JPH10504196A

JPH10504196A - 鱗翅目害虫に対して有効な蛋白質毒素

Info

Publication number: JPH10504196A
Application number: JP8507560A
Authority: JP
Inventors: ジェウェルペイン; オーガストジェイ．シック; ケネスイー．ナーバ; エイチ．アーネストシェネフ; ジョージイー．シュワブ
Original assignee: マイコーゲンコーポレーション
Priority date: 1994-08-15
Filing date: 1995-08-14
Publication date: 1998-04-28
Also published as: EP0776368A2; WO1996005314A3; CA2196080A1; AU711479B2; US5686069A; WO1996005314A2; AU3324795A; US5985267A

Abstract

(57)【要約】鱗翅目昆虫に対して有効なバチルス・チューリンギエンシス（B.t.）の新規な分離株が開示され、請求の範囲に記載される。したがって、該分離株又はそれらの変異株は害虫を抑制するために使用できる。更に、新規なデルタ内毒素をコードする遺伝子をこの分離株から取り出し、宿主となる他の微生物または植物に導入することが可能である。該宿主におけるデルタ内毒素の発現により、該宿主の存在する環境において感受性害虫が抑制される。

Description

【発明の詳細な説明】鱗翅目害虫に対して有効な蛋白質毒素関連出願の相互参照本願は、1990年10月15日に出願され既に放棄されている出願第07/597,607号の継続出願である、1993年3月16日に出願された同時係属中の出願第08/032,778号の一部継続出願である。発明の背景土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis:B.t.）は、パラ胞子の結晶性蛋白質封入体を特徴とする、グラム陽性の胞子形成細菌である。この封入体は、明確な形をした結晶として顕微鏡下で見えることがよくある。この結晶性蛋白質は、害虫に対して非常に毒性であり、毒素活性に関して特異的な、デルタ内毒素の前駆体である。あるB.t.内毒素遺伝子が分離され配列が決定され、組換えDNAに基づいたB.t.産物が製造され認可されている。更に、遺伝子工学技術を使用したB.t.内毒素を農業環境へ持ち込むための新しい方法が、開発途中である。その方法には、昆虫耐性にするため内毒素遺伝子で遺伝子操作した植物の使用、及びB.t.内毒素運搬用担体として安定化した完全な微生物細胞の使用が含まれる（Gaertner,F.H.，L.Kim［1988］TIBTECH 6:S4-S7）。このように、単離されたB.t.内毒素遺伝子は市場価値のあるものになりつつある。この十年までは、B.t.殺虫剤の商業的使用は主として鱗翅目（毛虫）の害虫の狭い範囲に制限されていた。B.チューリンギエンシス亜種クルスタキ（kurstaki ）の胞子及び結晶の調製物が長年に亘り鱗翅目害虫用の市販殺虫剤として使用されていた。例えば、B.チューリンギエンシス変種クルスタキHD-１は、多くの鱗翅目昆虫の幼虫に毒性であるデルタ内毒素を産生する。しかし、最近、研究者らは非常に広範囲の害虫に特異性を有するB.t.殺虫剤を発見した。例えば、B.t.の亜種であるイスラエレンシス（israelensis）及びサンジェゴ（san diego）（B.t.テネブリオニス(tenebrionis)、M-７としても知られる）が、それぞれ双翅目及び甲虫目の昆虫の駆除のため市販されている（ガートナー、F.H.[1989]「殺虫蛋白質の細胞送達系：生きた微生物及び生きていない微生物（Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins:Living and N on -Living Microorganisms）」、穀物保護剤の制御された輸送（Conrolled Delive ry of Crop Protection Agents）、R.M.ウィルキンス（R.M.Wilkins）、テイラー（Taylor）及びフランシス（Francis）編、ニューヨーク及びロンドン、1990 ，245〜255頁）。また、「カウチ（Couch）,T.L.(1980)「バチルス・チューリンギエンシス変種イスラエレンシスの蚊病原性」Developments in Industrial Mic robiology 22:61〜76」；「ビーグル（Beegle）,C.C.、(1978)「農業生態系における昆虫生産細菌の使用」Developments in Industrial Microbiology 20:97〜1 04」も参照せよ。「クリーグ（Krieg）、A.M.フーガー（Hugar）、G.A.ランゲンブルッフ（Langenbruch）、W.シュネッター（Schnetter）（1983）Z.ang.Ent.96 :500〜508」にバチルス・チューリンギエンシス変種テネブリオニスと名付けられたB.t.分離株が記載されている。これは、報告によれば、甲虫目の２種の甲虫に対して活性である。この２種とは、コロラドポテト甲虫である、レプチノターサ・デセンリネアータ（Leptinotarsa decemlineata）及びアゲラスチカ・アルニ（Agelastica alni）である。最近、B.t.の新亜種が同定され、活性のデルタ内毒素蛋白質の遺伝子が分離された（ホフテ（Hofte）,H.、H.R.ホワイトリー（Whiteley）［1989］Microbiolo gical Reviews 52(2):242〜255）。ホフテ及びホワイトリーはB.t.クリスタル蛋白質遺伝子を、主な４種類に分類した。その種類は、CryI（鱗翅目特異的）、Cr yII（鱗翅目及び双翅目に特異的）、CryIII（甲虫目特異的）、CryIV（双翅目特異的）である。他の害虫に特異的に毒性である株の発見が報告された（ファイテルソン（Feitelson）J.S.、J.ペイネ（Payne）、L.キム（1992）Bio/Technology 10:271〜275）。大腸菌におけるB.t.結晶蛋白質遺伝子のクローニング及び発現が、出版された文献に記載されている（シュネフ（Schnepf）,H.E.、H.R.ホワイトリー［1981］ Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2893〜2897）。米国特許第4,448,885号および米国特許第4,467,036号の両方に、大腸菌におけるB.t.結晶蛋白質の発現が開示されている。米国特許第4,797,276号及び第4,853,331号に、種々の環境で甲虫目害虫駆除に使用できるB.チューリンギエンシス変種サンジェゴ（B.t.テネブリオニス、M-７としても知られる）が開示されている。米国特許第5,164,180号に、鱗翅目害虫に対して活性があるB.t.分離株、PS81A2が開示されている。米国特許第5,15 1,363号に、線虫に対する活性を有するB.t.のある種の分離株が開示されている。他にも、B.t.の新しい分離株及びB.t.分離株の新しい使用法に関して多くの特許がある。新しいB.t.分離株及び既知のB.t.分離株の新しい使用法の発見が、経験的に予測不可能な技術として残されている。発明の概要本発明は、抗鱗翅目害虫活性を有する、バチルス・チューリンギエンシスの新規の分離株に関する。特に、本発明は、新規のB.t.分離株及びその変異株、ならびに抗鱗翅目害虫活性のある蛋白質をコードするB.t.分離株から得られる新規のデルタ内毒素遺伝子を包む。図面の簡単な説明図１は、一般式（配列番号27）の一文字アミノ酸配列を示す図である。番号付けは便宜的なものであり、およその位置付けに過ぎない。一般式において、分子のＮ-末端側の半分は残基番号1〜638から成る。Ｃ-末端側の半分は残基番号639 〜1213から成る。ここで、 A＝ ala G＝ gly M＝ met S＝ ser C＝ cys H＝ his N＝ asn T＝ thr D＝ asp I＝ ile P＝ pro V＝ val E＝ glu K＝ lys Q＝ gln W＝ trp F＝ phe L＝ leu R＝ arg Y＝ tyr k＝ KまたはR z＝ G、S、D、またはN j＝ E、Q、R、またはK x＝ G、S、D、N、E、Q、R、またはK u＝ C、P、T、またはA b＝ M、I、L、V、またはF o＝ C、P、T、A、M、I、L、V、またはF -＝天然アミノ酸 .＝天然アミノ酸またはその完全脱落配列の簡単な説明配列番号1 は遺伝子８１Ａ２のヌクレオチド配列である。配列番号2 は毒素８１Ａ２のアミノ酸配列である。配列番号3 は遺伝子９１Ｃ２のヌクレオチド配列である。配列番号4 は毒素９１Ｃ２のアミノ酸配列である。配列番号5 は実施例３に記載したようなRFLP分析に使用される放射標識オリゴヌクレオチドプローブである。配列番号6 は本発明に従って遺伝子９１Ｃ２を増幅するために使用される進行方向オリゴヌクレオチドプライマーである。配列番号7 は本発明に従って遺伝子９１Ｃ２を増幅するために使用される逆方向オリゴヌクレオチドプライマーである。配列番号8 は本発明に従って遺伝子９１Ｃ２を同定するために使用される合成オリゴヌクレオチドプローブである。配列番号9 はCryIF遺伝子用のプローブにコードされているペプチド配列である。配列番号10 は本発明に従ったヌクレオチドプローブである。配列番号11 はCryIF遺伝子用プローブにコードされているペプチド配列である。配列番号12 は本発明に従ったヌクレオチドプローブである。配列番号13 はCryIF遺伝子用プローブにコードされているペプチド配列である。配列番号14 は本発明に従ったヌクレオチドプローブである。配列番号15 はCryIF遺伝子用プローブにコードされているペプチド配列である。配列番号16 は本発明に従ったヌクレオチドプローブである。配列番号17 はCryIF遺伝子用プローブにコードされているペプチド配列である。配列番号18 は本発明に従ったヌクレオチドプローブである。配列番号19 はCryIF遺伝子用プローブにコードされているペプチド配列である。配列番号20 は本発明に従ったヌクレオチドプローブである。配列番号21 はCryIF遺伝子用プローブにコードされているペプチド配列である。配列番号22 は本発明に従ったヌクレオチドプローブである。配列番号23 はCryIF遺伝子用プローブにコードされているペプチド配列である。配列番号24 は本発明に従ったヌクレオチドプローブである。配列番号25 はCryIF遺伝子用プローブにコードされているペプチド配列である。配列番号26 は本発明に従ったヌクレオチドプローブである。配列番号27 は本発明に従った一般式である。発明の詳細な説明本発明は、抗鱗翅目活性を有するバチルスチューリンギエンシスの分離株に関する。これらの分離株には、観察される抗鱗翅目活性の原因であるデルタ内毒素をコードする遺伝子が含まれる。従って、本発明は抗鱗翅目B.t.分離株、抗鱗翅目B.t.毒素、及びこれらの毒素をコードする遺伝子に関する。更に本発明の態様は、抗鱗翅目B.t.毒素をコードする遺伝子を用いて形質転換した組換え宿主に関する。更に、本発明は、鱗翅目を駆除する方法に関し、その方法には本発明の分離株、毒素、遺伝子、及び組換え宿主の使用が包まれる。本明細書に特別に実例として挙げられているのは、B.t.PS81T1、B.t.PS53C2、 B.t.PS31F4、B.t.PS86V1、B.t.PS8612、B.t.PS73E、B.t.PS81K、B.t.PS83E2、B. t.PS81E、B.t.PS81Z3、B.t.PS53B5、B.t.PS83R、B.t.PS53B2、B.t.PS83N2、B.t. PS81B5、B.t.PS86W1、及びB.t.PS93C2と命名された分離株である。また特に実例とされるのは、91C2と命名された毒素、及びこの毒素をコードする遺伝子である。91C2遺伝子はCryIF遺伝子である。CryIFはB.t.遺伝子の鱗翅目活性のあるCryI 群に属す遺伝子の亜群である。本明細書に記載されている発見により、当業者は抗鱗翅目活性を有する他のCryIF毒素（およびその毒素をコードする遺伝子）を同定することができる。本発明の毒素は、鱗翅目に対して活性であり且つ下記の特徴のうちの一つ以上を有するという特徴がある。 1．毒素91C2との高度のアミノ酸相同性 2．本発明で開示しているプローブまたは遺伝子とハイブリダイズする、毒素をコードするヌクレオチド配列。 3．本発明で開示しているプライマーを使用したPCRにより増幅できる、毒素をコードするヌクレオチド配列。 4．本明細書に提示されている一般式に合致するアミノ酸配列。 5．毒素91C2に対して生成した抗体に対する免疫応答性。本発明による有用なバチルス・チューリンギエンシス分離株は、生化学的に純粋な型の下記の特徴を有する。本発明による有用なB.t.分離株は寄託されている。目的のB.t.遺伝子を含む組換え微生物もまた寄託されている。培養物は「特許培養液コレクション（Patent Culture Collection）（NRRL）、地方研究センター（Regional Research Cente r）、1815 ノース大学通り（North University Street）、ピオリア、イリノイ州 61604 米国」の永久コレクション（permanent collection）に寄託されている。本特許出願の係属中、特許商標庁長官が37 CFR 1.14及び35 U.S.C．§122において資格があると決定した者には、培養物の入手が可能であることを確実にするという条件下で、本培養物は寄託されている。本願の対応出願またはその子の出願が出願される各国の特許法により必要とされているように、寄託物は入手可能である。しかし、寄託物の入手可能性は、本発明を実施する権利を構成し政府の行為により認可された特許権を減損するものではないことを理解すべきである。更に、微生物の寄託に関するブダペスト条約（Budapest Treaty for the Depo sit of Microorganism）の条項に従い、本寄託培養物は保存され、かつ一般に入手可能な状態にある。即ち培養物は、最新の寄託物試料の分譲請求の後少なくとも5年間、そしていずれにしても、寄託日から少なくとも30年間またはその培養物を開示している特許の実施期間の間、生存し夾雑物のないように保つのに必要な全ての注意を払いながら培養物は保存される。寄託者は、請求時に寄託物の状態のために試料を分譲できない場合、寄託物を取り替えなければならない義務を認めている。本寄託培養物の公共への入手可能性に関する制限は全て、その寄託物を開示する特許が許可された時点で、不可逆的に取り除かれるであろう。毒素及び遺伝子本発明による毒素及び遺伝子には、本明細書に開示された全長配列だけでなく、配列の断片、より長い配列、及び本明細書に特に例示されている特徴的な殺虫毒素活性を保持している融合蛋白質もまた含まれる。本発明の一つの面は、抗鱗翅目活性を有する毒素の同定に使用できる、以降一般式（配列番号27）と呼ばれる一般式の発見に関する。一般式は分子量約130kDa の毒素蛋白質を表す。一般式は、一文字アミノ酸配列により表され、図１に示されている。パテントイン（PatentIn）の形式に従って本明細書に示された配列表は、３文字アミノ酸コードを使用しており、ある特定の位置の２つのアミノ酸間の選択を示すための規定は存在しない。それ故、パテントイン配列表において、「Xaa」は配列内の変異の点を表すのに使用するが、配列中の特定の位置に許容される特定のアミノ酸置換については、図１の１文字コードを参照されたい。更に、本発明の鱗翅目毒性を特定するための資料が、表２及び表３に示されている。この表は、鱗翅目毒素の既知のCryIサブクラスに属する毒素間の関連を示している。これらの表は２つの蛋白質間の最も適合する配列に対する評価値を数字で示している。評価値が反映するのは、（１）正確な一致に対する正の評価値、（２）関連蛋白質において１つのアミノ酸が他のアミノ酸へ置換した可能性（または置換していない可能性）を反映する正のまたは負の評価値、及び（３）ギャップ導入のための負の評価値である。ある蛋白質をそれ自身と並べた配列は、可能な限り最も高い評価値を有する、即ち完全に一致しギャップがない。しかし、関連のない蛋白質または任意に作製した配列は典型的な低い正の評価値になるであろう。関連のある配列は、ランダムなバックグラウンド評価値と完全一致の評価値との間の評価値になる。本明細書に報告する配列の比較は、「GCG 配列解析ソフトウエアーパッケージバージョン７、1991年4月の「ベストフィット」プログラム」に従って実施されている、スミスおよびウォーターマン（Waterman）（「1981」Advances in Appl ied Mathematics 2:482〜489）のアルゴリズムを使用して行った。配列は、デフオルトパラメーター値（default parameter values）（comparison：Swagappep ．Cmp，gap:3.0，length weight;0.1）と比較した。プログラムの出力値を性質評価値（Quality score）とする。表２及び表３は、CryI毒素蛋白質の示されたアミノ酸間で対にした配列評価値を示す。表４は、目的の蛋白質の比較アミノ酸を示す。表２は、任意の配列の評価値に対して補正する前の評価値を示す。各サブクラスでは、最も高い配列評価値は、常に、同じサブクラスに属す別の毒素蛋白質間であることに留意されたい。例えば、CryIA(a)についての最も高い配列評価値は、それ自身とは別として、CryIA(d)との間である。更に、CryIA(a)は、他の３種のCryIA毒素蛋白質全てとの間で最も高い評価値になる。同様に、他のCryI毒素は同じサブクラスの他のメンバーとの間で最も高い評価値になる。本発明に特に関連するのは、CryIF毒素蛋白質同士は互いに最も高い評価値になるという事実である。表３は、横列の配列に関して縦列の配列を任意にシャッフルした50種の配列の平均評価値を差し引いた後の同じ分析を示す。表３では、表２と同様の関係が保たれていることに留意されたい、即ち毒素蛋白質は同一のサブクラスの他のメンバーと最も高い評価値を示す。繰り返すが、２つのCryIF毒素蛋白質同士は互いに最も高い評価値を示す。同一のサブクラスのメンバーに対して補正した配列評価値を検討すると、CryIサブクラスは約450またはそれ以上の補正配列評価値を有する蛋白質と定義できることが分かる。従って、本発明のある種の毒素は、鱗翅目活性を有し、且つCryIF(a)またはCr yIF(b)(91C2)との間で、450〜500またはそれ以上の配列評価値を有する毒素として定義することができる。本明細書で用いられる「配列評価値」という用語は、前述のようにして得られ表３に示した評価値を算出するために使用される補正評価値を意味する。本発明の毒素は、91C2と命名された遺伝子によりコードされる毒素として特に本明細書に例示されている。この毒素は本発明の毒素の例示にすぎないため、本発明には、更に、91C2と同じまたは本質的に同じ抗鱗翅目生物活性を有する様々な毒素（および様々な毒素をコードするヌクレオチド配列）が含まれるということが容易に理解されるべきである。このような同等な毒素は、91C2とのアミノ酸相同性を有するであろう。このアミノ酸相同性は、典型的には75％以上、好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上である。アミノ酸相同性は、毒素のある重要な領域で最も高く、それが毒素の生物活性の原因となるか、または最終的に生物学的活性の原因となる三次元構造の決定に関与する。これに関連して、活性にとって重要でない領域に作製されるか、または分子の三次元構造に影響を与えない保存的なアミノ酸置換である一定のアミノ酸置換は許容される。例えば、アミノ酸は次のような分類に分けられる、即ち、無極性、非荷電極性、塩基性、及び酸性である。ある分類のアミノ酸が同じ分類の他のアミノ酸に置き換わることによる保存的な置換は、その置換がその化合物の生物活性を実質的に変化させない限り、本発明の範囲内である。表5は、各分類に属するアミノ酸の例の一覧表である。場合によっては、非保存的な置換も作ることができる。重要な要因は、この置換が毒素の生物活性を有意に減少させてはならないことである。本発明の毒素は、前述されているような、毒素封入体の形状及び場所といった点からも特徴づけられる。鱗翅目活性のある毒素をコードする遺伝子は、いくつかの方法によって同定され入手できることは、当業者には明白であろう。本明細書に例示されている特定の遺伝子は、前述したように培養物寄託機関に寄託された分離株から得られるであろう。これらの遺伝子またはそれらの一部またはそれらの変種は例えば遺伝子用機械を使用して人工的に構築してもよい。本明細書で用いられる遺伝子の「変種」、または「変異」という用語は、同一の毒素をコードするヌクレオチド配列、または鱗翅目活性を有する同等の毒素をコードするヌクレオチド配列を表す。これらの遺伝子変異は、標準的な点突然変異誘発の技術を使用して容易に構築できよう。また、これらの遺伝子の断片も、標準的な方法に従って市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて作製できる。例えば、Bal31のような酵素、または部位特異的突然変異誘発を、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを規則正しく切り取るために使用することができる。また、活性ある断片をコードする遺伝子も他の様々な制限酵素を使用して得られるであろう。蛋白質分解酵素がこれらの毒素の活性ある断片を直接得るために使用されることもある。同等な毒素および／またはこの同等な毒素をコードする遺伝子を、本明細書に提示する教示によりB.t.分離株および／またはDNAライブラリーから探し出すこともできる。本発明の殺虫毒素を得る方法は多数ある。例えば、本明細書で開示され請求される殺虫毒素の抗体は、蛋白質の混合物から他の毒素を同定し分離するために使用できる。特に、抗体は、毒素の最も不変である部分及び他のB.t.毒素とは最も異なる部分に対して作製してもよい。それから、該抗体は、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、またはウェスタンブロッティングにより、特徴的な活性を有する同等な毒素を特異的に同定するために使用できる。本明細書に開示される毒素に対する抗体、または同等な毒素に対する抗体、またはこれらの毒素の断片に対する抗体は、当分野の標準的な方法を用いて容易に調製できる。その後、このような毒素をコードする遺伝子を、微生物から得ることができる。本発明の毒素及び遺伝子を同定するための別法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による。このプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。この配列は、適当な標識により検出可能とするか、または国際特許出願第WO93/16094号に記載されているように本質的に蛍光を有するように作製してもよい。当分野において周知であるように、もしプローブ分子及び核酸検体が２分子間に強い結合を形成することによりハイブリダイズするなら、該プローブ及び検体は実質的に相同性を有することが論理的に想定できる。プローブの検出は、ハイブリダイズされたかどうかを既知の方法で検出するための手段となる。このようなプローブ解析は、本発明の毒素をコードする遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に従いプローブとして使用されるヌクレオチド区分は、標準的な方法を使用しDNA合成機を用いて合成できる。標識されたヌクレオチド区分をプローブとして使用するに当たり、特定のプローブが当業者には既知の、放射性及び非放射性標識を含む適当な標識を用いて標識される。典型的な放射性標識には、³²P 、¹²⁵I、³⁵S、などが含まれる。放射性同位元素で標識したプローブは、DNA試料に相補的なヌクレオチド配列から、簡便なニックトランスレーション反応により、DNA分解酵素及びDNA合成酵素を用いて構築できる。それから、プローブと試料とをハイブリダイゼーション用緩衝液中で結合させ、アニーリングが起きる迄適当な温度に保つことができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは当分野において周知の技術により厳密な条件下で行われる。この条件は、例えば、「ケラー（Keller）,G.H.、M.M.マナク（Manak）(1989)DNA probes、ストックトンプレス、ニューヨーク、ニューヨーク州、169〜170頁」に記載されている。その後に、オートラジオグラフィおよび／または液体シンチレーション測定により典型的な方法で検出し定量できる、試料及び結合したプローブ分子を残して、余分な物質が除去されるよう膜を洗浄する。非放射性標識には、例えば、ビオチンまたはチロキシンのようなリガンド、ならびに加水分解酵素またはペルオキシダーゼのような酵素、またはルシフェリンのような様々な化学蛍光物質、またはフルオレセイン及びその誘導体のような蛍光性化合物が含まれる。プローブは、分離を容易にするために、その両端を異なる型の標識を用いて標識してもよい。例えば、前述の末端には同位元素標識をそしてもう一方の末端にはビオチン標識を使用する。二本鎖の形成及び安定性は、ハイブリッドの２本の鎖の間の実質的な相補性に依存する。即ち、ある程度の不適合は許容される。従って、本発明のプローブには、目的とする標的ポリヌクレオチドと安定なハイブリッドを形成する、記載されている配列の、変異（単一の変異及び複数の変異の両方）、欠失、挿入、およびこれらの組み合わせが含まれる。変異、挿入および欠失を、ある特定のポリヌクレオチド配列において多くの方法により作ることができ、その方法は通常の当業者には既知である。他の方法も将来明らかとなるかもしれない。既知の方法には次のような方法が含まれるが、これに限定されない。（１）化学的に、または他の方法で既知の配列の変異、挿入、または欠失である人工的配列を合成すること、（２）ハイブリダイズを経て新配列を得るために、またはプローブ配列の変異、挿入、もしくは欠失を得るために、本発明のプローブを使用すること、および（３）インビトロまたはインビボで試験配列を変異、挿入、または欠失させること。留意すべき重要なことは、特定のプローブから作製した変異型、挿入型および欠失型は親プローブより更に効率よくなったり、またはより効率悪くなることがあるということである。このように効率に差が生じても、これらの変異型は本発明の範囲内である。このように、開示した配列の変異型、挿入型、および欠失型は当業者には周知の方法により容易に調製することができる。これらの変異型は、変異型がプローブと実質的な配列相同性を有する限り、本プローブと同様の方法に使用できる。本明細書で使用される、実質的な配列相同性とは、変異型が親プローブと同じ能力で機能するのに充分な相同性を意味する。好ましくは、この相同性は50％以上であり、より好ましくは75％以上であり、最も好ましくは90％以上である。変異型が意図された能力で機能するのに必要な相同性の程度は、配列を使用する目的によるであろう。配列の機能を改良するように、または方法論的利点を提供するように設計された、変異型、挿入型および欠失型の突然変異を作製することは当分野に習熟した人の技術の範囲内にある。本発明に従い、CryIF分類の毒素遺伝子を迅速に同定するのに有用な特定のヌクレオチドプローブには以下のものが含まれる。（i）ペプチド配列「Ser Thr Gly Arg Leu Pro Leu Asp」（配列番号９）をコードするDNA。該プローブの具体例は「AGTACWGGMAGRTTACCRTT RGAY」（配列番号10）である。（ii）ペプチド配列「Glu Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn」（配列番号11）をコードするDNA。該プローブの具体例は「GARGATTCWCCAGTWTCWGC WAAT」（配列番号12）である。（iii）ペプチド配列「Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu Phe Gly Val」（配列番号13）をコードするDNA。このようなプローブの具体例は「AATGGWTTTAATAGTGCTG AATTTGGGAGT W」（配列番号１４）である。（iV）ペプチド配列「Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr」（配列番号15）をコードするDNA。このようなプローブの具体例は「GTAACWGCAGARACWGTWA G WAGTCAAACW」（配列番号１６）である。（v）ペプチド配列「Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp G lu」（配列番号17）をコードするDNA。このようなプローブの具体例は「GTMTTYA ATC CWGGWGGMGC MATWTGGATW GCWGATGARG AT」（配列番号18）である。（vi）ペプチド配列「Val Arg Gly Gly Phe Gly」（配列番号19）をコードするDNA。このようなプローブの具体例は「GTMMGAGGWG GWTTTGGR」（配列番号20）である。（vii）ペプチド配列「Gly Thr Asn His Thr Arg Thr」（配列番号21）をコードするDNA。このようなプローブの具体例は「GGWACRAAYCAYACMMGAAC W」（配列番号22）である。（Viii）ペプチド配列「Val Arg Trp Pro Gly Glu Ile」（配列番号23）をコードするDNA。このようなプローブの具体例は「GTWMGATGGCCWGGWGARAT W」（配列番号24）である。（iX）ペプチド配列「Ser Asp Ser Trp Arg Ala」（配列番号25）をコードするDNA。このようなプローブの具体例は「AGTGATTCWT GGAGAGCW」（配列番号26）である。遺伝コードの重複のため、即ち蛋白質の合成に用いられるアミノ酸の大部分で一つ以上のコーディングヌクレオチドトリプレット（コドン）が使用されうるため、異なるヌクレオチド配列が一つの特定のアミノ酸をコードすることが可能である。それ故、B.t.毒素及びペプチドのアミノ酸配列は、その蛋白質またはペプチドの同一アミノ酸配列をコードする同等なヌクレオチド配列により調製することができる。従って、本発明にはそのような同等なヌクレオチド配列が含まれる。また、逆の、即ち相補的配列も本発明の範囲内であり、当業者により容易に使用され得る。組換え宿主本発明の分離株に含まれる毒素コード遺伝子は、多様な微生物または植物の宿主へ導入することができる。毒素遺伝子が発現すると、直接的または間接的に、殺虫剤が細胞内で生産され、そして保持される結果となる。適当な微生物宿主、例えばシュードモナスを用いて、生きた微生物を鱗翅目の場所に適用することができる。そこでそれらが増殖し害虫により摂取される。その結果、この害虫が抑制されることになる。または、毒素遺伝子を持つ微生物を、毒素活性を延長し細胞を安定化するような条件下で処理してもよい。毒素活性を保持している処理後の細胞を、標的害虫の環境に適用することもできる。 B.t.毒素遺伝子を適当なベクターにより微生物宿主に導入し、その宿主を生きた状態で環境に適用する場合には、ある種の宿主微生物を使用することが必須となる。例えば、土壌に住み着くことが分かっている微生物宿主を選ぶことが可能である。このような微生物は、その野生型微生物と土壌中でうまく競合することができるように選択される。また、その宿主微生物には、安定保持のためとポリペプチド殺虫剤を発現する遺伝子の発現のための手段が準備されていること、そして、望ましくは、環境による破壊や無毒化から殺虫剤を保護する改良手段が講じられていることも重要である。多数の微生物が根圏（植物の根の周囲の土壌）に存在することが分かっている。このような微生物には、細菌、藻、および真菌が含まれる。特に重要な微生物は、バシラス属（Bacillus）、シュードモナス属(Pseudomonas)、エルウィニア属(Erwinia)、セラッチア属(Serratia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、ザントモナス属(Xanthomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、リゾビウム属( Rhizobium)、ロドシュードモナス属(Rhodopseudomonas)、メチロフィリウス属(M ethylophilius)、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、アセトバクター属( Acetobacter)、ラクトバシラス属(Lactobacillus)、アスロバクター属(Athrobac ter)、アゾトバクター属(Azotobacter)、リューコノストック属(Leuconostoc)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、およびクロストリジウム属(Clostridium)などの細菌；サッカロマイセス属(Saccharomyces)、クリプトコッカス属(Cryptococc us)、クルイベルマイセス属(Kluyveromyces)、スポロボロマイセス属(Sporobolo myces)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、およびオーレオバシジウム属(Aureobasid ium)などの真菌、特に酵母；藍藻科(Cyanophyceae)、原核緑藻科(Prochlorophyc eae)、紅藻科(Rhodophyceae)、渦鞭毛藻科(Dinophyceae)、黄金色藻科(Chrysoph yceae)、プリムネシウム科(Prymesiophyceae)、黄緑藻科(Xanthophyceae)、ラフィド藻科(Raphidophyceae)、珪藻科(Bacillariophyceae)、真正眼点藻科(Eustig matophyceae)、クリプト藻科(Cryptophyceae)、ユーグレナ藻科(Eustigmatophyc eae)、プラシノ藻科(Prasinophyceae)、緑藻科(Chlorophyceae)などの藻類である。特に重要であるのは、シュードモナス・シリンジー(Pseudomonas syringae) 、シュードモナス・フローレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マーセッセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・ザイリナム（Ace tobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaci ens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオテイ（Rhizobium melioti）、アルカリゲネス・エントロファス（Alcalig enes entrophus）、およびアゾトバクター・ビンランデイ（Azotobacter vinlan dii）などのフィトスフィアー（phytosphere）細菌種、ならびにロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、ロドトルラ・グルチニス（R．glutinis）、ロドトルラ・マリナ（R．marina）、ロドトルラ・オーランチアカ（R．aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、クリプトコッカス・ジフルエンス（C．diffluens）、クリプトコッカス・ローレンチ（C．laurentii ）、サッカロマイセス・ロセイ（Saccharomyces rosei）、サッカロマイセス・プレトリエンシス（S．pretoriensis）、サッカロマイセス・セレビジエ（S．ce revisiae）、スポロボロマイセス・ロセウス(Sporoboromyces roseus)、スポロボロマイセス・オドラス（S．odorus）、クルイベロマイセス・ベロナ（Kluyver omyces veronae）、およびオーレオバシデイウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）などのファイストファー酵母である。特に重要であるのは色素微生物（pigmented microorganism）である。様々な方法が、毒素をコードするB.t.遺伝子を、遺伝子の安定保持と安定発現を考慮した条件で、微生物宿主に導入するために用いられる。このような方法は当業者には既知であり、例えば、米国特許第5,135,867号に記載されている。これは本明細書に参照として組み込まれる。細胞処理上述のように、B.t.またはB.t.毒素を発現する組換え細胞は、毒素活性を延長し、細胞を安定化するために処理することができる。形成された殺虫マイクロカプセルは、安定化された細胞構造内にB.t.毒素を含み、マイクロカプセルが標的害虫の環境に適用されたときに毒素を保護するであろう。適当な宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれでもよく、通常は哺乳動物のような高等生物に有毒な物質を産生しない細胞に限定される。しかし、毒性物質が不安定であるか、または哺乳動物宿主に対する毒性の可能性を完全に回避することができるほど充分に低い適用レベルであれば、高等生物に有毒な物質を産生する生物を使用することもできる。宿主として特に重要なのは、原核生物、および真菌のような下等真核生物であろう。細胞は通常、完全なものであり、処理する場合には実質的に胞子型ではなく増殖型であろうが、しかし場合によっては胞子を用いてもよい。微生物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子を含む微生物の処理は、毒素の性質に悪影響を及ぼさず、また毒素を保護する細胞の能力を減少させない限り、化学的手段によっても、物理的手段によっても、または化学的および／または物理的手段の組み合わせによってもよい。化学試薬の例はハロゲン剤、特に原子番号17から80 のハロゲンである。更に特定すると、ヨードが、緩和な条件および充分な時間で、望ましい結果を得るために使用される。他の適当な技術は、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドのようなアルデヒド；塩化ゼフィランおよび塩化セチルピリジニウムのような抗感染剤；イソプロピルおよびエタノールのようなアルコール；ルゴールヨード（Lugol iodine）、ブーイン固定剤(Bouin's fixative) 、およびヘリー固定剤(Helly's fixative)のような種々の組織固定剤（Humason ，Gretchen L.，Animal Tissue Techniques，W.H.Freeman and Company，1967、参照）；または細胞が宿主の環境に適用された際に細胞内で産生される毒素の活性を保護し延長するような物理的（熱）および化学的手段の組み合わせで処理することを含む。好ましい態様では、酸が細胞安定化に使用される。物理的手段の例は、ガンマ線照射およびエックス線照射のような短波長照射、凍結、紫外線照射、凍結乾燥などである。微生物細胞の処理法は、米国特許第4,695,455号および第4,695,462号に開示されている。これらは本明細書に参考として組み込まれる。細胞は、一般的に、環境条件に対する抵抗性を強化するような構造的安定性を強化しているのであろう。殺虫剤が前駆体である場合は、殺虫剤の前駆体から成熟型への転換過程が標的害虫病原体によって阻害されないように、細胞処理法を選択すべきである。例えば、ホルムアルデヒドは蛋白質を架橋して、ポリペプチド殺虫剤の前駆体転換過程を阻害するであろう。処理方法は毒素の生物学的有効性または生物活性の実質的な部分を保持するものである必要がある。生産目的のための宿主細胞の選択に当たり特に重要な特質は、宿主へのB.t.遺伝子導入の容易性、発現系の入手可能性、発現効率、宿主における殺虫剤の安定性、および補助的な遺伝能力の存在である。殺虫剤マイクロカプセルとして使用するための重要な特質は、厚い細胞壁、色素沈着、および封入体の細胞内パッケージングまたは形成といった殺虫剤を保護する性質を有し；水性環境で生存することができ；哺乳動物に対する毒性をもたず；害虫を摂取のために誘引し；毒素を損なわずに容易に殺傷および固定することができる、などである。他に考慮すべきこととしては、製剤化および取り扱いの容易性、経済性、保存時の安定性などが挙げられる。細胞の増殖 DNA構築体が選択に対する優位性を提供する場合、実質的に全ての細胞、または全ての細胞がB.t.遺伝子を保持するような選択培地を準備すれば、B.t.殺虫遺伝子を含む細胞宿主はいかなる簡便な栄養培地でも増殖させることができる。それから、細胞は通常の方法に従って収穫する。または、細胞は収穫前に処理することもできる。本発明のB.t.細胞は、標準人工培地および発酵技術を使用して培養できる。培養サイクルの完了後、当分野分野において既知の手段により発酵培養液からB.t. の胞子および結晶を最初に分離することにより細菌が回収される。回収されたB. t.の胞子および結晶は、取扱いおよび特定の標的害虫への適用を容易にするため、界面活性剤、分散剤、不活性な担体、およびその他の成分を添加することにより、吸湿性粉体、濃縮液、顆粒、またはその他の剤型へと製剤化することができる。このような製剤化および適用の方法は当分野において周知である。製剤化誘引物質、ならびにB.t.分離株、または本発明に開示されたB.t.分離株から得られる遺伝子を含む組換え微生物、の胞子および結晶を含む製剤化された顆粒状餌は、土壌に適用することができる。製剤は、種子のコーティングとして、または穀物サイクルの後期段階における根の処理または植物全体の処理として適用することができる。当業者には理解されるように、殺虫剤濃度は、特定の製剤の性質、特に濃縮物であるかまたは直接使用されるかにより大きく変化する。殺虫剤は、少なくとも１重量％含まれていてもよいし、100重量％でもよい。乾燥製剤は殺虫剤を約１〜９５重量％を含み、液体剤型は通常液相中の固体重量として約１〜６０％を含むであろう。製剤は一般的には、１mg当たり約10²〜10⁴個の細胞を含むであろう。これらの製剤は、１ヘクタール当たり約50mg（液状または乾燥状）から１kgまたはそれ以上で投与される。製剤は、鱗翅目の環境、例えば土壌に、噴霧、散布、スプリンクラーなどにより適用することができる。変異株新規な本発明の分離株の変異体は、当分野において既知の方法で作製できる。例えば、胞子形成しない変異株は、新規な分離株のエチルメタンスルホネート（EMS）変異誘導法により得られる。変異体は、紫外光およびニトロソグアニジンを使用して当分野において既知の方法により作製できる。非胞子形成性変異体のうちの数パーセントは、培養時間を延長しても完全なままで溶菌せず、このような株は溶菌マイナス（-）といわれる。溶菌マイナス株は、振とうフラスコ培地で胞子形成しない変異株をスクリーニングし、培養終了時でも完全であり毒素結晶を含んでいる変異株を選択することにより同定できる。溶菌マイナス株は、保護されたカプセル化された毒素蛋白質を作製するための細胞固定法に適している。上述の非胞子形成性変異株のファージ耐性変種を調製するには、ファージ溶菌液の一部を栄養寒天上に広げ乾燥させる。それから、ファージ感受性菌株の一部を直接、乾燥した溶菌液上に置き、乾燥させる。プレートは30℃でインキュベートする。プレートを2日間インキュベートすると、多数のコロニーが寒天上に増殖しているのが観察されるであろう。これらのコロニーのいくつかを拾い上げ、栄養寒天培地上で継代する。これらの耐性であると考えられる株について、ファージ溶菌液をクロスストリークすることにより耐性を試験する。ファージ溶菌液の線をプレート上に引き、乾燥させる。それから、推定耐性培養液を、ファージの線を横切るようにストリークする。30℃で一晩インキュベートした後、耐性菌培養液は、ファージの線を横切るストリーク内で全く溶菌を示さない。それから、栄養寒天プレート上に耐性菌液を播くすることにより、ファージに対する耐性が再確認される。感受性菌も、陽性対照として同様に播く。乾燥後、一滴のファージ溶菌液をプレートの中央に置き、乾燥させる。耐性菌液は、30℃で24時間インキュベートした後、ファージ溶菌液を置いた領域に溶菌を示さなかった。下記は、本発明を実施するための最良の形態を含む方法を例示する実施例である。これらの実施例は、本発明を限定するものとして解釈されるべきはない。特記しない限り、百分率は全て重量に基づき、溶媒混合液の割合は全て容積に基づく。実施例１ー本発明のB.t.分離株の培養新規なB.t.分離株またはその変異株の継代培養液を、下記の培地、ペプトン、ブドウ糖、塩培地に接種するために使用することができる。バクトペプトン（Bacto Peptone） 7.5 g/l ブドウ糖 1.0 g/l KH₂PO₄ 3.4 g/l K₂HPO₄ 4.35 g/l 塩溶液 5.0 ml/l CaCl₂溶液 5.0 ml/l 塩溶液（100 ml） MaSO₄・7H₂O 2.46 ｇ MnSO₄・H₂O 0.04 ｇ ZnSO₄・7H₂O 0.28 ｇ FeSO₄・7H₂O 0.40 ｇ CaCl₂溶液（100 ml） CaCl₂・2H₂O 3.66 ｇ pH 7.2 塩溶液および塩化カルシウム溶液を濾過滅菌し、オートクレーブして加熱したブロスに、接種時に添加した。フラスコを30℃で回転式振とう機で200rpmで64時間インキュベートした。上記の手順は、当分野において既知の方法により大量発酵器へと容易にスケールアップすることができる。上述の発酵により得られたB.t.胞子および／または結晶は、当業者に既知の方法により単離できる。通常使用される方法は、収穫した発酵培地を遠心分離などの分離法に供するものである。実施例２−B.t.分離株の鱗翅目に対する活性下記の株を抗鱗翅目活性について試験そ、下記の結果を得た。スポドプテラ・エキシグアに対するバイオアッセイ法 B.t.培養液を回収し滅菌脱イオン水に再懸濁させた。各培養液の一定量をUSDA昆虫餌（USDA Insert Di et）（Technical Bulletin 1528，U.S．Department of Agriculture，1976）に取り込ませた。24匹のS.エキシグアの幼虫に、この餌を６日間与えた。致死率はこの時点で測定した。トリコプルシア・ナイに対するバイオアッセイ法 B.t.培養液を回収し滅菌脱イオン水に再懸濁させた。各培養の一定量をUSDA昆虫餌上に適用した。餌皿にT. ナイの幼虫を置いた。６日後に致死率を決定した。実施例３−RFLP分析による毒素遺伝子の特徴決定細胞の全DNAを、600nmの吸光度が1.0になるまで増殖させたバチルス・チューリンギエンシス（B.t.）細胞から調製した。細胞を遠心分離により回収し、プロトプラストを20％のショ糖および50mg/mlリゾチームを含有するTES緩衝液（30mM Tris-HCl、10mM EDTA、50mM NaCl,pH=8.0）中で調製した。SDSを最終濃度4％になるよう添加することによりプロトプラストを溶解させた。細胞成分は、4℃で1 00mM（最終濃度）の中性塩化カリウム溶液中で一晩かけて沈澱させた。上清を２回フェノール／クロロホルム（1:1）で抽出した。DNAは、エタノール沈澱させ、塩化セシウム−エチジウムブロマイド勾配を用いた等密度バンドにより精製した。 B.t.細胞から単離された細胞の全DNAを制限酵素で分解し、0.8％(w/v)アガロース−TAE緩衝液（50mM Tris-HCl、20mM NaOAc、2.5mM EDTA,pH＝8.0）を緩衝液としたゲル電気泳動により分離した。ゲルのサザンブロットを、［³²P］放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブ、ATGATTCATGCGGCAGATA（配列番号５）とハイブリダイズさせ、その後洗浄して末結合の放射能を除去した。標準オートラジオグラフィー技術を使用して、ブロットをKODAK X-OMAT（登録商標）フィルムに感光させた。その結果、毒素遺伝子または毒素遺伝子断片に相当する一連のハイブリダイゼーションバンド（フィンガープリント）が得られた。この型の特徴決定法は、独特のDNAフィンガープリントにより各分離株を分類する、制限酵素断片長多型（RFLP）分析として知られる。実施例４−バチルス・チューリンギエンシス株PS91C2由来の新規なCryIF毒素遺伝子の分子クローニングおよび発現細胞の全DNAを、600nmの吸光度が1.0になるまで増殖させたバチルス・チューリンギエンシス（B.t.）細胞から調製した。細胞は遠心分離により沈澱させ、プロトプラスト緩衝液（0.3M ショ糖、25mM Tris-HCl［pH8.0］、25mM EDTA中の20 mg/ml リゾチーム）。３７℃−時間のインキュベート後、プロトプラストを。凍結および融解を２回繰り返すことにより溶解させた。9倍容の0.1M NaCl、0.1％ SDS、0.1M Tris-HClからなる溶液を、完全な溶解液に添加した。清澄にした溶解液を、フェノール：クロロホルムA（1:1）で２回抽出した。核酸は、２倍容のエタノールで沈澱させ、遠心分離でペレットにした。ペレットをTE緩衝液に再懸濁させ、RNaseを最終濃度50μg/mlになるよう添加した。３７℃−時間のインキュベート後、溶液はフェノール：クロロホルムA（1:1）およびTE飽和クロロホルム Aで１回ずつ抽出した。10分の1容の3M NaOAcおよび2倍容のエタノールを添加して、DNAを水相から沈澱させた。DNAを遠心分離によりペレットにし、70％エタノールで洗浄し、乾燥させ、TE緩衝液に再懸濁させた。新規な130kDaの毒素遺伝子の1.58kbp断片を、PS91C2細胞DNAから下記のプライマーを用いたポリメラーゼチェーン反応（PCR）増幅により得た。順方向5'-GAGT GGGAAG CAGATCTTAA TAATGCACAA TTAAGG-3’(配列番号 6)および逆方向5'-ATAC(C またはT)CGATCGATATGATA(GまたはA)TCCGT-3’(配列番号7)である。このDNA断片を、pBluescript S/K（ストラタジーン社（Stratagene）、カリフォルニア州ラホラ（La Jolla））中にクローニングし、シーケネース（Sequenase）（U.S.バイオケミカルズ（U.S.Biochemicals）、オハイオ州クリーブランド（Cleveland ））を用いてジデオキシヌクレオチド配列決定法（サンガー（Sanger）ら、[197 7]Proc，NAtl，Acad．Sci.USA 74:5463-5467）によりDNA配列を決定した。CryIF 遺伝子に特有のDNA配列を、他のCryI遺伝子とのコンピューター比較により同定した。次の配列をもつオリゴヌクレオチドプローブを合成した。5'-CCCAATGTGAA TGTACTTTGCGC-3’(配列番号8)。このプローブを³²Pで放射標識し、PS91C2細胞全 DNAのサザーンブロットの標準的なハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイズしたバンドは、約7.5kbpのHindIII断片を含んでいた。 NdeIIで部分消化したPS91C2 DNAから、遺伝子ライブラリーを構築した。制限酵素部分分解物を、アガロースゲル電気泳動により分画した。9.3から23kbpの大きさのDNA断片を、ゲルから切り出し、ゲル片から電気溶出させ、エルチップＤ（Elutip D）イオン交換カラム（シュライシャー・アンド・シュエル（Schleich er and Schuell）、ニューハンプシャー州キーン（Keene））で精製し、エタノール沈澱により回収した。NdeII挿入配列を、BamHIで消化したラムダージェム-1 1（RambdaGem-11）（プロメガ（Promega）、ウィスコンシン州マジソン）中に連結させた。組換えファージをパッケージングし、大腸菌KW251細胞上に播いた。プラークを、上述した各プローブとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。ハイブリダイズしたファージを、プラーク精製し、標準的な方法（マニアチスら、前記）によりDNAを分離するため大腸菌KW251細胞の液体培養液に感染させるために使用した。 130kDaのCryIF毒素をコードする遺伝子を継代するために、準備的な量のファージDNAをSau3Aで消化し、アガロースゲルで電気泳動した。毒素遺伝子を含む約８kbpのバンドをゲルから切り出し、ゲル片から電気溶出させ、上述のようなイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。精製されたDNA挿入配列を、XhoI で消化したpHTBlueII（pBluescript S/K（ストラタジーン社）および内在B.t.プラスミド由来の複製起点からなる大腸菌／B.チューリンギエンシス・シャトルベクター）に連結させた（D.Lereclusら、[1989]FEMS Microbiol．Lett．60:211-218）。ライゲーション反応液を、凍結コンピテント大腸菌NM522細胞（ATCC 47000）を形質転換するために使用した。β−ガラクトシダーゼ形質転換株を、上述のアルカリ溶解プラスミドミニ調製物を制限分解することによりスクリーニングした。目的のプラスミド構築体、pMYC2361は、殺虫蛋白質を含む他の毒素遺伝子と比較して新規な毒素遺伝子を含む。 pMYC2361を、結晶を形成しない（Cry^-）B.t.宿主、CryB（A.Aronson、パーデュー（Purdue）大学、インディアナ州ウェストラファイエット（West Lafayettt e））にエレクトロポレーションにより導入した。130kDa毒素の発現を、SDS-PAG E分析により示した。実施例3に記述したスクリーニング法により、クローン化された遺伝子の産物のプルテラ・ザイロステラに対する毒性を決定するために、Na Brにより精製した結晶を調製した（Pfannenstiel,M.A.ら、「1984」FEMS Microb iol．Lett．21:39）。CryIF毒素のP.ザイロステラに対するLC₅₀は、5μg／ml餌と決定された。実施例５−毒素遺伝子の植物への挿入本発明の一つの面は、鱗翅目毒素をコードする遺伝子による植物の形質転換である。形質転換された植物は、鱗翅目の攻撃に対して抵抗性である。本明細書に開示される鱗翅目に対して活性な毒素をコードする遺伝子は、当分野において既知の種々の技術を使用して植物細胞へ導入することができる。例えば、外来遺伝子を高等植物へ挿入するための、大腸菌の複製系と形質転換細胞の選択を可能にするマーカーとを含む多数のクローニングベクターが、入手可能である。該ベクターには、例えばpBR322、pUC系、M13mp系、pACYC184などが含まれる。従って、B.t.毒素をコードする配列は、ベクターの適当な制限酵素部位に挿入することができる。得られたプラスミドは、大腸菌の形質転換に使用される。大腸菌細胞を、適当な栄養培地で培養してから回収し溶解させる。プラスミドを回収する。配列決定分析、制限酵素分析、電気泳動、およびその他の生化学的一分子生物学的方法が、一般的に分析法として用いられる。それぞれの操作後、使用されたDNA配列は切断され、次のDNA配列と連結させることができる。各プラスミド配列は、同じプラスミドにクローニングしても、別のプラスミドにクローニングしてもよい。目的の遺伝子を植物に挿入する方法によっては、他のDNA配列が必要な場合もある。例えば、TiプラスミドまたはRiプラスミドを植物細胞の形質転換に使用する場合、TiプラスミドまたはRiプラスミドのT-DNAの、右端および左端のことが多いが、少なくとも右端を、挿入されるべき遺伝子の隣接領域として連結させる必要がある。植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用は、熱心に研究され、欧州特許第0 1 20 516号、「Hoekema（1985）The Binary Plant Vector System，Offset-durkke rij Kanters B.V.,Alblasserdam、第5章」、「Fraleyら、Crit．Rev．Plant Sci ．4:1-46」および「Anら(1985)EMBO J．4:277-287」に十分に開示されている。挿入されたDNAは一旦ゲノムに組み込まれると、比較的安定に存在し、通常再び出てはこない。通常そのDNAは、特にカナマイシン、G 418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、またはクロラムフェニコールのような殺生物剤または抗生物質に対する耐性を形質転換植物細胞に与える選択マーカーを含む。このように、用いられるマーカーはそれぞれ、挿入DNAを含まない細胞より形質転換された細胞を選択できるものでなければならない。数多くの技術が、DNAを植物宿主細胞に挿入するために利用できる。それらの技術には、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスを使用したT-DNAによる形質転換、融合、注入、またはエレクトロポレーション、ならびにその他の可能な方法が含まれる。アグロバクテリアを形質転換に使用する場合は、挿入されるDNAは特別なプラスミド、即ち中間ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングする必要がある。中間ベクターは、Ｔ−DNA中の配列に相同な配列による相同組換えにより、TiプラスミドまたはRiプラスミドの中に組み込むことができる。TiプラスミドまたはRiプラスミドはまた、Ｔ−DNAの移入に必要なvir領域を持つ。中間ベクターはそれ自体はアグロバクテリアにおいて複製できない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドによってアグロバクテリウム・ツメファシエンシスに移入することができる（接合）。バイナリーベクターは、それ自体で大腸菌およびアグロバクテリウムの両方で複製できる。このベクターは、選択マーカー遺伝子、および左右のＴ−DNA境界領域により囲まれているリンカーまたはポリリンカーを含む。このベクターは、直接アグロバクテリア中に形質転換することができる（Holstersら、[1978]Mol．Gen．Genet．163:181-187）。宿主細胞として使用されるアグロバクテリウムは、vir領域を持つプラスミドを含むべきである。vir領域は、Ｔ−DN Aを植物細胞に移入するために必要である。さらにもう一つのＴ−DNAが含まれていてもよい。こうして形質転換された細菌は、植物細胞の形質転換に使用される。植物移植片は、植物細胞へのDNA移入のためのアグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネスを用いて有利に培養することができる。感染した植物材料から（例えば、葉片、茎の一部、根だけでなく、プロトプラストまたは懸濁培養細胞からも）、完全な植物体を、選択用の抗生物質または殺生物剤を含む適当な培地中で再生させることができる。こうして得た植物は、それから、挿入DNAの存在を試験される。注入およびエレクトロポレーションの場合には、プラスミドに特別に要求されることはない。通常のプラスミド、例えばpUC誘導体などを使用することが可能である。形質転換された細胞は植物の内部で通常の方法で増殖する。それは生殖細胞を形成し、形質転換された一つまたは複数の形質を子孫の植物に遺伝させることができる。このような植物は、通常の方法で増殖し、形質転換された同じ遺伝的因子または他の遺伝的因子を持つ植物と交配させることができる。得られたハイブリッドは、類似の形質的特性を有する。実施例６−新規なB.t.遺伝子の昆虫ウイルスへのクローニング数多くのウイルスが昆虫に感染することが分かっている。このようなウイルスには、例えばバキュロウイルスおよびエントモポックスウイルスが含まれる。本発明の一つの態様において、本明細書に開示される鱗翅目に対して活性な遺伝子を、昆虫ウイルスのゲノムと共に存在させ、それによりウイルスの病原性を強化することができる。B.t.毒素遺伝子を含む昆虫ウイルスを構築する方法は既知であり、当業者により容易に実施される。このような手順は、例えば、メリーウェザーら（Merryweather,A.T.,U.Weyer,M.P.G.Hariss,M.Hirst,T.Booth,R.D.Posse e[1990]J.Gen.Virol.71:1535-1544）、およびマーテンスら（Martens,J.W.M.,G. Honee,D.Zuidema,J.W.M.van Lent,B.Visser,J.M.Vlak[1990]Appl．Environment al Microbial．56(9):2764-2770）に開示されている。本明細書に記載された実施例および態様は、単に説明を目的とするためのものであるということ、また、それらを参照することにより種々の修飾または改変が当業者に示唆されるであろうが、それらも本願の精神および範囲、および添付の請求の範囲に含まれるものであるということが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ナーバケネスイー. アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴカミニトミラデルマー 12123 (72)発明者シェネフエイチ．アーネストアメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴヘンデルコート 7954 (72)発明者シュワブジョージイー. アメリカ合衆国カリフォルニア州エンシニタスウォーナットビュー 1351

Claims

【特許請求の範囲】１．害虫を、鱗翔目の抑制に有効な量のバチルス・チューリンギエンシスPS91 C2、または該分離株の胞子、結晶もしくは毒素、または鱗翔目の害虫に対する活性を保持しているそれらの変異体と接触させることを含む、鱗翔目害虫を抑制する方法。２．実質的に完全なバチルス・チューリンギエンシス分離株または鱗翔目害虫に対する活性を保持しているそれらの変異体が、実質的に完全な細胞が標的害虫の環境に適用された際の殺虫活性を延長するように処理されている、請求項1記載の方法。３．バチルス・チューリンギエンシスPS91C2、またはその変異体、または該分離株の胞子もしくは結晶を殺虫剤用担体と共に含む、物質組成物。４．鱗翔目害虫に対する活性を有する実質的に純粋な毒素蛋白質であって、さらに（a）該毒素のアミノ酸配列が配列番号27に示された一般式に適合するという特徴、（b）該毒素のアミノ酸配列が毒素91C2と少なくとも75％の相同性を有するという特徴、（c）該毒素をコードするDNAが蛋白質91C2の全部または一部をコードするDNA とハイブリダイズするという特徴、（d）該毒素をコードするDNAが配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24および配列番号26、ならびに配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23または配列番号25をコードするDNAからなる群より選択されるプローブとハイブリダイズするという特徴、（e）毒素91C2と免疫反応性の抗体と免疫反応性であるという特徴、および（f）該毒素のアミノ酸配列が毒素91C2と少なくとも約450の配列値（alignmen t value）を有するという特徴、からなる群より選ばれる少なくとも一つの特徴を有する、実質的に純粋な毒素蛋白質。５．配列番号27に示される一般式に適合する、請求項4記載の毒素。６．請求項4記載の毒素において、該毒素のアミノ酸配列が毒素91C2と少なくとも約450の配列値（alignment value）を有する、毒素。７．請求項4記載の毒素において、該毒素をコードするDNAが毒素91C2の全部または一部をコードするDNAとハイブリダイズする、毒素。８．請求項4記載の毒素において、該毒素をコードするDNAが配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24および配列番号26、ならびに配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23または配列番号25をコードするDNAからなる群より選択されるプローブとハイブリダイズする、毒素。９．蛋白質91C2と免疫反応性の抗体と免疫反応性である、請求項4記載の毒素。１０．配列番号4に示された配列から本質的になるアミノ酸配列を有する、請求項4記載の毒素。１１．請求項4で定義されたバチルス・チューリンギエンシス毒素をコードする単離されたポリヌクレオチド。１２．配列番号4に示されたアミノ酸配列をコードするDNAを含む、請求項11記載の単離されたポリヌクレオチド。１３．配列番号3に示された配列から本質的になるヌクレオチド配列を含む、請求項11記載のポリヌクレオチド。１４．害虫を鱗翔目の抑制に有効な量の請求項1で定義された毒素と接触させることを含む、鱗翔目害虫を抑制する方法。１５．請求項4記載の毒素をコードするヌクレオチド配列により形質転換された宿主。１６．配列番号4のアミノ酸配列を有する毒素蛋白質をコードするヌクレオチド配列により形質転換されている、請求項15記載の形質転換された宿主。１７．配列番号3のヌクレオチド配列を発現するように形質転換されている、請求項15記載の形質転換された宿主。１８．鱗翔目害虫に対して活性な、バチルス・チューリンギエンシスPS91C2およびその変異体から得られるヌクレオチド配列によりコードされる毒素。