の精製され単離された ＤＮＡ。 ７． 図４に示したＣＤＲ３のＶα領域であるＶα３．１−Ｊαｋ−Ｃαをコー ドするＤＮＡ配列を含む、請求項１記載の精製され単離されたＤＮＡ。 ８． ＲＡ患者の滑液組織に見られるＴ細胞レセプターのＣＤＲ３領域を含むポ リペプチド。 ９． ＣＤＲ３のＶβ領域であるＶβ１７ｓｅｑ１を含み、図３に示したアミノ 酸配列を備えた、請求項８記載のポリペプチド。 １０． ＣＤＲ３のＶβ領域であるＶβ１７ｓｅｑ２を含み、図３に示したアミ ノ酸配列を備えた、請求項８記載のポリペプチド。 １１． ＣＤＲ３のＶβ領域であるＶβ１７ｓｅｑ３を含み、図３に示したアミ ノ酸配列を備えた、請求項８記載のポリペプチド。 １２． ＣＤＲ３のＶβ領域であるＶβ１７ｓｅｑ４を含み、図３に示したアミ ノ酸配列を備えた、請求項８記載のポリペプチド。 １３． ＣＤＲ３のＶβ領域を含み、アミノ酸配列ＩＧＱ＿Ｎを備えた、請求項 ８記載のポリペプチド。 １４． ＣＤＲ３のＶα領域であるＶα２．３−Ｊα（ＩＧＲＪａ０９）−Ｃα を含み、図４に示したアミノ酸配列を備えた、請求項８記載のポリペプチド。 １５． 図４に示したＣＤＲ３のＶα領域であるＶα３．１−Ｊαｋ−Ｃαを含 む、請求項８記載のポリペプチド。