JPH10504964A

JPH10504964A - 家族性型ヒトアミロイド前駆タンパク質を発現するトランスジェニック動物

Info

Publication number: JPH10504964A
Application number: JP8508912A
Authority: JP
Inventors: シン，グルパーカシユ; チエン，ハワード・ワイ; ヘブンズ，ロバート・ピー; シリナスシンジ，ダリプ・ジエイ・エス; スミス，デイビツド・ダブリユ; トラムバウアー，マーナ・イー; フアン・デル・プルーヒ，レオナルドス・ハー・テー; ボンズ，アウラワン; ツエン，ヒユーイ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1994-09-01
Filing date: 1995-08-28
Publication date: 1998-05-19
Also published as: US6211428B1; EP0778886A1; EP0778886A4; WO1996006927A1; CA2198451A1

Abstract

(57)【要約】ヒトアミロイド前駆タンパク質をコードする遺伝子を有するトランスジェニックマウスを提供する。このトランスジェニックマウスは、アルツハイマー病及び他の認識障害に影響を与える化合物の評価に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称家族性型ヒトアミロイド前駆タンパク質を発現するトランスジェニック動物発明の分野本発明は、トランスジェニックマウスにおけるヒトアミロイド前駆タンパク質の家族性アルツハイマー病（Ｖ−Ｉ）変異体の脳特異的発現に関する。図面の簡単な説明図１．ヒトＴｈｙ−１プロモーターをコードする７．１ｋｂＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメント、ヒトＡＰＰ７５ＩＦＡＤ（Ｖ−Ｉ）ｃＤＮＡ及びＳＶ４０由来３′フランキング配列の概略図。シグナルペプチド（Ｓｐ）、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ）及びβＡ４ドメインを含むＡＰＰ関連領域並びにＶ−ＩＦＡＤ突然変異の位置を示す。プライマーの位置は矢印で示されている。プライマーを６６ｂｐＳＶ４０小型ｔイントロン（物理的地図中の刻み目）をはさむようにして用い、ＲＴ−ＰＣＲによりＡＰＰ７５１ＦＡＤｍＲＮＡから３１９ｂｐフラグメントを増幅した。図２．ＡＰＰ７５１ＦＡＤ始祖のＲＮＡ分析。上のパネル：ＡＰＰ７５１ＦＡＤトランスジェニック（Ｔｇ）マウス及び同年齢の非トランスジェニック（ＮＴｇ）Ｆ１マウスのノーザーンブロット分析。脳（Ｂ）、腎臓（Ｋ）及び腸（Ｉ）由来のポリＡ⁺ｍＲＮＡ試料（約４μｇ）をＭＯＰＳホルムアルデヒドゲル上で分離し、ナイロン膜に移した。ＲＮＡを³²Ｐ標識トランスジーン特異的ＳＶ４０配列とハイブリダイズさせた。顕著な脳特異的発現が１４．２系統のＦ１トランスジェニック動物に認められた。７．２系統と９．３系統のトランスジェニック動物では、低レベルの発現しか認められなかった。下のパネル：ノーザーンブロットを３２Ｐ標識β−アクチンプローブとハイブリダイズさせ、種々のレーンにロードしたポリＡ⁺ｍＲＮＡの相対量を予測した。図３．ＡＰＰ７５１ＦＡＤのＲＴ−ＰＣＲ分析。潅流させたトランスジェニック動物（１４．２系統）の種々の組織由来の全ＲＮＡ１μｇを逆転写し、次いで、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。増幅産物を０．８％アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜にブロットし、ＳＶ４０配列とハイブリダイズさせた。脳には顕著なＡＰＰ７５１ｍＲＮＡの発現が見られたが、殆どの他の組織では極く僅かな発現しか得られなかった。図４．ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＡＰＰ７５１ＦＡＤＲＮＡの局在。コンピューターで作成した典型的なｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションＸ線フィルムオートラジオグラムの偽配色像（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｌｏｒｉｍａｇｅｓ）は、トランスジェニックマウスの脳の種々の領域におけるヒトＡＰＰ７５１ＦＡＤｍＲＮＡの発現を示している。１４．２系統〔吻（ｒｏｓｔｒａｌ）から尾（ｃａｕｄａｌ）まで;標識したＡ、Ｂ、Ｃ〕；９．３系統（Ｅ、Ｆ、Ｇ）；及び７．２系統（Ｉ、Ｊ、Ｋ）。ｍＲＮＡの最高レベルの発現は１４．２系統に属するマウスの脳に認められた。発現は脳全体にわたっていたが、皮質（Ｃ）と海馬（ｈ）に特に集中して見られた。扁桃体（ａｍ）、上丘（ｓｃ）の表層及び中心灰白質（ｃｇ）でも高レベルのｍＲＮＡが認められた。他の領域、例えば、視床下部内側視神経交差前方領域（ｍｐｏ）及び弓形核（ａｒｃ）、外側中隔（ｌａｔｅｒａｌｓｅｐｔｕｍ；ｌｓ）並びに尾状被殻（ｃｐ）に低レベルの発現が認められた。１４．２系統（Ｄ）、９．３系統（Ｈ）及び７．２系統（Ｌ）から脳切片を採取し、³⁵Ｓで標識した（「アンチセンス」プローブと相補的な）対照「センス」プローブとハイブリダイズさせたときには、ｍＲＮＡシグナルは得られなかったが、このことは、標識したアンチセンスヒトＡＰＰ７５１ＦＡＤｍＲＮＡプローブを用いて得られるＲＮＡシグナルの特異性を示している。図５．ウエスターンブロッティングによるＡＰＰ７５１（Ｖ−Ｉ）タンパク質の分析。種々のトランスジェニック動物（９１−９５）及びヒト特異的抗体（Ａｂ）６Ｅ１０〔Ｋｉｍら，（１９９０）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７，１１３−１２２；Ｋｉｍら，（１９８８）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２，１２１−１３０〕を有する非トランスジェニック対照動物（９６、９７）由来の脳タンパク質溶解物のウエスターンブロッティング。一番上のパネルは、６Ｅ１０Ａｂとの反応性を示し、真中のパネルは、ヒト及びマウスのＡＰＰを認識するＣＴ１５Ａｂとの反応性を示し、一番下のパネルは、 β−チューブリン対照Ａｂとの反応性を示す。動物９５（１４．２系統のトランスジェニック動物）は、マウス中で発現した５００ｋｂのＹＡＣから誘導されたヒトＡＰＰタンパク質〔標識されたＹＡＣ；Ｌａｍｂら，（１９９３）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ５，２２−３０〕と同等レベルの大量のＡＰＰ７５１タンパク質を発現する。ＣＴ１５パネル中のＮ＋Ｏは、９５系統動物における完全修飾グリコシル化７５１タンパク質を表す。９．３系統及び７．２系統の動物（それそれ、９１、９２及び９３、９４）は、より低レベルのＡＰＰタンパク質を有していた。図６．マウスの脳におけるＡＰＰ７５１ＦＡＤの発現。ヒトＡＰＰ遺伝子を過発現するトランスジェニックマウスの脳を分析した。ヒトＡＰＰ（クローン２２Ｃ１１，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ；希釈度１：２０）のＮ末端に対するモノクローナル抗体を用い、ＡＰＰ７５１ＦＡＤトランスジェニック１４．２始祖（１８ケ月齢）の脳の皮質及び海馬において高度に免疫反応性のニューロンを検出した。非トランスジェニック対照（１５ケ月齢）はこの染色パターンを示さなかった。染色度は、年齢に関連するようであった。トランスジェニックマウスのニューロンにおけるこのようなＡＰＰ免疫反応性の集積物は、見たところ顆粒状沈着物のようであった。図７．ＦＡＤＡＰＰ７５１の４３アミノ酸β−Ａ４ドメインは太字で示され、Ｖ−Ｉ置換はボックスで囲まれている。発明の背景アルツハイマー病（ＡＤ）は、６５歳以上の人々に不均衡に作用する神経障害である。この障害の頻度は、６０〜６５歳では１％未満、７５歳では５％であるが、８５歳になると４７％と高くなる。６５歳以上の人々の全ての痴呆症例の６０％〜８０％はＡＤに起因する。患者は、認識機能及び記憶の低下を示す。ＡＤには適当な診断法も有効な治療法も存在しない。ＡＤの正確な判定には、脳の生検又は剖検が必要である。ＡＤの成因は不明であるが、ＡＤの発症には、遺伝的、免疫的且つ環境的要素が関わっている。ＡＤの主徴には、老人斑の存在、並びに、新皮質、海馬及び関連構造物中の神経原線維のもつれやおびただしい神経損失が含まれる。老人斑は、グリア、星状膠細胞及び異栄養性神経突起のかさ輪の周囲のβ−アミロイド核を含む細胞外沈着物からなっている。β−アミロイド沈着は新皮質の血管壁中に存在する。老人斑の主成分は、βＡ４と称される４ｋＤａペプチドであり、このペプチドは１２０ｋＤａという大きなアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）からタンパク質分解により切り出される。老人斑の他の成分には、ユビキチン、アミロイドＰ、ＡｐｏＥ、インターロイキン−１及びα−１−アンキモトリプシンが含まれる。ＡＤにβＡ４が関与することを裏付ける生物学的証拠に加えて、ＡＰＰとＡＤの関連を示唆する強力な遺伝子データが存在する。ＡＤに関与する遺伝子の位置は、ダウン症候群患者を分析することにより解明される。この患者の場合、第２１染色体のトリソミーがＡＤの早期発症の原因である。ダウン症候群患者の核型を分析すると、関与する遺伝子は第２１染色体長腕の上部にマッピングされた。この領域は、ＡＰＰ遺伝子を含む数個の遺伝子をコードしている。ダウン症候群患者におけるＡＤの早期発症（〜３５歳）は、第２１染色体長腕上の原因マーカーの遺伝子量（ｇｅｎｅｄｏｓａｇｅ）の増大が、殆どのＡＤ患者に認められる神経病理学的症状の成因であり得ることを示唆している。大多数のＡＤ症例は散発性のようであるが、早期発症の家族性ＡＤ（ＦＡＤ）も数例報告されている。ＦＡＤ家族の遺伝子を分析することにより、該障害は、第２１染色体長腕上にマッピングされ、ＡＰＰ遺伝子に近接する常染色体優性遺伝子欠損として遺伝することが証明された。これらの知見は、ダウン症候群患者を分析して得られた遺伝子データと符合する。ＡＤの早期発症がＡＰＰ遺伝子のエクソン１７における７１７位のアミノ酸の突然変異（Ｖａｌ−Ｉｌｅ）の存在と密接に関連するＦＡＤ家族も数例同定された。ＡＰＰの膜貫通ドメイン内のこの突然変異はＦＡＤと共に受け継がれる。ＡＰＰ７１７ＦＡＤに罹患した家族が異なる人種起源（英国人、日本人及びカナダ人）であることから、これらのＡＤ症例にＦＡＤ遺伝子が関与することは確かである。この突然変異は、散在性ＡＤ患者、ダウン症候群患者、後期発症家族性ＡＤの対照個人にも、殆どの他の早期発症ＦＡＤ症例の対照個人にも存在しない。ＡＰＰ遺伝子中に、他のＦＡＤ家族におけるＡＤの発症を説明し得るいくつかのさらなる突然変異が存在することが確認されている。５例の異なる早期発症ＡＰＰ７１７ＦＡＤ家族における遺伝子的証拠は、これらのＦＡＤ家族のＡＰＰ７１７遺伝子がＡＤの進行経路に直接関与するという仮説を裏付けるものである。ＡＰＰ遺伝子は、長さが約４００ｋｂの、細胞−細胞間相互作用に関与し得るグリコシル化された膜貫通タンパク質をコードする。ＡＰＰ遺伝子は、代替スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇ）により少なくとも５つの異なるＡＰＰ転写体を形成する１９以上のエクソンを有している。主要な転写体は、６９５、７５１及び７７０個のアミノ酸のタンパク質（ＡＰＰのこれら主要形態はそれぞれ、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０と称される）をコードする。ＡＰＰ６９５転写体は脳に豊富である。ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０ｍＲＮＡ種をコードする転写体は末梢組織で優位である。３種のアイソフォームは全て４２アミノ酸βＡ４ドメインを含んでいる。ＡＰＰアイソフォーム７５１及び７７０は、Ｋｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ）をコードする追加の５６アミノ酸挿入体を含んでいる。ＡＰＰは、タンパク質分解により少なくとも２つの経路で代謝される。第１経路は、βＡ４ドメインのＬｙｓ１６とＬｅｕ１７の間に位置するα−セクレターゼ切断部位に関連し、タンパク質分解によるこの部位での切断が、アミロイド形成性βＡ４物質の形成を阻止する。第２経路は、タンパク質分解により全長ＡＰＰ分子のβ−セクレターゼ切断部位及びγ−セクレターゼ切断部位で切断して完全形のアミロイド形成性βＡ４（３９−４２アミノ酸）を生成させる。ＡＤ患者に見られるβＡ４を有する老人性沈着物は、老齢のヒトや、非ヒト霊長類、北極クマ及びイヌを含む他の老齢哺乳動物にも認められる。しかし、通常、実験用のラット及びマウスのような他の老齢哺乳動物にはβＡ４沈着物は生成されない。費用効果の高い、ヒトの病理発生の模擬体となる実験用動物モデルが存在しないために、ＡＤの神経病理学の理解及びＡＤ治療剤の開発が遅れている。トランスジェニック技術がこの問題に対する適当な代替法となり得る。高レベルのヒトＡＰＰ又はその成分を産生する遺伝子構築物をマウス中枢神経系の鍵領域に付加して、ＡＤ表現型に似た神経病理学的変化を引き起こし得る。トランスジェニック囓歯類動物モデルにヒトＡＤのあらゆる特徴を同時に生じさせることは不可能かも知れないが、該疾患の重要な特徴を適切なトランスジェニック動物モデルに生じさせることは可能であると思われる。従って、本発明の目的は、ヒトＦＡＤＡＰＰ７５１（Ｖ−Ｉ）アイソフォームの過発現により神経病理学的症状を示すトランスジェニックマウスを提供することである。ＦＡＤＡＰＰ７５１（Ｖ−Ｉ）アイソフォームは、家族性ＡＤに罹患している患者の脳で特異的に過発現し、従って、他の人々によって樹立されたものとは異なる有用且つ新規な動物モデルである。本発明のトランスジェニックマウスは、ＡＤの進行を段階的に追跡し得るので、ＡＤの新たな標的の同定に有用である。本発明のマウスは、神経機能不全に関与するＦＡＤＡＰＰ７５１（Ｖ−Ｉ）の作用に影響を与える化合物や、βＡ４沈着物の形成及び／又は βＡ４機能に影響を与える化合物の同定に用い得る。ＦＡＤＡＰＰ（Ｖ−Ｉ）タンパク質中のアミノ酸を置換すると、ＡＰＰタンパク質の正常な機能が変わり、それによってＡＤの早期発症が引き起こされると考えられる。このように、突然変異タンパク質におけるＡＰＰのプロセシング及び／又はＡＰＰ機能の変化がこれらの症例のＦＡＤの原因となり得る。トランスジェニックマウスで、ヒトアミロイド前駆タンパク質のセグメント又は全長の野生型タンパク質を発現させようとする試みは成功を納めている。マウスでの種々の野生型の全長の及びトランケートしたＡＰＰｃＤＮＡアイソフォームの発現を概説する多くの論文が発表されている〔Ｋａｍｍｅｓｈｅｉｄｔら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，１０８５７−１０８６１；Ｓａｎｄｈｕら，（１９９１）Ｊ．Ｂｊｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２１３３１−２１３３４；Ｑｕｏｎら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２，２３９−２４１；Ｗｉｒａｋら，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，３２３−３２５；Ｋａｗａｂａｔａら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５４，４７６−４７８；国際公開第ＷＯ９３／０２１８９号，Ｎｅｖｅ，Ｒ．（発明者）〕。しかし、ＡＤ用のトランスジェニックマウスを作出しようとするこれら過去の試みは実質的に失敗に帰した。その主な理由の一つは、これらの刊行物のいずれにおいても、研究者が、（i）マウス脳でのｃＤＮＡ構築物から発現された全長の組換えヒトＡＰＰタンパク質の高レベル発現、（ii）脳におけるＡＰＰタンパク質沈着物、又は（iii）神経病理学的症状を再現可能に確認していないからである〔Ｊｕｃｋｅｒら，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，１４４３−１４４５；Ｗｉｒａｋら，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，１４４５；Ｍａｒｘ，（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５，１２００−１２０２；Ｋａｗａｂａｔａら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５６，２３ページ〕。強力なニューロン特異的プロモーターを用いて、ＡＤの家族性型（ＡＰＰ７１７）を表すＡＰＰ７５１（Ｖ−Ｉ）ｃＤＮＡを過発現させることは、他の人々によって試みられたことはなく、本明細書に記載の動物モデルのユニークな態様である。本発明のマウスは、ウエスターンブロッティングによりＡＰＰ７５１ＦＡＤタンパク質の高定常状態発現、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる中枢神経系でのＡＰＰｍＲＮＡのユニークな分布及び神経内タンパク質ＡＰＰＦＡＤ凝集物のユニークな沈着を示すという点で他のマウスと異なっている。本発明のこれらの特徴は、ニューロンのβＡ４免疫反応性凝集物の同定とあいまって、この分野の研究において過去に請求されたものの範囲を越えている。該疾患は、ＦＡＤが早期に発症するという点で老年期のＡＤとは異なる。従って、本明細書に呈示されているモデルはＡＤのユニークな態様を表わすものである。発明の要旨６９８位のアミノ酸のバリンがイソロイシンに置換された家族性型ＡＰＰ７５１アイソフォーム（ＡＰＰ７５１アイソフォームのナンバリング；ＡＰＰ７７０アイソフォームのナンバリングに基づきＡＰＰ７１７として既に導入されている）を脳特異的に発現するトランスジェニックマウスを提供する。本発明のトランスジェニックマウスは、ＡＤ及び中枢神経系関連障害の研究に用いることができる。発明の詳細な説明６９８位のアミノ酸のバリンがイソロイシンに置換された家族性型ＡＰＰ７５１アイソフォーム（ＡＰＰ７５１アイソフォームのナンバリング；ＡＰＰ７７０アイソフォームのナンバリングに基づきＡＰＰ７１７として既に導入されている）を脳特異的に発現するトランスジェニックマウスを提供する。本発明のトランスジェニックマウスは、ＡＤ及び中枢神経系関連障害の研究に用いることができる。本明細書中の「動物」という用語は、ヒトを除く全ての脊椎動物を含むものとして用いられる。また該用語は、胚期及び胎児期を含む全発育段階の動物個体をも含む。「トランスジェニック動物」とは、マイクロインジェクション（顕微注入）又は組換えウイルス感染によるような細胞下レベルでの任意の遺伝子操作により直接間接に受容した遺伝情報を有する１個以上の細胞を含む動物である。導入されたこのＤＮＡ分子は、染色体内に組み込まれるか、又は染色体外でＤＮＡを複製し得る。「生殖細胞系トランスジェニック動物」という用語は、遺伝情報が生殖系細胞に導入され、それによって該情報を子孫に伝達する能力が付与されたトランスジェニック動物を指す。そのような子孫が実際に該情報の一部又は全てを有している場合、該子孫もまたトランスジェニック動物である。上記遺伝情報は、レシピエント（受容動物）が属する動物種に対して異種であるか、特定のレシピエント個体に対してのみ異種であるか、又は既にレシピエントが保有している遺伝情報であり得る。この最後の例では、導入された遺伝子は本来の内因性遺伝子とは異なったものとして発現し得る。該遺伝子は、ゲノム源から遺伝子を単離することにより、単離されたｍＲＮＡの鋳型からｃＤＮＡを作製することにより、特異的合成により、又はそれらの任意の組合わせにより、得ることができる。構造遺伝子を発現させるためには、該遺伝子を機能的にプロモーターと結合させる必要がある。特定の組織又は特定の発育期に対して遺伝子発現を増大、減少、調節又は指示するためにプロモーター／調節配列を用い得る。プロモーターは天然プロモーターである必要はない。本発明の好ましい実施態様では、ヒトＴｈｙ−１（ｈＴｈｙ−１）プロモーターを用いる。ｈＴｈｙ−１プロモーターは脳内で優先的に目的遺伝子を発現させる〔Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊら，（１９８７）Ｃｅｌｌ，５０，４４５−４５２〕。本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、非ヒト動物の生殖系に「トランスジーン」を導入して作出される。一般に、細胞中にＤＮＡを導入し得る方法が利用可能であり、このような方法は当業界において周知であるが、特定タイプのトランスジェニック動物の作出には実験が必要である。種々のトランスジーン導入法を用いることができる。一般に、マイクロインジェクション法では、接合体が最適な標的である。マウスでは、雄性前核は直径が約２０μｍの大きさにもなり、それによって１〜２ｐＬのＤＮＡ溶液の再現可能な注入が可能になる。接合体を遺伝子移入の標的として用いると大きな利点が得られ、殆どの場合、注入されたＤＮＡは最初の切断前に宿主遺伝子に取り込まれる〔Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，４４３８−４４４２〕。その結果、トランスジェニック非ヒト動物の殆ど全ての細胞が組み込まれたトランスジーンを保有する。一般に、これによって生殖細胞の５０％がトランスジーンを有することになるので、始祖から子孫へのトランスジーンの伝達も効率的に行われるであろう。本発明の実施に際しては、トランスジーンの組込みには接合体のマイクロインジェクションが好ましい方法である。また、レトロウイルス感染を用いて非ヒト動物にトランスジーンを導入することも可能である。発育中の非ヒト胚は胞胚期までｉｎｖｉｔｒｏで培養し得る。この時期には、割球がレトロウイルス感染の標的となり得る〔Ｊａｅｎｉｃｈ，Ｒ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７３，１２６０−１２６４〕。効率的な割球感染は、酵素処理して透明帯を除去することにより得られる〔Ｈｏｇａｎら，（１９８６），ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．〕。トランスジーンの導入に用いられるウイルスベクター系は、典型的にはトランスジーンを保有する複製欠陥レトロウイルスである〔Ｊａｈｎｅｒら，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，６９２７−６９３１；ＶａｎｄｅｒＰｕｔｔｅｎら，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，６１４８−６１５２〕。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することにより容易且つ効率的に行われる〔ＶａｎｄｅｒＰｕｔｔｅｎ，前掲；Ｓｔｅｗａｒｔら，（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：３８３−３８８〕。あるいは、もっと後の時期に感染させてもよい。ウイルス又はウイルス産生細胞は胞胚腔に注入し得る〔Ｊａｈｎｅｒら，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ２９８；６２３−６２８〕。殆どの始祖動物では、トランスジェニック非ヒト動物を形成する細胞のサブセットでのみ取り込みが起こるので、トランスジーンについてモザイクとなる。さらに、始祖動物は、ゲノムの多様な位置にトランスジーンのレトロウイルス挿入体を含む可能性がある。これらは一般に子孫に受け継がれる。さらに、妊娠中の胚に子宮内でレトロウイルス感染させることにより、例え低効率ではあっても、トランスジーンを生殖系に導入することも可能である〔Ｊａｈｎｅｒら，（１９８２），前掲〕。トランスジーンを導入するための第３のタイプの標的細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞はｉｎｖｉｔｒｏで培養した移植前の胚から得られる〔Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９２，１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．ら，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３０９，２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒら，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，９０６５−９０６９；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２２，４４５−４４８〕。トランスジーンは、ＤＮＡトランスフェクション又はレトロウイルス仲介遺伝子導入により効率的にＥＳ細胞に導入し得る。その後で、得られた形質転換ＥＳ細胞を非ヒト動物由来の胞胚と合わせることができる。ＥＳ細胞は胚に定着し、得られたキメラ動物の生殖系に寄与する〔総説については、Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，１４６８−１４７４参照〕。導入されたＤＮＡの存在及びその発現を評価する方法は容易に入手し得、当業界において周知である。そのような方法には、外来性ＤＮＡを検出するＤＮＡ（サザーン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を検出するウエスターンブロットが含まれるがそれらには限定されない。該方法には、アミロイド前駆タンパク質及びアルツハイマー病関連病因を検出する免疫学的方法及び組織化学的方法が含まれる。本明細書に用いられている「トランスジーン」とは、以下に記載の方法によるような人的介入により非ヒト動物の生殖系に導入されるＤＮＡ配列である。ＡＤの治療に用い得る化合物は、これらのトランスジェニックマウスにおいて、ＡＰＰの神経変性作用を阻止する能力、ＡＰＰの発現を阻止する能力又は神経栄養化合物若しくは他の神経活性化合物を評価する能力を、他の感受性マーカー（即ち、サイトカイン、アポリポタンパク質過発現及びノックアウト、プロテアーゼインヒビター、血清アミロイドタンパク質、ＮＧＦ受容タンパク質並びにプリオンタンパク質トランスジェニックマウス）となる種々の遺伝子バックグラウンド若しくはトランスジーンと組み合わせて測定することにより検出し得る。そのような化合物は、医薬上許容し得る組成物を製造するための公知方法に従って処方される。そのような組成物は、種々の標準的な経路で患者に投与し得る。以下の実施例は例示を目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１ニューロン特異的ヒトＴｈｙ−１プロモーターを用いたヒトＡＰＰ７５１ＦＡＤ発現ベクターの構築Ａ．ヒトＴｈｙ−１配列及びＳＶ４０配列を含むプラスミドｐＨＺ０２４の構築ヒトＴｈｙ−１プロモーターとＴｈｙ−１遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンとを含むｐＢＳＨＴ１の３．７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢｇｌIIフラグメントを、ｐＴＺ１８ｕのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化してｐＨＺ０２０を作製した。導入を望む新規コード配列からのＡＴＧを、最初の翻訳開始部位をコードするようにＴｈｙ−１プロモーターの下流に導入するには、Ｔｈｙ−１遺伝子由来のＡＴＧ翻訳開始コドンの除去が必要であった。従って、（ＡＴＧ翻訳開始コドンをコードする）ｐＢＳＨＴ１の１．６ｋｂＢａｍＨＩ−ＢｇｌIIフラグメントをｐＴＺ１８ｕのＢａｍＨＩ部位にサブクローン化して、ｐＨＺ０２１ａを作製した。開始コドンを不活化（ｓｉｌｅｎｃｅ）し、都合の良いクローニング部位を付加するために、鋳型としてのｐＨＺ０２１ａと、２０マー（Ｔ７；５′プライマー）オリゴヌクレオチド及び７３マー（ｏＨＺ００２；破壊されたＡＴＧ及び数カ所の都合の良いクローニング部位を含む３′プライマー）オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマーｏＨＺ００２では、ＡＴＧ翻訳開始コドンが突然変異を起こしており、ＨｉｎｄIII制限酵素部位で置換されていた（以下に記載の配列参照；ＨｉｎｄIII制限酵素部位は太字で示され、突然変異した残基には下線が施されている）。１．３ｋｂの増幅産物中に下線を付した残基を組込むと、ＡＴＧが破壊された（イタリック体で示されている非改変相補鎖中のＣＡＴ）が、ＨｉｎｄIII部位（太字体）が形成された。１．３ｋｂの増幅産物中の０．３ｋｂのＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメントをＮｃｏＩ−ＸｂａＩ消化ｐＨＺ０２０につないで改変型Ｔｈｙ−１プロモーターを再構成した。得られたベクターをｐＨＺ０２２と称する。Ｔｈｙ−１プロモーターの下流のこのプラスミドに、ｐＳＶ２ｎｅｏ〔ｐＨＺ０２３；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＢｅｒｇ，（１９８２）Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７〕のＳＶ４０小型ｔイントロンの上流のＳｍａＩ制限酵素部位にＢｇｌIIリンカーを挿入するステップ、及び、ＳＶ４０小型ｔイントロン及びポリアデニル化部位を含む１．０ｋｂのＢｇｌII−ＢａｍＨＩを分離し、これをＢｇｌII消化ｐＨＺ０２２につなぐステップからなる２ステップ手順で、ＳＶ４０配列を挿入した。得られたプラスミドｐＨＺ０２４において、多目的クローニング部位によってＳＶ４０配列からニューロン特異的ヒトＴｈｙ−１プロモーターを分離して、所望の遺伝子又はそのセグメントの挿入を可能にする。Ｂ．ＡＰＰ７５１ＦＡＤ発現ベクター、ｐ４の構築プラスミドＤＡ−１２（ＭｏｕｎｔＳｉｎａｉＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅのＮ．Ｒｏｂａｋｉｓ博士及びＭＲＬ，ＷｅｓｔＰｏｉｎｔのＲ．Ｓｗａｎｓｏｎ博士から恵与された）を制限酵素で消化して、後発性ＦＡＤ突然変異（Ｖ−Ｉ）を有する全長のヒトＡＰＰ７５１ｃＤＮＡをコードする２．７ｋｂのＳｍａＩ−ＣｌａＩ制限フラグメントを得た。ＳｍａＩ−ＣｌａＩ制限酵素フラグメントの末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑にした。該フラグメントをｐＨＺ０２４（ｐＨＺ０２４は、ＸｈｏＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いてＸｈｏＩ部位を平滑にした）に連結した。このようにして、ヒトＡＰＰ７５１ｃＤＮＡ（Ｖ＞Ｉ）をｈＴｈｙ−１プロモーターの制御下におき、その３′末端にＳＶ４０小型ｔイントロン及びポリＡ付加部位をフランキングした。得られたプラスミドをｐ４と称する。プラスミドｐ４のＡＰＰ７５１ｃＤＮＡ挿入体のコード配列のヌクレオチド配列を完全に確認して、全アミノ酸配列が予想通りであり、全長のポリペプチドを発現することを確実にした。ＡＰＰ７５１のｍＲＮＡの３ ′非コード延長配列に７９ｂｐの欠失が認められた。接合体へのマイクロインジェクション用に、ＣｓＣｌ勾配上でｐ４発現ベクターを精製し、単一のＸｂａＩ制限酵素部位で消化し、ＥｃｏＲＩで部分制限酵素消化して、フランキングプラスミド配列を含まない７．１ｋｂフラグメント、Ｔ−ＡＰＰ７５１ＦＡＤを得た。該７．１ｋｂフラグメントを、１０ｎｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む分取用１％低融点アガロースゲル上で精製した。ＤＮＡを短波長の紫外光に最小限暴露して視覚化し、７．１ｋｂバンドを切り出し、６５〜７０℃で融解、フェノール／クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）中でエタノール沈殿させ、前もってリンスしておいた０．２μｍ酢酸セルロースフィルターを介して濾過した。その後、ヒトＴｈｙ−１プロモーターを連結したヒトＡＰＰ７５１ＦＡＤｃＤＮＡ、ＳＶ４０小型ｔイントロン及びポリＡ付加配列を含む精製した７．１ｋｂ線状ＤＮＡを顕微注入した（図１）。宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中のプラスミドｐ４試料を、ブダペスト条約下、に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２，ＵＳＡに寄託し、受託番号が与えられた。制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ改変用酵素は全てＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．から入手した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）又は二本鎖ＤＮＡＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＢＲＬ，Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡの配列決定を行った。ＡＢＩＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、モデル番号３８１Ａ上でオリゴデオキシヌクレオチドを合成した。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ− Ｅｌｍｅｒ，Ｃｏｒｐ．に従って行った。実施例２ヒトＴｈｙ−１プロモーターの制御下のヒトアミロイド前駆タンパク質を含むトランスジェニックマウスの作出ヒトＴｈｙ−１プロモーターの制御下にヒトＡＰＰ７５１ＦＡＤｃＤＮＡを含む実施例１のｐ４ＤＮＡ構築物を、過剰排卵Ｂ６ＳＪＬ雌から得た単一細胞受精マウス胚の前核に顕微注入した。このマイクロインジェクション用に最適なＤＮＡ濃度は、マウス胚に顕微注入した遺伝子構築物の数種の希釈液を用いた毒性テスト実験から経験的に得られたＬＤ₅₀値であった。このＬＤ₅₀値は７．５ ×１０^-9μｇであることが判明した。次いで、７．５×１０^-9μｇのＤＮＡを注入した胚を手術により偽妊娠レシピエントマウスの輸卵管に再移植し、出産日まで生育させた。３〜４週目に、ＤＮＡ（サザーン）分析用に尾から約１ｃｍをクリップして生後の尾試料を採取し、トランスジーンの存在を確認した。剖検及び／又は生検を行って、組織化学的実験及び発現実験用の組織標本を集めた。実施例３トランスジェニックマウスの分析Ａ．ＤＮＡ分析プロテイナーゼＫ溶解法を用いて尾試料から抽出したゲノムＤＮＡをＤＮＡ蛍光定量法により定量した。約７ｍｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲル上でサイズ分離した後、ＤＮＡをサザーンブロッティングによりナイロン膜に移した。フィルターをトランスジーン特異的³²Ｐ標識ＳＶ４０配列とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの試薬、５０％デキストラン硫酸、１．２％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌの変性・音波処理サケ精子ＤＮＡ及び０．１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）中６５℃で行った。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中室温で１５分間、次いで、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中６５℃で２〜３時間行った。増感板を用い、−７０℃で最大５日間、フィルターをＸ線フィルムに露出した。同一アガロースゲル中で同時移動する既知量の線状化ｐ４ベクターを用い、トランスジェニック子孫由来の７μｇのゲノムＤＮＡについてトランスジーンのコピー数を測定した。プローブを用いて検出できたマウスゲノム中のトランスジーンは僅か０．１コピーであった。適切なトランスジェニック始祖を飼育して子孫を産ませた。３匹のトランスジェニック始祖に、７．２、９．３及び１４．２の番号をつけた。これら３匹の始祖のトランスジーンコピー数は、始祖７．２及び１４．２のＦ１後代では１〜５の範囲であり、始祖９．３のＦ１後代では６〜１０の範囲であった。Ｂ．ＲＮＡ分析Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉの方法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９〕を用い、脳、肝臓、肺、腎臓、脾臓、腸、心臓、胸腺及び骨格筋を含むマウス組織から全ＲＮＡを単離した。よって概説された方法に従い、ミニオリゴ（ｄＴ）セルローススピンカラムキットを用いて全ＲＮＡからポリＡ⁺ｍＲＮＡを精製した。ＭＯＰＳ−ホルムアルデヒドゲル上、５ボルト／ｃｍで３〜４時間室温で緩衝液を常時再循環させながら約４μｇのポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを分離した。実験後、臭化エチジウム染色によりＲＮＡを視覚化した。染色後、ゲルをＤＥＰＣ処理水中で繰り返しリンスして過剰のホルムアルデヒドを除去した。ＲＮＡの有効な移動を確実にするために、ゲルを５０ｍＭＮａＯＨ及び１０ｍＭＮａＣｌに２０分間浸し、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で３０分間中和した。最後に、ＲＮＡを２０×ＳＳＣ中でナイロン膜に移した。ＡＰＰ７５１ＦＡＤトランスジェニック転写体を同定するために、フィルターをトランスジーン特異的ＳＶ４０配列とハイブリダイズさせた。１４．２トランスジェニック系列の脳では、ＡＰＰ７５１ＲＮＡの発現レベルが他のトランスジェニック試料の１０倍以上に増大したことが認められたが、対照脳試料ではトランスジーンの発現は全く認められなかった（図２）。さらに、トランスジェニック動物由来の他の組織ではＡＰＰトランスジーンの発現は検出されず、これは、ｈＴｈｙ−１プロモーターのニューロン特異的発現を示している。ノーザーンブロット分析でＡＰＰ７５１ｃＤＮＡを検出し得るということは、ＲＮＡが中枢神経系中で豊富に発現されることを示している。過去の報告は逆転写酵素ＰＣＲ法に基づいていたが、これは、トランスジーンの発現が低レベルであるためと思われる。Ｃ．ＲＴ−ＰＣＲＡＰＰトランスジェニック動物のトランスジェニックｍＲＮＡを速やかに分析するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイをさらに用いて、ＦＡＤＡＰＰ７５１の発現について、種々の組織から単離した全ＲＮＡを分析した。血液による組織の汚染を回避するために、生理的食塩水を潅流させたトランスジェニック動物からＲＴ−ＰＣＲ分析用の全ＲＮＡを調製した。ヒト胎盤ＲＮアーゼインヒビターの存在下４２℃で少なくとも１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。５１９−５プライマー（CGGGCTCTCCTGATTATTTATCT；配列番号３）及び５１９−３プライマー（AAAGGCATTCCACCA CTGCT; 配列番号４）及びＧｅｎｅＣｅｔｕｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）成分の存在下に製造業者の指示に従ってＰＣＲ増幅を行った。プライマー（図１、物理的地図下の矢印）を６６ｂｐの小型ｔイントロン（図１；物理的地図中の刻み目）をはさみ込むように設計して、ＲＮＡ調製物を汚染し得るＤＮＡを含むイントロンからスプライスしたｍＲＮＡ増幅物を分離し、ｍＲＮＡからＲＮＡ前駆転写体を排除した。増幅プロフィールは、９５℃で２分間のインキュベーションを１サイクル、９５℃で１分間及び６０℃で１分間のインキュベーションを３５サイクル、並びに６０℃で７分間の延長インキュベーションサイクルを含むものであった。増幅はＢｉｏｓサーマルサイクラー中で行った。ＰＣＲ産物をＴｒｉｓ酢酸− ＥＤＴＡ緩衝液中の１．５％アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、ＳＶ４０配列とハイブリダイズさせた（図３）。独立に作出された３種のトランスジェニック系列（７．２、９．３及び１４．２；図３には１４．２系列のみを示す）のＦ２後代由来の脳試料中に、予想したＲＮＡ由来３１９ｂｐフラグメントが産生された。非トランスジェニック対照脳試料由来のＲＮＡには増幅シグナルは認められなかった。Ｄ．ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション動物を安楽死させ、無菌条件下に脳を素早く取り出し、直ちにドライアイス上のイソペンタン中−３５℃で冷凍し、−７０℃で貯蔵した。次いで、冠又は矢状切片（〜１０μｍ）をクリオスタット（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）中−１８〜− ２０℃で切断した。切片を解凍して「ＰｒｏｂｅＯｎ」スライド（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にのせ、完全に（約１時間）風乾し、０．１Ｍリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）中４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、ＰＢＳで２分間リンス、脱脂し、エタノール系列（５０、７０及び９５％）で脱水（各５分間）、９５％エタノール中４℃で貯蔵した。ヒトＡＰＰ７５１ｍＲＮＡに特異的な「アンチセンス」オリゴヌクレオチドプローブは４０塩基長であり、ヒトＡＰＰ遺伝子の１１３８−１１７７塩基（5 ′-ACT GGC TGC TGT TGT AGG AAT GGC GCT GCC ACA CAC GG CC-3′；配列番号５）〔Ｐｏｎｔｅら，（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ，３３１，５２５−５２７〕と相補的であった。該プローブをＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡ合成装置（３９４型）上で合成し、８％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素分取用配列決定ゲル上で精製した。該プローブを、Ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験に用いると、ヒト及びサルの脳切片ではＡＰＰ７５１のハイブリダイゼーションシグナルが検出されたが、マウス脳切片では検出されず、これは、該プローブのヒトＡＰＰ７５１特異性を示している（マウスＡＰＰ７５１との交差ハイブリダイゼーションはない）。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（２５単位；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用い、１Ｍカコジル酸カリウム、１２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ｐＨ６．６）及び２５ｍＭ塩化コバルトを含む反応緩衝液中、３７℃で１５分間、ＡＰＰ７５１プローブを、３０：１モル比の［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ：オリゴヌクレオチド中の［³⁵Ｓ］デオキシアデノシン５′−（α−チオトリホスフェート）（［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ）（１４１５Ｃｉ／ｍＭ）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）で３′ 末端標識した。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０スピンカラムを用い、放射性標識したオリゴヌクレオチドを、非標識ヌクレオチドから分離し、その溶出液に２μｌの１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて、硫黄残基による架橋結合を防止した。数種の標識反応液中の標識化ＡＰＰ７５１オリゴヌクレオチドプローブの比活性は、１．２〜２．３×１０⁹ｃｐｍ／μｇの範囲で異なっていた。既に記載された方法〔Ｓｉｒｉｎａｔｈｓｉｎｇｈｊｉら，（１９９０），Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，３４，６７５−６８６；Ｓｉｒｉｎａｔｈｓｉｎｇｈｊｉ及びＤｕｎｎｅｔｔ（１９９３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇｉｎｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｈａｒｉｆ，ＮＡ編），４３−７０〕と実質的に同じ方法で、マウス脳切片のハイブリダイゼーションを行った。簡単に言えば、切片をアルコールから取り出して約１時間風乾し、５０％脱イオン化ホルムアミド、４×クエン酸ナトリウム塩水溶液（ＳＳＣ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの試薬、２００μｇ／ｍｌ酸−アルカリ変性サケ精子ＤＮＡ、１００μｇ／ｍｌの長鎖ポリアデニル酸、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０％デキストラン硫酸及び４０ｍＭＤＴＴを含む１００ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液中、０．４〜１．０×１０⁶ｃｐｍの³⁵Ｓ標識プローブと共にインキュベートした。非特異的ハイブリダイゼーションを明確にするために、スライドに隣接して固定した切片を、過剰（×１００）濃度の非標識オリゴヌクレオチドプローブの存在下に標識オリゴヌクレオチドプローブと共に又は同一領域由来のセンスプローブと共にインキュベートした。該切片の上にパラフィルムカバースリップをそっとのせ、これを湿潤容器に入れ、３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、切片を１×ＳＳＣ中５７℃で１時間洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ、７０％及び９５％エタノール中で簡単にリンスして風乾し、次いで、ＡｍｅｒｓｈａｍＨｙｐｅｒｆｉｌｍ、β−ｍａｘＸ線フイルムに２〜１７日間露出した。１４．２始祖（１４．２．５．１３、１４．２．３．２５及び１４．２．３．５７）からの３匹の動物及び２匹の対照非トランスジェニック同腹子マウス（１４．２．５．１２及び１４．２．３．２６）並びにトランスジェニック７．２系統及び９．３系統の動物及びその非トランスジェニック同腹子からの切片のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。全３匹のトランスジェニック動物由来のハイブリダイズ切片のオートラジオグラム（２日間露出）は、脳全体に濃厚で均質なＡＰＰ７５１ｍＲＮＡの発現を示した。発現は、全ての皮質領域（前頭葉前部、帯状、前頭、後頭、梨状領域）及び海馬（歯状回、ＣＡ３、ＣＡ２、ＣＡ１野及び扁桃体）で特に豊富であった。濃厚ではあっても比較的弱い発現が、中隔、尾状被殻及び視床に認められた（図４）。（１）１００倍過剰の非標識オリゴヌクレオチドの存在下に標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた３匹のトランスジェニック動物からの隣接させた切片はハイブリダイゼーションシグナルを与えず、（２）標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた対照非トランスジェニック動物（１４．２．３．２６及び１４．２．５．１２）からの切片は脳のどの領域でもハイブリダイゼーションシグナルを与えず、（３）センスプローブとのハイブリダイゼーションによっても検出可能なシグナルを与えなかったことを示す結果（図４）から、ｍＲＮＡシグナルの特異性が証明された。Ｅ．ウエスターンブロッティングによるＡＰＰタンパク質の検出ヒトＡＰＰ７５１タンパク質は、これらのトランスジェニックマウス由来の脳溶解物のウエスターンブロッティングによっても同定された（図５）。同定されたＡＰＰ７５１タンパク質の量は、内在性マウスＡＰＰ７５１タンパク質の量と等しかった（詳細については図面の説明を参照のこと）。Ｆ．免疫組織化学マウスを十分に麻酔し、次いで、順次、生理的食塩水、及び０．１Ｍリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドを心臓を介して潅流させた。脳を取り出し、１時間４％パラホルムアルデヒド中で後固定し、次いで、４℃で、０．１ＭＰＢＳ中の３０％スクロースに入れ、脳が衰弱（ｓｉｎｋ）したら、イソペンタン中−３５℃で冷凍し、切片作製時まで−７０℃で貯蔵した。クリオスタット（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）で切片（２０ｍＭ）を作製し、不凍液中−２０ ℃で貯蔵した。切片を不凍液から取り出し、ＰＢＳ及びトリトンＸ１００（０．３％）を５回取り換えて洗浄した。切片を正常なヤギ血清（ＰＢＳ及びトリトン中３％）中で９０分間インキュベートしてバックグラウンド染色を阻止した。次いで、切片を、合成β−アミロイド（１−４０）ペプチド（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）に対するウサギポリクローナル抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。再び、切片をＰＢＳ及びトリトン（３×５分）で十分に洗浄し、次いで、標準的なアビジン−ビオチン複合体法（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）を用い免疫染色した。染色した切片を、風乾し、Ｄｅｐｅｘにはめ込んだゼラチンサブベッド上に固定した。Ｂ−ＡＰＰ（クローン２２Ｃ１１、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）のＮ末端に対する市販のモノクローナル抗体は、１８ケ月齢のＡＰＰ７５１ＦＡＤマウスの皮質及び海馬（ＣＡ３−ＣＡ１）のニューロンを強く染色した。この染色パターンは均質ではなく、ニューロン及び神経突起では顆粒状に見えた。ニューロン内βＡＰＰ免疫反応性のこの沈着様集積は、対照の非トランスジェニックマウスでは見られなかった（図６）。実施例４細胞培養本発明のトランスジェニック動物は細胞培養用の細胞源として用いることができる。トランスジェニックマウスの脳組織を、直接ＤＮＡ若しくはＲＮＡを分析するか又は遺伝子によって発現したタンパク質について脳組織をアッセイしてヒトアミロイド前駆タンパク質の存在について分析する。遺伝子を保有する脳組織の細胞の培養には、当業界で周知の標準的培養法を用いることができる。実施例５スクリーニングアッセイヒトアミロイド前駆タンパク質の発現を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する化合物についてのスクリーニングには、トランスジェニック動物及び該動物由来の細胞を用いることができる。調節は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はタンパク質又はそれらの組合わせを含み（但し、これらには限定されない）、多様なレベルで起こり得る。家族性型のヒトアミロイド前駆タンパク質ＡＰＰ７５１をコードする遺伝子を含む細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物においてヒトアミロイド前駆タンパク質の発現を調節する化合物の能力を決定する１つの方法は、（ａ）トランスジェニック動物を該化合物で処理するステップ、（ｂ）処理した動物においてヒトアミロイド前駆タンパク質の発現又は凝集を測定するステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）の測定値を対照と比較するステップからなる。トランスジェニック動物由来の細胞においてヒトアミロイド前駆タンパク質の発現を調節する化合物の能力を決定する方法は、（ａ）該細胞を該化合物で処理するステップ、（ｂ）処理した細胞においてヒトアミロイド前駆タンパク質の発現又は凝集を測定するステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）の測定値を対照と比較するステップからなる。実施例６関連するＦＡＤＡＰＰ７５１ β−Ａ４配列のヌクレオチド配列４３アミノ酸のβ−Ａ４ドメインは太字で強調され、Ｖ−Ｉ置換はボックスで囲まれている（図７）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者チエン，ハワード・ワイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ヘブンズ，ロバート・ピーイギリス国、エセツクス・シー・エム・ 20・２・キユー・アール、ハーロウ、イーストウイツク・ロード、ターリングス・パーク（番地なし) (72)発明者シリナスシンジ，ダリプ・ジエイ・エスイギリス国、エセツクス・シー・エム・ 20・２・キユー・アール、ハーロウ、イーストウイツク・ロード、ターリングス・パーク（番地なし) (72)発明者スミス，デイビツド・ダブリユイギリス国、エセツクス・シー・エム・ 20・２・キユー・アール、ハーロウ、イーストウイツク・ロード、ターリングス・パーク（番地なし) (72)発明者トラムバウアー，マーナ・イーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者フアン・デル・プルーヒ，レオナルドス・ハー・テーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ボンズ，アウラワンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ツエン，ヒユーイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．家族性型ヒトアミロイド前駆タンパク質ＡＰＰ７５１をコードする遺伝子を含む細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物。２．哺乳動物である、請求項１に記載の動物。３．囓歯類動物である、請求項１に記載の動物。４．マウスである、請求項１に記載の動物。５．ヒトアミロイド前駆タンパク質をコードする遺伝子がヒトＴｈｙ−１プロモーターの下流に存在する、請求項１に記載の動物。６．マウスである、請求項５に記載の動物。７．トランスジーンがｐ４（ＡＴＣＣ）である、請求項６に記載のマウス。８．家族性型ヒトアミロイド前駆タンパク質を含む、請求項４に記載の動物由来の細胞系。９．ヒトアミロイド前駆タンパク質の活性を調節する化合物の能力を決定する方法であって、（ａ）トランスジェニック動物を該化合物で処理するステップ、（ｂ）処理した動物においてヒトアミロイド前駆タンパク質の発現又は凝集を測定するステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）の測定値を対照と比較するステップからなる前記方法。１０．請求項９に記載の方法で同定された化合物。１１．トランスジェニック動物由来の細胞においてヒトアミロイド前駆タンパク質の活性を調節する化合物の能力を決定する方法であって、（ａ）該細胞を該化合物で処理するステップ、（ｂ）処理した細胞においてヒトアミロイド前駆タンパク質の発現又は凝集を測定するステップ、及び（ｃ）ステップ（ｂ）の測定値を対照と比較するステップからなる前記方法。１２．請求項１１に記載の方法で同定された化合物。