JPH10505423A

JPH10505423A - 細胞分離

Info

Publication number: JPH10505423A
Application number: JP8509302A
Authority: JP
Inventors: ユゲルスタッド，ジョン; ステンスタッド，パー; キラース，ラーズ; バージ，アーヴィッド; プレストヴィック，ヴェンケ，スレタージェル
Original assignee: ジンベントエイエス
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 1998-05-26
Also published as: AU3395595A; GB9417864D0; WO1996007909A1; EP0782704A1; CA2199020A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、固相選択的細胞-捕獲マトリックスに細胞が非-特異的に結合するのをブロックするために乳タンパク質を使用する方法を提供する。一般的にいって、固相選択的捕獲マトリックスは、標的-特異的結合パートナー、例えば抗体により標的細胞を選択的に分離するのに適した固体支持体である。

Description

【発明の詳細な説明】細胞分離本発明は、選択的細胞単離手法における細胞の非-特異的結合をブロッキングする方法に関する。細胞および他の生存可能な実体（entities）、例えばウイルスの分離および選択的単離は、医学および生化学および同様の関連分野において、調製の観点から、また研究用の手段としての両方で特別な重要性および実に増大する重要性を有する領域を表す。すなわち、例えば細胞分離は、骨髄からの悪性細胞の除去（パージ）において、あるいは特定細胞型の精製集団を得るために、例えば元に戻すため、または例えば培養または遺伝物質の挿入による後続の研究または操作のために必要な工程である。細胞分離はまた、例えば臨床サンプルから細菌または原生動物またはウイルスのような病原性細胞を単離することにより疾患および感染を診断する際に、また、例えば食品および廃水中の細菌汚染または他の病原性物質汚染をモニターする際に、しばしば用いられる。従って細胞分離は多くの重要な領域、例えば重大な疾患の処置および研究、診断、血液および組織の型決定、食品および環境の安全性などに関連している。細胞を分離するための多くの方法が知られている。最近、これらの方法は、アフィニティー結合システムを用いて、すなわち分離すべき細胞と、ある形態の支持体とに別個に結合する１対の結合パートナー（これは接触させると結合し、これにより細胞をその周囲から選択的に除去することを可能にする）を用いて、所望の細胞を選択的に捕獲することに基づいている。これは一般的に、特異的結合パートナーとして細胞表面上の抗原を認識する抗体を用いて達成され、より最近では支持体として磁性ビーズを用いて達成され、これは磁性凝集による結合細胞の分離（いわゆる "免疫磁性分離" ）を容易にする。細胞およびウイルスの選択的分離のために選択的アフィニティー-捕獲マトリックス、および特に磁性ビーズを用いることは、文献に広く記載されている（概説については、例えば Ugels tad et al.，Progress of Polymer Sience，17(1)，87- 161，1992; および Olsvik et al.，Clinical Microbiology Reviews，43-54，J anuary 1994 参照）。この形態の分離に伴う問題は所望しない細胞が支持体に非-特異的に結合することであり、標的特異的結合パートナーにより支持体に結合する所望の標的細胞のみならず、支持体の表面に非-特異的に結合する他の所望しない細胞をも分離することになる。非-特異的結合の程度は、用いられる細胞、支持体およびアフィニティー結合システムの性質により変化するが、一般的にいって、これは固相アフィニティー捕獲に基づく全てのシステム、および特に免疫磁性分離に伴う問題である。これは、例えば骨髄清浄化（パージ）または型決定において、例えば所望の細胞のみを単離することが重要な場合に、もしかして重大な結果を招くことがあり、また、例えば診断システムの結果に混乱を来すことがある。細胞の非-特異的結合が起こりうる部位をブロックするために支持体をウシ血清アルブミン(BSA)で前処理することにより、支持体に細胞が非-特異的に結合するのを減少させる試みがなされている。同様の効果は、不活性免疫グロブリン、すなわち非-標的特異的免疫グロブリンを用いて達成できる。しかしながら、このような方法を用いて達成できる非-特異的結合の減少は完全ではなく、多くの場合この問題を緩和するためには充分でない。従って、選択的細胞捕獲マトリックスに細胞がこのように非-特異的に結合するのをブロックするための改良方法に対する要求がある。本発明は、このような方法を提供しようとしている。すなわち本発明者らは、ブロッキング剤として乳タンパク質、例えばカゼインを使用することにより、このような非-特異的細胞結合を劇的に減少させることができ、多くの場合に完全に防止できることを見出した。カゼインは以前、タンパク質の物理的吸着を防止するために、固体表面、例えばポリスチレンの処理に使用されてきた。このような有用性は、最も顕著には、プレートをカゼイン溶液にさらしてブロックする ELISA などの免疫アッセイ手法（例えばVogt et al.， J．Immunol．Methods．101, 43-50，1987参照）において応用されているが、他の用途、例えばウエスタンブロッティングおよびサザンブロッティングにおける用途もまた記載されている（例えば Johnson et al.，Gene Anal．Techn．1, 3-8，1984参照）。しかしながら、細胞が固体支持体に非-特異的に付着するのを防止するためにカゼインが効果的であろうことは、これまで提案されなかった。従って本発明は、その最も一般的な意味において、固相選択的細胞-捕獲マトリックスに細胞が非-特異的に結合するのを防止するために乳タンパク質を使用する方法を提供する。もう一つの観点からみて、本発明はまた、固相選択的細胞-捕獲マトリックスに乳タンパク質を添加することを含む、固相選択的細胞-捕獲マトリックスに細胞が非-特異的に結合するのを防止する方法を提供する。一般的にいって、固相選択的捕獲マトリックスは、標的-特異的結合パートナーにより標的細胞を選択的に分離するのに適した固体支持体であり、例えば固体支持体は標的-特異的結合パートナーを担持していてもよい。前記のように、このようなブロッキングは、所望しない細胞の非-特異的結合が問題となることのある混合物から細胞を選択的に単離する際に特に重要である。従ってもう一つの観点によれば、本発明は、乳タンパク質を添加して非-標的細胞の非-特異的結合をブロックすることを特徴とする、標的-特異的結合パートナーにより標的細胞を固体支持体に選択的に結合させ、この支持体に結合した細胞をサンプルから分離することを含む、サンプルから標的細胞を選択的に単離する方法を提供する。本明細書において "細胞" という用語は、原核細胞、真核細胞および他の生存可能な実体、例えばウイルスおよびマイコプラズマ属菌、およびサブ細胞成分、例えば細胞内器官の全てを包含するために用いられる。従って、代表的な"細胞" には、哺乳類動物および非哺乳類動物の細胞、植物細胞、プロトプラスト、細菌、原生動物およびウイルスの全ての型が包含される。ここで用いられる "ブロッキング" という用語は、前記の非-特異的結合の減少および防止の両方を包含する。前記のように、本発明により得られる非-特異的結合の減少は、予想されたよりもはるかに高く、BSA および他のタンパク質を用いて得られるよりも著しく良好である。実際に、BSA で既に前処理された固体支持体を乳タンパク質で処理すると、BSA 単独で処理された支持体と比較して、非-特異的結合の顕著な減少を生じる。乳タンパク質は、免疫アッセイにおける非-特異的吸着のブロッキングのための、公知の文献に記載された任意の乳タンパク質であってよく、例えばカゼイン、乳漿タンパク質濃厚物、無脂肪乾燥ミルクおよびスキムミルクを包含する。これら乳タンパク質のいずれも、単独でまたは組み合わせて使用できる。カゼインを選択すると便利である。乳タンパク質の誘導体、例えば部分加水分解物または架橋タンパク質も包含される。固体支持体は、公知の支持体、あるいは固定化、分離などのために現在広く用いられているか、または提案されているマトリックスのいずれてあってもよい。これらは粒子、シート、ゲル、フィルター、膜、あるいはマイクロタイターストリップ、チューブまたはプレートなどの形態をとることができ、高分子材料で好都合に作製できる。粒子状材料、例えばビーズ、特に重合体ビーズは、結合能が大きいために一般的に好ましく、その広範囲のものがこの技術分野で公知である。操作および分離を補助するために、磁性ビーズが好ましい。ここで用いられる "磁性" という用語は、支持体が磁場に置かれたときに、それに与えられた磁気モーメントを有することができ、従ってその磁場の作用下に排除（移動）できることを意味する。換言すれば、磁性粒子からなる支持体は、磁性凝集により容易に除去できる。このような磁性粒子は、残留磁気、従って塊状化を防ぐために超常磁性であることが好ましく、また一様な動力学および分離を提供するように単分散状であることが有利である。超常磁性単分散状粒子の製造は Sintef が EP- A-106873 に記載している。Dynal AS（Oslo,Norway）から DYNABEADS として販売されている単分散状重合体超常磁性ビーズは、本発明に従って使用または変性しうる商業的に入手可能な磁性粒子の例である。このような支持体への細胞の非-特異的結合は、細胞の物理的吸着によって起こり、細胞分離手法に使用可能な全ての種類の固体表面、特に親水性表面および疎水性表面の両方を含む重合体支持体において観察されており、このような全ての支持体は本発明の範囲内に包含される。しかしながら、この問題は疎水性支持体で悪化することがあるという幾つかの報告がある。多くの理由から、疎水性表面は、特異的結合パートナー、例えば抗体をカップリングさせるために好ましい（あるいは少なくとも、カップリング反応時に表面が疎水性であることが好ましい）。この理由は、化学的カップリングにより支持体に抗体を結合させる反応が場合によっては遅いということである。抗体が支持体表面に自動的かつ高度に結合すると、反応部位における抗体濃度が非常に大幅に増大することになり、これにより化学的カップリング速度がより速くなる。従って、比較的に疎水性の表面を使用すると、細胞が支持体表面に非-特異的に付着するのを効果的にブロックする必要性が強くなる。前記のように、細胞の非-特異的結合を阻止する際の乳タンパク質の利点は、明確かつ疑いの余地なく、むしろ親水性表面を含む全ての種類の支持体表面で認めることができるが、これは疎水性表面で特に顕著であり、この場合カゼインは、BSA を最適量で用いると、BSA よりも著しく良好である。標的-特異的結合パートナーは、標的粒子を認識でき、かつこれに結合できる任意の分類のものであってよく、好都合には、分離技術および固定化技術に従来用いられているような任意の結合パートナーを含むことができる。この意味で、結合パートナーは、標的細胞および支持体の両方に選択的に結合可能な単一の実体を含むことができ、あるいは一端において標的細胞に選択的に結合可能な成分を含み、他端において支持体に結合する成分を含む実体のシリーズを含むことができる。最も簡単な場合、このようなシリーズは、標的細胞を認識する第１結合パートナーと、この第１結合パートナーおよび支持体に結合する第２結合パートナーとを含むことができる。典型的には、結合パートナーは、細胞、ウイルス粒子などの表面上の抗原を認識する抗体または抗体フラグメントを含む。抗体はモノクローナル、ポリクローナルまたはキメラであってよく、結合活性を保持しているフラグメントの形態、例えば F(ab)₂、Fab またはFv フラグメント（Fv フラグメントは抗原結合部位を含む抗体の "可変" 領域と定義される）の形態で使用できる。その代わりの結合パートナーとしては、タンパク質、例えばアビジン、レクチン、または細胞表面上のリセプターに結合するリガンドが挙げられる。分離することが望まれる粒子、および粒子をそれから分離することが望まれる環境に応じて、結合パートナーは、粒子に対して特異的な表面エピトープ、例えば特定の細胞型によってのみ発現される表面抗原を選択的に認識するように選ぶことができ、あるいは結合パートナーは、もっと一般的な反応性を有するもの、例えばある範囲の細胞を認識できるものであってもよい。その選択性および容易な入手可能性のため、抗体およびそれらのフラグメント、特に IgG 抗体および IgM 抗体は一般的に好ましい結合パートナーである。モノクローナル抗体は所望の標的特異性を容易に提供できる。従って、このような抗体またはそれらのフラグメントは、標的細胞に結合させるために支持体に直接にカップリングさせることができ、あるいはこれらを結合パートナーシリーズの一部として、上記のように間接的にカップリングさせることができる。好都合には、このような間接的カップリングは第２抗体を介していてもよく、この第２抗体は、それ自体が支持体に結合されており、かつ、ある部位、例えば Fc 部分で標的-特異的な第１抗体に結合し、これは第１抗体を標的と自由に結合できるようにしておく。その代わりに、このような第２抗体を免疫グロブリン-結合タンパク質、例えばプロテインＡで置き換えることができる。支持体は、機能性基、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基またはアミノ基を担持していてよく、これらの基は抗体の共有結合、または抗体の結合に好適なリガンドの共有結合を許容するように、よく知られた方法で活性化できる。好適なリガンドの例は、アビジンまたはストレプトアビジンであり、これは、ビオチン処理した標的-特異的結合パートナーで引き続き結合させるために、支持体に直接にカップリングさせることができる。支持体はまた、エポキシ基またはアルデヒド基のような基を担持していてもよく、この場合は抗体またはリガンドと支持体との共有結合カップリングを確立するために活性化する必要がない。多くの細胞特異的抗体が知られており、商業的に入手できる。このような多くの抗体およびそれらの源は Linccott の Directory（40 Glen Drive，Mill Vall ey，California，USA から入手可能）にリストされている。このような抗体の代表的なものとしては、下記のものを挙げることができる。ヒト多性能前駆体に対する抗体 B1-3C5、Sera Lab Ltd，Sussex，UK．から入手可能; ヒト樹状細胞に対する抗体 BU10、Binding Site Ltd，Birmingham，UK から入手可能; ヒト HLA DR および DR 組織適合性抗原に対する抗体 B721 および L243、Becton Dickinson Immunocytometry Systems，CA，USA から入手可能; ミトコンドリアに対する抗体 MAB1273、Paesel GmbH，Frankfurt，Germany から入手可能; カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する抗体 CA14-50、Chemunex S.A .，Maisons Alfort，France から入手可能; Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体 HBC170-4、Biosoft，Paris，France から入手可能; 黄色ブドウ球菌（Stap hylococcus aureus ）に対する抗体 4D2、Biodesign Inc．Main，USA から入手可能。さらなる例として、大多数の抗体は肝生成系の細胞上で発現された特定のマーカーに対して利用可能である（例えば Dako，Copenhagen から入手可能なCD 抗原に対する抗体の範囲参照）。加えて、初期肝生成細胞の選択に有用な抗-CD34 抗体 12.8 および B1-3C5 は Biosys S.A，France から入手できる。文献はまた、細菌、原生動物およびウイルスを含む多数の抗体に関する記載が含まれている。すなわち、例えば大腸菌（E.Coli）の K88（F4）ふさ状抗原に対する抗体は Lund et al が J．Clin．Micobiol．26: 2572-2575 に記載しており ; Skjerve および Olsvik はサルモネラ属菌（Salmonella）の免疫磁性分離において市販のポリクローナルヤギ IgG を用い(J．Fod Microbiol．14：11-18，198 9); サルモネラ属菌に対する血清-グループ特異的モノクローナル抗体は Widjoj oatmodo et al．が記載しており(Eur．J．Clin，Microbiol．Infect．Dis．10: 935-938，1991); Skjerve et al．はリステリア・モノサイトゲネス（Listeria Monocytogenes ）に対するモノクローナル抗体を記載しており(Appl．Environ．M icrobiol．56: 3478-3481); Morgan et al はシュードモナス・プチダ（Pseudom onas putida ）に対するモノクローナル抗体を記載しており(Appl．Environ．Mic robiol．67: 503-509，1991); HIV-感染 CD4 細胞を検出するために有用な CD4 抗原に対する抗体はBrinkmann et al が記載している(J．virol．65: 2019-2023 ，1991)。あるいは所望の特異性を有するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は標準的技術を用いて得ることができる。結合パートナーを選ぶことにより、所望の粒子または所望しない粒子を結合させることができ、すなわちポジティブ選択またはネガティブ選択を達成することができ、例えば所望の細胞集団を単離するか、あるいは所望しない粒子をシステムからパージすることができる。本発明の方法は、例えば血液、血漿または他の体液または臨床サンプルから、あるいは細胞培養物または他の生物学的媒質または人工的媒質などから、様々な所望の細胞集団をポジティブ選択する際に特に有用であることが見出された。結合パートナー、例えば抗体およびそれらのフラグメントを支持体に結合させてアフィニティー捕獲マトリックスを提供するための多くの方法が知られており、文献に広く記載されている。ある範囲の機能性基を支持体に備えることができ、これらの基を活性化して、活性化された基を抗体中のアミノ基またはSH 基と反応させることにより、支持体と抗体との間に共有結合を与えることができる。このように結合された抗体は、前記のように標的-特異的抗体であってよく、あるいは標的-特異的な第１抗体と結合する第２抗体であってもよい。最も普通の方法の例は次のとおりである：１．-CH₂-OH 基を含む支持体に、塩化スルホニルで活性化して抗体をカップリングさせて、支持体上にスルホニルエステルを与え、次いでこれを抗体上のアミノ基または -SH 基と反応させて、それぞれ -CH₂-N H- 結合および -CH₂-S- 結合を有する共有結合カップリングした抗体を与える。２．COOH 基を含む支持体に、このカルボキシル基をカルボジイミドおよび N-ヒドロキシスルホサクシンイミドで活性化して抗体をカップリングさせ、これにより支持体と抗体との間にアミド結合を形成する。３．グルタルアルデヒドで活性化されたアミノ基を含む支持体に抗体をカップリングさせ、これにより反応させて、抗体のアミノ基との共有結合を形成する。４．エポキシ基を含む支持体への抗体のカップリングは、エポキシ基が抗体上のアミノ基および -SH 基と直接に反応するので、さらに活性化しないで行われる。前記の磁性ビーズまたは他の支持体には、結合パートナーを結合させるためのある範囲の機能性基（例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基またはアミノ基）を備えることができ、あるいは例えば表面コーティングにより変性して所望の機能性基を導入することができる。US-A-4654267、 4336173 および 4459378 には、このような多くの表面コーティングの概論が記載されている。支持体への標的細胞の結合は、多数の工程により行うことができる。例えば、特異的結合パートナーを含めた全ての試薬を、段階的に支持体に結合させ、次いでこれを標的細胞含有サンプルと接触させることができる。あるいは、標的細胞集団を、別の段階で、適切な不溶性支持体にさらす前に、特異的結合パートナー、例えばモノクローナル抗体と接触させることができる。従って、連結の異なる部分は、複雑な間接的連結の場合は特に、結合させるために接触させる前に、標的細胞および支持体の各々において形成することができる。一つの好ましい方法は、標的細胞と接触させる前に、抗体または他の標的-特異的結合パートナーを支持体に結合させることである。あるいは、抗体（標的- 特異的結合パートナーとして）を、最初の工程で標的細胞に結合させることができる。別の工程で、第１抗体の Fc 領域に結合しうる第２抗体を支持体に結合させ、次いで細胞と支持体とを接触させる。標的細胞を固体支持体に選択的に結合させるための特に有利なカップリングシステムは、我々の同時係属国際特許出願 No．WO94/20858 に記載されている。これは、標的-特異的結合パートナーと固体支持体との間のヒドロキシボリル／シス-ジオール連結に基づいている。前記のように、この連結は実体のシリーズを含む結合パートナーシステムの形態であってもよく、細胞を認識する第１標的- 特異的結合パートナー、またはこの第１パートナーを結合する第２結合パートナーの何れか一方を、このようにして支持体に結合させる。すなわち第１抗体または第２抗体がヒドロキシボリル／シス-ジオール連結の対象であってよい。ヒドロキシボリルに基づくシステムは、カップリンクおよび後続の IgM 抗体の遊離化において特に効果的であることが見出された。ヒドロキシボリル／シス -ジオール連結により支持体にカップリングされた IgM 結合パートナーの使用法は、本発明の好ましい観点である。我々は驚くべきことに、結合パートナーをヒドロキシボリルに基づく結合によりカップリングさせる場合、支持体上で結合パートナーの好ましいオリエンテーションが得られ、その選択的結合が損なわれないことを見出した。これは引き続いて、支持体への標的細胞の結合を、極めて効果的かつ信頼性の高いものにする。以下にさらに詳細に論じるように、ヒドロキシボリルに基づくシステムの追加の利点は、特定の状況において、ヒドロキシボリル／シス-ジオール残基の結合を温和な条件下で逆転でき、これにより標的細胞を簡単かつ破壊しない手段で遊離化できることである。しかしながら、上記の観点からドロキシボリル／シス- ジオール連結方法が有利であるが、特に非-特異的な細胞結合の問題が生じるようであり、この問題はこの方法において特に目立つようである。特に、Ｂ細胞および単球の目立った非-特異的結合が観察された。従って、このような細胞が存在する場合に、この技術の使用を厳しく制限し、かつ複雑にする恐れがある。本発明によれば、乳タンパク質を使用すると、ヒドロキシボリルに基づく結合が備えられた固体支持体による非-特異的細胞結合をブロックするのに特に効果的であることが見出された。これは本発明の特に好ましい態様である。細胞分離手法において、標的細胞および用途に依存して、分離後に細胞を支持体から脱着することが望まれる場合も望まれない場合もあろう。すなわち幾つかの場には、例えば臨床用途または機能性研究のために純粋な細胞分画を単離する必要がある一方で、他の場合（例えばパージまたは他のネガティブ選択手法）には、そうする必要がない。広範囲の脱着方法がこの技術分野で知られており、異なる支持体には異なる方法が適切であろう。特異的結合パートナーが抗体である場合、Dynal AS，Oslo，Norway の DETACHaBEAD システムを使用できる（例えば Rasmussen et al．の J．Immunol．Methods，146，195-202，1992 参照）。他の脱着方法としては、例えば過剰の遊離抗原を用いた競合置換反応、またはチオール試薬、例えばジチオスレイトールを用いたジスルフィド結合の切断が挙げられる。ヒドロキシボリルに基づく連結は、WO64/20858に記載されているような競合性シス-ジオール試薬を添加することにより簡単かつ効果的に破壊できる。乳タンパク質を添加する時期、およびこれにさらす時間の長さ、またはこれと共にインキュベートする時間の長さは、支持体および結合の性質に依存し、そしてまた分離後に標的細胞を遊離化することが望ましいか否かにも依存する。全ての場合、乳タンパク質の添加は、結合パートナーが支持体に充分に連結するのを可能にするように行う必要がある。非-特異的な細胞結合の防止に加えて、乳タンパク質はまた、結合パートナーが表面に結合するのを減少させる効果も有する。従って、一般的にいって、乳タンパク質は結合パートナーが支持体に連結または結合された後に添加される。結合パートナーが多成分システムである場合、この添加は一般的に、前記のシステム中の支持体-結合成分、例えば第２抗体が結合された後に行われる。ある種の乳タンパク質は、所望により結合パートナーの結合工程中に添加できるが、一般的にいって、主要な部分は、結合パートナー（結合パートナー成分）が結合された後に添加される。結合パートナーの結合工程中に追加のタンパク質を含ませると、結合パートナーが正しいオリエンテーションで結合するのを促進するのに有利なことがあり、乳タンパク質はこのような追加のタンパク質を提供するのに使用できる。上記で説明したように、タンパク質性結合パートナー、例えば抗体は、支持体へのその連結を強化する疎水性表面との疎水性相互作用を生じさせる傾向を有する。これは、後続の脱着を望まない場合、あるいは例えば型決定反応において、結合パートナーが支持体から漏洩するのを防ぐことが特に望ましい場合に有利である。すなわち、このような場合、より強い疎水性結合が形成されるのを保証するために、カップリング反応の後、支持体が乳タンパク質に長時間さらされるのを防ぐことが望ましいことがある。このような状況において、支持体を乳タンパク質と共にインキュベートするブロック工程は、何時でも、結合パートナーと支持体との間で充分強い結合を確立するのに充分なだけ、時間的な上限なしに、好都合に行うことができる。しかしながら、支持体から結合パートナーを後で脱着する必要があるならば、結合パートナーが支持体に充分強く連結したらすぐに、しかし支持体と結合パートナーとの間で強すぎる疎水性相互作用（これは結果として得られる脱着度を低下させる傾向がある）が確立する前に行うことが好ましいことがある。この時間は、支持体の種類および結合パートナーの種類により大いに変化する。原則として、ブロッキング剤は、結合パートナーが支持体に強固に結合された後は何時でも添加することができ、その時間は 15分〜24時間またはそれ以上で変化しうる。一例として、乳タンパク質ブロッキング剤は１〜４時間後に添加できる。ブロッキング剤を添加した後、結合パートナーが結合している支持体は、結合パートナーの脱着が望まれない場合は特に、使用前に任意の長さの時間貯蔵することができる。細胞の選択的捕獲の場合のように、ある工程において支持体から結合パートナーを遊離化することが望まれるであろうシステムについては、場合により支持体をできるだけ早く使用することが好ましいことがある。なぜならば、結合パートナーの構造が変化する可能性があり、これは非-特異的結合を生じさせることがあるためである。しかしながら、乳タンパク質が支持体の表面に存在すると、支持体への結合パートナーの疎水性結合が減少するので、４℃で数週間貯蔵した後でも、結合パートナー、例えば抗体を支持体から充分に遊離化することができる。一般的にいって、支持体はブロッキング剤の存在下に貯蔵され、使用直前に洗浄される。支持体から漏洩してしまうことのある結合パートナーを除去するために洗浄することが望ましい。ブロッキング工程中の温度および他の条件は特に臨界的ではなく、従来の実験室の手順および条件を使用できる。ブロッキング工程中の温度は４℃が好都合であることが見出された。用いられる乳タンパク質の濃度もまた、状況および選択に応じて変化することができる。例えば 0.01〜0.1 % w/v、より好ましくは 0.05〜0.1 % w/v の濃度が好適である。前記のように、本発明の方法は、全血液、バッフィコート、および例えば密度勾配遠心分離により得られた細胞懸濁物を含む生物学的媒質または人工的媒質から、全ての原核細胞、真核細胞または他の生存可能な実体を単離するのに利用できる。本発明の方法を実施するために必要な種々の試薬および材料は、好都合にはキットの形態で提供することができる。従って、本発明のもう一つの観点は、 (i) 上記で定義した固体支持体; (ii) 前記支持体および標的細胞に結合しうる上記で定義した標的-特異的結合パートナー; および (iii) 乳タンパク質を含む、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。本発明の細胞分離方法は、多くの用途、例えば、骨髄パージ、同種移植片中の正常Ｔ細胞の枯渇、例えば元に戻すための幹細胞の単離、機能性研究のための純粋細胞サブ集団の単離、組織型決定、および診断、例えば細菌性病原体の検出に使用できる。非-特異的細胞結合は、例えば下記の状況において説明されるような細胞分離手法において問題となりうる。１．直接のポジティブ細胞分離工程において、標的細胞に非-標的細胞が夾雑（汚染）する場合。このような非-標的細胞の夾雑は、例えば幹細胞のポジティブ分離の場合のように、標的細胞が低濃度で存在する場合に特に重大な問題である。通常、幹細胞の濃度は、ビーズに非-特異的に結合した他の細胞の量が比較的に少なくても、この量が、単離された幹細胞に基づいて高い％を占めるほどに低い。２．細胞のネガティブ除去により標的細胞を単離する際に、標的細胞が損失する場合。この選択的細胞分離方法は、除去しようとする非-標的細胞上の抗原に対する結合パートナーを担持した支持体により、細胞懸濁物から全ての非-標的細胞を除去することに関する。標的細胞の非-特異的結合は標的細胞の損失を表し、これは場合により著しい。特別な例としては、骨髄分離に関連して骨髄から癌細胞をパージする際に、骨髄中の幹細胞分画の部分を除去することが挙げられる。この場合、免疫磁性パージにより癌細胞が洗浄除去された骨髄は患者に再注射される。移植の成功は、再注入される骨髄中に活性な幹細胞が充分な数で存在することに依存する。従って、癌細胞を枯渇させる工程中に、磁性粒子への幹細胞の非-特異的結合が高いことは、望ましくない。３．標的細菌の免疫磁性単離において、単離された細菌またはウイルスに細胞および非-標的細菌が夾雑する場合。単離された細菌中に夾雑物が存在すると、単離された標的細菌の次の決定を複雑にすることがある。下記の非限定的な実施例を参照して、以下に本発明をより詳細に説明する。実施例粒子が細胞に非-特異的に結合するのを減少させるための異なる物質および方法の効果は、異なった手段で実証することができる。異なる方法で得られた様々な粒子表面への細胞の非-特異的結合の結果を、下記に示す。実施例１磁性粒子への細胞結合の直接測定による細胞の非-特異的結合磁性粒子への細胞の非-特異的結合に対するブロッキング剤の効果を、簡単ではあるが一定した手段で実証するために使用できる直接的方法は、所定の条件下で磁石により移動させたときに、多数の所定の磁性ビーズと共に輸送されるほどに強くビーズに結合した細胞を測定することに基づいている。この操作は、下記のように行った。バッフィコートの勾配遠心分離により得られ、20ｘ10⁶細胞／１ml を含む単核細胞の懸濁液を、３粒子／細胞に相当する量の磁性粒子と共にインキュベートした。穏やかに回転しながら４℃で 30分間インキュベートした後、粒子および細胞を含む試験管を、PBS 緩衝液 pH 7.4 で 10 倍に希釈し、細胞が結合した粒子を磁石で懸濁液から分離した。アクリジンオレンジおよびエチジウムブロマイドで着色した後、ビーズに結合した細胞数を、Burker 血球計を用い蛍光顕微鏡で評価した。粒子に結合した細胞の数は、懸濁液中の全細胞の％として表した。期待したとおり、ビーズに結合した細胞の絶対数は細胞懸濁液ごとに変化したが、異なる粒子表面上に細胞が非-特異的に結合した相対値はかなり一定しており、全ての場合に、細胞の非-特異的結合の防止において最も効果的なブロッキング剤として、カゼインが明らかに好ましいことを示した。カゼインは、予め BSA で被覆した粒子の改良にも応用された。この場合、予め BSA で処理した粒子の後処理剤としてカゼインを用いた。この処理の効力は、上記のように評価した。実施例１に記載した方法により細胞の非-特異的結合について調査したビーズの種類は、下記のとおりであった。ａ．M-450 粒子（DYNAL AS）幾つかの論文（例えば J．Ugelstand et al.，Progress of Polymer Sience， 87-161，1992）に記載されているこれらの粒子は、エポキシ樹脂で被覆されており、かつ中程度の親水性表面を有する磁性粒子である。これらの粒子は、そのままで、BSA およびカゼインでの処理後の両方において、細胞の物理的吸着を直接測定するために使用した。短時間の実験（タンパク質を１時間結合させた後、細胞の非-特異的結合の測定値を得た）において、細胞付加の測定は、タンパク質が物理的に吸着された粒子上で行われると考えることができる。細胞付着を測定する前に、粒子をタンパク質で１日間またはそれ以上処理した場合の結果は、共有結合したタンパク質で被覆された粒子に細胞が吸着した場合と考えることができる。ｂ．表面に BSA が共有結合している粒子これらの粒子は、M-450 粒子を、0.1 % の BSA を含む BSA 溶液と共に室温で 20 時間インキュベートすることにより調製した。これらの粒子への細胞の非- 特異的吸着は、直接に、あるいは 0.1 % カゼイン溶液を用いて pH 7.4 で粒子を４℃で１時間処理した後に、測定した。項目 a）に挙げた手順とは異なり、この場合の粒子は、カゼインを添加する前に化学的に結合した BSA で常に被覆されていたので、測定値は、BSA で被覆された粒子への細胞の非-特異的結合の減少に対するカゼインの効果を示す。ｃ．表面にフェニル基が結合している粒子比較的高い疎水性表面を有する種類の支持体を代表として意図したこれらの粒子は、次のように調製した。遊離のエポキシ基を担持した Dynabeads M450、4.5μmの磁化可能なビーズ（D ynal AS，Oslo，Norway）(10 g)を、ビス-(3-アミノプロピル)アミン(100 g)と 70℃で５時間反応させ、ビーズ上に表面 -NH₂基を与えた。次いでビーズをジグライム（ジエチレングリコールジメチルエーテル）500 mlで７回洗浄した。次いでビーズ（10 g）をグリシジルメタクリレート(200 g)と 70℃で 20 時間反応させ、表面ビニル基を与えた。ビーズをアセトン 500ml で７回洗浄した後、ビーズ 10ｇを、アクリル酸 50ｇ、およびイソプロパノール 300ｇ中に分散させた A IBN（アゾビスイソブチロニトリル）２ｇと 70℃で 20 時間反応させると、共重合して表面 -COOH 基が形成された。この -COOH ビーズ（0.5 g）をジグライム 7.5 ml 中に分散させ、ジグライム 7.5 ml 中の 2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)（0.5 g）の溶液を加えた。20℃で 10 分間攪拌した後、アニリン 1ml を加え、この懸濁液を 30℃で 16 時間攪拌した。次いでビーズをジグライム 50 ml で５回、メタノール 50 ml で１回、蒸留水 50 ml で少なくとも３回洗浄した。これらの粒子への非-特異的細胞付着は、前記のように測定した。細胞の非-特異的付着は、タンパク質溶液でビーズを前処理した場合について、種々のタンパク質濃度および種々のインキュベーション時間で測定した。ｄ．表面上にボロン酸基を有する粒子これらの粒子は、国際特許出願 No．PCT/GB94/00473 に記載された手順に従って調製した。前記の COOH ビーズ（5 g）を、100 ml の 0.1 M 燐酸塩緩衝液 pH 7.3 で１回洗浄した。次いでビーズを同じ緩衝液 50 ml 中に再分散させ、0.1 M 燐酸塩緩衝液(50 ml)中の 3-アミノフェニルボロン酸(3 g)の溶液を加えた。0 .1 M 燐酸塩緩衝液 pH 7.3（100 ml）中の L-エチル-3-(3-アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)（3 g）および N-ヒドロキシスルホサクシンイミドのナトリウム塩(0.5 g)の溶液を、10℃で攪拌下に滴下した(20 ml/min)。さらに５分間攪拌した後、温度を 20℃に高め、粒子懸濁液を 20℃で 20 時間攪拌した。次いでビーズを洗浄した。150 ml の 0.1 M 燐酸塩緩衝液 pH 7.3 で２回、150 ml の 1 M NaCl で２回、150 ml の0.1 M 炭酸塩緩衝液 pH 10.5 で２回、各洗浄は攪拌下に１時間。最後にビーズを蒸留水 200 ml で３回洗浄した。異なるタンパク質で処理した後、粒子への細胞の非-特異的付着の測定は、前記の a、b、c および d の粒子について記載したのと同様に行った。ｅ．グルタルアルデヒドを用いて表面に BSA またはカゼインがカップリングされている粒子次のようにして、グルタルアルデヒドを用いて磁性ビーズ表面に BSA またはカゼインを結合させた。M450 ビーズ（100 ml）を、0.1 % の BSA または0.1 % のカゼインの何れか一方を含む 2 ml の PBS 緩衝液 pH 7.4 中に分散させ、20 ℃で 20 時間インキュベートした。次いで粒子を磁石で単離して洗浄した後、0. 1 M 燐酸塩緩衝液 pH 7.7 中のグルタルアルデヒド溶液（0.5 M）2 ml を加えた。この反応を 20℃で 20 時間行った。単離して洗浄した後、0.1 % の BSA または 0.1 % のカゼインの何れか一方を含む 2 ml の PBS 緩衝液 pH 7.4 を加えた。20℃で 20 時間インキュベートした後、ビーズを再び単離して洗浄した。次いで、アルデヒド基をヒドロキシ基に変換するために、ビーズを、0.1 M NaBH₄を含む PBS 緩衝液 pH 7.4（2 ml）中で 20℃にて４時間インキュベートした。次いでビーズを蒸留水 2 mlで６回洗浄した。これらの粒子はまた、疎水性表面を有する磁性粒子に予め結合された BSA またはカゼインを架橋させることにより直接に調製することができた。ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅに記載した粒子への細胞の非-特異的結合の測定結果を表Ｉに示す。表Ｉは、細胞の非-特異的結合の減少におけるカゼインの利点が、BSA と比較して、表面にボロン酸がカップリングされた粒子の場合に最も卓越していることを示している。また、表Ｉ中の a）粒子と b）粒子との比較は、より親水性の表面の場合よりも疎水性表面の場合に、カゼインの利点がさらに卓越していることを示している。ブロッキング剤としてカゼインを使用することにより、疎水性の c）粒子（フェニル基を有する粒子）の非-特異的結合を減少でき、これらが、BSA で処理された、よりいっそう親水性の M450 粒子で得られるよりも、細胞付着を受けにくくすることは、注目すべきである。実施例２粒子から脱着した細胞分画における無関係な細胞での標的細胞の汚染から評価した、細胞をポジティブ選択する場合の非-特異的結合ポジティブ細胞分離後に遊離化された標的細胞中の非-特異的細胞を測定するために用いた粒子は、表面にボロン酸が共有結合している粒子であった。ポジティブ細胞分離に用いるこれらのボロン酸粒子は、細胞の非-特異的付着の直接測定に用いたボロン酸粒子について実施例１に記載したのと同様にして調製した。これらの粒子を用いた細胞のポジティブ分離は、今までのところ、T4 細胞、T8 細胞、Ｂ細胞および単球について行った。単離した細胞から粒子を除去した後に得られた細胞分画中での細胞の非-特異的結合の防止、およびこれによる標的細胞の汚染の防止に対するカゼインの効果を、BSA の効果と比較して、T4 細胞の場合について詳細に説明する。前記の他の細胞のポジティブ単離により、同様の結果が得られた。"Bor- 粒子" への抗-CD4 抗体のカップリング前記のように調製した "Bor-粒子" を抗-IgG1、抗-CD4 モノクローナル抗体、 ST4（Biosys，Compiegne，France）と共にインキュベートした。粒子（10mg/ml ）のインキュベーションは、抗体（100 μg/ml）と共に PBS 緩衝液 pH 7.4 中で４℃にて１時間行った。次いで粒子を磁石で単離した後、PBS 緩衝液で１回洗浄した。次いで 0.1 % のカゼインまたは 0.1 % の BSA の何れか一方を含む PBS 緩衝液 pH 7.4 中で粒子を４℃で１時間インキュベートした後、使用直前に、同じ PBS 緩衝液で４℃にて２回洗浄した。細胞懸濁液の調製血小板-枯渇バッフィートから Lymphoprep（Nycomed Pharma AS，Oslo，Norwa y）により末梢血単核細胞（PBMC）を単離し、0.6 % のクエン酸ナトリウムを含む PBS 緩衝液 pH 7.4 で４回洗浄した。次いでこの PBMC 懸濁液を CD14 に対するモノクローナル抗体で被覆されたDy nabeads M450（５〜10 粒子／標的細胞）（Dynal AS，Oslo，Norway）と共にインキュベートした。粒子濃度は少なくとも 20 x 10⁶ビーズ/ml であった。インキュベーションは、2 % のウシ胎児血清を含む PBS 緩衝液 pH 7.4 中で４℃にて 30 分間行った。次いで磁性粒子を、これにより単球を磁石で除去し、単球を枯渇した PBMC を集めた。T4 細胞の単離抗-CD4 抗体で被覆されたボロン酸粒子を、単球を枯渇した PBMC と共にインキュベートした。粒子の数を 10〜20 粒子／標的細胞に調節し、さらに粒子濃度を 25 x 10⁶ビーズ/ml に保持した。インキュベーションは 0.1 % のカゼインまたは 0.1 % の BSA の何れか一方を含む PBS 緩衝液 pH 7.4 中で４℃にて 30 分間行った。インキュベーションの後、懸濁液をインキュベーション緩衝液で 1 0 倍に希釈した。次いで粒子に結合した標的細胞および過剰の粒子を、外部磁石を用いて磁性凝集により単離した。単離された細胞を、0.1 % のカゼインまたは 0.1 % の BSA の何れか一方を含む PBS 緩衝液 pH 7.4 中に再懸濁させ、磁性粒子に結合した細胞を再び磁石を用いて単離した。単離と再懸濁のこの工程を４回繰り返した。ビーズの脱着細胞からビーズを脱着させるために、単離された細胞を、50 % のウシ胎児血清、0.3 % のクエン酸ナトリウムおよび 0.2 M のソルビトールを含むPBS 緩衝液 pH 7.4 中に 20℃で再懸濁させた。次いで細胞が入った試験管を Rock and R oller（Labinco，Breda，The Netherlands）の上に２時間置いた。次いで粒子を磁石で除去した。この工程により 80〜90 % の細胞がビーズから脱着された。収率を向上させるために、ビーズを脱着緩衝液中に再懸濁させ、懸濁液をピペットで 10 回処理した。再び磁石を用いてビーズを除去し、細胞を集め、最初の段階からの細胞懸濁液に加えた。細胞の計数異なる細胞分画中の細胞の数を、Coulter Multisiser II（Coulter Electroni cs Ltd.，Luton，England）を用いて決定した。流動血球計算発蛍色素が接合された CD3、CD4、CD8、CD19 および CD56 に対する抗体(Bect on Dickinson，Mountain View，Clifornia，USA)を下記の三つの細胞分画：単球を枯渇した PBMC、T4 細胞の単離後に残った細胞分画、および磁性ビーズを除去した単離細胞からの分画と共にインキュベートした。FACScan流動血球計数装置（Becton Dickinson）を用いて細胞を分析した。ブロッキング剤の有効性は、細胞を単離し磁性粒子を除去した後に遊離化された細胞中の非-標的細胞汚染を測定することにより決定した。結果：細胞懸濁液から単離された標的細胞の数は、ブロッキング剤としてのBSA およびカゼインで実際上同じであった。ブロッキング剤としての BSA では、ビーズから遊離化した細胞分画は 85 % の標的細胞（T4 細胞）を含んでいた。汚染は主にＢ細胞であり、単離された細胞の 13 % に達した。ブロッキング剤としてのカゼインでは、遊離化した細胞分画は 98 % の T4 細胞を含んでいた。実施例３ブロッキング剤として BSA またはカゼインを用いた細胞懸濁液からの標的細胞の除去細胞を単離する全ての場合に、標的細胞に加えて少量の非-標的細胞が細胞懸濁液から除去される。標的細胞を単離する間に両方の磁性粒子が過剰に除去されるだけでなく、粒子と標的細胞との凝集物として除去される場合は、同じ表面処理を行ったが粒子上に無関係な抗体を有する場合よりも認めうるほど多量の非- 標的細胞が同時に除去される。すなわち、標的細胞がビーズと一緒に単離されるということは、非-標的細胞が非-特異的に結合する傾向が、ビーズ単独の場合よりも高いことを明確に意味する。標的細胞の除去は、異なる粒子を用い、モノクローナル抗体に対して異なるカップリング方法を用い、かつブロッキング剤として BSA またはカゼインを用いて行った。M-450 ビーズの場合、ビーズを先ずモノクローナル抗体 ST4 と共に 20℃で 20 時間インキュベートした。次いで粒子を 0.1 % の BSA または 0.1 % のカゼインと共にさらに 20 時間インキュベートした。BSA で被覆された粒子およびカゼインで被覆された粒子の両者を、実施例２に記載したのと同じ型の細胞懸濁液からT4 細胞を除去するために使用した。BSA を有するビーズおよびカゼインを有する粒子の両者は、細胞懸濁液から 9 5 % 以上の標的細胞を除去することができた。細胞の非-特異的結合は、T4 細胞を除去する前および T4 細胞を除去した後の細胞懸濁液中の非-標的細胞を、前記の流動血球計数法を用いて決定して評価した。この場合もまた、細胞の非-特異的結合において BSA 被覆ビーズとカゼイン被覆ビーズとの間で明らかな相違があり、後者は、非-標的細胞の非-特異的結合を減少させるのに明らかに好ましい。後続の抗体結合のために塩化スルホニルで活性化したビーズについても同様の手法を用いた。この場合にもまた、BSA をカゼインで置き換えると、著しく減少した非-特異的な細胞の除去が観察された。 BSA またはカゼインで被覆した粒子をグルタルアルデヒトで架橋した場合、過剰のアルデヒド基を用いて IgG モノクローナル抗体をビーズにカップリングさせたのち、シッフ塩基および残留アルデヒド基を減少させるために、システムを水素化硼素ナトリウムで処理した。BSA 被覆およびカゼイン被覆の両方の粒子は、標的細胞の除去に有効であった。ここでもまた、カゼイン被覆粒子は標的細胞と一緒に非-標的細胞を除去する傾向が低かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バージ，アーヴィッドノールウェー，エヌ−7034 トロンドハイム，アーリングスクジャルクソンズゲイト 14 (72)発明者プレストヴィック，ヴェンケ，スレタージェルノールウェー，エヌ−7035 トロンドハイム，ジョンスヴァンスファイエン 87シー

Claims

【特許請求の範囲】１．固相選択的細胞-捕獲マトリックスへの細胞の非-特異的結合をブロックするために乳タンパク質を使用する方法。２．固相選択的細胞-捕獲マトリックスに乳タンパク質を添加することを含む、固相選択的細胞-捕獲マトリックスに細胞が非-特異的に結合するのを防止する方法。３．固相選択的細胞-捕獲マトリックスが、標的-特異的結合パートナーにより標的細胞を選択的に分離するのに適した固体支持体である、請求項１または請求項２に記載の方法。４．乳タンパク質を添加して非-標的細胞の非-特異的結合をブロックすることを特徴とする、標的-特異的結合パートナーにより標的細胞を固体支持体に選択的に結合させ、この支持体-結合細胞をサンプルから分離することを含む、サンプルから標的細胞を選択的に単離する方法。５．乳タンパク質がカゼインである、請求項１〜４の何れかに記載の方法。６．固相または固体支持体が粒状である、請求項１〜５の何れかに記載の方法。７．固相または固体支持体が磁性のものである、請求項１〜６の何れかに記載の方法。８．標的-特異的結合パートナーが、標的細胞および支持体の両方に選択的に結合可能な単一の実体を含むか、あるいは一端において標的細胞に選択的に結合可能な成分を含み、他端において支持体に結合する成分を含む実体のシリーズを含む、請求項３〜７の何れかに記載の方法。９．標的-特異的結合パートナーが、一つまたはそれ以上の抗体あるいはそのフラグメントを含む、請求項３〜８の何れかに記載の方法。１０．抗体が IgM またはそのフラグメントである、請求項９に記載の方法。１１．標的-特異的結合パートナーが、ヒドロキシボリル／シス-ジオール結合を含む連結により前記支持体にカップリングされる、請求項３〜１０の何れかに記載の方法。１２．標的-特異的結合パートナーが、シス-ジオール基を担持しており、かつ、前記ヒドロキシボリル／シス-ジオール連結を介して、支持体上のヒドロキシボリル基に直接に結合される、請求項３〜１１の何れかに記載の方法。１３．標的-特異的結合パートナーが、前記第１標的-特異的結合パートナーと結合する第２結合パートナーにより支持体に間接的に結合され、前記第２結合パートナーが、シス-ジオール基を担持しており、かつ、前記ヒドロキシボリル／シス-ジオール連結を介して、支持体上のヒドロキシボリル基に結合する、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。１４．標的-特異的結合パートナーまたはその支持体結合成分が支持体に結合された後、乳タンパク質が固相または固体支持体に添加される、請求項３〜１３の何れかに記載の方法。１５．乳タンパク質が 0.01〜0.1 % w/v の濃度で用いられる、請求項１〜１４の何れかに記載の方法。１６．前記の分離された細胞を前記支持体から脱着させることをさらに含む、請求項４〜１５の何れかに記載の方法。１７．前記標的-特異的結合パートナーがヒドロキシボリル／シス-ジオール連結により前記支持体にカップリングされ、前記の脱着が、競合性シス-ジオール含有試薬を添加して前記ヒドロキシボリル／シス-ジオール連結を切断することにより達成される、請求項１６に記載の方法。１８．(i)前記請求項の何れかで定義した固体支持体; (ii)前記支持体および標的細胞に結合可能な前記請求項の何れかで定義した標的-特異的結合パートナー; および (iii)乳タンパク質を含む、請求項２〜１７の何れかに記載の方法に使用されるキット。