JPH10505232A

JPH10505232A - 鳥類骨髄単球性成長因子を用いる鳥類の処置方法

Info

Publication number: JPH10505232A
Application number: JP8508052A
Authority: JP
Inventors: ジョンストン，ポール・エイ; ブランド，モリー・エム; ケンパー，エイプリル・イー; リュー，ホン; ティスコウスキー，ジュリアス・ケイ; ハーディング，ティモシー・ダブリュー
Original assignee: エンブレクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-08-19
Filing date: 1995-07-12
Publication date: 1998-05-26
Also published as: WO1996006170A1; CA2197650A1; AU2968595A; AU686842B2; EP0777733A1; IL114685A0

Abstract

(57)【要約】鳥類骨髄単球性成長因子を鳥に卵内投与することによって、鳥を処置する方法が開示される。この方法は、好ましくは、孵卵約第１８日にニワトリＭＧＦを用いてニワトリに対して行われる。

Description

【発明の詳細な説明】鳥類骨髄単球性成長因子を用いる鳥類の処置方法関連出願本出願は、Paul Johnsonらによって１９９４年８月１９日に出願された「鳥類骨髄単球性成長因子を用いる鳥類の処置方法」についての米国出願第08/292,854 号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、ニワトリ骨髄単球性成長因子（chicken myelomonocytic growth fa ctor，ｃＭＧＦ）のような鳥類骨髄単球性成長因子を卵内（in ovo）投与することによる鳥類の処置に関する。発明の背景ニワトリ骨髄単球性成長因子（ｃＭＧＦ）は、骨髄細胞を刺激して増殖させ、単球／マクロファージ系列の細胞を産生する鳥類の造血性サイトカインである。ｃＭＧＦは、レクチン刺激脾臓培養物で初めて同定され、Leutz et al.,ENBO J. 3,3191-3197(1984)によるＬＰＳ刺激ニワトリマクロファージ細胞系（ＨＤ１１）によって生成されたコンディションドメディウム(conditioned medium)から精製された。ｃＭＧＦは、in vitroで、ウイルスにより形質転換されたニワトリの骨髄性細胞系の成長、並びに正常骨髄培養物中でのマクロファージ及び顆粒球コロニーの形成を刺激する糖タンパク質である（Leutz et al．前出）。ｃＭＧＦはLeutz et al．（ENBO J 8）によってクローニングされているが、天然のものであろうと組換え体であろうと、十分に純粋なｃＭＧＦがそれらの可能性のある用途の特徴付けに利用できるようにはなっていない。 Fredericksenの米国特許第5,028,421号は、卵にＴ細胞成長因子を導入して１８日間孵卵することによる、孵化後の処置鳥類の体重を増加させる方法を開示している。１９９２年９月１７日に出願された米国特許出願07/947,035号は、卵にインシュリン様成長因子を導入することによる、処置された鳥類の成長を増強する方法を開示している。鳥類の処置に骨髄単球性成長因子を使用することは開示も示唆もされていない。発明の要約鳥類の処置方法が本明細書に開示される。この方法は、生物学的に活性な量の鳥類骨髄単球性成長因子（ＭＧＦ）を鳥に卵内投与することにより行われる。本発明の第２の態様は、精製組換え鳥類骨髄単球性成長因子の製造方法である。この方法は、ＭＧＦをコードする組換えＤＮＡ構成物を含み、かつそれを発現する宿主細胞（例えば、大腸菌(Escherichia coli)、ピキア・パストリス（Pich ia pastorisなど）を培養培地で培養し、該宿主細胞からの組換えＭＧＦを含む培養培地を集め、かつ該培養培地からＭＧＦを単離することを含む。本発明の第３の態様は、鳥類の成長を高める方法である。この方法は、孵化後の鳥の成長を高めるのに有効な量の鳥類ＭＧＦを鳥に卵内投与することにより実施される。本発明の第４の態様は、鳥類における骨髄増殖を高める方法である。この方法は、鳥類において骨髄増殖を高めるのに有効な量の鳥類ＭＧＦを鳥に卵内投与することにより行われる。本発明の第５の態様は、鳥における、大腸菌感染又はサルモネラ感染のような細菌感染の進行を阻害する方法である。この方法は、細菌感染の進行を阻害するのに有効な量の鳥類骨髄単球性成長因子（ＭＧＦ）を該鳥に卵内投与することを含む。本発明の第６の態様は、ウイルス、真菌、又は原虫感染の進行を阻害するのに有効な量の鳥類骨髄単球性成長因子（ＭＧＦ）を鳥に卵内投与することによる、鳥におけるウイルス、真菌、又は原虫感染の進行を阻害する方法である。本発明の前述の、及び他の目的及び態様を、本明細書において以下に詳細に説明する。図面の詳細な説明図１は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、分析された、ＩＰＴＧに誘導される又は誘導されない形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌ライセートのクーマシーブルー染色タンパク質の図である。図２は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶離されたｃＭＧＦによって誘導された骨髄増殖のグラフである。図３は、ｐＰＩＣ９−ｃＭＧＦ及びｐＨＩＬ−ＳＩ−ｃＭＧＦで形質転換されたピキア・パストリスの成長培地によって誘導された骨髄増殖対ＧＳ１１５／Ｈｉｓ⁺Ｍｕｔ^-アルブミン分泌染色のグラフである。図４は、±２０μｇ／ｍｌのｃＭＧＦで培養された骨髄細胞による、ウサギ抗ＳＲＢＣＩｇＧでオプソニン化されたヒツジ赤血球のＦｃ受容体を介した食作用のグラフである。図５は、±２０μｇ／ｍｌのｃＭＧＦで培養された骨髄細胞による、ＩＳで誘導された亜硝酸生成のグラフである。図６は、±２０μｇ／ｍｌのｃＭＧＦで培養された骨髄細胞による、ホルボールエステルで誘導されたスーパーオキシド生成のグラフである。図７は、示されている用量のｃＭＧＦで４８時間培養された骨髄細胞による、ウサギ抗ＳＲＢＣＩｇＧでオプソニン化されたヒツジ赤血球のＦｃ受容体食作用のグラフである。図８は、示されている用量のｃＭＧＦで４８時間培養された骨髄細胞による、ＩＳ（ＰＡ−１４Ａ、２．５μｇ／ｍｌ）で誘導された亜硝酸生成のグラフである。図９は、２．５μｇ／卵の酵母に発現されるアルブミン又は２．５μｇ／卵、０．２５μｇ／卵及び０．０２５μｇ／卵のピキア・パストリスに発現されたｃＭＧＦを第１８日に注入された卵の孵化後４日に採血された雛のプールされた血から単離された付着精製抹消血単核白血球による、ＰＭＡ誘導性スーパーオキシド生成のグラフである。図１０は、０．１ＵのＩＳ、０．２５μｇの酵母に発現されるアルブミン、及び０．２５μｇ又は０．０５μｇのｃＭＧＦのいずれかが注入された卵から孵化した日齢雛から取り出された１２本の大腿骨から得られた全プール骨髄細胞総数のグラフである。図１１は、０．１ＵのＩＳ、０．２５μｇの酵母に発現されるアルブミン、及び０．２５μｇ又は０．０５μｇのｃＭＧＦのいずれかが注入された卵から孵化した日齢雛から取り出された１２本の大腿骨から得られた付着精製骨髄細胞による、ホルボールエステルに誘導されたスーパーオキシド生成のグラフである。発明の詳細な説明本明細書において用いられる「卵内(in ovo)」という用語は、孵化前の卵に入っている鳥類を指す。したがって、本発明は、卵の処置方法及び鳥類の処置方法の両者として考えることができる。本発明は、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、及びキジの卵を含むあらゆる鳥の卵で実施することができる。ニワトリの卵が好ましい。本発明の方法によって処置される卵は受精卵である。卵は孵卵期間のいかなる時点で処置することも可能であるが、孵卵の第４四半期に処置することが好ましく、孵卵第１８日目（すなわち、胚発生の第１８日目）付近で処置することが最も好ましい。「鳥類ＭＧＦ」という用語は、あらゆる鳥類種によって生成されるＭＧＦに対応するＭＧＦに用いられる。「鳥類」という用語は、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、及びキジを含むが、これらに限定されるものではない全ての鳥類種を包含することが意図されている。様々な種の鳥類ＭＧＦが公知である。また、この用語は、それらの活性断片及び類似体を含むことも意図されている。ＭＧＦはあらゆる適切な薬学的に許容し得る担体中に供与することができるが、リン酸緩衝生理食塩液のような水性担体中に供与することが好ましい。ＭＧＦの卵内投与は、様々な有用な結果を提供する。例えば、ＭＧＦの卵内投与は、孵化した雛の成長を高めることに用いることができる。加えて、ＭＧＦの卵内投与は骨髄細胞の増殖を高めることに用いることが可能であり、これは初期段階で免疫系をより十分に発達させる（すなわち、その鳥の免疫能の発現を促進する）。上述のように、ＭＧＦの卵内投与は、大腸菌感染（すなわち、鳥類大腸敗血症）またはサルモネラ感染のような鳥における細菌感染の進行を阻害する方法を提供する。同じく上述されるように、ＭＧＦの卵内投与は、鳥におけるウイルス感染（例えば、感染性嚢性疾患ウイルス感染、ニューキャッスル病ウイルス、マレック病ウイルス等）の進行を阻害する方法、真菌感染の進行を阻害を方法、及び原虫感染（例えば、鳥類コクシジウム症におけるアイメリア・テネラ（Ei meria tenella）のようなアイメリア種）を阻害する方法を提供する。ＭＧＦは、前述の感染に対して鳥を保護するのに有効なワクチン（例えば、生ワクチン又は複製しない免疫原）と共に投与することができる。ＭＧＦは、殻を通して化合物を運ぶいかなる手段によっても卵に投与することができる。しかしながら、好ましい投与方法は注入によるものである。ＭＧＦは卵のいかなる部位にも注入することができる。好ましくは、注入部位は、羊水及び胚それ自体を含む卵黄嚢内の羊膜によって決定される領域、又は気室のいずれかの内部である。孵卵の第４四半期の初めには、羊膜が十分広がっていて、その卵の大きい端部の中心からその長軸に沿って注入を行うほとんど全ての時に、羊膜を確実に通過することができる。本明細書に記述される方法を実施するのに用いられるＭＧＦの投与量は重要ではなく、慣例的な方法で決定することができる。一般に、投与量は処置している鳥の種、投与時期及び部位、並びに所望の効果に応じて変化する。投与量の上限は慣例的に決定することができるが、一般には、被験体当たり（すなわち、卵内注入当たり、つまり卵当たり）１０μｇ以上もしくは１００μｇ以上である。投与量の下限も同様に慣例的に決定することができるが、被験体当たり１０００ｎｇ以下もしくは１ｎｇ以下でよい。注入の機構も重要ではない。使用される方法は、その処置が孵化率を下げることがないように、胚又はそれを包む胚体外膜の組織及び器官を過度に傷つけないことが好ましい。約１８〜２２ゲージの針を付けた皮下注射器が適切である。気室に注入するには、卵に針を約２ｍｍだけ挿入することが必要である。卵の大きな端部の中心から十分に挿入した場合、１インチ針は殻、気室を包む外卵殻膜及び内卵殻膜、並びに羊膜を突き抜ける。発育の正確な段階及び胚の位置に応じて、この長さの針は雛の上部の液体中又は雛自体の内部のいずれかで止まる。針による損傷又は針先の切れ味が悪くなるのを防ぐために、針を挿入する前に殻を通して先導孔を押し抜くか穿孔することができる。所望であれば、ワックスのような十分に細菌を通さないシーリング材で卵を密封して不所望の細菌が続いて侵入することを防ぐことができる。鳥類の胚用の高速自動化注入システムが本発明の実施に特に適していることが想像される。例としてはHebrankの米国特許4,903,635号及び4,681,063号、Lewis の米国特許5,056,464号、並びにMillerの米国特許4,040,388号、4,469,047号及び4,593,646号に開示されるものである、多くのそのような装置が利用可能であり、これらの引例は、参照することによりその全体を本明細書にそのまま組込むものとする。このような装置の全ては、本発明を実施する際には、本明細書に記述される鳥類ＭＧＦを収容し、その装置によって運ばれる卵に鳥類ＭＧＦを注入する位置におかれたインジェクターを含む。この装置の他の特徴は上記に論じられている。加えて、所望であれば、注入後の卵の穴を密封するためにその注入装置と作動可能に連動する密封装置を備えていてもよい。本発明の実施に好ましい装置は、Hebrankの米国特許4,903,635及びLewisの米国特許5,056,464号に開示されており、これらの引例は、参照することによりその全体をそのまま本明細書に組み込むものとする。これらの装置は、液状物質を複数の卵に分配するための注入装置及びその注入装置に対して卵を並べるための装置を有する。これらの装置の特徴は、本発明を実施するための上述の装置の特徴と合わせることができる。本発明の実施においては、注入された卵を孵卵して孵化させ、その鳥を少なくとも２週齢まで成長させる。ニワトリ骨髄単球性成長因子（ｃＭＧＦ）及びそれをコードするＤＮＡが公知である（Leutz et al.，ENBO J 3,3191-3197(1984)、Leutz et al.，ENBO J 8,1 75-181(1989)）。したがって、本発明の実施に用いられるＭＧＦタンパク質は、当該技術分野において周知の技術で、又は当業者には容易に理解されるそれらの変法によって作製することができる。遺伝子工学的手法による組換えＤＮＡ、ベクター、宿主細胞、及びタンパク質の生成は公知である。例えば、Bellらの米国特許4,761,371号の第６欄第３行から第９欄第６５行、Clark et al．の米国特許 4,877,729号の第４欄第３８行から第７欄第６行、Schillingの米国特許4,912,03 8号の第３欄第２６行から第１４欄第１２行、及びWallnerの米国特許4,879,224 号の第６欄第８行から第８欄第５９行を参照のこと。ＭＧＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野において周知のように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法及び重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）を用いることにより回収することができる。Mullis et al．の米国特許 4,683,195号及びMullisの米国特許4,683,202号を参照のこと。ＭＧＦタンパク質は、そのＭＧＦタンパク質をコードするＤＮＡを有するベクターで形質転換された宿主細胞において合成することができる。ベクターは複製可能なＤＮＡ構成物である。ベクターは、ここでは、ＭＧＦタンパク質をコードするＤＮＡの増幅及び／又はＭＧＦタンパク質をコードするＤＮＡの発現に用いられる。発現ベクターは複製可能なＤＮＡ構成物であって、この構成物では、ＭＧＦタンパク質をコードするＤＮＡが適切な宿主中でそのＭＧＦタンパク質の発現を起こすことが可能な適切な制御配列に作動可能であるように結合している。このような制御配列に対する要求は、選択された宿主及び選択された形質転換法に応じて変化する。一般に、制御配列には、転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列が含まれる。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。通常、複製起点によって与えられる宿主での複製能力、及び形質転換体の識別を容易にする選択遺伝子が、必要なものの全てである。本発明の実施に有用なベクターには、プラスミド、ウイルス（ファージを含む）、レトロウイルス、及び組込み可能なＤＮＡ断片（すなわち、相同組換えにより宿主のゲノムに組込むことが可能な断片）が含まれる。ベクターは宿主のゲノムとは無関係に複製して機能し、又は、時には、ゲノム自体に組込まれる。適切なベクターは、目的とする発現宿主に適合する種に由来するレプリコン及び制御配列を有する。形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ手法を用いて構築されたＭＧＦタンパク質ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている細胞である。形質転換された宿主細胞は、通常、ＭＧＦタンパク質を発現するが、ＭＧＦタンパク質ＤＮＡのクローニング又は増幅のために形質転換された宿主細胞はＭＧＦタンパク質を発現する必要はない。ＤＮＡ領域は、それらが機能的に関連する場合には、互いに作動可能であるように結合している。例えば、プロモーターは、それがコード配列の転写を制御する場合には、その配列に作動可能であるように結合し、リボソーム結合部位はそれが翻訳されるように位置する場合には、コード配列に作動可能に結合する。一般には、作動可能であるように結合するというのは、隣接していることを意味し、リーダー配列の場合には、隣接し、かつ読み枠内にあることを意味する。適切な宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞、又は高等な真核細胞が含まれる。原核細胞には、グラム陰性微生物又はグラム陽性微生物、例えば、大腸菌（E.co li）又はバチルスが含まれる。高等な真核細胞には、以下に記述される哺乳動物起源の確立された細胞系が含まれる。宿主細胞の例は、大腸菌 W3110(ATCC 27,3 25)、大腸菌Ｂ、大腸菌 X1776(ATCC 31,537)、及び大腸菌 294(ATCC 31,446)である。シュードモナス種、バチルス種、及びレイ菌も適切である。適切な微生物ベクターの様々なものが利用可能である。一般には、微生物ベクターは、目的とする宿主によって識別される複製起点、その宿主内で機能するプロモーター、及び耐抗生物質性を提供し、又は栄養要求性を付与するタンパク質をコードする遺伝子のような表現型選択遺伝子を有する。他の宿主に対しては、類似の構成物が作製される。大腸菌は、典型的には、ｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。Bolivar et al.，Gene 2,95(1977)を参照のこと。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を有し、したがって、形質転換細胞を同定する簡便な手段を提供する。発現ベクターは、宿主生物によって識別されるプロモーターを有する必要がある。これは、一般には、目的とする宿主から得られるプロモーターを意味する。組換え微生物発現ベクターにおいて最も一般的に用いられるプロモーターは、β ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系（Chang et al. , Nature 275,615(1978)、及びGoeddel et al.，Nature 281,544(1979)）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al.，Nucleic Acids Res．8 ,4057(1980)及びＥＰＯ出願公開36,776号）並びにｔａｃプロモーター（H.DeBoe r et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,21(1983)）を有する。通常はこれらが用いられるが、他の微生物プロモーターも適切である。多くのヌクレオチド配列に関する詳細が公開されており、これが、熟練研究者がそれらをプラスミドまたはウイルスベクター内でＭＧＦタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能であるように結合することを可能にしている（Siebenlist et al.，Cell 20,269(1980)）。プロモーター及びシャイン・ダルガノ配列（原核宿主の発現用）は、ＭＧＦタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能であるように結合する。すなわち、それらは、ＤＮＡからＭＧＦタンパク質の伝令ＲＮＡの転写を促進するように位置する。酵母培養物のような真核微生物は、適切なＭＧＦタンパク質をコードしているベクターで形質転換することができる。例えば、米国特許4,745,057号を参照のこと。多くの他の株が通常利用可能ではあるものの、下等真核宿主微生物の中で酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）が最も一般的に用いられる。酵母ベクターは、２ミクロン酵母プラスミド又は自律複製配列（ＡＲＳ）に由来する複製起点、プロモーター、ＭＧＦタンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化及び転写終了のための配列、並びに選択遺伝子を有することができる。プラスミドの例は、ＹＲｐ７（Stinchcomb et al.，Nature 289,39(1979)、Kingsman et al.，G ene 7,141(1979)、Tschemper et al.，Gene 10,157(1980)である。このプラスミドは、トリプトファン中での成長能力を欠く酵母の変異株、例えばATCC 44076、すなわちＰＥＰ４−１（Jones，Genetics 85,12(1977)）、に対する選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を有する。酵母宿主細胞ゲノム内のｔｒｐ１に損傷があると、トリプトファンの非存在下における成長によって形質転換の検出に効果的な環境が提供される。酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzeman et al.，J.Bio l.Chem．255,2073(1980)）又は、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのような他の解糖酵素（Hess et al.,J.Adv.Enzyme Reg．7，149(1968)及びHolland et al.，Bioc h emistry 17,4900(1978)）のプロモーターが含まれる。酵母の発現に置いて用いられる適切なベクター及びプロモーターは、R.Hitzeman et al.、ＥＰＯ公開73, 657号にさらに説明されている。特に好ましい酵母宿主細胞はピキア・パストリスであり、これは適切な形質転換ベクターと一緒に米国特許4,683,293号、4,808,537号、4,812,405号、4,818,7 00号、4,837,148号、4,855,231号、4,857,467号、4,879,231号、4,882,279号、4 ,885,242号、4,895,800号、4,929,555号、5,002,876号、5,004,688号、5,032,51 6号、5,122,465号、5,135,868号、及び5,166,329号に記述されている。これらの出願は引用することにより本明細書にそのまま組込むことを特に意図している。多細胞生物に由来する細胞の培養物は、ＭＧＦタンパク質合成の望ましい宿主である。原理的には、脊椎動物の培養物に由来するものであろうと、昆虫細胞を含む非脊椎動物の培養物に由来するものであろうと、あらゆる高等真核細胞培養物が使用可能である。しかしながら、実施例で説明されるように、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の細胞培養における増殖は慣例的な手順になっている。Tissue Culture，Academic Press，Kruse and Patterson，editors(1973)を参照のこと。有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、並びにＷＩ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＣＶ、及びＭＤＣＫ細胞系である。このような細胞に対する発現ベクターは、通常、（必要であれば）複製起点、発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーターを、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位（イントロンを含むゲノムＤＮＡが用いられる場合）、ポリアデニル化部位、及び転写終了配列と共に有する。脊椎動物細胞の形質転換に用いられる発現ベクター内の転写配列及び転写制御配列は、しばしばウイルス源から得られる。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導される。例えば、米国特許4,599,308号を参照のこと。初期及び後期プロモーターは、この両者がＳＶ４０ウイルス性複製起点をも有する断片としてウイルスから容易に得ることができるため有用である。Fiers et al.，Nature 273 ,113(1978)を参照のこと。実施例に記述されるように、ワクチニアウイルスを用いることが可能である。さらに、ＭＧＦタンパク質プロモーター、制御及び／又はシグナル配列も、このような制御配列が選択された宿主細胞に適合する限り、用いることができる。複製起点は、ＳＶ４０または他の源（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、もしくはＢＰＶ）から派生され得るような外来性の起点を含めるようにベクターを構成することにより、あるいは宿主細胞の染色体複製機構により、備えることができる。ベクターが宿主細胞の染色体に組込まれる場合には、後者で十分である。ウイルス性複製起点を有するベクターを用いるのではなく、選択可能なマーカー及びＭＧＦタンパク質ＤＮＡを用いる同時形質転換法により哺乳動物細胞を形質転換することができる。適切な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はチミジンキナーゼである。米国特許4,399,216号を参照のこと。このようなマーカーは、形質転換体細胞、すなわち外来性ＤＮＡを取り込むのに適当な細胞の同定を可能にするタンパク質、一般には酵素である。一般には、同定は、毒性であるか、あるいはマーカータンパク質を取り込むことなくしては細胞を得ることができない臨界栄養の培養培地中において、形質転換体が生存するかどうかに基づく。 Smith et al．の米国特許4,745,051号及び4,879,236号に記述されるように、昆虫細胞（例えば、培養されたスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugi perda）細胞）のような宿主細胞及びバキュロウイルス発現ベクター（例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）ＭＮＰＶ、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）ＭＮＰＶ、ラキプルシア・オウ（Rachiplusia ou ）ＭＮＰＶ、もしくはガレリア・オウ（Galleria ou）ＭＮＰＶから誘導されるベクター）のような発現ベクターを本発明の実施において用いることができる。一般には、バキュロウイルス発現ベクターは、多角体の多角体転写開始シグナルからＡＴＧ開始部位の範囲で、バキュロウイルス多角体プロモーターの転写制御下にある位置に挿入されている発現させようとする遺伝子を含むバキュロウイルスゲノムを有する。次の例は本発明を説明するために提示されており、それらを限定することを意図するものではない。これらの例において、ｂｐは塩基対を、ｈｒは時間を、ｋＤａはキロダルトンを、Ｍはモル濃度を、μｇはマイクログラムを、ｍｌはミリリットルを、ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムを、ＩＰＴＧはイソプロピル−β −Ｄ−チオピラノシドを、ＲＰＭＩはローズウェルパーク記念研究所(Rosewell Park Memorial Institute)を、ＦＢＳは仔ウシ血清を、ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィーを、ＲＰ−ＨＰＬＣは逆相高速液体クロマトグラフィーを、ｎｇはナノグラムを、ＹＥＡは酵母により発現されたアルブミンを、Ｕは単位を、ＩＭは筋肉内を、μＬはマイクロリットルを、ｍｇはミリグラムを、ｃｆｕはコロニー形成単位を、及び°Ｆは華氏を意味する。例１ニワトリ骨髄単球性成長因子のクローニングこの例では、ヌクレオチド１１４にLeutzによって報告されたＴではなくＣが見出されたことを除いては、Leutz et al.，ENBO J 8,175-181(1989)に記述されたｃＭＧＦをコードするＤＮＡの単離が記述される。グアナジニウムイソチオシアネートで溶解したコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激した、６週齢のレグホンから単離された脾臓細胞から全ＲＮＡを調製した。このように調製された全ＲＮＡをｃＭＧＦ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅することにより、〜５６０ｂｐの期待されるサイズのバンド及び〜８００ｂｐを超えるバンドが得られた。両バンドはＣｏｎＡで４８時間刺激した脾臓細胞に特異的であり、対照実験に又は２４時間だけ刺激した脾臓細胞では増幅しなかった。内部ｃＭＧＦプライマー４をｃＭＧＦプライマー６と共に用いる５６０ｂｐバンドの第２段階のＰＣＲ増幅により、期待されるサイズの生成物が得られた。この５６０ｂｐバンドをインビトロジェンｐＣＲＩＩベクターにサブクローニングした。５６０ｂｐのＰＣＲ生成物を含む３つのクローンのＤＮＡ配列解析により、真のｃＭＧＦのｃＤＮＡがクローニングされていることが確認された。この配列は公開された配列とは１塩基対異なっている（上述のＴ→Ｃの変化）。これはアミノ酸レベルの変化を生じることはなく、おそらくはニワトリの系列の間の自然発生的な遺伝的多型であることを示している。例２大腸菌におけるニワトリＭＧＦの発現成熟ｃＭＧＦタンパク質のｃＤＮＡをコードする５６０塩基対ＰＣＲ生成物を、大腸菌（E.coli）発現ベクターｐＥＴ３Ａ、Ｂ＆Ｃにサブクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌宿主株の成長培養物にイソプロピル−β−Ｄ−チオピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してＴ７ポリメラーゼを誘導した。このＴ７ポリメラーゼは、次に、プラスミド中の標的ＤＮＡを転写する。Ｎｄｅｌ及びＢａｍＨＩ部位を用いてｐＥＴ３Ａ、Ｂ＆ＣにクローニングされたｃＭＧＦ組換え体は、いかなるＩＰＴＧ誘導性ｃＭＧＦ発現も表さなかった。ＢａｍＨＩ部位を用いることにより、遺伝子１０のタンパク質の最初の１１アミノ酸と融合した形でｃＭＧＦタンパク質の翻訳が可能となる。これによってより効率的な翻訳が可能であり、発現されたタンパク質に安定性をもたらす。ｃＭＧＦクローンをｃＭＧＦプライマー１＋６で再増幅してＢａｍＨＩ部位を加工し、それをｐＣＲＩＩにサブクローニングした。ｃＭＧＦのｃＤＮＡをｐＥＴ３ＡベクターのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。次に、正しい向きにある組換え体を、Ａｖａｌ消化により同定した。このｐＥＴ３Ａ−ｃＭＧＦ−ＢａｍＨＩプラスミドで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞においてＩＰＴＧ誘導性の〜２１ｋＤａのバンドが観察された。これら３種類のクローンの対数増殖期にある培養物をＩＰＴＧの添加により誘導し、ｐＥＴ３ＡベクターのＢａｍＨＩ部位にクローニングされているポジティブコントロールであるタンパク質ｇＣａｐ４１の発現に適していることが従来見出されている条件下で３時間増殖させた。これらの大腸菌をペレット化し、ＳＤＳサンプルバッファー中で可溶化して、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１）。完全なｃＭＧＦコード配列から誘導されたｍＲＮＡのin vitroでの翻訳の間に、２３アミノ酸シグナル配列が切り出されている２６．５ｋＤａの前駆体が合成され、膜の存在下において、ｃＭＧＦが２つのＮグリコシル化部位でグリコシル化されて２８ｋＤａの成熟ｃＭＧＦが生じる。成熟ｃＭＧＦタンパク質の計算上の分子量は〜２０．０１４ｋＤａであり、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるものよりも約４ｋＤａ小さい。超音波処理またはデオキシコレートでの穏やかな界面活性剤による溶解により細胞を破壊し、次いで遠心して可溶性画分及び不溶性画分を分離した。その後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、推定ｃＭＧＦタンパク質が可溶性画分又は不溶性画分のいずれに発現しているのかを決定した。両細胞溶解法からの結果は、ｃＭＧＦが不溶性画分、おそらく封入体に優先的に含まれることを示した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから溶離された天然ｃＭＧＦ及びｒｃＭＧＦ−ｔｒｐＥはニワトリ骨髄細胞における造血性コロニーの増殖を刺激し、これは生物学的活性がＳＤＳによっては破壊されないことを示す。しかしながら、その生物学的活性は、還元剤に曝すことに対しては感受性であることが見出された。封入体に向けられたｒｃＭＧＦ−ｇ１０は、封入体を５０％グリセロールで洗浄し、５％ＳＤＳ中でその封入体を可溶化することにより回収した。ＨＰＬＣ及びＰｉｅｒｃｅ(Rockford，Illinois，USA)からのＤＥＴＯＸＩ−ＧＥＬ^TMカラムによるＳＤＳ及び汚染細菌ＬＰＳの除去の後の推定ｃＭＧＦ−ｇ１０タンパク質の再折り畳みに、幾つかの方法が試みられた。２１ｋＤａの推定ｃＭＧＦバンドの存在がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより各方法について確認されたが、骨髄増殖検定において活性を示すサンプルはなかった。しかしながら、ＲＰＭＩ１６４０培地＋ゲンタマイシン中で２〜３ｍｍ²のゲルスライスを一晩インキュベートすることによる、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの２１ｋＤａ推定ｃＭＧＦバンドの溶出は、骨髄増殖検定において活性を示した。これに対して同じゲルからの４１ｋＤａのｇＣＡＰバンドは活性を示さなかった。図２を参照のこと。２１ｋＤａのｃＭＧＦタンパク質を含む、０．１％トリトンＸ−１００で洗浄した封入体を５％のＳＤＳ、８Ｍの尿素及び６Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌ中で可溶化し、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。全ての可溶化法に対して等しいクロマトグラフィープロフィールが得られ、２１ｋＤａのｃＭＧＦタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定された。乾燥したＲＰ−ＨＰＬＣ精製ｃＭＧＦタンパク質を、ＳＤＳ、トリトンＸ−１００、リン酸二カリウム及びオクチル− β−グルコシドを含む異なる手法で可溶化した。界面活性剤が可溶化の最も有効な方法であるものと決定された。可溶化ｃＭＧＦ・封入体のサイズ排除分析により、そのタンパク質が大きな凝集体として溶出するが、そのカラムの移動相に１０％エタノールを添加すると、ｃＭＧＦの溶出プロフィールをよりモノマーに近いものに大きく変化することが示された。例３ピキア・パストリスにおけるニワトリＭＧＦの発現ピキア・パストリスはメタノール栄養性(metylotropic)であり、したがってメタノールを単独の炭素源として代謝することが可能であり、かつ哺乳動物系と同様のグリコシル化を伴ってタンパク質産物を生成する。タンパク質産物を細胞内に生産し、又は分泌させるプラスミドを利用することができる。この系における異種タンパク質発現は厳しく制御されており、成長培地にメタノールを添加することにより非常に高いレベルで誘導される。ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ^Rから入手可能なピキア・パストリス発現キットを用いた（電話番号602-748-4400）。ｃＭＧＦクローンをプライマ７＋６で再増幅してＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位を加工し、２つのピキア発現ベクター、ｐＰＩＣ９及びｐＨＩＬ−Ｓ１にサブクローニングした。これら両者は、それぞれ、α交配因子又は酸ホスファターゼ遺伝子からのシグナルペプチドを伴う分泌型融合タンパク質産物を生成する。最初に、そのＰＣＲ産物をｐＣＲＴＭＩＩベクターにサブクローニングした。ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＩ単独での消化により、正しいサイズの挿入断片が生じた。このｃＭＧＦ挿入断片をフェノール／クロロホルム法を用いて低融点アガロースゲルから単離し、ｐＰＩＣ９ベクターのＥｃｏＲＩ部位又はｐＨＩＬ−ＳＩのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにライゲートした。このライゲーションをＤＨ５αｆ’に形質転換し、選択培地上に塗布した。ＤＮＡを制限消化することにより、潜在的なｃＭＧＦサブクローンを確認した。各タイプのクローンの１つをさらに分析するために選択した。ｐＰＩＣ９−ｃＭＧＦ及びｐＨＩＬ−ＳＩ−ｃＭＧＦにおける正しい向きのｃＭＧＦを、酵素Ａｖａｌ及びＢｇｌＩＩで消化することによりチェックした。これらのクローンの５’末端のＤＮＡ配列決定により、これらのクローンが正確にサブクローニングされ、ｃＭＧＦのｃＤＮＡが分泌のためのピキアベクターのシグナル配列を伴って読み枠内にあることが確認された。チモラーゼで処理することにより、ＧＳ１１５（Ｈｉｓ^-）株からスフェロプラストを調製した。このピキア・スフェロプレートを、ｐＰＩＣ９及びｐＨＩＬＳ１にサブクローニングされたｃＭＧＦのＢｇｌＩＩ消化物で形質転換した。この形質転換された酵母を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから提供された形質転換及び分泌の陽性対照と共に選択培地上に塗布した。ピキアＧＳ１１５（Ｈｉｓ^-）は、遺伝子ＨＩＳ４でコードされるヒスチジナールデヒドロゲナーゼ活性を欠如していた。この欠如は、この株を、ヒスチジンが補足されている複合培地又は無機質培地で成長することを可能にした。ＧＳ１１５（Ｈｉｓ^-）がＨＩＳ４遺伝子を有するプラスミドで形質転換される場合には、この形質転換体は、ヒスチジンが補足されていない無機質培地で成長するそれらの能力により選択される。次に、形質転換体を選択培地に塗布した。これにより、ｃＭＧＦ遺伝子が酵母のゲノムに安定に組込まれている組換え体が同定できた。ｐＨＩＬＳ１−ｃＭＧＦ及びｐＰＩＣ９−ｃＭＧＦベクターでの形質転換から、幾つかの潜在的なｃＭＧＦ組換えクローンが選択された。これらのクローンをメタノールの存在下において液体培地中で成長させ、発現と培地中への組換えタンパク質の分泌を誘導した。各組換えクローンからの培養培地の上清を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。それらの結果により、〜２５及び２９ｋＤａ（未変性ｃＭＧＦのグリコシル化形態のサイズ）の２種類の優勢タンパク質を発現する５種類の潜在的なｃＭＧＦクローンが明らかになった。この５種類の潜在的な陽性サンプルを骨髄増殖検定においてin vitroでの活性について試験し、生物学的に活性であることが見出された。タンパク質の発現を、前に同定された５種類のｃＭＧＦ発現クローンのうちの４種類及びネガティブコントロールとして含められたアルブミン発現形質転換体を用いる４０ｍＬ、２日間の誘導培養にスケールアップした。この酵母メタノール成長培地は骨髄細胞の増殖を阻害するため、サンプルをＡＭＩＣＯＮ^TMの１０ｋ及び１００ｋのＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰＴＭ限外濾過器で処理して酵母培地をＲＰＭＩ培地に交換し、サンプルを濃縮した。この骨髄増殖検定の結果が図３に報告されている。ｃＭＧＦで形質転換された全ての酵母サンプルは、骨髄増殖検定における活性を示した。これに対して、アルブミン対照は増殖応答を示さなかった。最初の２日間の誘導期間の後に活性を示した４種類のクローンをさらに２日間誘導し、その上清を上述のように超音波処理した。第２〜第４日に誘導されたものと比較して、最初の２日間誘導したサンプルに活性の相違は観察されなかった。加えて、１００ｋ残留物及び１０ｋ濾過画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び骨髄増殖検定で分析した。形質転換された酵母成長培地から生物学的に活性な分泌ｃＭＧＦを回収するため、１００ｋ濾過を省き、かつ早期洗浄工程で１０％エタノールを使用して、バッファ交換及び濃縮手順を変更した。この新しい手順により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した場合に２５及び２９ｋＤａの推定ｃＭＧＦバンドを有し、ＲＰ− ＨＰＬＣで分解することが可能な物質が生成した。ＲＰ−ＨＰＬＣの後に集められた画分のうちの１つは骨髄増殖検定で活性であり、２つのｃＭＧＦバンドを有していた。このピキア発現系において、酵母の染色体に組込まれている遺伝子の複数のコピーは、しばしば高レベルのタンパク質発現を生じる結果となる。したがって、各陽性クローンにおけるｃＭＧＦ遺伝子のコピー数を決定するのに、サザンブロッティング法を用いた。これらの結果は、全てのｃＭＧＦ発現クローンが遺伝子カセットの１コピーを有することを示した。細胞培養条件をｃＭＧＦ産物の生成の増加に最適化することにも焦点が当てられ、１つのｐＰＩＣ９−ｃＭＧＦ発現クローンが４０．０Ｌ培養へのスケールアップのために選択された。細菌汚染を防ぐためにゲンタマイシンを添加した。得られた結果は、２日間のメタノール誘導が最適であることを示すように思われた。例４培養された骨髄細胞におけるｃＭＧＦが誘導するマクロファージの機能的応答の増強ニワトリ骨髄細胞をＲＰＭＩ１６４０培地＋５％ＦＢＳ±２０μｇ／ｍｌｃＭＧＦで培養し、時間０並びに培養の１日後、２日後、３日後、及び４日後のＦｃ受容体介在食作用、ＩＳ誘導亜硝酸塩生成及びホルボールエステル誘導スーパーオキシド生成を行うそれらの能力について検定した。それらの結果は図４に報告されている。培養培地中にｃＭＧＦが存在することにより、Ｆｃ受容体介在食作用及びＩＳ誘導亜硝酸塩生成の獲得が大きく促進され、高められている。図４及び５を参照のこと。しかしながら、ホルボールエステル誘導スーパーオキシド生成は、ｃＭＧＦの存在には影響を受けない。図６を参照のこと。これらの結果は、ピキア・パストリスが生成する組換えｃＭＧＦが、骨髄細胞の増殖及びマクロファージの機能的応答の獲得の両者を刺激することを示している。例５ in vivo 及び卵内(in ovo)で使用するためのｃＭＧＦの回収消費された形質転換酵母成長培地からピキア・パストリスが発現した生物学的に活性なｃＭＧＦを回収するため、サンプルをＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ^TM１０ｋ濾過器（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて処理して酵母培地を交換し、その中のタンパク質を濃縮した。早期洗浄工程において１０％エタノールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、次いで最終洗浄においてＰＢＳのみを用いる限外濾過により酵母培地を交換した。得られた生成物を、以下に記述されるin vivo及び卵内での実験において、その調製品中の全タンパク質の量を示す量で用いた。例６ in vitro でのｃＭＧＦの活性以前のデータはｃＭＧＦのクローニング及び発現を記述し、ピキア・パストリスに発現されるｃＭＧＦを用いるin vitroでの骨髄細胞の処理の効果に対する初期実験を記述していた。この初期実験は、これらの細胞の増殖及び成熟マクロファージの機能的応答の獲得を示した。これらの研究を拡張し、幾つかの予備的な in vivoでのデータを集めた。培地中でのマイクログラム量のｃＭＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）の存在により、ＢＭ細胞培養の最初の２日間にわたり、Ｆｃ受容体介在食作用及びＩＳ誘導亜硝酸塩生成の獲得が大きく促進され、高められた。ホルボールエステル誘導スーパーオキシド生成に対するｃＭＧＦの効果はより複雑であるように思われ、依然として評価の対象である。ＢＭ培養におけるｃＭＧＦが誘導する成熟マクロファージの機能的応答の獲得についての用量応答を決定するため、細胞をＲＰＭＩ１６４０培地＋５％ＦＢＳ及び示されている用量のｃＭＧＦで４８時間培養し、Ｆｃ受容体介在食作用（図７）、ＩＳ誘導亜硝酸塩生成（図８）及びホルボールエステル誘導スーパーオキシド生成（データは示さず）を行うそれらの能力について検定した。ＢＭ細胞における培養４８時間後の、ｃＭＧＦが誘導するＦｃ受容体介在食作用及びＩＳ誘導亜硝酸塩生成の獲得は用量依存性であり、これはｃＭＧＦ濃度の１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲から始まり、１〜２μｇ／ｍｌの範囲で最大刺激に到達する。培養したＢＭ細胞のＰＭＡ誘導スーパーオキシド産性に対するｃＭＧＦの効果は、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で刺激し、５００ｎｇ／ｍｌ以上の用量で阻害するという、やはり複雑なものであった。ｃＭＧＦが誘導するＢＭ細胞の増殖もナノグラムの範囲で開始された（データは示さず）。したがって、ピキア・パストリスが生成する組換えｃＭＧＦは、骨髄細胞の増殖及び成熟マクロファージの機能的応答の獲得の両者を刺激する。他のサイトカイン類に加えてｃＭＧＦを含有するコンカナバリンＡで刺激された脾臓細胞のコンディションドメディウム（ＩＳ）も骨髄細胞の増殖を刺激する。培地単独又は培地＋ＩＳ、ｃＭＧＦもしくは酵母に発現されるアルブミンのいずれか２．５μ ｇ／ｍｌにおけるＢＭ細胞の４８時間培養の効果の比較は、培地単独と比較した場合ｃＭＧＦ及びＩＳの両者が増殖を誘導するが、高用量のアルブミンも幾らかの増殖を誘導することを示した（データは示さず）。ＢＭ培養における成熟マクロファージの機能的応答の獲得に対するｃＭＧＦ、ＩＳ、及び酵母に発現されるアルブミンの効果の比較を行った。Ｆｃ受容体介在食作用の増強がアルブミンで１６％、培地単独で５％及びＩＳで２．５％であるのに対して、ｃＭＧＦは３７％で最も効率的であった（データは示さず）。ｃＭＧＦ及びＩＳ処理の両者は、アルブミン及び培地培養細胞に対して、ＩＳ誘導亜硝酸塩生成を大きく刺激した（データは示さず）。ｃＭＧＦ、ＩＳ、及びアルブミン処理は、培地培養細胞に対して、全てＰＭＡに誘導されたスーパーオキシド応答を高めた（データは示さず）。したがって、ピキア・パストリスが生成する組換えｃＭＧＦは、骨髄細胞の増殖及び成熟マクロファージの機能的応答の獲得の両者を刺激する。他のサイトカイン類（ＩＬ−２及びＩＦＮなど）に加えてｃＭＧＦを含むＩＳも、骨髄細胞の増殖及び成熟マクロファージの機能的応答の獲得の両者を刺激する。しかしながら、ＩＳでのＢＭの処理は、ＩＳで培養された腹腔に誘導されたマクロファージで以前になされた観察と同様に、Ｆｃ受容体介在食作用に対して効果がないか、もしくはこれを阻害した。したがって、ｃＭＧＦの卵内に送達することにより、雛がより多数の機能的に活性化されたマクロファージを備えて孵化する結果を生じるものと思われる。このより多数の機能的に活性化されたマクロファージは、細菌感染により良好に対処することが可能であり、その免疫応答の調節における中心的な役割を果たす。例７卵内でのｃＭＧＦ：孵化後の末梢血単核白血球に対する効果孵卵の１８日目に酵母に発現されるアルブミンを２．５μｇ／卵、又は酵母に発現されるｃＭＧＦを０．０２５μｇ／卵、０．２５μｇ／卵、もしくは２．５ μｇ／卵のいずれかを卵に注入し、これらの卵から孵化した雛を飼育して、各処理群からの５羽の雛から孵化後１、４、及び７に採血した。血液塗抹標本を調製して、白血球の分化総数を評価した。その結果を以下の表１に示す。孵化後第１日に、担体（アルブミン２．５μｇ）、ｃＭＧＦ０．２５μｇ及びｃＭＧＦ２．５μｇ処置の５羽の雛のうちの１羽並びにｃＭＧＦ０．０２５μｇ処置の５羽のうちの５羽において、異常な白血球比が明白であった。卵内でのｃＭＧＦ０．０２５で顆粒球が増加し、これが赤芽球のレベルを高めた。孵化後第４及び第７日には白血球分化総数に対する効果はないことが明らかであった。処置群当たり５羽の雛について、パーコール勾配上で遠心することにより、プールされた血から末梢血単核白血球（ＰＢＬ）を調製し、得られたＰＢＬを組織培養物中に入れて２時間付着させた。激しく洗浄することにより付着していない細胞を除去し、得られた白血球の付着集団をＦｃ受容体介在食作用、ＩＳ誘導亜硝酸塩産性及びホルボールエステル誘導スーパーオキシド生成を行うそれらの能力について検定した。試験したあらゆる時点で、ＩＳもしくはＬＰＳ誘導亜硝酸塩生成及びＦｃ受容体介在食作用（オプソニン化ＳＲＢＣ）は検出できなかった。興味深いことに、白血球は非オプソニン化ＳＲＢＣを食細胞することが可能であった。これは、血液単球の正常なホメオスタシス機能、すなわち、老化し、損傷を受け、もしくは外来のＲＢＣ又は他の細胞の認識及び食作用の反映である可能性がある。孵化後第１、第４及び第７日に付着精製白血球は多量のＰＭＡ誘導スーパーオキシドを生成し、孵化後第４日にｃＭＧＦ注入群から単離されたものはアルブミン対照群からのものより多く生成した（図９）。第１、第４、及び第７日に、０．２５μｇｃＭＧＦ／卵、及び０．０２５μｇｃＭＧＦ／卵の群からのＰＢＬは、ＰＭＡに応答してアルブミン対照よりも多くのＯ₂を生成した。ｃＭＧＦ２．５μｇ／卵の群からのＰＢＬは、孵化後第４日に、ＰＭＡに応答してアルブミン対照よりも多くのＯ₂を生成したが、第１日または第７日には多くを生成しなかった。同様の実験において、骨髄細胞を、酵母に発現されるｃＭＧＦ又はアルブミン及びＩＳを注入した卵から孵化した日齢雛の大腿骨から単離した。単離された細胞の数（図１０）及び付着精製骨髄細胞のＰＭＡ誘導スーパーオキシド産性を示す（図１１）。卵内でのｃＭＧＦは、日齢雛の大腿骨から単離された骨髄細胞の数を大いに増加させた。ＰＢＬの機能的応答に対する卵内でのｃＭＧＦの効果と同様に、ｃＭＧＦ処置群からの骨髄細胞はＰＭＡでの刺激に応答してより多くのスーパーオキシドを生成した。したがって、卵内でのｃＭＧＦ注入は利用可能な骨髄細胞の数および機能的活性化を高め、これが、これらの卵から孵化した雛から単離された血液白血球による白血球血液分化総数（初期の）及びＰＭＡ誘導スーパーオキシド生成に影響を及ぼす。スーパーオキシド産性物及びその反応性酸素中間誘導体は、抗体及び補体と共に細菌病原体に対する最初の防御列を形成する単球／マクロファージ及び顆粒球の主要な抗微生物産性物なので、ｃＭＧＦを注入された卵から孵化した雛は罹病性が高いこの期間に細菌感染をほとんど受けない。in vivoでの大腸菌抗原投与モデルにおける卵内でのｃＭＧＦ投与の効力は調査中である。例８孵化率の研究商用孵化場（ＲｏｓｅＨｉｌｌ）で孵卵され、そこから入手した卵を、明かりに透かして生きている胚を検出した。孵卵の１８日目に、生育可能な卵に様々な試験物品を卵内注入し、孵化籠に入れて孵卵器に戻した。２１日目に得られた孵化率を記録した（表２）。汚染された可能性があるｃＭＧＦの２．５μｇ用量を除いて、これらの試験物品の卵内注入は孵化率に大きな影響を及ぼさない。例９孵化場汚染大腸菌抗原添加スクリーニングモデル孵化場汚染モデルは、気室にＶＰＩ大腸菌株（典型的には１０⁴ＣＦＵ）を注入されている卵（典型的には３６個の卵）を孵化場の最上部トレイに配置することを含む。これらの感染卵から孵化した雛は、次に、同じ孵化場で孵卵された卵から孵化した実験雛に病原体を移す。様々な処置群をその孵化場の２つの別々の場所で標本とし、その場所を試験ごとに無作為に変える。孵化当日に雛を引き抜き、羽に識別片を付け、他と混ぜ、平面囲いに入れ、死亡率について１日に２回２週間観察する。２週間目に、雛を計量及び計数する。一連の３つの別々の大腸菌孵化場汚染抗原投与モデルを実施した（表３）。これらのモデルは、卵内注入されたゲンタマイシン０．２ｍｇ、ＹＥＡ（酵母に発現されるアルブミン）、及びｒｃＭＧＦ８００Ｕでの効力を示した。ｒｃＭＧＦ８００Ｕでの処置及びゲンタマシン０．２ｍｇは、ＰＢＳと比較した場合には効果があったが、ＹＥＡ対照との比較では効果がなかった。８０単位のｃＭＧＦは試験１では有効であったが、試験２及び３では効果がなかった。なぜＹＥＡが８００単位のｃＭＧＦに匹敵する効力を発揮するのかは不明である。卵内でのｃＭＧＦは、ＹＥＡを注入した対照と比較した場合、孵化時の雛の大腿骨における骨髄細胞数及び第４日の雛から集めた末梢血リンパ球に由来するＰＭＡ誘導スーパーオキシド生成の両者におけるより高い増加を一貫して生じる。加えて、ＹＥＡは、in vitroで骨髄細胞を刺激して増殖させることはない。ＹＥＡは８００単位のｃＭＧＦの投与と等しいタンパク質濃度で投与される。ゲンタマイシンを伴う、又は伴わないｃＭＧＦ及び１０ＵのＩＭの効力を評価するため、２つのさらなる大腸菌孵化場汚染抗原投与試験を行った。その結果を表４に示す。前の試験と比較した場合、両試験における死亡率は低かった。しかしながら、ポジティブコントロール（ゲンタマイシン．０５ｍｇ）とネガティブコントロール（ＰＢＳ）とは、おそらく、互いに大きく異なっていた。数値上死亡率を下げた処置は、２００Ｕおよび８００ＵのｃＭＧＦ、１０ＵのＩＭ並びに４０Ｕ、２００Ｕもしくは８００ＵのｃＭＧＦと０．０５ｍｇのゲンタマイシンの組み合わせであった。４０ＵのｃＭＧＦは有効ではなかった。前の試験と比較して（おそらく、卵の源として異なる群を用い、異なる飼育施設に雛を入れたことにより）死亡率のレベルは低かったが、これらのデータはｃＭＧＦが投与量に応答することを示した前のデータと一致する。孵化場汚染大腸菌抗原投与モデルにおけるＹＥＡの効力をさらに評価するため、ＹＥＡ投与量応答試験を行った（表５）。ポジティブコントロールとして用いられたゲンタマイシン処置は、我々の前のデータ（上記表３及び４）とは対照的に、死亡率をＰＢＳを注入した対照より下げることができなかった。この理由は不明であるが、様々なＹＥＡ投与量の効力の間の差異をより良好に識別できるように初期の雛の死亡率を高める試みの下で、雛をその孵化場に更なる日数置いた。この更なるストレスが試験物品の効力を打ち負かした可能性がある。ｒｃＭＧＦとＹＥＡとの相対効力を正確に識別するためには、まずこれらのタンパク質を、酵母培地の成分として存在し、又は生成の間に酵母によって生成される潜在的な汚染物質から精製することが必要であろう。例１０筋肉内大腸菌抗原投与スクリーニングモデル孵化後第３日及び第７日の、大腸菌筋肉内抗原投与に対するＩＭ及びｃＭＧＦの卵内での投与の効力を評価した（表６及び７）。これは、皮膚、腸及び肺上皮の保護防御並びにＧＡＬＴ又はＢＡＬＴにより付与される保護を回避する、全身性感染に対するサイトカインの効力を評価する新しいモデルである。また、鳥が孵化後第３日又は第７日まで抗原投与されない場合の効力の持続の評価も始めた。第３日に抗原投与する実験では、孵化当日のサイトカイン類の卵内注入と筋肉内での注射との効力を比較した。１８日目に卵内、又は孵化当日に筋肉（左肢）内で試験物品を鳥に注射した。雛の羽に識別片を付け、他のものと混ぜて平面囲いに入れた。第３日又は第７日に、適当な投与量の大腸菌ＣＱＲ株を右肢に筋肉内注射した。雛を再び平面囲いに入れ、抗原投与後７日間死亡率を観察した。第３日に抗原投与するモデルの結果は一貫性がなかった（表６）。最初の試験では、４０ＵのｃＭＧＦは、卵内及び孵化当日での注入並びに１０⁵ＣＦＵでの抗原投与による死亡率を下げた。しかしながら、この発見はより低い抗原投与レベル（１０⁴ＣＦＵ）では繰り返されなかった。２回目の試験では、４０ＵのｃＭＧＦは卵内注入された場合には１０⁵抗原投与による死亡率を下げたが、孵化後に注射された場合は下げなかった。最初の試験においては、選択された抗原投与レベル、１０⁴及び１０⁵ＣＦＵ、では死亡率の増大が起こらなかった（データは示さず）。２回目の試験では、１０⁶ＣＦＵの抗原投与量だけが高レベルの死亡率を生じ、そこではゲンタマイシン、１０ＵのＩＭ並びに４０Ｕ及び８００ＵのｃＭＧＦの両者が数字の上で死亡率を下げた。例１１経口強制送胃大腸菌抗原投与スクリーニングモデルこのモデルでは、孵化当日の平面囲いに入れる直前に、雛に約１０⁹ＣＦＵの大腸菌ＶＰＩ株を経口強制送胃する。抗原投与培養物は、抗原投与の間氷上に保持する。各処置群からの羽に識別片を付けた同数の雛を他のものと混ぜ、平面囲いに入れる前に１００μＬの抗原投与培養物を無作為に強制送胃する。１日に２回１０日間、雛の死亡率を観察する。孵化当日の経口による大腸菌抗原投与に対する、ゲンタマイシンを伴う、もしくは伴わない、卵内でのｃＭＧＦ及びＩＭ投与の効力を評価する２回の試験の結果を以下に示す（表８）。この試験は、１０ＵのＩＭ投与量及びｃＭＧＦの効力を評価し、サイトカイン類を０．０５ｍｇのゲンタマイシンと共に注入したときに利益が付け加わるかどうかを決定するように設計された。８つの囲いのうち２つの囲いは、２回の試験から削除した。この囲いは死亡率が５０％を越えていた。このモデルでは、１０ＵのＩＭ及び０．０５ｍｇのゲンタマイシンが大腸菌に対する効力を明白に示した。４０Ｕもしくは２００ＵのｃＭＧＦは効力を示さなかったが、８００Ｕでは数字の上で死亡率を下げた。ＩＭがゲンタマイシンに加えられたときには更なる効果はなかった。これらの２回の試験は、試験１の抗原投与していない対照が驚くほど高レベルの死亡率であったことを除いて、結果が似ていた。試験１の抗原投与していない対照の高レベルの死亡率は、おそらく、処置群を混ぜて等しく標本化したことによる囲いの内部での水平伝染のためである。他の大腸菌孵化場汚染抗原投与試験（上記例９を参照）では、ｃＭＧＦの効力の試験に酵母に発現されるアルブミン（ＹＥＡ）が用いられている。しかしながら、ＹＥＡは骨髄及び免疫細胞集団に対するin vitro又はin vivoでのｃＭＧＦの他の効果のいかなるものも発揮することができないが、それが８００ＵのｃＭＧＦと等しいタンパク質ベースで投与された場合には孵化場汚染モデルで一貫して効力を示している。ＹＥＡの効力をさらに評価し、かつｃＭＧＦと比較し、さらにその防御をタンパク質（ＢＳＡ）又は酵母発現系によって生成された生成物（ＹＥＭは、細胞内βガラクトシダーゼを発現する形質転換されたピキア・パストリス株に由来する培地である）の卵内での分配に帰することができるかどうかを決定するため、２種類の調製品を経口抗原投与モデルで試験した。その結果を表９に示す。ＹＥＭ、ｃＭＧＦ、ＹＥＡ、０．０５ｍｇのゲンタマイシン及びＢＳＡの全てが死亡率を下げたが、ＹＥＡが最も効果的であった。鳥の等しい体重は、処置群において死亡しなかった鳥が罹患せず、又は成長が抑制されていないことを示唆している。例１２食餌ストレス・大腸菌抗原投与モデルこのモデルは、ストレス（具体的には、３６時間の食料及び水の剥奪）により若七面鳥の肝臓、腎臓及び血液での大腸菌のコロニー形成を生じるというLeitne r及びHellerの発見(1992: Avian Diseases 36: 211-220)に基づいている。孵化当日に七面鳥に大腸菌を経口強制送胃して５日後食餌を抜き、臓器を取り出して３６時間後のコロニー形成を評価した。最初の実験では、ブロイラーの雛にＰＢＳ、ＹＥＡ（酵母に発現されるアルブミン）、５、５０Ｕ、又は５００ＵのｃＭＧＦのいずれかを卵内投与し、前化時に１０⁸ＣＦＵの大腸菌（ＶＰＩ１９９０株）を経口強制送胃し、孵化後第４日から３６時間食料及び水を除いて、組織（肝臓及び血液）のコロニー形成又は第１２日の死亡率のいずれかについて評価した。それらの結果を表１０に示す。臓器侵入はほとんどなく、これが卵内でのｃＭＧＦ投与による効果の判別を困難にした。高投与量のｃＭＧＦ及び等量のＹＥＡタンパク質の両者は死亡率を下げた。このモデルにおける卵内でのｃＭＧＦ投与の効力を評価するため、第２の研究を行った。両試験の結果を表１１に示す。ＰＢＳを注入した対照における臓器侵入の証拠はなかった。最初の試験では、食料及び水を孵化後第４日から３６時間剥奪し、雛に１００μＬの１０⁹ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌培養物を経口強制送胃した。この抗原投与処方では、ＰＢＳを注入した雛の肝臓又は血液にコロニー形成は生じなかった。第２の試験では、食料及び水を剥奪する期間を４８時間に増やし、雛に２００μｌの１０⁹ｃｆｕ／ｍＬ大腸菌培養物を経口強制送胃した。しかしながら、依然としてＰＢＳを注入した雛に臓器侵入の証拠はなかった。ＹＥＡを０．２ｇ投与された雛も臓器コロニー形成を示さなかった。しかしながら、興味深いことに、ｃＭＧＦを卵内投与された雛は臓器侵入を示した。この結果は、５００Ｕの投与量ではほとんど見られないが、両試験である程度一致した。おそらく、ｃＭＧＦは細菌を食菌し、かつ内部に保持することができる単球／マクロファージ系列の細胞数を増大させるが、これらの細胞は殺菌性であるほど十分に活性化されておらず、組織マクロファージの形態で細菌の貯蔵庫として役立っているためであろう。完全な活性化及び細胞内細菌の破壊には、ｃＩＮＦのような第２のシグナルが必要であろう。第２の試験では、抗原投与量の増加、食料及び水の剥奪期間の増加、又はその両者により、１２日間の死亡率が増大した。食料及び水の剥奪は、孵化場汚染及び経口強制送胃モデルに通常見られるレベルより２週間の死亡率を増大させた。この２つの試験の間にも死亡率データに多くの変動が存在したが、ｃＭＧＦは効果がないように思われた。ＰＢＳ及びＹＥＡ群の両者には検出可能な臓器コロニー形成はないが死亡率のレベルに大きな相違があるため、臓器コロニー形成と死亡率が相関し得るかどうかは不明である。例１３第０日ｃＭＧＦ卵内注入及び第１３日大腸菌抗原卵内投与モデル孵卵第０日のｃＭＧＦ卵内注入を、それが卵の孵卵の第２週から始まる細菌性病原体を防御する胚の食作用の機能的応答性の数を増大させるかどうかを決定するために評価した。Klasing(1991)は、オプソニン介在食作用が、孵卵の第２週に胚を細菌性病原体から防御し得ると推測した。食菌性細胞は、殻上の病原体が胚へ伝播しうる、漿尿膜が殻膜と融合した後の重大な時期に胚を保護する。孵卵の第０日に、ｃＭＧＦを０．２５Ｕ、２．５Ｕ、２５Ｕ又は２５０Ｕのいずれかでアルブミンに注入した。孵卵の第１３日に、孵卵器（９９°Ｆ）から卵を直接取り出し、４０°Ｆで４分間、大腸菌ブロスに浸漬した。この温度では、殻及び殻膜を横切って細菌が移動することが促進される。孵卵第１８日での同様の大腸菌抗原投与は、孵化率を７％減少させ、２週間の死亡率を７％増加させた(Reide t al．1961)。ｃＭＧＦを注入した卵の別の群は、孵化率に対する第０日のｃＭＧＦ注入の効果を評価するため、大腸菌には晒さなかった。これらの結果を表１２及び１３に示す。各処置群について６８個の卵の１回の繰り返しのみを評価したためデータは変動しているが、孵化率は第０日のｃＭＧＦ投与によっては一貫して影響を受けなかった（表１２）。孵卵の間の細菌性抗原投与の評価に用いられたこのモデルは良好に機能した。抗原投与時に生きていた卵の孵化率は、抗原投与されなかった卵の９４．５％と比較して、８７．３％であった。後期の胚の死亡率及び死亡した雛のパーセントは、正常な抗原投与されていない卵を大きく上回った。第０日のｃＭＧＦ投与は、数字の上で胚の死亡率を増加させ、このモデルでは効力を示さなかった。例１４ネズミチフス菌孵化場汚染及び孵化後シーダースクリーニング抗原投与モデルこの孵化場汚染モデルは、汚染された卵（典型的には１５個の卵）を孵化場の最上部の籠に置き、ネズミチフス菌を抗原投与として送達することを除けば、前述の大腸菌孵化場汚染モデル（上記例９を参照）と非常に似ている。この孵化後シーダー抗原投与モデルは、サルモネラ属菌に晒した鳥と晒していない鳥とを平面囲いで混ぜ合わせることを含み、これは雛から雛への病原体の水平伝染をシミュレートする。ネズミチフス菌孵化場汚染モデル及び孵化後シーダーモデルの両者において、ｃＮＧＦ及びＩＭを全て試験した。これらのモデルは、現実には細胞内にある異なる細菌性病原体に対するこれらのサイトカイン産性物の効力を評価するために行った。ネズミチフス菌孵化場汚染モデル及び孵化後シーダーモデルの第１０日の死亡率の結果を以下に示す（表１４）。結果は対照に対するパーセントとして表されている。この抗原投与は非常に強力であり、これらのモデルに対して前に行われた試験よりも高レベルの死亡率を生じた。効力を示した処置は、孵化場汚染モデルにおける０．５ｍｇのベイトリル（Ｂａｙｔｒｉｌ）だけであり、これでさえ前の試験よりも低いレベルの効力であった。このレベルの抗原投与は試験された生成物の効力を打ち負かし得るようである。例１５コクシジウム症抗原投与スクリーニングモデルコクシジウム症Ｅ．テネラ(E.tenella)卵母細胞抗原投与モデルにおいて、ｃＭＧＦ及びＩＭの効力を評価した（表１５）。このモデルは、低レベルの経口抗原投与の後の糞便への卵母細胞の排出を測定し、宿主に感染もしくはそこで増殖する寄生虫の能力を評価する。放出される卵母細胞の数の減少によって測定される効力は、寄生虫が盲腸の上皮下層内の細胞に侵入もしくは感染することができなかったか、又は寄生虫が細胞の内部で増殖することができなかったか、あるいは有性生殖もしくは卵母細胞の生成が阻害されたことを示唆する。孵化後第１日又は第７日に雛に１０００個の卵母細胞を経口抗原投与し、抗原投与後７２時間の間排出された糞便を集めて放出される卵母細胞の数を数えた（表１５）。孵化後第１日又は第７日のいずれかに鳥に抗原投与した。孵化後第１日での抗原投与に続く卵母細胞の排出は、ｃＭＧＦ又はＩＭの卵内投与によっては影響を受けなかった。４０ＵのｃＭＧＦについては、平均卵母細胞生成は数字上は減少したが大きなものではなく、ＩＭは生成される卵母細胞数を実際に増加させた。孵化後第７日での抗原投与に続く卵母細胞の排出は、４０ＵのｃＭＧＦの卵内投与により大きく減少した。８００ＵのｃＭＧＦは数字上は卵母細胞の排出を減少させたが、ＩＭは数字上は卵母細胞の排出を増大させた。コクシジウム症に対するｃＭＧＦ卵内投与の効力を、第２のアイメリア・テネラ卵母細胞生成抗原投与モデルにおいて評価した。孵卵の第１９日に卵にＰＢＳ、ＹＥＡ、５Ｕ、１０Ｕ、５０Ｕ、１００Ｕ、２００Ｕ又は８００ＵのｃＭＧＦのいずれかを注入した。その後、孵化後第７日に、ブロイラーの雛に１０００個のアイメリア・テネラの卵母細胞を抗原投与し、抗原投与後７２時間の間排出された糞便を集めて放出された卵母細胞の数を数えた（表１６）。卵内にｃＭＧＦを５Ｕ、１０Ｕ、５０Ｕ、１００Ｕおよび２００Ｕ投与した後には、アイメリア・テネラの卵母細胞生成は数字上減少した。８００ＵのｃＭＧＦは無効であった。これらの結果は、卵母細胞生成抗原投与試験において４０ＵのｃＭＧＦの効力は示されたが、８００ＵのｃＭＧＦの効力は示されなかった前の研究に一致する。さらなる研究で、防御ｃＭＧＦ投与量と等しいタンパク質レベルのＹＥＡ、ｃＭＧＦの動力学及び投与量応答並びに他のコクシジア株に対する効力を評価する必要がある。例８〜１５に記述される抗原投与モデルはこのｃＭＧＦの評価のために始められたものであり、これらのモデルのさらなる開発によってより一貫したデータが得られるものと思われることに注意するべきである。例えば、第１の第７日筋肉内抗原投与モデルにおいて、死亡率を得るのに用いられる大腸菌は有効とするには低すぎ、ネズミチフス菌抗原投与物はあらゆる効力が不明瞭になるほど強力であったかもしれない。それにもかかわらず、これらの予備的な抗原投与モデルからのデータは、ｃＭＧＦが孵化場汚染大腸菌抗原投与に対する投与量依存性の効力を一貫して示し、コクシジウムＥ．テネラ卵母細胞抗原投与に対する投与量依存性の効力をも発揮することを示している。試験された他のモデルからのデータはほとんど一貫性がなく、そこでは、様々な投与量のｃＭＧＦが個々の試験で効力を示しているにもかかわらず、そのデータは第２の実験では常には再現されることがない。しかしながら、全体として、これらのデータは、組換えｃＭＧＦの卵内投与が、孵化後の最初の数週間に、孵化する雛を感染性病原体に対してほとんど感受性にしないという利益を孵化する雛に付与するという仮説に一致する。８００ＵのｃＭＧＦと等しいタンパク質濃度の、酵母に発現されるアルブミン（ＹＥＡ）は、８００単位のｃＭＧＦに匹敵する効力を発揮する。ｃＭＧＦ卵内投与は、ＹＥＡを注入した対照と比較して、孵化時の雛の大腿骨中の骨髄細胞の数及び第４日の雛から集められた末梢血白血球からのＰＭＡ誘導スーパーオキシド生成の両者を増大させる。加えて、ＹＥＡは、in vitroで骨髄細胞を刺激して増殖させることがない。したがって、大腸菌孵化場汚染モデルにおけるＹＥＡの効力は、いまだに不明である何らかの代替機構によるものであると思われる。先の記述は本発明を説明するものであり、それらを限定するものであると解釈されるものではない。本発明は以下の請求の範囲によって定義され、この請求の範囲には、この請求の範囲に包含されるその等価物が伴う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＨＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＦＨ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ケンパー，エイプリル・イーアメリカ合衆国、 27312 ノース・キャロライナ、ピッツボロ、マンティス・ロード 50 (72)発明者リュー，ホンアメリカ合衆国、 27511 ノース・キャロライナ、キャリー、デュアリントン・プレイス 208 (72)発明者ティスコウスキー，ジュリアス・ケイアメリカ合衆国、 27511 ノース・キャロライナ、キャリー、ウッドラフ・コート 111 (72)発明者ハーディング，ティモシー・ダブリューアメリカ合衆国、 27514 ノース・キャロライナ、ローリー、ボーリンウッド・ドライヴ 700、＃28ディー

Claims

【特許請求の範囲】１．鳥類骨髄単球性成長因子（ＭＧＦ）をコードする組換えＤＮＡ構成物を含み、かつそれを発現する宿主細胞を培養培地で培養するステップと、前記宿主細胞からの組換えＭＧＦを含む培養培地を集めるステップと、前記培養培地から前記ＭＧＦを単離するステップとを含む精製された組換えＭＧＦを生成する方法。２．前記ＭＧＦがニワトリＭＧＦである請求項１に記載の方法。３．前記宿主細胞が大腸菌である請求項１に記載の方法。４．前記宿主細胞がピキア・パストリスである請求項１に記載の方法。５．前記ＭＧＦがグリコシル化されたＭＧＦである請求項３に記載の方法。６．請求項４に記載の方法により生成される鳥類ＭＧＦ。７．生物学的に活性な量の鳥類骨髄単球性成長因子を鳥に卵内投与するステップを含む鳥の処置方法。８．前記鳥が、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ及びキジからなる群より選択される請求項７に記載の方法。９．前記鳥が、ニワトリ及び七面鳥からなる群より選択される請求項７に記載の方法。１０．前記鳥類ＭＧＦが孵卵の約最後の四半期の間に前記鳥に卵内投与される請求項７に記載の方法。１１．前記鳥がニワトリであり、かつ前記鳥類ＭＧＦが孵卵約第１５日から第１９日に前記ニワトリに投与される請求項７に記載の方法。１２．前記鳥が七面鳥であり、かつ前記鳥類ＭＧＦが孵卵約第２１日から第２６日に前記七面鳥に投与される請求項７に記載の方法。１３．前記投与ステップが、鳥の胚が入っている卵に鳥類ＭＧＦを注入することによって行われる請求項７に記載の方法。１４．前記投与ステップが、羊膜、卵黄嚢又は気室によって決められる領域に前記ＭＧＦを注入することによって行われる請求項７に記載の方法。１５．前記鳥がニワトリであり、かつ前記鳥類ＭＧＦがニワトリＭＧＦである請求項７に記載の方法。１６．前記鳥類ＭＧＦと同時に前記鳥にワクチンを投与する請求項７に記載の方法。１７．前記ワクチンが生ワクチンである請求項１６に記載の方法。１８．前記ワクチンが複製しないワクチンである請求項１６に記載の方法。１９．細菌感染阻害量の鳥類骨髄単球性成長因子（ＭＧＦ）を鳥に卵内投与するステップを含む鳥の細菌感染の進行を阻害する方法。２０．前記鳥が、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ及びキジからなる群より選択される請求項１９に記載の方法。２１．前記鳥が、ニワトリ及び七面鳥からなる群より選択される請求項１９に記載の方法。２２．前記鳥類ＭＧＦが、孵卵の約最後の四半期の間に前記鳥に卵内投与される請求項１９に記載の方法。２３．前記鳥がニワトリであり、かつ前記鳥類ＭＧＦが孵卵約第１５日から第１９日に前記ニワトリに投与される請求項1９に記載の方法。２４．前記鳥が七面鳥であり、かつ前記鳥類ＭＧＦが孵卵約第２１日から第２６日に前記七面鳥に投与される請求項１９に記載の方法。２５．前記投与ステップが、鳥の胚が入っている含まれている卵に鳥類ＭＧＦを注入することによって行われる請求項１９に記載の方法。２６．前記投与ステップが、羊膜、卵黄嚢又は気室によって決められる領域に前記ＭＧＦを注入することによって行われる請求項１９に記載の方法。２７．前記鳥がニワトリであり、かつ前記鳥類ＭＧＦがニワトリＭＧＦである、請求項１９に記載の方法。２８．前記細菌感染が大腸菌による感染である請求項１９に記載の方法。２９．前記細菌感染がサルモネラ属菌による感染である請求項１９に記載の方法。３０．前記鳥類ＭＧＦと同時に前記鳥にワクチンを投与する請求項１９に記載の方法。３１．前記ワクチンが生ワクチンである請求項３０に記載の方法。３２．前記ワクチンが複製しないワクチンである、請求項３０に記載の方法。