JPH10505094A

JPH10505094A - オリゴヌクレオチドプロドラッグ

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Publication number: JPH10505094A
Application number: JP8509709A
Authority: JP
Inventors: アイヤー，ラドハクリシュナン・ピー; ユ，ドン; アグラワル，サディール; デブリン，テレサ
Original assignee: Hybridon Inc
Current assignee: Aceragen Inc
Priority date: 1994-09-07
Filing date: 1995-09-07
Publication date: 1998-05-19
Also published as: AU3675195A; EP0779893B1; WO1996007392A2; ATE202569T1; CA2199464A1; DE69521517D1; EP0779893A2; WO1996007392A3; DE69521517T2

Abstract

(57)【要約】少なくとも６つの共有結合したヌクレオチドを含み、そのうちの少なくとも一つが、５'リン酸、３'リン酸、またはインターヌクレオチドリン酸結合に可逆的に共有結合した親油性の化学基で誘導体化されている、オリゴヌクレオチドプロドラッグが開示される。このプロドラッグは、該誘導体化ヌクレオチドから該親油性基を開裂し、かくして親オリゴヌクレオチドを再生する細胞内または組織の酵素と反応性である。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドプロドラッグ発明の背景本発明は、アンチセンス療法に関する。さらに詳しくは、本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを促進させる組成物および方法に関する。細胞および外来遺伝子の発現を調節しうる新たな化学療法剤が開発されている。これら化学療法剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれ、標的核酸分子にワトソン−クリックまたはフーグスティーン塩基対形成則により結合する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、そうして結合することによって該標的の機能を下記幾つかの機構のうちの一つによって妨害する：正常な転写、スプライシングまたは翻訳に必要な因子の結合を妨害することによって；ＲＮアーゼによるＲＮＡの酵素分解を引き起こすことによって、または該アンチセンスオリゴヌクレオチドに直接結合した反応基を介して該標的を破壊することによって。それゆえ、これらアンチセンスオリゴヌクレオチドは遺伝子発現配列を特異的に抑制するために広く用いられる研究手段となりつつあり、化学療法剤としての使用の可能性が探索されている(たとえば、リシーウィッツ(Ｌisciewicz)ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａca d.Ｓci.(ＵＳＡ)(１９９３)９０：３８６０〜３８６４；ベイエバー(Ｂayever) ら、(１９９２)Ａntisense Ｒes.Ｄevelopment２：１０９〜１１０参照)。アンチセンス分子が治療学的価値を有するためには、それが細胞内に入り込み、標的の内生核酸分子と接触する能力を有することが必要である。さらに、アンチセンス分子は細胞および／または生体の高度のヌクレオチド分解環境の苛酷さに耐えることができなければならない。最近の研究によれば、人為的なインターヌクレオチド結合などのある種の修飾を有するオリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドをヌクレオチド分解に対して耐性にするのみならず(たとえば、アグラワル(Ａgrawal)ら(１９８８)Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)８５：７０７９〜７０８３；アグラワルら(１９８９ ) Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)８６：７７９０〜７７９４；ガオ(Ｇao)ら(１９９０)Ａntimicrob.Ａgents Ｃhem.３４：８０８；およびストレイ(Ｓtorey)ら (１９９１)Ｎucleic Ａcids Ｒes.１９：４１０９)、細胞による該オリゴヌクレオチドの取り込みをも増大させることが示されている。たとえば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドに比べて一層速やかに細胞に結合し、細胞により取り込まれることがわかっている(ザオ(Ｚhao)ら(１９９３)Ａntisense Ｒes.Ｄev.３：５３〜５６)。オリゴヌクレオチドの取り込みは飽和しうるものであり、配列に依存せず、温度およびエネルギーに依存する。そのような取り込みは８０,０００ダルトンの膜タンパク質を介して起こることを示唆する幾つかの証拠が存在するが(ローク( Ｌoke)ら(１９８９)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)８６：３４７４；ヤクボフ(Ｙakubov)ら(１９８９)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)８６：６４５４)、このタンパク質の遺伝子は未だクローニングも特徴付けもされていない。一つの研究は、オリゴヌクレオチドのインターナリゼーションがエンドサイトーシスによるよりも陥没性の(caveolar)プロトサイト機構(protocytotic mechanism)によるものであることを示唆している(ザメクニック(Ｚamecnick)(１９９４)Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)９１：３１５６)。オリゴヌクレオチドのインターナリゼーションが受容体を介したエンドサイトーシス経路によるのか、ピノサイトーシス機構によるのか、それとも両者の組み合わせによるのかについては殆どわかっていない。細胞による取り込みを改善するために、オリゴヌクレオチドはまた上記以外の仕方で修飾されている。たとえば、少なくとも一つのヌクレオチド残基がその２ '位でアミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、糖、リン酸化糖、神経伝達物質、ホルモン、シクロデキストラン、デンプン、ステロイドまたはビタミンを含む種々の分子と結合した、細胞による取り込みの改善されたオリゴヌクレオチドが開示されている(ＷＯ９３／２３,５７０)。アビジンの存在下でのビオチン化オリゴヌクレオチドの細胞取り込みの促進もまた示されている(パードリッジ(Ｐardr idge) ら(１９９１)ＦＥＢＳＬett.２８８：３０〜３２)。さらに、ホスホジエステル結合したオリゴデオキシヌクレオチドが孔形成剤のストレプトリシンＯにより細胞中に導入されており(バリー(Ｂarry)ら(１９９３)Ｂiotechniques１５：１０１６〜１０１８)、カチオン性脂質を含むリポソーム調製物がヒト細胞間接着分子の一部に対して標的したアンチセンス分子の細胞による取り込みを促進することが示されている(ベネット(Ｂennett)ら(１９９２)Ｍol.Ｐharmacol.４１：１０２３〜１０３３)。５'−コレステリル修飾したホスホジエステル結合オリゴヌクレオチドは、増大した細胞取り込みおよび生物学的効果を示す(クリーグ(Ｋri eg)ら(１９９３)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)９０：１０４８)。さらに、抗体標的したリポソームが、ＨＩＶ感染細胞によるＨＬＡクラスＩ分子に対して標的したオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進するのに用いられている(ゼルファティ(Ｚelphati)ら(１９９３)Ａntisense Ｒes.Ｄev.３：３２３〜３３８ )。医薬として有用な特定の非オリゴヌクレオチド性の代謝的に不安定な分子が前駆体または「プロドラッグ」の形態で調製されており、該分子は標的器官または細胞内で化学的または酵素を媒体として変換を受けて治療学的分子を放出することができる(ブンドガール(Ｂundgaard)、バイオ−リバーシブル・キャリヤーズ・イン・ドラッグ・デザインシオリー・アンド・アプリケーション(Ｂio−rever sible Ｃarriers in Ｄrug Ｄesign.Ｔheory and Ａpplication)(ロシュ(Ｒoche )編)ペルガモン・プレス、ニューヨーク(１９８７)１３〜９４頁参照)。たとえば、ピバムピシリン、タラムピシリン、およびバカムピシリンなどのβ−ラクタム抗生物質のカルボキシル基にアシルオキシアルキルエステル型の基を結合させてアンピシリンのプロドラッグ誘導体が形成されている(たとえば、デーネ(Ｄae hne)ら(１９７０)Ｊ.Ｍed.Ｃhem.１３：６０７；ボディン(Ｂodin)ら(１９７５) Ａntimicrob.Ａgents Ｃhemother.８：５１８；クレイトン(Ｃlayton)ら(１９７６)Ｊ.Ｍed.Ｃhem.１９：１３８５参照)。９−[２−(ホスホノメチルオキシ)エチル]アデニン(ＰＭＥＡ)(スタレット(Ｓtarrett)ら(１９９４)Ｊ.Ｍed.Ｃhem. ３７：１８５７〜１８６４)やホスホノホルメート三ナトリウム(ホスカーネットナトリウム(foscarnet sodium))(アイアー(Ｉyer)ら(１９８９)Ｔetrahedron Ｌ ett. ３０：７１４１〜７１４４)などの抗ウイルス剤のホスホネートプロドラッグが経口アベイラビリティーを増加させるために調製されている。リン酸基をＮ−ホスホメチルジペプチドに結合させて亜鉛プロテアーゼニュートラルエンドペプチダーゼ(抗高血圧症剤)のプロドラッグが形成されている(デュ・ロンベール(Ｄe Ｌombaert)ら(１９９４)Ｊ.Ｍed.Ｃhem.３７：４９８〜５１１)。酪酸の抗癌プロドラッグが調製されている(ヌーデルマン(Ｎudelman)ら(１９９４)Ｊ.Ｍed.Ｃ hem.３５：６８７〜６９４)。加えて、５−ヨード−２'−デオキシウリジン−５ '−ジホスフェートのジホスフェート類似体からなる抗ヘルペスプロドラッグが報告されている(イェニングスら(Ｊennings)(１９９２)Ｊ.Ｃhem.Ｓoc.Ｐerkin Ｔrans.Ｉ：２１９６〜２２０２)。しかしながら、これまでのところアンチセンスオリゴヌクレオチドのプロドラッグは存在せず、修飾オリゴヌクレオチドおよび非修飾オリゴヌクレオチドの不充分な取り込みがインビトロおよびインビボの両方で問題であった。それゆえ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みおよび代謝的安定性を促進するための改良された組成物および方法に対する必要性が依然として存在する。そのような促進は、最終的にアンチセンスオリゴヌクレオチドの効能の上昇および使用すべき投与量の減少をもたらすであろう。理想的には、そのような組成物および方法はまた、オリゴヌクレオチドの一般的な脂質溶解度を上昇させるうえでも有用であろう。発明の要約本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みおよび代謝的安定性を高めるための、および該オリゴヌクレオチドの細胞でのおよび一般的なインビボ脂質溶解度を増大させるための、改良された組成物および方法を提供する。細胞による取り込みが促進され、経口アベイラビリティーが上昇し、除放または制御放出特性を有し、毒性が低下し、生理学的な関門を乗り越える能力が増大したアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボでの半減期および細胞内への取り込みは、これらオリゴヌクレオチドを親油性の化学基で可逆的に誘導体化することによって促進しうることがわかった。オリゴヌクレオチドに親油性基を共有結合することにより、誘導体化されていない親分子に比べて該オリゴヌクレオチドのイオン性が減少し、細胞膜を経由した輸送を一層受けやすくなる。いったん細胞または生体内に入ったら、該誘導体化オリゴヌクレオチドから該親油性基が内生の酵素によって開裂され、それによって親のオリゴヌクレオチドが再生される。この発見を生かして、合成の可逆的に誘導体化したアンチセンスオリゴヌクレオチドすなわち「オリゴヌクレオチドプロドラッグ」およびその使用法を開発した。本発明の一つの側面において、オリゴヌクレオチドプロドラッグが提供される。本明細書において「オリゴヌクレオチドプロドラッグ」とは、複数のヌクレオチドが３'→５'、５'→３'、３'→３'、５'→２'、２'→５'、２'→３'、または３'→２'にて共有結合したオリゴヌクレオチド分子であって、該オリゴヌクレオチドを一層親油性に導く化学基でマスキングまたは誘導体化することによって親分子に比べて脂質膜の通過を容易にしたものをいう。さらに、「プロドラッグ」の形態のオリゴヌクレオチドは親分子に比べて分解を受けにくいが、親分子と同様に相補的なヌクレオチド配列を有する他の核酸にハイブリダイズすることができる。細胞、組織あるいは生体内のある種の酵素と接触すると、該プロドラッグは開裂された親オリゴヌクレオチドを再生する。オリゴヌクレオチドプロドラッグは少なくとも６つの共有結合したヌクレオチドを含む。これらヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、該ヌクレオチドの５ 'リン酸または３'リン酸、またはインターヌクレオチドリン酸結合に可逆的に共有結合した親油性の化学基で誘導体化されている。本明細書において「ヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチド、および環式糖および／または修飾塩基を有する類似体を含むその類似体、およびリボキシヌクレオチドおよびその類似体をいう。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドプロドラッグは「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」である、すなわち、少なくとも一つのリボヌクレオチドまたはその類似体、および少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドまたはその類似体を含む。一つの特定の態様において、リボヌクレオチド類似体は２−Ｏ−メチルなどの２−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドである。ヌクレオチドに結合した親油性基としてはエステルまたはアミドが挙げられ、プロドラッグは細胞もしくは組織の酵素と反応して該酵素は該誘導体化ヌクレオチドから親油性基を開裂する。好ましい態様において、親油性基がエステルを含む場合には該酵素はエステラーゼであり、親油性基がアミドである場合には該酵素はホスホルアミダーゼである。ヌクレオチドに共有結合した親油性化学基は、アルキル、アリール、アラルキル、複素環基、脂肪酸、ステロイドエステル、またはステロイドアミドである。幾つかの好ましい態様において、１を越えるヌクレオチドが誘導体化されている場合には、該ヌクレオチドに結合した化学基はこれら親油性基の混合物であってよい。他の好ましい態様において、親油性化学基は、該ヌクレオチドの３'リン酸または５'リン酸上またはインターヌクレオチドリン酸上の硫黄、酸素またはアミン基に、または該ヌクレオチド上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、またはリン酸エステル基に結合する。他の態様において、オリゴヌクレオチドプロドラッグは「キメラ」である。本明細書において「キメラ」とは、１を越える種類のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドをいう。一つの特定の態様において、オリゴヌクレオチドプロドラッグは、ホスホジエステル、カルバメート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アセトアミデート、ホスホルアミデート、ホスホジエステル、アルキルホスホネート、カーボネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミダイト、またはカルボキシメチルエステル、または非修飾オリゴヌクレオチドの基本糖およびインターヌクレオシド部分と等配電子の(isosteric)類似体などの、少なくとも２つの異なるヌクレオチドからなる。他の態様において、オリゴヌクレオチドプロドラッグは分枝していてよい、すなわち３'および／または２'末端を介して結合した２つのオリゴヌクレオチド配列を含んでいてよい。本発明はまた、オリゴヌクレオチドプロドラッグを含む医薬製剤をも提供する。幾つかの態様において、この医薬製剤はウイルス核酸中の領域に相補的なオリゴヌクレオチドプロドラッグを含み、該プロドラッグに加えて他の抗ウイルス剤をも含む。一つの特定の態様において、該医薬製剤中のオリゴヌクレオチドプロドラッグはウイルス核酸の第一の領域に相補的であり、抗ウイルス剤は該第一の領域とは重複しない該ウイルス核酸の第二の領域に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに他の態様において、該医薬製剤は経口的に許容しうる担体を含む。外来オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みおよび細胞内濃度を増加させる方法もまた本発明によって提供される。この方法においては、細胞を上記医薬製剤で処理または接触させる。いったん細胞内に入り込むと、細胞内の酵素が可逆的に誘導体化されたヌクレオチドから該プロドラッグ上の親油性基を開裂し、それによってオリゴヌクレオチドプロドラッグから親オリゴヌクレオチドを再生する。このようにして、該オリゴヌクレオチドの細胞内濃度が上昇する。幾つかの好ましい態様において、親油性基はエステラーゼまたはホスホルアミダーゼにより開裂されうる。本発明の他の側面において、ウイルス感染に対して細胞を処理する方法、または細胞のウイルス感染を防止する方法が提供される。この方法においては、ウイルスの核酸中の一部に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプロドラッグに細胞を接触させる。該オリゴヌクレオチドプロドラッグは細胞内に入り込み、そこでエステラーゼまたはホスホルアミダーゼが親油性化学基を誘導体化ヌクレオチドから開裂し、それによって親オリゴヌクレオチドが放出される。ついで、該オリゴヌクレオチドはウイルス核酸の相補的部分にハイブリダイズする。かくして、本発明は偶然感染した細胞培養株を処置するための有用な組成物を提供する。本発明による組成物を用いることによって、細胞からウイルスまたはマイコプラズマ汚染を排除することができる。さらに他の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドの細胞内またはインビボでの脂質溶解度およびバイオアベイラビリティーを増加させる方法を提供する。この方法においては、オリゴヌクレオチドを修飾して該オリゴヌクレオチドに比べて脂質溶解度およびバイオアベイラビリティーが一層高いオリゴヌクレオチドプロドラッグを形成させる。上記のように、本発明のプロドラッグは少なくとも６つの共有結合したヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドのうちの少なくとも一つは親油性化学基が可逆的に共有結合した５'リン酸、３'リン酸、またはインターヌクレオチドリン酸結合を有し、該親油性化学基は細胞のエステラーゼまたはホスホルアミダーゼにより開裂されうる。図面の簡単な説明本発明の上記側面および他の側面、その種々の特徴、並びに本発明そのものは、添付の図面とともに以下の記載を読んだときに一層完全に理解される。該図面において：図１は、オリゴヌクレオチドプロドラッグからオリゴヌクレオチドへの変換を示す一般化した反応式の模式図である、ここで「Ｚ」は官能基、「Ｘ」はＯ、ＳまたはＮＲ(Ｒはアルキルまたはアリール)、ＹはＯまたはＳ、Ｒはアルキル、アリール、アラルキル、複素環基、脂肪酸、またはステロイド、「Ｒ”」は分枝基、および「Ｑ」はＯやＳなどのヘテロ原子であるかまたは共有結合である；図２は、同じ親オリゴヌクレオチドを生成する異なるオリゴヌクレオチドプロドラッグの種々の親油性基に対する酵素の作用を示す模式図である；図３は、ステロイド骨格の一般構造を示す模式図であり、該ステロイドは該ステロイド上のいずれの部位においてもＺ（アミドまたはエステル）を介してヌクレオチドに結合できる；図４は、アシルオキシアルキルエステル型プロドラッグ１の生体内活性化によりオリゴヌクレオチド５を生成することを示す模式図である；図５は、ヨードアルキルアシレート１０ａ−ｄの表示およびヨードアルキルアシレート１０ａ−ｄによるＲ_p２またはＳ_p２の処理によりＳ−アルキルジヌクレオシド、ホスホロチオエート３ａ−３ｄを生成することを示す模式図である；図６は、ｄ(ＴｐｓＴ)エステル３ａ−ｃが加水分解して化合物４および親オリゴヌクレオチド２を生成することを示す模式図である；図７Ａは、ヒト血清によるＲ_p３ｂの加水分解の逆相ＨＰＬＣでの経時プロフィルの収集であり、矢印は保持時間を分で表してある；図７Ｂは、ヒト血清によるＳ_p３ｂの加水分解の逆相ＨＰＬＣでの経時プロフィルの収集であり、矢印は保持時間を分で表してある；図８は、ＰＳ／ＰＯ含有親オリゴヌクレオチド(Ａ)、オリゴヌクレオチドプロドラッグ(Ｂ)、およびエステラーゼとともに２４時間インキュベートした後のオリゴヌクレオチドプロドラッグ(Ｃ)のポリアクリルアミドゲルの³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトルおよびオートラジオグラムを示す；および図９は、親オリゴヌクレオチド(レーン１および３)、プロドラッグオリゴヌクレオチド(レーン２および４)、およびエステラーゼとともに３６時間インキュベートした後のプロドラッグオリゴヌクレオチドのオートラジオグラムである。好ましい態様の詳細な説明本明細書中に引用する特許および科学文献は当業者に利用可能な知識を確立するものである。発行された米国特許、許された出願、およびそれらに引用された文献は参照のため本明細書中に引用する。アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現のインヒビターとしてその治療学的作用を発揮するには、それらが細胞によって取り込まれ、インターナリゼーションされる必要がある。しかしながら、かかるオリゴヌクレオチドがポリイオン性であったり高分子量であったりすると、脂質膜を通過する能力は低下する。負の電荷の少ないオリゴヌクレオチドは細胞によって一層効率的に取り込まれることが知られている(テンサマニ(Ｔemsamani)ら(１９９４)Ａntisense Ｒes.Ｄe v.４：３５〜４２)。本発明は、脂質膜を経由したオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを改善することによって、必要なアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療の効能を高め、投与量を減少させる方法を提供する。このアプローチにおいて、標的器官、組織または細胞内またはその近傍で酵素による変換を受けることによって機能性の親アンチセンスオリゴヌクレオチドを放出するようにオリゴヌクレオチド含有プロドラッグを設計した。これらオリゴヌクレオチドプロドラッグは、細胞膜を経由した受動拡散によって細胞内に入り込む能力を有し、血液−脳関門を含む種々の生理学的関門を通過して輸送される能力をも有する親油性で低イオン性のオリゴヌクレオチドコンジュゲートとなるように、可逆的に誘導体化されたオリゴヌクレオチドである。これらオリゴヌクレオチドプロドラッグは、少なくとも６つ、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドを含む。一つのヌクレオチドの３'末端は隣のヌクレオチドの５'末端に共有結合している。ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドまたはその類似体、リボヌクレオチドまたはその類似体であるか、またはデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド類似体、リボヌクレオチド、およびリボヌクレオチド類似体の組み合わせによりキメラオリゴヌクレオチドプロドラッグを形成してもよい。本明細書において使用する「ヌクレオチド類似体」なる語は、インビボでは天然に認められないヌクレオチドであって、合成基が結合しているかまたはその３ 'または５'末端化学基と置換されているものを包含する。それゆえ、ヌクレオチド類似体は、一つのヌクレオチドの５'末端と他のヌクレオチドの３'末端との間にホスホジエステル以外のインターヌクレオチド結合を形成し、その際、該５' ヌクレオチドリン酸はいかなる数の化学基で置換されていてよい。好ましい合成結合としては、アルキルホスホネート、リン酸エステル、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、カーボネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、およびカルボキシメチルエステルが挙げられる。「ヌクレオチド類似体」なる語はまた、修飾した塩基および／または糖を有するヌクレオチドをも包含する。たとえば、３',５'一置換ヌクレオチドは、３'位および５'位の両方でヒドロキシル基以外の化学基(その３'位において)およびリン酸基以外の化学基(その５'位において)に結合した糖を有する修飾したヌクレオチドである。修飾したヌクレオチドはまた、キャッピングした分子種であってよい。さらに、該分子中のヌクレオチド当たり一つの非架橋性酸素が置換されている酸化されていないまたは部分的に酸化されたヌクレオチドもまた修飾したオリゴヌクレオチドと考えられる。また、３'および／または５'末端においてヌクレアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基を有するか、および／またはヒトの介入なしにはインビボで認められない種々の他の構造上の修飾を有するものも、修飾したヌクレオチドと考えられる。修飾はまた、リン酸基における置換をも含む。たとえば、５'リン酸基の酸素を、硫黄、アミンまたは他の基で置換してよい。ヒトの介入なしにはインビボで認められない種々の他の構造上の修飾を有するヌクレオチドもまた修飾したヌクレオチドと考えられる。オリゴヌクレオチドプロドラッグの少なくとも一つのヌクレオチドを誘導体化して、該プロドラッグが誘導体化の前に比べてイオン性が低く、親油性が高くなるようにした。このことは、図１にプロドラッグ１として示すように、ヌクレオチドの３'リン酸基、５'リン酸基、またはインターヌクレオチドリン酸基に、硫黄、酸素、またはアミン基にて親油性の化学基を共有結合することにより行う。親油性の化学基を結合させることのできる幾つかの好ましいヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、およびリン酸エステルが挙げられる。プロドラッグの少なくとも一つのヌクレオチドが上記のようにして誘導体化され、すべてのヌクレオチドが同様に誘導体化されてよい。誘導体化された残基はオリゴヌクレオチドプロドラッグ中のどの位置にあってもよい。すなわち、該残基はプロドラッグの内部領域または末端領域にあってよく、該分子全体に分散していてもよい。下記表１は、６、１７、２５、および３０ヌクレオチドを有する幾つかの代表的なオリゴヌクレオチドプロドラッグを例示する。「↓」は誘導体化されたヌクレオチド残基の位置を示す。誘導体化する化学基は、親油性でオリゴヌクレオチドのイオン強度を全体として減少させるものであればいかなるものであってもよい。有用な親油性化学基としては、アルキル、アリール、アラルキル、アルカン基が挙げられるが、これらに限られるものではない。他の有用な親油性化学基としては、炭素数が約３〜約４０の長い炭化水素鎖を有する脂肪酸、および１または複数の位置にＯ、Ｎ、ＳまたはＰなどのヘテロ原子を含有する、５または６員炭素環を有する複素環化合物または融合多環系が挙げられる。ヘテロ環化合物の非限定的な例示としては、チオフェン、イミダゾール、ピリミジン、ピロール、フラン、およびプリン、並びにステロイドエステルおよびステロイドアミドなどのステロイド類が挙げられる。さらに他の有用な親油性基は、炭素数が約１７〜約４０、好ましくは約１７〜約３２のステロイド類である。図３は、４つの炭素環と親油性基が結合してよい１７の位置を有するステロイドの一般的な構造を示す。複数の誘導体化ヌクレオチドに結合した親油性化学基は同じであっても異なっていてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドプロドラッグ中のヌクレオチドの配列はいかなる配列であってもよいが、それは細胞膜を通過または輸送されるオリゴヌクレオチドプロドラッグの能力は配列依存性でないからである。それゆえ、オリゴヌクレオチドプロドラッグ中のヌクレオチドの配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用目的に応じて変わりうる。たとえば、特定のウイルス感染を予防または治療するためにオリゴヌクレオチドを使用する場合には、該プロドラッグのヌクレオチド配列の少なくとも一部は該ウイルス核酸のヌクレオチド配列の一部に相補的であろう。別のやり方として、標的細胞または組織中の目的とするタンパク質(酵素など)をコードする特定の遺伝子の発現を制御するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。多くのウイルスおよび細胞の遺伝子のヌクレオチド配列は知られており、それらに対してアンチセンスオリゴヌクレオチドが調製されている。本発明のオリゴヌクレオチドプロドラッグの調製は、誘導体化しうるヌクレオチドを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し、ついで該オリゴヌクレオチド上の反応性基に親油性化学基を共有結合させる、すなわち誘導体化させることにより行う。本発明の親アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で認識されたいずれかの方法(プロトコールズ・フォア・オリゴヌクレオチズ・アンド・アナログズ(Ｐrotocols Ｆor Ｏligonucleotides and Ａnalogs)(Ｍeth.Ｍol.Ｂio.(アグラワルら)ヒューマナ・プレス、トトワ、ニュージャージー、Ｖol.２０、１９９３)中)；グッドチャイルド(Ｇoodchild)(１９９０)Ｂioconjugate Ｃhem.１：１６５〜１８７；およびウールマン(Ｕhlmann)ら(１９９０)Ｃhem.Ｒev.９０：５４３〜５８４に概説されている)により調製できる。たとえば、ホスホルアミデート、Ｈ−ホスホネート化学、メチルホスホルアミデート、またはメトキシホスホルアミダイト化学(手動または自動合成機により行い、ついで処理することができる)などの技術を用いてヌクレオチドを共有結合することができる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、誘導体化したり標的核酸にハイブリダイズする能力を損なうことなく、多くの方法で修飾することができる。たとえば、修飾はオリゴヌクレオチド分子の内部であっても末端であってもよく、アミノ基と末端リボース、デオキシリボースとの間に種々の数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン化合物などのインターヌクレオシド結合の該分子への付加、および開裂するか、または反対鎖へ架橋するもしくは付随酵素もしくはウイルスゲノムに結合する他のタンパク質へ架橋するリン酸修飾を含む。そのような修飾したオリゴヌクレオチドの例としては、修飾した塩基および／または糖（リボースの代わりのアラビノースなど)を有するオリゴヌクレオチド、または３'位および５'位の両方でヒドロキシル基以外の化学基(その３'位にて)またはリン酸基以外の化学基(その５'位にて)に結合した糖を有する３',５'−置換オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の修飾したオリゴヌクレオチドは、３'および／または５'末端でヌクレアーゼ耐性を付与する嵩ばった置換基でキャッピングされているか、またはヌクレオチド当たり一つの非架橋性酸素が置換されている。そのような修飾は、インターヌクレオシド結合の幾つかまたはすべてにおいて行うことができるし、オリゴヌクレオチドのいずれかもしくは両方の末端で、および／または該分子の内部で行うことができる(アグラワルら(１９９２)Ｔrends.Ｂiotec hnol. １０：１５２〜１５８に概説）。オリゴヌクレオチドプロドラッグ中のヌクレオチドの誘導体化は、オリゴヌクレオチド中の少なくとも一つのヌクレオチドの３'リン酸基、５'リン酸基、またはインターヌクレオチドリン酸基に親油性化学基を結合させることにより行う。化学基の共有結合は、結合させようとするアミドなどやエステルなどの基に特有の当該技術分野で認識されたプロトコールにより行うことができる。いったん細胞、標的組織、または生体内に取り込まれると、オリゴヌクレオチドプロドラッグはエステラーゼやホスホルアミダーゼなどの内生の酵素によりプロセシングを受ける。この酵素は組織特異的または細胞特異的であり、それゆえ、プロドラッグが標的組織または細胞に到達または接近した場合にのみ親油性化学基が該薬剤から開裂され、かくして親のアンチセンスオリゴヌクレオチドを再生するようにオリゴヌクレオチドプロドラッグを設計することができる。図１は、プロドラッグ１からの親オリゴヌクレオチド(化合物５)の再生を酵素とともに示す一般的模式図であり、図２は、オリゴヌクレオチドプロドラッグに結合した種々の特定の親油性化学基に対する酵素の特異的作用を示す。オリゴヌクレオチドから親油性基を放出する酵素としては、エステラーゼおよびホスホルアミダーゼが挙げられる。細胞および生体組織中に認められる有用なエステラーゼとしては、チオールプロテアーゼ、カルボキシルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼ、たとえばトリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼ(膵臓中に認められる)など、トロンビン、プラスミン、および補体Ｃ１(血清中に認められる)、カリクレイン(生体および組織中に認められる)、先体プロテアーゼ(精子中に認められる)、およびリソゾームプロテアーゼ(動物細胞中に一般的に認められる）が挙げられるが、これらに限られるものではない。たとえば、図４は、プロドラッグの形態のオリゴヌクレオチド(プロドラッグ１)からのアンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはホスホルアミデートの再生を示す(Ｘ＝Ｓの場合)。プロドラッグ１において、ホスホロチオエートのホスホリル基よりも高度に親電子性のカルボニル炭素中心に酵素媒体加水分解攻撃が向けられるように、不安定なカルボン酸エステル基を導入する。このことが今度は、インビボにおける生体内活性化の間での天然のホスホジエステル骨格よりもホスホロチオエートの再生(すなわち、親アンチセンスオリゴヌクレオチドの再生)を確実にする。アシルオキシアルキルエステル型の基は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの理想的な結合の条件を満たす。それゆえ、アシルオキシアルキルエステル型のプロドラッグ１はエラスターゼにより生体内活性化を受けて不安定なヒドロキシメチルオリゴヌクレオチド１ａを生成し、ついで該オリゴヌクレオチドは容易にホルムアルデヒドを除去して親ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド５を生成する。酵素加水分解の速度は種々のアシル基を選択することにより調節でき、プロドラッグ１( Ｒ＝ｔ−ブチル)などの一層立体障害の大きい誘導体では加水分解が遅い。アシルオキシアルキル基並びにアリール基、アルキル基、アラルキル基、複素環基、脂肪酸基、ステロイドエステル基、およびステロイドアミド基をホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホルアミデート中に導入すると、親油性で低イオン性のオリゴヌクレオチドが得られる。そのような修飾はこれらプロドラッグが細胞によって効率よく取り込まれることを可能にし、取り込まれた細胞内では該細胞のエラスターゼやホスホルアミダーゼが該プロドラッグ中のエステルまたはアミド基を加水分解して親オリゴヌクレオチドを再生する。種々のオリゴヌクレオチドプロドラッグの調製モデルとして、ジヌクレオチドホスホロチオエートの化学選択的Ｓ−官能化のために下記方法を設計した。５' 末端に５'ジメトキシトリチル基(ＤＭＴ)を有するジヌクレオチドホスホロチオエート２[ｄ(ＴｐｓＴ)]を、自動ＤＮＡ合成機上での公知のホスホルアミダイト化学(たとえば、ボーケージ(Ｂeaucage)ら(１９９２)Ｔetrahedron４８：２２２３〜２３１１を参照)を用い、１０×１０μモルスケールで合成した。アイヤーらによって記載されているように(Ｊ.Ｏrg.Chem.(１９９０)５５：４６９３〜４６９８およびＪ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.(１９９０)１１２：１２５３〜１２５４)、インターヌクレオチドホスファイト結合の酸化的硫化を３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１,１−ジオキシドを用いて行い、ホスホロチオエート結合を生成した。合成後、コントロールドポアガラス(controlled-pore-glass)(ＣＰＧ)支持体を２８〜３０％ＮＨ₃で処理して上記ジヌクレオチドホスホロチオエートを支持体から開裂し、β−シアノエチルリン酸保護基を除去した。ついで、この２量体を逆相ＨＰＬＣに供して、５'−ＤＭＴ基を有するホスホロチオエートプロドラッグ２の構成Ｒ_p(保持時間(Ｒ_t)＝３９分)およびＳ_p(Ｒ_t、３５分)ジアステレオマーを単離した。ついで、個々のＲ_pおよびＳ_pジアステレオマーを８０％酢酸で処理して５'−ＤＭＴを除去し、逆相ＨＰＬＣで再度精製して純粋なＲ_pおよびＳ_p異性体を得た(Ｒ_p：Ｒ_t、２４.２分；Ｓ_p：Ｒ_t、２５.４分)。プロドラッグ２の個々のジアステレオマーへの絶対配置「Ｒ_p」および「Ｓ_p」の割り当ては、先に充分に確立された文献(コノリー(Ｃonnolly)ら(１９８４)Ｂ iochem.２３：３４４３〜３４５３)に従い、逆相ＨＰＬＣ上でのＲ_pおよびＳ_pジヌクレオシドホスホロチオエート(５'−ＤＭＴ「オン」および５'−ＤＭＴ「オフ」)の相対的移動度に基づいて行う。これら割り当てをさらに確かめるため、ＰＳ−プロドラッグ２の個々のジアステレオマーをコノリーらの方法(上掲)を用いてヘビ毒ホスホジエラスターゼ(II 型)で処理した。このヘビ毒はＲ_pジアステレオマー(Ｒ_t、２４．２分、δ５２. ６ｐｐｍ)を立体特異的に加水分解し、ヌクレアーゼＰ１はＳ_pジアステレオマー (Ｒ_t、２５.４分、δ５２.２ｐｐｍ)を加水分解する。これらプロドラッグ２のジアステレオマーを、図５に示すように化学選択的Ｓ −アルキル化プロトコール(たとえば、アグラワルら(１９９１)Ｎucl.Ａcids Ｒ es.１８：５４１９〜５４２３)を用いてＳ−アルキルホスホロチオエートに変換した(ＰＳ−プロドラッグ３ａ−ｄ)。アルキル化反応に必要なヨードアルキルアシレート(化合物１０ａ−ｄ)は、アイヤーらの方法(Ｔetrahedron Ｌett.(１９８９)３０：７１４１〜７１４４)に従ってクロロアルキルアシレート(図４)を用いて対応クロロアルキルアシレートから調製した。これらは、今度はウリッヒ( Ｕlich)らにより記載されているように(Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.(１９２１)４３：６６０)、触媒量の無水塩化亜鉛の存在下での対応酸クロライドとパラホルムアルデヒドとの反応により合成した。反応を逆相ＨＰＬＣによりモニターしたところ、キラルなリン中心でエピメリ化の形跡は認められなかった。他の部位での反応の欠如を反映して有意の副生成物は検出されなかった。それゆえ、Ｒ_p２はＲ_p３ａ−ｄを与え、Ｓ_pはＳ_p３ａ−ｄを与える。すべての場合において、反応混合物を処理し、分取逆相ＨＰＬＣにより生成物を単離した。プロドラッグ３の種々の類似体の保持時間を表２に示す。 ³¹Ｐ−ＮＭＲの測定によると、類似体３ｃのＲ_p異性体は一般に２４.８ｐｐｍの値を有し、３ｃのＳ_p異性体は２５.８ｐｐｍの値を有していた。プロドラッグ３のＲ_pおよびＳ_pトリエステルは、Ｒ_pおよびＳ_pジエステル対応物(すなわち、類似体２)とは異なり、ヘビ毒ホスホジエラスターゼおよびＰ１ヌクレアーゼに対してそれぞれ抵抗性であった。これらの結果は、プロドラッグがその親化合物に比べてヌクレアーゼ消化を受けにくいことを示している。プロドラッグ３ａ−ｄは不安定なカルボン酸エステル残基を有するホスホトリエステルであるが、これらは容易に単離および精製される。これらプロドラッグは水性緩衝液およびアセトニトリルやクロロホルムなどの有機溶媒に可溶である。これらプロドラッグは分解の形跡なしに水性緩衝液(ｐＨ７.０)中、０〜５℃ にて無期限に貯蔵できる。しかしながら、水性緩衝液(ｐＨ７.０)中で周囲温度にて長期間貯蔵すると若干の分解は起こる。上記表２は、水性緩衝液中、周囲温度での類似体の分解の半減期を示す。予想されるように、立体障害の少ない類似体３ａは立体障害の一層大きい類似体３ｂ−ｃに比べて加水分解を受けやすかった。分解の主要な生成物は、脱硫生成物、すなわち天然のジエステル４であった。ついで、プロドラッグ類似体３ａ〜３ｃを血清中で加水分解を受ける能力について分析した。これら血清媒体加水分解の研究は、酢酸アンモニウム(すなわち、塩)を含有するＨＰＬＣ精製材料について行った。塩の存在が加水分解の動力学および生成物プロフィル(すなわち、生体内可逆性(bio-reversibility))に影響を及ぼすか否かを決定するため、エステル３ａ−ｃ(塩を含有または含有しないＨＰＬＣ移動相)をヒト血清とともにインキュベートした。表３は、塩の存在下および不在下での類似体３ａ−ｃの加水分解の半減期(ｔ_1/2)を示す。すべての場合において、Ｓpトリエステル３ａ−ｃからＲ_p２への立体特異的な加水分解変換が観察された。Ｓ_pエステル３ａ−ｃはＲ_pエステル３ａ−ｃに比べると遥かに速やかに加水分解された。さらに、副生成物として有意の量のリン酸エステル４の生成が３ｃの加水分解において認められた。表３に示されるように、同じ血清媒体加水分解研究を塩不含の材料を用いて行うと、加水分解の半減期は有意に短くなった。典型的に、Ｒ_p３ｃ(塩不含)の加水分解の半減期が１６３分であったのに対し、Ｒ_p３ｃ(塩含有)の加水分解の半減期は１,９８０分であった。酵素媒体加水分解を塩の不在下で行ったときに、脱硫生成物４の生成の増加が、とりわけ立体障害の大きい類似体Ｒ_pおよびＳ_p３ｃの場合に観察された。この場合、類似体３ａ−ｃの場合の脱硫生成物４の起源は図６に示す経路に従うように思われる。または、脱硫生成物の少なくとも一部は血清中に存在するホスホジエステラーゼ様活性によって媒体される加水分解によって生成され、酢酸アンモニウムはこのホスホジエステラーゼ様活性を抑制し、エステラーゼ活性を低減させる。そこで、血清中に存在するエステル加水分解を担う因子がエステラーゼ様活性を有することを確認するための研究を行った。これら研究においては塩不含の材料のみを用いた。典型的なカルボキシルエステラーゼ酵素としてブタ肝臓エステラーゼ(これは少なくとも７種の酵素の混合物である)を用いた。１００％酢酸アンモニウム緩衝液(０.１Ｍ)から酢酸アンモニウム(０.１Ｍ)中の８０％アセトニトリルまでの勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにより反応をモニターした。これら研究から得られたデータを一次速度論モデルに従って分析した。得られた結果を図７Ａおよび７Ｂ(図中、矢印は化合物４、２および３ｂの保持時間を分で示す)に示し、表４に概要を示す。基質３ａ−ｃをブタ肝臓エステラーゼと化学量論比(１単位／基質１μモル)でインキュベートすると、殆ど即時に立体特異的な加水分解が観察され、所望の生成物Ｒ_pまたはＳ_p２が得られた。これらの条件下で、化合物３ａ−ｃの加水分解速度の立体的な差異は認められなかった(すなわち、Ｒ_pおよびＳ_pの両者とも同じ速度で加水分解された)。また、立体障害の大きい類似体と小さい類似体との間での半減期の差異も認められなかった。これら観察は、酵素への基質の高い結合親和性および大きな触媒速度を反映している。しかしながら、酵素濃度を下げていくと、以前の血清研究で認められたように若干の立体的差異が認められた。逆の立体化学的優先(preference)が観察された：Ｒ_p(Ｒ_p３ｃ、ｔ_1/2＝１８５分 )はＳ_p(Ｓ_p３ｃ、ｔ_1/2＝４３０分)よりもわずかに速く加水分解された。これらの結果は、ブタ肝臓エステラーゼがヒト血漿カルボキシルエステラーゼと比較したときに基質３ａ−ｃに対する立体特異性が異なることを示唆している。血清研究の場合のように、立体障害の大きいｔ−ブチル類似体は立体障害の小さい類似体に比べて一層ゆっくりと加水分解された。脱硫生成物４の生成も、血清媒体加水分解研究の場合のように、これら条件下でとりわけ立体障害の大きい類似体３ｃの場合に観察された。加水分解反応の機構に関してさらに洞察を得、加水分解がカルボキシル基に対する最初の攻撃によって開始されることを示すため、Ｒ_pおよびＳ_pベンゾイル類似体３ｄを調製した。Ｒ_pまたはＳ_p３ｄをブタ肝臓エステラーゼとともにインキュベートすると、安息香酸の生成(確実な標準と比較してクロマトグラフィーにかけることにより同定した)とともに類似体２が得られた。これらデータは、ホスホリル基における攻撃よりもむしろエステラーゼによるカルボニル炭素への最初の求核攻撃(類似体２を生成する)を示している。類似体４の生成の経路は図６に示してある。この経路は、エステラーゼのセリンヒドロキシル基によるエステルカルボニル中心への最初の求核攻撃によりオキシアニオン中間体９が生成し、この中間体が近位のリン中心に対して分子内攻撃を行って環状中間体１１を生成することを含む。経路ａによる中間体１１の断片化により所望の生成物２が生成し、一方、経路ｂによる中間体１１の断片化からは脱硫生成物４を生成するが、いずれの経路においても同じアシル一酵素中間体１２を生成する。酵素媒体加水分解により主要な生成物として期待されるホスホロチオエート２(経路ａにより) が生成する。上記モデルの結果に基づき、オリゴヌクレオチドプロドラッグおよびその親オリゴヌクレオチド(ともに配列番号：２を有する)をエステラーゼによる加水分解前および加水分解後にＮＭＲスペトル分析およびポリアクリルアミドゲル電気泳動により調べた。これらオリゴヌクレオチドをＤ₂Ｏ中に溶解し、ＮＭＲスペトルを記録した。得られた結果を図８に示すが、ここでＡは親オリゴヌクレオチドのスペトルを、Ｂはプロドラッグのスペトルを、Ｃはエステラーゼとともにインキュベートしたプロドラッグのスペトルを示す。図８に示すように、親油性基で誘導体化したリン核のスペトルにおいてケミカルシフトがみられる(Ａでは約δ５７であるが、Ｂではそれが右側にシフトしている)。さらに、エステラーゼ消化を２４時間行った後の親オリゴヌクレオチドにおいて、誘導体化リン核スペトルの元あった位置(δ−８)へのシフトがＣにおいてみられ、誘導体化の可逆性を示した。Ａ、およびＣにおいて分析した分子種を、図８および９に示すようにポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーに供した。これらオートラジオグラムは、酵素とインキュベートして３６時間以内にオリゴヌクレオチドプロドラッグが親オリゴヌクレオチドに変換されることを示している。下記実施例は本発明を製造および実施するための好ましい例示を示すものであるが、これら例示に本発明を限定することを意図するものではない。なぜなら、別の方法を用いて同様の結果を得ることができるからである。実施例１．d(ＴpsＴ)および親オリゴヌクレオチドの合成 d(ＴpsＴ)２およびオリゴヌクレオチドの自動化固相合成を、ホスホルアミダイト化学(ボーケージ(Ｂeaucage)ら(１９９２)、Ｔetrahedron ４８：２２２３ −２３１１)を用い、ＤＮＡ合成機(バイオサーチ(Ｂiosearch)８７００、ベッドフォード(Ｂedford)、マサチューセッツ)で１０×１０μモルのスケールで行った。オリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロチオエートの調製に必要な酸化的硫化反応は、アイヤーら(Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc．(１９９０)１１２：１２５３ −５４；Ｊ．Ｏrg．Ｃhem．(１９９０)５５：４６４３−９８)によって記載されているように、アセトニトリル中の結晶性３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３ −オン−１,１−ジオキシド(アール・アイ・ケミカル(Ｒ.Ｉ.Ｃhemical Ｃo.)、コスタ・マサ(Ｃosta Ｍasa)、カリフォルニア)の０.２Ｍ溶液を用いて行った。その硫化反応を合成のスケールに依存して、４５秒から２分行った。合成の後、コントロールドポアガラス(ＣＰＧ)支持体を５５℃にて２８−３０％ＮＨ₃で８ −１０時間処理して、その支持体からジヌクレオシドホスホロチオエートを開裂させ、β−シアノエチルホスフェート保護基を除去した。２のＲ_p：Ｓ_p比を³¹Ｐ −ＮＭＲおよびＨＰＬＣ分析に基づき６０：４０であると推定した。２．ヨードアルキルアシレートの合成ヨードアルキルアシレート１０ａ−ｄを、以前にスリバストバ(Ｓrivastva)らによって記載されたように(Ｂioorg．Ｃhem．(１９８４)１２：１１８−１２９) およびアイヤーら(Ｔetrahedron．Ｌett．(１９８９)３０：７１４１−７１４４ )によって記載されたように調製し、特徴付けた。簡単には、暗所、２５℃で３０分かけてクロロアルキルアシレート１２.７０ｇ(８５mＭ)を、１００ｍｌの乾燥アセトニトリル中のヨウ化ナトリウム(１７. ５６)に添加した。すぐにＮaＣlの白い沈澱が現れ始めた。その内容物を１２時間撹拌した。その沈澱を濾過し、ついでそのアセトニトリルを真空中で濾液から除去した。その濾液を７０mlのトルエンに溶解させ、４０mlの５％重亜硫酸ナトリウム水溶液で２度洗浄し、ついで４０mlの水で洗浄した。そのトルエン層をついで無水硫酸ナトリウムで蒸発させた。トルエンを真空中で除去し、ついでその結果得られた淡黄色の油状物の分留により透明な無色液体を得た(４８−５０℃ 、３mm Ｈg、１４.２ｇ、７０％)¹Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)δppm １.１９(s、９Ｈ )、５.９１(s、２Ｈ)¹³Ｃ−ＮＭＲ(ＣＤＣl₃)：δppm２６.４(ＣＨ₃)、３Ｌ４( ＣＨ₂)、３８.７(−Ｃ)、１７６.０(ＣＯ))。その分留物１０ａ−ｄを使用するまで−８０℃で保存した。３．ジヌクレオシドＳ−アルキルホスホロチオエートの合成そのエステル３ａ−ｃを、３７℃で３−４時間、Ｒ_pまたはＳ_p２の５０Ａ₂₆₀ 単位(０.５ｍｌ２５０mＭトリスバッファー、ｐＨ７.０中)を３ml アセトニトリル中の対応ヨードアルキルアシレート１０ａ−ｄ(２ミリモル)と反応させることによって合成した。その反応混合物を１００μlの０.５％重亜硫酸ナトリウムで反応停止させ、真空中で蒸発乾固させ、ついで以下に記載するように分取逆相ＨＰＬＣにかけた。その溶媒を真空中で除去し、そのようにして得たエステル(３ａ−ｃ)(化合物２に基づいて単離した収率６０−７０％)をさらなる実験のために使用した。ＮＭＲスペクトルを７.０５Ｔeslaで分離する広いバンドの存在下で操作する分光計上で記録した(３００ＭＨｚ、¹Ｈ)。³¹Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、外部標準としてトリメチルホスフェートを使用し、デューテロ化溶媒中で記録した。典型的な³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂Ｏ)：δ Ｒ_p３ｃ、２４.８；Ｓ_p３ｃ２５.８ ppm。４．分取ＨＰＬＣ５'−端にＤＭＴ基を有する脱保護ＴpsＴダイマーをＣ−１８逆相カラム(１２５Å、５５−１２５μＭ、ウォーターズ(ＷＡＴＥＲＳ)(ミルフォード(Milford) 、マサチューセッツ)、および１００％Ａから１００％Ｂへの７０分にわたる勾配[ Ａ：ＣＨ₃ＣＯ₂ＮＨ₄(０.１Ｍ、水中)；Ｂ：アセトニトリル：ＣＨ₃ＣＯ₂ＮＨ₄( ０.１Ｍ)(８０：２０)]を使用し、流速１２ml／分で逆相ＨＰＬＣによって精製した。ピーク(Ｒ_t＝４１分および４５分)のＴpsＴＤＭＴを回収し、３０分間、８０％酢酸を使用して脱トリチル化させた。その溶媒を除去し、ついで以下に記載するように、Ａ(０.１ＭＣＨ₃ＣＯ₂ＮＨ₄、水中)；Ｂ(アセトニトリル：０. １ＭＣＨ₃ＣＯ₂ＮＨ₄，★８０：２０)またはＡ(水)およびＢ(アセトニトリル：水(８０：２０))を使用し、１００％Ａから１００％Ｂの勾配で７０分間展開したＣ−１８カラムを使用した逆相ＨＰＬＣにその粗製化合物２をかけた。後者の系を使用すると塩不含物質が得られた。そのＲ_pおよびＳ_p２の分画を収集し、蒸発させ、凍結乾燥させ、ついで使用するまで０℃で保存した。³¹Ｐ−ＮＭＲ(Ｄ₂ Ｏ):δ Ｒ_p２、５２.６およびＳ_p２、δ ５２.２ppm。５．生体内可逆性研究Ａ．ヘビ毒ホスホジエステラーゼでの加水分解Ｒ_pおよびＲ_p割り当てを確かめるために、２の個々のジアステレオマーを立体特異的にＲ_pジアステレオマー(Ｒ_t＝２４.２分、δ＝５２.６ppm)を加水分解するヘビ毒ホスホジエステラーゼ(タイプII)およびＳ_pジアステレオマー(Ｒ_t＝２５.４分、δ＝５２.２ppm)を加水分解するヌクレアーゼＰ１で処理した。これをコノリー(Ｃonnolly)ら(Ｂiochem．(１９８４)２３：３４４３−３４５３)の方法を使用して行った。ヘビ毒ホスホジエステラーゼをベーリンガーマンハイム( Ｂoehringer Ｍannheim)ＧmbＨ、インディアナポリス、インディアナから５０％グリセロール、ｐＨ６.０の懸濁液中で得た。Ｂ．バッファーでの加水分解加水分解混合物は３７℃でｐＨ７.０、８０μlの２５mＭトリスバッファー中３ａ−３ｃ基質の約０.６Ａ₂₆₀単位を含有した。各時点でインキュベーション混合物の１０μl アリコートを１４０μl バッファーＡで希釈し、Ｃ１８４μ ラジアルパック(Ｒadial Ｐak)カートリッジカラム(ウォーターズ、ミルフォード、マサチューセッツ)を使用し、バッファーＡ(０.１ＭＣＨ₃ＣＯ₂ＮＨ₄))およびバッファーＢ(８０：２０、ＣＨ₃ＣＮ：０.１ＭＣＨ₃ＣＯ₂ＮＨ₄)の勾配( ６０分にわたる１００％Ａから６０％Ｂへ)で１.５ml／分の流速で展開し、逆相ＨＰＬＣによって分析した。Ｒ_p２の保持時間(Ｒ_t)はそれぞれ２４.２；Ｓ_p２、２５.４；および４、２１.０分であった。プロドラッグ３ａ−３ｃはバッファーに暴露後に出発物質のジヌクレオチドに変換された。Ｃ．血清加水分解加水分解混合物は３７℃、ｐＨ７.０で２５mＭトリスバッファー６０μl中、基質３ａ−３ｃの約０.６Ａ₂₆₀単位、２０μl ヒト血清(ギブコ(ＧＩＢＣＯ)、ＢＲＬ，ゲイザーズバーグ(Ｇaithersburg)、メリーランド)を含有した。各時点で、インキュベーション混合物のアリコートを１４０μl バッファーＡで希釈し、ついで上記実施例５Ｂに記載されるように逆相ＨＰＬＣにより分析した。プロドラッグ３ａ−３ｃは血清に暴露後に、図７Ａおよび７Ｂに示すように出発物質のジヌクレオチドに変換された。Ｄ．ブタ肝臓エステラーゼでの加水分解加水分解混合物は３７℃、ｐＨ７.０で２５mＭトリスバッファー６０μl中、基質３ａ−３ｃの約０.６Ａ₂₆₀単位および μlのブタ肝臓カルボキシルエステラーゼを含有した。各時点で、インキュベーション混合物の１０μl アリコートを１４０μl バッファーＡで希釈し、ついで上記実施例５Ｂに記載されるように逆相ＨＰＬＣにより分析した。プロドラッグ３ａ−３ｃはブタ肝臓エステラーゼに暴露後に、出発物質のジヌクレオチドに変換された。６．オリゴヌクレオチドプロドラッグの調製０.５mlの２５０mＭトリス−ＨＣlバッファー、ｐＨ７.０中のオリゴヌクレオチド(配列番号：１または配列番号：２)の９０Ｏ.Ｄ.の溶液に０.５mlのアセトニトリル中の２０μl ヨードメチルイソブチレートを添加した。その溶液を３７℃で１−３時間インキュベートした。その溶液のｐＨを定期的にトリエチルアミンを微量添加することによって６−７周辺に維持した。その反応の終わりに、溶媒を圧力下で除去し、ついで残渣を２００−５００μlの水および３０−４０ μlの1Ｍ塩化ナトリウム溶液中に溶解させた。その溶液に１−１.２mlの冷エタノールを添加し、ついでその溶液を約−８０℃に１−２時間維持した。その溶液を１５分間１０,０００ｇで遠心分離し、ついで得られたペレットをＨＰＬＣおよびゲル電気泳動によって分析するか、または上記のように塩化ナトリウム溶液に溶解させエタノール沈澱を行った。図８に示すように、この産物の³¹Ｐ−ＮＭＲは、出発物質のオリゴヌクレオチドがδ ５１ppmでシグナルを示したのに比較して、δ ２５ppmでシグナルを示した。その産物のゲル電気泳動(２０％ポリアクリルアミド)による分析は、出発物質のオリゴヌクレオチドに比較してゆっくり移動するバンドを示した。７．オリゴヌクレオチドプロドラッグでの生体内可逆性研究Ａ．ブタ肝臓エステラーゼによる加水分解プロドラッグの１.５Ａ₂₆₀単位(２５μlの２５０mＭトリス中、ｐＨ７.２)に２μlのブタ肝臓エステラーゼを添加し、ついでその反応混合物を３７℃で一晩インキュベートした。ついでその反応混合物のアリコートを２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素変性ゲルを使用してゲル電気泳動によって分析した。図８および９はそれぞれ２４時間後および３６時間後に得られたその反応混合物のプロフィルを示す。プロドラッグオリゴヌクレオチドは、ブタ肝臓エステラーゼに暴露後に親オリゴヌクレオチドに変換される。Ｂ．血清での加水分解プロドラッグ(２５μｌ)オリゴヌクレオチドの１.５Ａ₂₆₀単位(２５０mＭトリス中、ｐＨ７.２)に４０μlのヒト血清を添加し、ついでその反応混合物を３７℃で一晩インキュベートした。ついでその反応混合物のアリコートを実施例７Ａに記載されたようにゲル電気泳動によって分析した。図８は２４時間のインキュベート後に得られたその反応混合物のプロフィルを示す。プロドラッグオリゴヌクレオチドは血清に暴露後に、出発物質のオリゴヌクレオチドに変換される。Ｃ．イン・ビボ加水分解配列番号：２を有し、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよびホスホロチオエートの組合せを有するハイブリッドなキメラプロドラッグを、１５０−２００ｇのスプレーグドゥリー(Ｓprague Ｄawley)またはアルビノラットの尾の静脈に巨丸剤(bolus)静脈注射として普通の生理食塩水にて投与した。各投与量に対して３匹のラットを使用し、１−１０mg／Ｋgの投与量を与えた。投与後、その動物を代謝ケージに入れ、ついで７２時間まで尿のサンプルを収集した。０.２５ml 血液サンプルを次の投与との間に腋下切開部から収集した。そのサンプルを０℃ で０.２５μlの２７.５mＭＥＤＴＡを含むマイクロ遠心管に収集し、１６,０００×ｇの速度で遠心分離した。血漿サンプル(１５０−２００μl)を２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素変性ゲル中のポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)によって分析した。これらのサンプルをまた、そのオリゴヌクレオチドプロドラッグの親オリゴヌクレオチドへの生体内可逆性の半減期を決定するためＨＰＬＣによって分析した。その尿サンプルをまた、オリゴヌクレオチドプロドラッグおよびその代謝物の含量を決定するためＰＡＧＥおよびＨＰＬＣによって分析する。³⁵Ｓ−標識オリゴ−プロドラッグをこれらの実験において使用する。慢性的にＨＩＶ−感染した細胞中のオリゴヌクレオチドプロドラッグの抗−ＨＩＶスクリーニングは、リシエウイッツ(Ｌisciewicz)ら、(１９９３)、Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ)９０：３８６０−３８６４の記載に従って行った。これらの実験は、本発明の上記例示のオリゴヌクレオチドプロドラッグが好ましい物理化学的および薬理学的な特性に加えて、ＡＩＤＳに対する良好な治療学的な可能性を有することを示している。８．ジヌクレオシドＳ−アシルオキシアリールホスホロチオエートプロドラッグこれらのプロドラッグにおいては、図２に一般的に示されるように、アシルオキシアリール基はメチレン架橋を介してホスホロチオエート基に結合している。付加物中へのアリール基の導入は付加物に対してある程度の立体的な硬直性を与え、広範囲のｐＨにわたって水性バッファー中でのプロドラッグの一層大きな安定性を提供する。アシルオキシアリールホスホロチオエートプロドラッグの合成を、誘導体化していないホスホロチオエートを４−Ｏ−イソブチリル−α−ヨードトルエン(以下に記載するように合成した)と反応させることにより行った。市販されている４−ヒドロキシベンジルアルコール(アルドリッチ、ミルウォーキー、ウィスコンシン)をピリジンから３回蒸発させ、ついでピリジン中に溶解させて０.２Ｍ４−ヒドロキシベンジルアルコールを得た。クロロトリメチルシラン(アルドリッチ)を１.２モーラ等量で添加し、その溶液を室温で１５分間撹拌した。塩化イソブチリル(アルドリッチ)を１.２モーラ等量で添加し、その反応液を２時間撹拌した。その反応混合物を氷浴にて０℃に冷却し、ついで過剰な水を添加した(５０等量)。その氷浴を除去し、ついでその反応液を４時間撹拌した。その反応混合物を濃縮し、酢酸エチルで抽出した。その有機層を１０％の重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。蒸発により油状残渣を得、これを溶離剤としてヘキサン：酢酸エチル(８０：２０)を使用したシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。蒸発により４−Ｏ−イソブチリルベンジルアルコールを無色油状物として収率８０−９０％で得た。ついで、その４−Ｏ−イソブチリルベンジルアルコールをエーテル：アセトニトリルの１：２混合物中に溶解し、０.２８Ｍの濃度にした。トリフェニルホスフィン、イミダゾールおよび昇華ヨードを各１.５モーラ等量にて添加し、その反応液を２時間撹拌した。その反応混合物をエーテルで抽出した。エーテル層を濃縮し、ついで溶離剤としてヘキサン：酢酸エチル(９０：１０)を使用したシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーを行った。その産物を含有する分画を濃縮乾固し、４−Ｏ−イソブチリル−α−ヨードトルエンを白色固体として９０− ９５％収率で得た。４−Ｏ−イソブチリル−α−ヨードトルエン(２７mg)をｐＨ７トリスＨＣlバッファー(０.５Ｍ)：アセトニトリルの５０：５０混合物中に溶解した。この溶液をＴpsＴの３０Ｏ.Ｄ.単位に添加し、３７℃で３時間維持した。３０分ごとに、そのｐＨをトリエチルアミン(アルドリッチ)でｐＨ＝６−７に調節した。３時間後、ＨＰＬＣによって評価されるように反応は完了した。アシルオキシベンジルジヌクレオシドホスホロチオエートをＲ_p、Ｓ_p混合物( ブタ肝臓エステラーゼ(シグマ)の基質である)として得た。アシルオキシベンジルジヌクレオシドホスホロチオエートをエステラーゼとともにインキュベートすると、親ホスホロチオエートへの速やかで立体特異的で定量的な変換となり、加水分解の副産物としてキノメチド(quinomethide)が得られた。Ｒ_pアシルオキシベンジルジヌクレオシドホスホロチオエートのｔ_1/2は８時間であり、Ｓ_p立体異性体のｔ_1/2は１２時間であった。加えて、そのプロドラッグの加水分解からは脱硫化産物は生じなかった。ｐＨ２からｐＨ８の範囲のバッファー中でのプロドラッグの分解の半減期は２２℃で３０日より長かった。均等物当業者は本明細書に記載の発明を特定の態様に対する多くの均等物を認識するかまたはごく普通の実験方法を用いるだけで確認することができるであろう。そのような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アグラワル，サディールアメリカ合衆国01545マサチューセッツ州シュルーズベリー、ランプライター・ドライブ 61番 (72)発明者デブリン，テレサアメリカ合衆国02130マサチューセッツ州ジャマイカ・プレイン、ユージーン・サークル 11エイ番

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも６つの共有結合したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプロドラッグであって、少なくとも一つのヌクレオチドが、５'リン酸、３'リン酸、またはインターヌクレオチドリン酸結合に可逆的に共有結合した親油性の化学基で誘導体化されており、該親油性基がエステルまたはアミドよりなる群から選ばれ、該プロドラッグは該誘導体化ヌクレオチドから該親油性基を開裂する細胞内または組織の酵素と反応性であり、該酵素が該親油性基がエステルを含む場合にはエステラーゼであり、該親油性基がアミドである場合にはホスホルアミダーゼであることを特徴とするオリゴヌクレオチドプロドラッグ。２．該親油性化学基が、アルキル、アリール、アルカン、アラルキル、複素環基、脂肪酸、ステロイドエステル、ステロイドアミド、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれたものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグ。３．該親油性化学基が、ヌクレオチドリン酸、５'リン酸上の硫黄、酸素、またはアミン基に結合している、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグ。４．該親油性化学基が結合しているヌクレオチドが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、およびリン酸エステルよりなる群から選ばれたものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグ。５．キメラ体である請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグ。６．少なくとも１つのヌクレオチドが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスホジエステル、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミダイト、カルバメート、カーボネート、アセトアミデート、およびカルボキシメチルエステルよりなる群から選ばれたものである、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグ。７．少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドおよび少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグ。８．リボヌクレオチドが２−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグ。９．請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグを含む医薬組成物。１０．該オリゴヌクレオチドプロドラッグがウイルス核酸中の領域に相補的な核酸配列を含み、該組成物がさらに第二の抗ウイルス剤を含む、請求項９に記載の医薬組成物。１１．該オリゴヌクレオチドプロドラッグが該ウイルス核酸の第一の領域に相補的な核酸配列を含み、該第二の抗ウイルス剤が該第一の領域と重複しない該ウイルスの第二の領域に相補的なヌクレオチド配列を有する第二のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。１２．経口的に許容しうる担体中に含まれる請求項９に記載の医薬組成物。１３．外来のオリゴヌクレオチドの細胞による取り込みおよび細胞内濃度を上昇させる方法であって、該方法は、細胞を請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグを含む医薬組成物で処理する工程を含み、その際、酵素は可逆的に誘導体化したヌクレオチドから親油性基を開裂し、それによって該オリゴヌクレオチドプロドラッグから該オリゴヌクレオチドが再生され、かくして該オリゴヌクレオチドの細胞内濃度が上昇することを特徴とする方法。１４．該親油性化学基が、アルキル、アリール、アルカン、アラルキル、脂肪酸、複素環基、ステロイドエステル、ステロイドアミド、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれたものである、請求項１３に記載の方法。１５．ウイルス感染した細胞を処置および細胞におけるウイルス感染を予防する方法であって、該方法は、細胞を請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグと接触させる工程を含み、その際、該オリゴヌクレオチドプロドラッグはウイルスの核酸中の一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、該オリゴヌクレオチドプロドラッグは該細胞内に入り、そこでエステラーゼまたはホスホルアミダーゼが該ヌクレオチドから親油性化学基を開裂し、それによって該ウイルス核酸の相補的部分に結合する該オリゴヌクレオチドが放出され、かくして細胞のウイルス感染が処置または予防されることを特徴とする方法。１６．該親油性化学基が、アルキル、アリール、アルカン、アラルキル、脂肪酸、複素環基、ステロイドエステル、ステロイドアミド、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれたものである、請求項１５に記載の方法。１７．該親油性化学基がアラルキルである請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプロドラッグ。１８．該親油性化学基がアラルキルである請求項１３に記載の方法。１９．オリゴヌクレオチドの細胞内またはインビボでの脂質溶解度およびバイオアベイラビリティーを上昇させる方法であって、該方法は、該オリゴヌクレオチドを誘導体化することにより該オリゴヌクレオチドに比べて脂質溶解度およびバイオアベイラビリティーが高いオリゴヌクレオチドプロドラッグを生成する工程を含み、その際、該プロドラッグは少なくとも６つの共有結合したヌクレオチドを含み、少なくとも一つのヌクレオチドが、５'リン酸、３'リン酸、またはインターヌクレオチドリン酸結合に親油性の化学基が可逆的に共有結合しており、該プロドラッグは該誘導体化ヌクレオチドから該親油性基を開裂する細胞内または組織の酵素と反応性であり、それによって該オリゴヌクレオチドが細胞内で放出され、該酵素がエステラーゼおよびホスホルアミダーゼよりなる群から選ばれたものであることを特徴とする方法。２０．該親油性化学基が、アルキル、アリール、アルカン、アラルキル、脂肪酸、複素環基、ステロイドエステル、ステロイドアミド、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれたものである、請求項１９に記載の方法。２１．該親油性化学基がアラルキルである請求項２０に記載の方法。