JPH10505489A - 除神経筋キナーゼ（ｄｍｋ）、チロシンキナーゼスーパーファミリーのレセプター - Google Patents
除神経筋キナーゼ（ｄｍｋ）、チロシンキナーゼスーパーファミリーのレセプターInfo
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- JPH10505489A JPH10505489A JP8504978A JP50497896A JPH10505489A JP H10505489 A JPH10505489 A JP H10505489A JP 8504978 A JP8504978 A JP 8504978A JP 50497896 A JP50497896 A JP 50497896A JP H10505489 A JPH10505489 A JP H10505489A
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、dmkと称される遺伝子を提供する。この遺伝子は、除神経筋において高レベルで発現される新規なチロシンキナーゼレセプターをコードする。本発明はまた、dmk遺伝子産物に結合するリガンドを検出および／または測定するために使用され得るアッセイシステムを提供する。本発明はまた、Dmkと、Dmkへの結合を通してシグナル伝達を開始する薬剤との間の相互作用に基づく診断方法および治療方法を提供する。
Description
【発明の詳細な説明】
除神経筋キナーゼ(DMK)、
チロシンキナーゼスーパーファミリーのレセプター
１．序文
本発明は、新規のオーファンレセプター分子およびその使用、ならびにこれら
のレセプターと相互作用する新規のリガンドを同定するのに有用なアッセイシス
テムを提供する。
２．発明の背景
細胞に結合し、そしてそれによりこれらの細胞内に細胞の成長、生存、または
分化のような表現型応答を誘発するポリペプチドリガンドの能力は、膜貫通チロ
シンキナーゼによって媒介されることが多い。各レセプターチロシンキナーゼ(R
TK)の細胞外部分は、リガンド識別特性を有するタンパク質を提供するため、一
般に、分子のなかで最も特徴的な部分である。細胞外ドメインにリガンドが結合
することによって、細胞内チロシンキナーゼ触媒ドメインを介してシグナル伝達
が生じ、これは細胞内のターゲットタンパク質に生物学的シグナルを伝達する。
この細胞質の触媒ドメインの配列モチーフの特定の並びが、潜在的なキナーゼ基
質へのアクセスを決定する（Mohammadiら、1990、Mol．Cell．Biol.、11:5068-5
078頁：Fantlら、1992、Cell、69:413-413頁）。
すべての公知の成長因子RTKは、リガンドの結合に続いて二量化されると考え
られる（Schlessinger，J.、1988、Trend Biochem．Sci．13:443-447頁；Ullric
hおよびSchlessinger、1990、Cell、61:203-212頁；SchlessingerおよびUllrich
、1992、Neuron 9:383-391頁）。二量化する細胞質ドメイン間の分子の相互作用
により、キナーゼ機能が活性化される。血小板由来の成長因子(PDGF)のようない
くつかの場合には、リガンドは２つのレセプター分子を結合させるダイマーであ
る（Hartら、1988、Science、240:1529-1531頁；Heldin、1989、J．Biol．Chem
．264:8905-8912頁）が、例えばEGFの場合には、リガンドはモノマーである（We
ber
ら、1984、J．Biol．Chem.、259:14631-14636頁）。
より高度な微生物内の特定のチロシンキナーゼレセプターの組織分布により、
レセプターの生物学的機能に関する関連データが提供される。繊維芽細胞成長因
子(FGF)のような成長および分化因子のためのチロシンキナーゼレセプターは広
範に発現され、従って組織の成長および維持に一般的な役割を果たすと考えられ
る。レセプターのTrk RTKファミリー（GlassおよびYancopoulos、1993、Trends
in Cell Biol、印刷中）のメンバーは、より一般的には、神経系の細胞に限定さ
れ、これらのレセプターに結合する神経栄養因子は、脳および末梢の多様なニュ
ーロン群の分化を促進する（Lindsay，R.M.、1993、Neurotrophic Factors、S.E
．LoughlinおよびJ.H．Fallon編、257-284頁(San Diego，CA:Academic Press)）
。このようなTrkファミリーレセプターの１つ、trkBの組織内での局所化により
、このレセプターならびにこのレセプターに結合するリガンド（本明細書では同
族と呼ぶ）の潜在的な生物学的役割へのいくつかの洞察が提供された。従って、
例えば、成体マウスでは、有意なレベルのtrkB mRNAは肺、筋肉、および卵巣内
でも観察されたが、trkBは脳組織内で優先的に発現されることが見出された。さ
らに、trkB転写物は妊娠中期および後期の胎児内で検出された。14および18日齢
のマウス胎児のインサイチュハイブリダイゼーション分析により、trkB転写物は
、脳、脊髄、脊髄神経節および頭蓋神経節、交感神経系の脊椎神経幹ならびに種
々の神経感応経路を含む中枢神経系および末梢神経系に局在していることが示さ
れた。これは、trkB遺伝子産物が、神経発生および初期の神経発達に関与するレ
セプターであり、そして成体の神経系で役割を果たし得ることを示唆している。
RTKが発現される細胞環境は、リガンドのレセプターへの結合において示され
る生物学的応答に影響を与え得る。従って、例えば、Trkレセプターを発現する
ニューロン細胞が、そのレセプターに結合する神経栄養因子に曝される場合、ニ
ューロンは生存し、分化する。同じレセプターが繊維芽細胞によって発現される
場合には、神経栄養因子への曝露が繊維芽細胞の増殖を生じる（Glassら、1991
、Cell 66:405-413頁）。従って、細胞外ドメインはリガンド特異性に関する決
定因子を提供し、そして一旦シグナル伝達が開始されると、細胞環境がそのシグ
ナル伝達の表現型の結果を決定すると考えられる。
多くのRTKファミリーが、これらの細胞内ドメインの配列ホモロジーに基づい
て同定されている。例えば、TIE-1およびTIE-2として知られる、TIE（免疫グロ
ブリンおよびEGF相同ドメインを有するチロシンキナーゼ）ファミリーの２つの
メンバーは、細胞内領域に79%の配列ホモロジーを有する（Maisonpierreら、199
3、Oncogene 8:1631-1637頁）。これらのレセプターは細胞外ドメインに類似し
たモチーフを共有するが、配列の32%のみが同一である。これは潜在的に互いに
異なる生物学的役割を示すものであって、両方の遺伝子が胎児および出生児の組
織の内皮細胞内に広く発現される一方で、有意なレベルのtie-2転写物も、水晶
体上皮、心外膜および間充織の領域を含む他の胎児細胞集団中に存在するという
事実に反映されている。
NGFによって利用されるレセプターおよびシグナル伝達の経路には、trkプロト
オンコジーンの産物が含まれる（Kaplanら、1991、Nature 350:156-160頁；Klei
nら、1991、Cell 65:189-197頁）。Kleinら（1989、EMBO J．8:3701-3709頁）は
、ヒトtrkプロトオンコジーンに高度に関連することが分かっているレセプター
のチオシンタンパク質キナーゼファミリーの第２のメンバーをコードする、trkB
の単離について報告した。TrkBは、BDNF、NT-4、およびより低い程度ではNT-3に
結合しこれらへの機能的応答を媒介する（Squintoら、1991、Cell 65:885-903頁
：Ipら、1992、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．89:3060-3064頁；Kleinら、199
2、Neuron，8:947-956頁）。アミノ酸レベルでは、trkおよびtrkBの産物は、trk
に存在する11個のシステインのうちの９個を含む細胞外領域中に、57%のホモロ
ジーを共有することが分かった。このホモロジーは、チロシンキナーゼ触媒ドメ
イン内では88%に増大することが分かった。Trk遺伝子ファミリーは現在では拡大
して、trkC座ならびにtrkCのための好適なリガンドとして同定されているNT-3を
包含する（Lamballeら、1991、Cell 66:967-979頁）。
２つの新規のヒト遺伝子、ror1およびror2は、細胞質部分にTrk族のチロシン
キナーゼレセプタードメインに相同な領域を有するタンパク質をコードするが、
これらのタンパク質は、細胞外部分においてTrkファミリーとはかなり異なる（M
asiakowskiおよびCarroll、1992、J．Biol．Chem．267:26181-26190頁）。
Trkファミリーに関連するキナーゼドメインを有する別のレセプターは、シビ
レエイTorpedo californicaで同定され、これは、筋肉繊維上の運動ニューロン
誘導シナプシスで役割を果たし得る。Jenningsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA
90:2895-2899頁(1993)。このキナーゼは、電気器官、筋肉に相同な組織から単
離された。rorと同様に、このタンパク質のチロシンキナーゼドメインはTrkファ
ミリーに関連するが、細胞外ドメインはTrkとは幾分異なる。このタンパク質は
、Torpedoの骨格筋内では高レベルで発現され、そして成体Torpedoの脳、脊柱、
心臓、肝臓および精巣内では非常に低いレベルで発現されることが見出された。
RTKは発達の間に多くの重要な機能を媒介すると考えられるので、新規のRTKの
同定および単離は、発達に重要な役割を果たし得る新しいリガンドを同定する手
段として用いられ得る。このような新規のRTKは、多くの場合、例えば、Trkファ
ミリーのメンバー間の既知のホモロジー領域を含むPCRに基づくスクリーニング
を用いて、チロシンキナーゼレセプターの公知のファミリーのさらに別のメンバ
ーを検索することによって同定および単離される（例えば、Maisonpierreら、19
93、Oncogene 8:1631-1637頁を参照のこと）。関連する公知のリガンドが存在し
ない、このようないわゆる「オーファン」チロシンキナーゼレセプターを単離し
、続いてこのようなレセプターが発現される組織を決定することにより、標的組
織内の細胞の成長、増殖、および再生の調節への洞察が提供される。さらに、こ
のようなレセプターは、同族リガンドを単離するためにも用いられ得、これは次
に、レセプターを発現する細胞の生存、成長、および再生を調節するために用い
られ得る。
３．発明の要旨
本発明は、除神経筋キナーゼ「Dmk」と呼ばれる新規のチロシンキナーゼを提
供する。これは、正常な筋肉および除神経筋、ならびに心臓、脾臓および網膜を
含む他の組織内で発現される。このタンパク質は、チロシンキナーゼのTrkファ
ミリーに関連すると考えられる。
本発明はさらに、Dmkをコードする単離された核酸分子を提供する。
本発明はまた、Dmkの細胞外ドメインを含むタンパク質またはペプチド、およ
びこのような細胞外ドメインをコードする核酸を提供する。
本発明はさらに、Dmkまたはその細胞外ドメインをコードする単離された核酸
分子を含むベクターを提供し、これは、細菌、酵母、および哺乳動物細胞内でDm
kを発現するために用いられ得る。
本発明はさらに、Dmkと相互作用する薬物のスクリーニングにおける、Dmkレセ
プターもしくはその細胞外または細胞内ドメインの使用を提供する。本明細書中
に記載するレセプターに結合する新規の薬物は、レセプターを天然に発現する細
胞における生存および分化を媒介するだけではなく、レセプターを発現するよう
に操作された細胞を処置するために用いられる場合に生存および増殖を提供する
。特定の実施態様では、Dmkの細胞外ドメイン（可溶性レセプター）は、同族リ
ガンドのスクリーニングに利用される。
本発明はまた、ヒトおよび動物の組織を発現するDmkの検出に有用なヒトDmkを
コードする核酸配列内に含まれる配列とハイブリダイズし得る核酸プローブを提
供する。
本発明はさらに、Dmkに関する抗体を提供する。
本発明はまた、診断的および治療的利用性を有する。本発明の特定の実施態様
では、本明細書で述べるレセプターの機能または発現の異常型を検出する方法は
、筋肉の障害または他の障害の診断に用いられ得る。他の実施態様では、レセプ
ターまたはこのレセプターに結合するアゴニストの操作は、アルツハイマー病、
パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病(Lou Gehrig's diseas
e)）および突発性捻転ジストニーを含む、神経性の疾患、筋肉または神経筋ユニ
ット障害の疾患の治療に用いられ得る。さらなる実施態様では、レセプターの細
胞外ドメインは、レセプターの標的細胞への結合をブロックするブロッキング剤
として利用される。
本発明のさらなる実施態様では、過剰のDmkを患う患者を、dmk遺伝子コード領
域に対応するアンチセンスRNAまたはアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの有効量を投与して、それによって過剰Dmkの発現を低減させることにより
治療し得る。
４．図面の簡単な説明
図１．dmkの核酸および推定アミノ酸（単一文字コード）配列。成熟Dmkをコー
ドするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド192の前後で始まる。
図２．発育初期のDmkの分布を示すノーザンブロット。レーン１：胎児全体E9
；レーン２：胎児全体E11；レーン３：胎盤E11；レーン４：胎児頭E12；レーン
５：胎児体E12；レーン６：胎児脊髄E12；レーン７：胎盤E12；レーン８：胎児
頭E13；レーン９：胎児体E13；レーン10：胎児脳E17；レーン11：胎児脳P1；レ
ーン12：胎児脳P10；レーン13：胎児脳P19；レーン14：成体脳；レーン15：成体
筋肉；レーン16：成体除神経筋、ここでは、受精の日を日E1とし、誕生の日を日
P1とする。
図３．成体組織のDmkの分布を示すノーザンブロット。レーン１：脳；レーン
２：嗅球；レーン３：皮質；レーン４：海馬；レーン５：視床／視床下部；レー
ン６：中脳；レーン７：後脳；レーン８：小脳；レーン９：脊髄；レーン10：胸
腺；レーン11：脾臓；レーン12：肝臓；レーン13：腎臓；レーン14：肺；レーン
15：座骨神経；レーン16：網膜；レーン17：心臓；レーン18：卵巣；レーン19：
筋肉；レーン20：除神経筋。
５．発明の詳細な説明
本発明は、チロシンキナーゼのtrkファミリーに関連する新規のチロシンキナ
ーゼ分子を提供する。このタンパク質の配列は、配列番号１として図１に示され
ている。この成熟タンパク質のコード領域は、コード領域の部位20またはその前
後のセリン−グリシン−トレオニンの位置またはその前後から始まると考えられ
る。
本明細書中に記載する新規のチオシンキナーゼは、除神経骨格筋内で誘導され
ることが分かっている。従って、これはDmk（除神経筋キナーゼ）と称されてい
る。正常な筋肉および除神経筋の両方、ならびに特に心臓において見出されるこ
とに加えて、Dmkは、脾臓、卵巣、および網膜に実質的に存在することも分かっ
ているが、これらに限定されないようである。発達初期に存在するようであるが
、成体の組織にも見出される。
Dmkは、Jenningsら、前出によって同定されたTorpedo RTKに関連し得る。しか
し、Dmkは除神経筋内で誘発されると考えられるが、Torpedo RTKに関してはこの
ような誘発は報告されていない点で異なる。さらに、Torpedo RTKは細胞外クリ
ングルドメインを有するが、Dmkはこれを有しない。しかし、これらのキナーゼ
は、同じファミリーまたは関連するファミリーのメンバーであり得る。
Dmkをコードする遺伝子はクローン化されており、そのDNA配列は決定されてい
る（図１；配列番号２）。この成熟タンパク質の細胞外ドメインは、部位192ま
たはその前後で始まり部位1610またはその前後で終わる核酸配列によってコード
されると考えられる。このタンパク質の膜貫通部分は、部位1611またはその前後
で始まり部位1697またはその前後で終わる核酸配列によってコードされると考え
られる。細胞内ドメインは、部位1698またはその前後で始まり部位2738またはそ
の前後で終わる核酸配列によってコードされると考えられる。Dmkをコードするc
DNAクローンは、1993年７月13日、American Type Culture Collectionに寄託さ
れ、受託番号ATCC 75498が与えられた。
本発明はまた、Dmkの細胞外ドメインを含むタンパク質またはペプチドおよび
この細胞外ドメインをコードする核酸を提供する。タンパク質の細胞外ドメイン
は、配列番号１として示されたコード領域の部位20〜492またはその前後のアミ
ノ酸からなると考えられる。
マウスのDmkは、ヒトライブラリー（好ましくは筋肉由来の）を検索するため
の本明細書で述べる材料および方法を用いて、ヒトにおいてこれに匹敵するタン
パク質を同定するために用いられ得る。さらに、DmkとTorpedoRTKとの間の類似
性は、さらに別の関連するRTKを検索するのに有用なプライマーを開発するため
のこれらの遺伝子内の配列相同性領域の利用性を示唆する。
従って、本発明は、本明細書に述べるDmkをコードするDNAにハイブリダイズし
、ストリンジェントな条件下でこれへの安定した結合を維持する、長さが約10塩
基より長い核酸またはオリゴヌクレオチドを提供する。しかし、このようなハイ
ブリダイズする核酸は、他のチロシンキナーゼをコードする核酸またはこれらに
相補的な核酸を含む任意の従来の核酸に比べて新規でありかつ自明ではない。
本明細書で用いるストリンジェントな条件とは、(1)洗浄には低イオン強度お
よび高温を用いること、例えば、0.15MのNaCl／0.015Mのクエン酸ナトリウム／0
.
1%のNaDodSO4を50℃で用いること、または(2)ハイブリダイゼーション中に、ホ
ルムアミドのような変性薬剤、例えば、42℃で750mMのNaCl、75mMのクエン酸ナ
トリウムを含むpH6.5の、0.1%のウシ血清アルブミン／0.1%のFicoll／0.1%のポ
リビニルピロリドン／50mMのリン酸ナトリウム緩衝液を有する50%（容量／容量
）のホルムアミドを用いることである。
本発明のDmkの一部またはすべてに対してコードするヌクレオチド配列を用い
て、新規ファミリーメンバーまたは他の種からのDmkを単離する場合、配列の長
さは、少なくとも、脊椎動物の自らのdmk由来の内因性mRNAにハイブリダイズし
得るのに十分なサイズであるべきである。代表的には、十分な配列サイズは約15
個の連続塩基（DNAまたはRNA）であり得る。
チロシンキナーゼ中に保存されているアミノ酸を取り囲むタンパク質領域に対
応する変性オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを用いて新規のRTKを同
定するストラテジーは既に記載されている（Wilksら、1989、Proc．Natl．Acad
．Sci．U.S.A.，86:1603-1607頁；Partanen，J.ら、1990、Proc．Natl．Acad．S
ci．U.S.A．87:8913-8917頁；LaiおよびLemke、1991、Neuron 6:691-704頁；Mas
iakowskiおよびCarroll、1992、J．Biol．Chem．267:26181-26190頁）。DmkとTo
rpedoRTKとの間の関係が出願人らによって発見されたことにより、スクリーニン
グ技法で用いられ得る未知のホモロジー領域が同定された。
DmkとTorpedoのRTKとの間のアミノ酸ホモロジードメインAsp-Val-Trp-Ala-Tyr
-Gly（配列番号３）に基づいた以下のプライマーを、RTKに特徴的な既知のホモ
ロジー領域に対応する別のプライマーと組み合わせて用い、これにより、関連す
るチロシンキナーゼ（例えば、他のファミリーのメンバー）を単離し得る［アミ
ノ酸およびヌクレオチドを表す、本明細書で用いられるすべてのコードは、37 C
.F.R．§1.822(b)に示される通りである］：
RTKに特徴的な既知のホモロジー領域に対応する別のプライマーとしては以下
のものがある：
もしくは、DmkおよびTrkファミリーのような関連するファミリーのメンバーに
よって共有されるホモロジー領域は、新規のRTKを単離するように設計されたス
トラテジーで使用され得る。
本発明はさらに、Dmkについて図１に示すようなアミノ酸配列（配列番号１）
を実質的に含む実質的に精製されたタンパク質分子、または機能的に等価の分子
を提供する。機能的に等価の分子とは、サイレント変化が生じる、配列内の残基
がアミノ酸残基に置換されている分子を含む。例えば、配列内の１つまたはそれ
以上のアミノ酸残基が、機能的な等価物として作用する類似の極性を有する別の
アミノ酸によって置換され、サイレント変更が行われ得る。配列内のアミノ酸の
置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例え
ば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、
バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含ま
れる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン
、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に帯電した（塩基性
）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。負に帯
電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ
る。また、例えばグリコシル化、タンパク質分解性切断、抗体分子または他の細
胞リガンドへの結合などによって翻訳中または翻訳後に様々に修飾されるタンパ
ク質あるいはその断片または誘導体も、本発明の範囲に含まれる。
本発明はさらに、本明細書で記載するDmkタンパク質に実質的な類似性を有す
るタンパク質の単離を意図する。本明細書で用いられる実質的な類似性とは、異
なる種由来のDmkであるタンパク質、または少なくとも40%の位置が同じである種
内のファミリーのメンバーであるタンパク質を意味する。タンパク質レベルでの
実質的な類似性としては、Dmkのエピトープに対して生じるいくつかのモノクロ
ーナル抗体への結合についてDmkと競合する被験体タンパク質の能力が含まれる
。
本明細書で述べるDmkタンパク質は、1)スクリーニングストラテジー、2)精製
ストラテジーおよび3)診断用途において有用である。スクリーニングストラテジ
ーに関しては、細胞生存アッセイおよび増殖アッセイに基づく発現クローニング
ストラテジーにより、同族リガンドをスクリーニングする方法が提供される（Gl
assら、(1991)Cell 66:405-413頁）。Dmkに結合するリガンドは膜に結合し得る
ため、このようなレセプターを同定する他のストラテジーの方がさらに適切であ
り得る（Armitageら、1992、Nature 357:80-82頁；Smithら、1993、Cell 73:134
9-1360頁）。好適な実施態様では、Dmkの細胞外ドメインをマーカーに融合して
、同族体に結合された場合の細胞外ドメインの同定および精製を可能にするキメ
ラタンパク質を作製する。
例えば、Smithら（前出）に記載されているように、同族リガンドが膜に結合
する場合は、Dmkの細胞外部分を、短縮型免疫グロブリンの重鎖(Fc)に融合し得
る。次に、この融合産物を、例えばフローサイトメトリーによって、レセプター
に結合する表面リガンドを発現する細胞を同定するために用い得る。もしくは、
Dmk結合リガンドのスクリーニングおよび精製には、Dmkの細胞外ドメインを標識
するために用いられるmycのような他のタグもまた有用である（Davisら、1991、
Science 253:59-63頁；Squintoら、1990、Neuron 5:757-766頁）。
他の実施態様において、公知のリガンドに結合するＲＴＫの細胞外部分をＤｍ
ｋの細胞外部分で置換する。通常はレセプターに対する公知のリガンドの結合に
関連する、表現型の変化または初期応答遺伝子の誘導のような測定可能な効果を
用いて、類似する効果を誘導する同族リガンドについてスクリーニングし得る。
例えば、導入されたＤｍｋレセプター、または膜貫通ドメインに融合したＤｍ
ｋの細胞外ドメインおよびもう１つのＲＴＫの細胞内ドメインを含むキメラタン
パク質（Ｄｍｋ−キメラレセプター）を保持する細胞株、ならびにレセプターを
有さない親細胞株を、レセプターを通じて作動し得る薬剤の任意の可能な供給源
に曝し得る；レセプターまたはキメラを保持する細胞株に対する任意の特異的効
果（例えば、細胞の生存または増殖）を用いて、そのレセプターに作用する薬剤
を同定し、そして最終的にこのような薬剤を精製し得る。一旦、特定のレセプタ
ー／リガンド系が定義されれば、種々のさらなる特異的アッセイ系を利用して、
例えば、Ｄｍｋのさらなるアゴニストまたはアンタゴニストについて検査し得る
。
本発明に従って、ＤｍｋまたはＤｍｋ−ＲＴＫキメラレセプターを通常発現し
ない細胞にこのレセプターを導入すれば、このレセプターを用いて、細胞の識別
可能な応答に基づき、レセプターに結合するリガンドを同定することができる。
本発明は、誘導された応答のタイプは、細胞に導入された特異的レセプターでは
なく利用した細胞に依存すると考える。従って、例えば、ＰＣ１２褐色細胞腫細
胞におけるＤｍｋレセプターの発現の結果、このレセプターに結合するリガンド
への曝露に際し、ＰＣ１２細胞の分化が起こり得、他方、繊維芽細胞において、
同じレセプターが、Ｄｍｋ結合リガンドに応答して、生存および増殖の両方を媒
介し得る。適切な細胞株を選択して、アッセイのための最大の利用性を有する応
答が得られ得、そしてチロシンキナーゼレセプターに作用し得る薬剤を発見し得
る。「薬剤」とは、レセプター依存性様式で記載される系で作用するペプチド分
子および非ペプチド分子を包含する（しかしこれらに限定されない）任意の分子
を言う。
開発されるべきより有用な系の１つは、成長因子依存性繊維芽細胞株への所望
のレセプターの導入を包含する；通常は増殖応答を媒介しないこのようなレセプ
ターは、それにも拘わらず、繊維芽細胞への導入の後、繊維芽細胞成長因子の効
果を定量するのに用いられる種々の十分に確立された方法によってアッセイし得
る（例えば、チミジンの取り込みまたは他のタイプの増殖アッセイ；ｖａｎ Ｚ
ｏｅｌｅｎ，１９９０，「ポリペプチド成長因子の検出のための生物学的アッセ
イの使用」Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２巻
，１３１−１５２頁；Ｚｈａｎ および Ｍ．Ｇｏｌｄｆａｒｂ，１９６６，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，第６巻，３５４１−３５４４頁参照）。これら
のアッセイは、導入されたレセプターを有する細胞株およびレセプターを欠く親
細胞株の両方について、任意の調製物をアッセイし得るというさらなる利点を有
する；レセプターを有する細胞株に対する特異的効果のみが、導入されたレセプ
ターを通じて媒介されると判断される。
本明細書に記載するオーファンレセプターを発現する細胞は、天然にこのレセ
プターを発現し得るか、あるいはこのレセプターを発現するように遺伝子的に操
作され得る。例えば、第６節または第８節（下記）に記載のように得られる核酸
配列を、当該分野で公知の任意の方法を用い、トランスジェニック動物などを介
して、トランスフェクション、形質導入、マイクロインジェクション、エレクト
ロポレーションによって細胞に導入し得る。
オーファンレセプターへのテスト薬剤の特異的結合を多数の方法で測定し得る
。例えば、テスト薬剤の細胞への実際の結合を、（ｉ）インタクトな細胞の表面
に結合したテスト薬剤；（ｉｉ）細胞溶解物中のレセプタータンパク質に架橋し
たテスト薬剤；または（ｉｉｉ）インビトロでレセプターに結合したテスト薬剤
を検出または測定することによって検出または測定し得る。テスト薬剤とレセプ
ターとの間の特異的相互作用を、その相互作用の固有の特性を示す試薬を用いる
ことによって評価し得る。
あるいは、レセプターに対するテスト薬剤の特異的結合を、神経突起発芽の誘
導、即時性遺伝子発現またはレセプターのリン酸化を包含する（しかしこれらに
限定されない）レセプター／リガンド結合の二次的な生物学的効果を評価するこ
とによって測定し得る。例えば、神経突起発芽を誘導するテスト薬剤の能力を、
レセプターを欠く細胞、および例えば、Ｄｍｋ細胞外ドメインおよびＴｒｋファ
ミリーのメンバーの細胞内ドメインを含むキメラレセプターを発現する比較細胞
においてテストし得る；レセプターを欠く比較細胞においては起こらず、レセプ
ター発現細胞において起こる神経突起発芽は、特異的テスト薬剤／レセプター相
互作用の指標となる。レセプターマイナス細胞およびレセプタープラス細胞にお
ける即時性遺伝子（例えば、ｆｏｓおよびｊｕｎ）を検出することによって、あ
るいは当該分野で公知の標準的なリン酸化アッセイを用いてレセプタータンパク
質のリン酸化を検出することによって、同様の分析を行い得る。
同様に、本発明は、（ｉ）本明細書に記載するようなチロシンキナーゼレセプ
ターを発現する細胞をテスト薬剤に曝露する工程、および（ｉｉ）レセプターへ
のテスト薬剤の特異的結合を検出する工程を包含し、ここでレセプターへの特異
的結合がシグナル伝達活性に正に相関する、シグナル伝達活性を有する薬剤の同
定方法を提供する。特異的結合を、上記のように、直接結合または結合の二次的
な生物学的効果のいずれかについてアッセイすることによって検出し得る。この
ような方法は、新たな神経栄養因子または心臓保護活性のような他の薬学的活性
を有する因子の同定、あるいは、製薬業、このような活性についての多数のペプ
チド薬剤および非ペプチド薬剤（例えば、ペプチドミメティック(mimetic)）の
スクリーニングにおいて特に有用であり得る。
本発明の、特定の非限定的な、好適な実施態様おいて、レセプターマイナスで
あるか、遺伝子操作によりレセプタープラスにされたＰＣ１２（または繊維芽細
胞、下記参照）を交互に横列に含む大きな格子状の培養ウェルを調製し得る。次
いで、グリッドの各縦列またはその一部が、異なるテスト薬剤を含むように、種
々のテスト薬剤を添加し得る。次いで、各ウェルを、神経突起発芽の存在または
非存在についてスコア取りし得る。極めて多くのテスト薬剤を、このようにして
、シグナル伝達活性についてスクリーニングし得る。
また、本発明は、上記の方法に従って使用し得るアッセイ系を提供する。この
ようなアッセイ系は、例えば固体支持体に固定されたレセプターのインビトロ調
製物を含み得、あるいは、好ましくは、本明細書に記載するレセプタータンパク
質を発現する細胞を含み得る。
さらに、本発明は、Ｄｍｋを包含する（しかしこれに限定されない）上記組換
え核酸分子を保持する宿主細胞および微生物ならびにベクターを提供する。上記
のように、適切な発現ベクター中のＤｍｋをコードする核酸の、トランスジェニ
ック動物などを介するトランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーショ
ン、マイクロインジェクションによって、レセプタータンパク質を発現する細胞
に遺伝子操作を施してレセプターが得られ得る。特定の実施態様において、組換
え核酸を保持する宿主細胞はＣＯＳのような動物細胞である。他の実施態様にお
いて、宿主細胞は細菌、好ましくはEscherichia coliである。
ＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入についての当業者に公知の任意の方法
を用いて、レセプターをコードする発現ベクターを構築し得る。これらの方法は
、インビトロ組換えＤＮＡ法および合成技術およびインビボ組換え（遺伝的組換
え）を包含し得る。レセプタータンパク質またはペプチドフラグメントをコード
する核酸配列の発現は、レセプタータンパク質またはペプチドを組換えＤＮＡ分
子で形質転換した宿主中で発現させるように第２の核酸配列によって調節し得る
。例えば、レセプターの発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハ
ンサーエレメントによって制御し得る。レセプター発現を制御するのに使用し得
るプロモーターは、Ｓｑｕｉｎｔｏら（１９９１、Ｃｅｌｌ ６５：１−２０）
に記載された長末端反復(long terminal repeat)；ＳＶ４０初期プロモーター領
域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ ２９０
：３０４−３１０）、ＣＭＶプロモーター、Ｍ−ＭｕＬＶ５’末端反復、ラウス
肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、
１９８０、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロ
モーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の
調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２
）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ
−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター
（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）（「組換え細菌由来の有用なタンパク質」Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４−９４参照）
；Ｇａｌ４プロモーターのような酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメ
ント、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグ
リセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、
ならびに組織特異性を呈しかつトランスジェニック動物で利用されてきた以下の
動物転写制御領域：膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗ
ｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、
１９８６、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂ
ｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏ
ｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領
域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、リ
ンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｉら、
１９８４、Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ
． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４）、精巣、乳房、リンパ
系細胞および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１
９８６、Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制
御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．、１
：２６８−２７６）、肝臓で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒ
ｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−
１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）
；肝臓で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９
８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１）、骨髄系細胞
で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ ４６：
８９−９４）；脳における稀突起膠芽細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺
伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１
２）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５、
Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）、および視床下部で活性な性腺刺激ホ
ルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３４：１３７２−１３７８）を包含するが、これらに限定されない。
レセプターをコードする遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは、以下の３つ
の一般的アプローチ：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）「
マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入された配列の発現
によって同定できる。第１のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外
来遺伝子の存在を、挿入された遺伝子に相同な配列を含むプローブを用いてＤ
ＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出し得る。第２のアプローチに
おいて、ベクター中の外来遺伝子の挿入によって引き起こされるある種の「マー
カー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形
質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の存在または非存在
に基づいて、組換えベクター／宿主系を同定し、そして選択し得る。例えば、レ
セプターをコードする遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入された場
合、遺伝子挿入物を含む組換え体を、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定
し得る。第３のアプローチにおいて、組換えベクターによって発現された外来遺
伝子産物をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定し得る。この
ようなアッセイは、例えば、レセプターをコードする遺伝子産物の物理的または
機能的特性に基づき得る（例えば、神経栄養因子への、またはレセプターを直接
認識する抗体へのレセプターの結合による）。本発明の細胞は一時的にまたは、
好ましくは、構成的かつ永続的にレセプターまたはその一部を発現し得る。
好ましい実施態様において、本発明は、本明細書に記載するレセプターまたは
その一部を発現し、さらに即時性遺伝子プロモーター［例えば、ｆｏｓまたはｊ ｕｎ
プロモーター（Ｇｌｌｍａｎら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６
：４３０５−４３１６）］を含む組換え核酸を含む細胞を提供する。このよう
な細胞を、レセプターに結合するリガンドに曝露すると、結合は二次的に即時性
プロモーターの転写を誘導する。このような細胞を用いて、例えば、核ラン−オ
フ（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ−ｏｆｆ）分析、ノーザンブロット分析により即時
性遺伝子プロモーターの転写活性を測定することによって、あるいはプロモータ
ーによって制御される遺伝子のレベルを測定することによって、レセプター／リ
ガンド結合を検出することができる。即時性遺伝子プロモーターを用いて、神経
栄養活性の検出または測定のための、fosまたはjun、あるいはヒグロマイシン耐
性を付与する遺伝子（ＭｕｒｐｈｙおよびＥｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ、１９８７
、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：８２７
７−８２８１）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）
、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、β−ガラクトシダーゼ、
β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどのような任意の公知のレポー
タ
ー遺伝子を包含する（しかし、これらに限定されない）任意の検出可能な遺伝子
産物の発現を制御できる。
さらに、本発明のアッセイシステムで用いられた細胞は、神経系の細胞である
かもしれないか、またはそうでないかもしれない。例えば、本発明の詳細な、限
定されない実施態様では、成長因子依存性線維芽細胞は、シグナル伝達アッセイ
システムについての基礎として用いられ得る。無血清培地中で成長因子依存性で
ある線維芽細胞株（例えば、ZhamおよびGoldfalb、1986、Mol.Cell.Biol.6:3541
-3544に記載される）を、レセプターコード遺伝子でトランスフェクトし得る。
これは例えば、dmk遺伝子を含有するCMV-プロモーターベースの発現ベクターのD
NA（５μg）およびハイグロマイシン耐性遺伝子含有発現ベクター（１μg）を用
いるCaPO4トランスフェクションプロトコルを用いる。約48時間後、次いで細胞
をハイグロマイシン耐性について選択し、陽性のトランスフェクタントを同定し
得る。次いで細胞を、ハイグロマイシンの存在下で約３週間培養し、次いで耐性
コロニーをプールし得る。次いでこれらの細胞を、ポリ-D-リジンおよびヒトフ
ィブロネクチンでコートされた組織培養プレートに置き、そして10％仔ウシ血清
を加えたDMEM中で約４時間増殖させ、細胞をプレートに結合し得る。次いで血清
含有培地を吸引し得、細胞をPBSで約三回洗浄し、すべての残った血清を除去し
得る。次いで、細胞を無血清規定培地（８mM 重炭酸ナトリウム、15mM HEPES、
４×10-6 MnCl2、３mM ヒスチジン、10-5Ｍ エタノールアミン、10-7Ｍ 亜セレ
ン酸ナトリウム、１リットルあたり５mgのトランスフェリン、１リットル当たり
200mgのウシ血清アルブミン−リノレン酸複合体、ゲンタマイシン、ペニシリン
、およびストレプトマイシン、20mM L-グルタミンを追加した、DMEMとHamsF12の
3:1混合物）に移し得る。この方法で生成され、次いでDmkと結合可能な因子とと
もにインキュベートされた細胞は、約５日間の培養（48時間毎に培地および成長
因子を取り替える）の後、成長および増殖していることが期待され得る；しかし
、100ng/mlで無関係のリガンドで処理した、または無血清培地中の細胞は、増殖
しないはずである。
Dmkの生理学的役割への更なる洞察は、そのリガンドの定義から来る。Dmkタン
パク質のキナーゼドメインは、他のレセプターチロシンキナーゼに関連している
と思われるので、このタンパク質は、それが発現される細胞内でシグナル伝達に
関係するようである。従って、本明細書中で記載されるレセプターを用いてスク
リーニングされたDmk結合リガンドを用いて、天然に生じるDmk発現細胞内でシグ
ナル伝達を誘導し得る。この細胞としては、筋肉組織、心臓、脾臓、卵巣および
網膜内の細胞、ならびにDmkタンパク質を発現するように操作された細胞が挙げ
られる。このようなリガンドは、このような細胞の成長または生存を促進し得る
。
上記のように、本発明は、除神経筋で発現されると思われるチロシンキナーゼ
レセプターに関する。本発明に従って、これらのレセプターを認識できるプロー
ブを用いて、細胞および組織内のレセプターの変化したレベルを測定することに
より疾患または障害を同定し得る。このような疾患または障害は、次いで、これ
らのレセプターと結合するリガンドを用いて処置され得る。このような疾患とし
ては、筋肉の萎縮性変化またはジストロフィー性変化が、その根本的な病理学的
所見である疾患が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、筋肉萎縮は、
神経損傷による除神経（筋肉によるその神経との接触の消失）；変性、代謝性ま
たは炎症性神経障害（例えば、ギヤン−バレー症候群）、末梢神経障害、または
環境の毒物または薬物により生じる神経への障害から起こり得る。他の実施態様
では、筋肉萎縮は、運動ニューロン障害による除神経から生じる。このような運
動神経疾患としては、筋萎縮性側索硬化症（ALSまたはルーゲーリック病(Lou Ge
hrig's disease)）を含む成人運動ニューロン疾患；幼年性および若年性棘筋萎
縮、および多病巣性伝達遮断(multifocal conduction block)による自己免疫運
動神経障害が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施態様では、筋肉萎
縮は、慢性的な不使用から生じる。このような不使用による萎縮は、以下に挙げ
るが、それらに限定されない状態から生じ得る：卒中による麻痺、脊髄損傷；損
傷（例えば、骨折、捻挫、または脱臼）または長期のベッドでの安静による骨格
の不動化。さらなる他の実施態様では、筋肉萎縮は、代謝ストレスまたは栄養不
全から生じる。以下にこれらの例を挙げるが、それらに限定されない：ガンおよ
び他の慢性病の悪液質、絶食または横紋筋融解症、内分泌障害（例えば、甲状腺
の障害および糖尿病であるがこれらに限定されない）。筋肉萎縮はまた、筋ジス
トロフィー症候群に起因し得る。以下に例を挙げるが、それらに限定されない：
デュシェーヌ、ベッカー、筋緊張性、顔面肩甲上腕(fascioscapulohumeral)、Em
ery-Dreifuss、眼球咽頭、肩甲上腕、肢帯および先天性タイプならびに遺伝性末
梢筋傷害として知られるジストロフィー。さらなる実施態様では、筋萎縮は、先
天性筋傷害に起因する。以下にその例を挙げるが、それらに限定されない：良性
先天性低血圧症、中心コア病、ネマリン筋障害、および筋細管（中心核）筋障害
。さらに、Dmkおよびその関連するリガンドは、後天性（毒性または炎症性）筋
障害の処置に用いられ得る。筋肉の炎症性疾患の結果として生じる筋障害として
は、多発性筋炎および皮膚筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。毒性筋
障害は、薬剤に起因し得る。以下にその例を挙げるが、それらに限定されない：
adiodarone、クロロキン、クロフィブレート、コルヒチン、ドキソルビシン、エ
タノール、ヒドロキシクロロキン、オルガノホスフェート、perihexiline、およ
びビンクリスチン。
理論により結びつけられることは望まないが、マウス内のDmkの予備的なマッ
ピングは、この遺伝子が、ヒト染色体9qと相同の領域中のマウス第４染色体に位
置付けられることを明かにした。第４染色体のこの領域に関連するマウス内の変
異体としては、シェーカー(shaker)症候群の徴候（聴覚消失、頭部トシング(hea
d-tossing)、サークリング(circling)、および機能冗進(hyperactivity)を包含
する）を生ずる「wi」変異(旋回(whirler)）が挙げられる（Lane、P.W.、963、J
.Hered.54;263-266）。第４染色体のこの領域に関連するマウス内の他の変異は
、歩く際の激しい震えの徴候および後ろ足の揺れと関係する「vc」変異(動揺(va
cillans))である（Sirlin,J.L.、1956、J.Genet.54:42-48）。
ヒトでは、特発性ねじれ失調症（ITD）として知られる疾患は、ヒト染色体9q
バンド34へ連鎖分析によりマップされた遺伝子と関連する。この疾患は、頻繁に
ねじれおよび反復運動、あるいは異常な姿勢を起こす、持続性の不随意の筋肉収
縮により特徴づけられる。
dmk内の欠損が、これらの疾患と関連することが見いだされれば、本発明は、
インサイチュでのこのような遺伝子の置換のための遺伝子治療において有用であ
ると判明し得る。あるいは、Dmk遺伝子の独特のセグメントを利用するプローブ
は、このような障害のための診断薬として有用であると判明し得る。
本発明は、患者試料中のDmkの発現のレベルと健常人由来の比較サンプル中のD
mkの発現のレベルとを比較する工程を包含する、患者の神経障害または他の障害
の診断方法を提供する。この方法において、健常人と比較した、患者中のDmkの
発現のレベルの違いは、患者における障害が、Dmk代謝に１次的または２次的に
関連し得ることを示す。患者試料は、任意の細胞、組織、または体液であり得る
が、筋肉組織または脳脊髄液が好ましい。
用いられ得るプローブの一種は、抗体の結合ドメインを含む抗Dmk抗体または
そのフラグメントである。
本発明に従って、Dmkタンパク質、あるいはそのフラグメントまたは誘導体は
、抗Dmk抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。タンパク質合成のた
めの組換え技術（本発明のDmk核酸配列に基づいた）を用いる比較的多量のDmkタ
ンパク質の産生を提供することにより、Dmkの限定された量の問題が、取り除か
れた。
抗Dmk免疫応答を生じる可能性をさらに改善するために、Dmkのアミノ酸配列を
、増加した免疫原性と関連し得る分子の部分を同定するために分析し得る。例え
ば、このアミノ酸配列を、コンピューター分析に供し、Dmkの親水性、表面確率
、可撓性、抗原性指数、両親媒性ヘリックス、両親媒性シート、および２次構造
のコンピューター生成プロットを示す表面エピトープを同定し得る。あるいは、
異なる種由来のDmkの推定アミノ酸配列を比較して、そして比較的非相同性の領
域を同定し得る。これらの非相同性領域は、様々な種に渡って免疫原性である可
能性がより高い。
Dmkに対するモノクローナル抗体の調製のために、培養中の連続的細胞株によ
る抗体分子の産生を供給する任意の技術が、用いられ得る。例えば、Kohlerおよ
びMilsteinによりもともと開発されたハイブリドーマ技術（1975、Nature 256:4
95-497）、ならびにトリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（
Kozborら、1983、Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクロナール抗体を
産生するEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら、1985、「Monoclonal Antibodies an
d Cancer Therapy」Alan R．Liss,Inc．77-96頁）などは、本発明の範囲内であ
る。
治療的使用のためのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはキ
メラヒト−マウス（または他の種）モノクローナル抗体であり得る。ヒトモノク
ロナール抗体は、当該分野で公知の任意の多くの技術（例えば、Tengら、1983、
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：7308-7312；Kozborら、1983、Immunology Today
4:72-79；Olssonら、1982、Meth.Enzymol.92:3-16）により作製され得る。ヒト
定常領域を有するマウス抗原結合ドメインを含有するキメラ抗体分子が、調製さ
れ得る（Morrisonら、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851、Takedaら、19
85、Nature 314:452）。
当該分野で公知の種々の手順が、Dmkのエピトープへのポリクローナル抗体の
産生のために用いられ得る。抗体の産生のために、種々の宿主動物が、Dmkタン
パク質、あるいはそのフラグメントまたは誘導体の注射により免疫され得る。以
下にその例を挙げるが、それらに限定されない：ウサギ、マウス、ラットなど。
種々のアジュバントは、宿主種に依存し、免疫学的応答を増大するのに用いられ
得る。以下にアジュバントの例を挙げるが、それらに限定されない：フロイント
アジュバンド（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウ
ム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン）、pluronicポリオール、ポリアニ
オン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェ
ノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、BCG(Bacille Calmet
te-Guerin)）およびCorynebacterium parvum。
Dmkエピトープに対する抗体の分子クローンは、公知の技術により調製され得
る。組換えDNA方法（例えば、Maniatisら、1982，Molecular Cloning，A Labora
tory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York
）を用いて、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸
配列を構築し得る。
抗体分子は、公知の技術により精製され得る。例えば、免疫吸着またはイムノ
アフィニティークロマトグラフィー、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）のよ
うなクロマトグラフィー法、またはそれらの組み合わせなど。
本発明は、抗体分子およびそのような抗体分子のフラグメントを提供する。分
子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術により生成され得る
。
例えば、このようなフラグメントとして、以下に例を挙げるが、それらに限定さ
れない：抗体分子のペプシン消化により生成されるF(ab')2フラグメント；F(ab'
)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るFab'フラ
グメント、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成さ
れ得るFabフラグメント。
上記のプローブを実験的に用い、Dmkを発現することが今まで示されなかった
細胞または組織を同定し得る。さらに、これらの方法は、異常組織（例えば、悪
性腫瘍）によるDmkの発現を同定するのに用いられ得る。別の実施態様では、こ
れらの方法は、障害を被る患者由来の細胞、液、または組織のDmkの発現と、健
常人由来の比較される細胞、液、または組織内でのDmkの発現とを比較するため
に、診断的に用いられ得る。液は、特に血液または髄液以外の任意の体液をいう
と解釈される。健常人と比較した患者におけるDmkの発現のレベルの違いは、患
者の障害が、１次的または２次的に、Dmk代謝に関係し得ることを示す。例えば
、Dmkのレベルの増加は、患者の障害が、Dmk結合リガンドの正常レベルに対する
増加した感受性に関係することを示し得るか、あるいは患者のDmk結合リガンド
レベルが低く、その結果レセプターの数が代償として増加することを示唆し得る
。
本発明は、Dmk発現細胞に対するリガンドの効果に逆らうための可溶性レセプ
ター（細胞外ドメイン）の使用をさらに提供する。例えば、同族体(cognate)が
所望されないマイトジェン性特性を有することが見出される場合、このようなブ
ロッキングが所望される。
６．実施例：DmkをコードするcDNAのクローニング
6.1 材料および方法
チロシンキナーゼ相同ドメインを、Hanksら（1988）Science 241、42-52によ
るアラインメントに基づいて同定した。高度に保存された領域Asp-Leu-Ala-Ala-
Arg-Asn（配列番号７）およびAsp-Val-Trp-Ser-Tyr-Gly（配列番号13）は、以下
の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計するのに用いられ：
これを用いて除神経された筋肉のcDNAを用いるPCR反応をプライムした。得られ
た増幅DNAフラグメントを、プラスミドへの挿入によりクローン化し、配列決定
し、そしてDNA配列を、全ての公知のチロシンキナーゼの配列と比較した。cDNA
テンプレートを、オリゴd(T)プライマーを用いて、除神経筋組織のRNAの逆転写
により生成した。PCR反応を、40℃のプライマーアニーリング温度で行った。PCR
反応物のアリコートを、アガロースゲルでの電気泳動に供した。
これらのPCR反応由来のサイズ選択された増幅DNAフラグメントを、以下のよう
にプラスミド中にクローン化した：各PCR反応物を上記のように再増幅し、Xhol
およびSaclで消化して、プライマーの末端における部位を切断した（以下を参照
のこと）。Xhol/Sacl-切断DNAを、Magic PCRキット（Promegaより）により精製
し、Bluescript II SK(+)プラスミド内の適合するXhol/Sacl部位へクローン化し
、エレクトロポレーションにより、DH10B E.coliへ導入し、次いで選択寒天上に
形質転換体をプレートした。PCR形質転換由来のアンピシリン耐性細菌コロニー
を、96-ウエルマイクロタイタープレートに接種し、そしてチロシンキナーゼ挿
入物に隣接するベクタープライマー（T3およびT7）を用いるPCRのために用い、
そしてこれらのPCRフラグメントを、配列決定により分析した。
クローン化されたフラグメント配列の１つは、Dmkと命名された新規のチロシ
ンキナーゼドメインのセグメントを含有していた。Dmkに対応するPCR由来フラグ
メントの配列を用いてPCRプライマーを生成し、RACE手順によりより長いDmk特異
的フラグメントを得た。これらのより長いDmkプローブをハイブリダイゼーショ
ンプローブとして用いて、ラットの除神経された骨格筋のcDNAライブラリーから
完全長Dmk cDNAクローンを得た。ABI 373A DNAシーケンサーおよびTaq Dyedeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystem,Inc.、Foster City、C
A）を用いて、DNAを配列決定した。Dmkの配列（図１；配列番号１）は、タンパ
ク質のtrk ファミリーのメンバーと高度の相同性を有する。これは、筋肉内で見
られるJenningsら、Torpedo RTKに類似することもまた見出された。
6.2 結果と考察
既知のチロシンキナーゼ分子の保存領域に相当するオリゴヌクレオチドプライ
マーを、新規なオーファンチロシンキナーゼレセプター分子をコードするDNA配
列を増幅およびクローン化するために使った。チロシンキナーゼファミリーの分
枝の代表物のアミノ酸配列、およびこれらのタンパク質の触媒ドメイン内の相同
的な範囲を縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計に使用した。次いでこれら
のプライマーを、ラットの除神経筋cDNAライブラリーをテンプレートとして用い
る、PCR反応の開始に使用した。次いで、その結果得られた増幅DNAフラグメント
をBluescript II SK(+)プラスミドにクローン化して配列決定し、そのDNA配列を
既知のチロシンキナーゼのDNA配列と比較した。Dmkと命名した新規チロシンキナ
ーゼをコードするPCRフラグメントの配列を、さらに隣接するDNA配列を取得する
のに使用した。Dmk配列を含有するDNAフラグメントを、除神経骨格筋ライブラリ
ーからcDNAクローンを取得するためのプローブとして使用した。このクローンは
、trkファミリーのタンパク質のメンバーに対して高度の相同性を有する新規チ
ロシンキナーゼレセプターをコードしている。それはまた、JenningらのTorpedo
RTKとも相同的であることが見出された。
図１はDmkクローンのヌクレオチド配列(配列番号２)を表している。
７．実施例：さらなるチロシンキナーゼの同定
他の相同的セグメントと組み合わせて、現在使い得るチロシンキナーゼレセプ
ター中の相同的セグメントを得るために、新規Dmk配列を使用した。例えば、Tor
pedo trk-関連キナーゼとDmkとのアラインメントは以下の保存されたタンパク質
セグメントを示す：
この相同性「ボックス」は他のいかなる哺乳動物チロシンキナーゼレセプター
にも存在しない。本質的にこの「ボックス」に基づく縮重オリゴヌクレオチドは
、
既知または新規なチロシンキナーゼ相同性セグメントのいずれかと組み合わせて
、新規のチロシンキナーゼレセプターを同定するのに使用し得る。
7.1 材料と方法
DmkとTorpedo TRK Asp-Val-Trp-Ala-Tyr-Gly(配列番号３)間で高度に保存され
た領域、および配列番号５、７、９または11のような相同的な既知の領域に基づ
くさらなるプライマーを、cDNAを用いるPCR反応を開始するのに使われる縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用する。cDNAテンプレートは、
オリゴd(T)あるいは他の適当なプライマーを用いて、組織RNAの逆転写によって
作製する。PCR反応物のアリコートをアガロースゲルにおける電気泳動に供する
。得られた増幅DNAフラグメントをプラスミドに挿入してクローン化して配列決
定し、そしてそのDNA配列を全ての既知のチロシンキナーゼの配列と比較する。
これらのPCR反応由来の、サイズ選択した増幅DNAフラグメントを次のようにプ
ラスミドにクローン化した：各PCR反応は、上記実施例１のように再増幅し、プ
ライマーの末端で部位を切断するためにXhoIおよびSacIで消化する(下記参照)。
XhoI/SacI切断DNAをプラスミド内の適合性のXhoI/SacI部位にクローン化し、エ
レクトロポレーションによってE．coliに導入し、引き続いて選択寒天培地に形
質転換体をプレート化する。PCR形質転換由来のアンピシリン耐性の細菌コロニ
ーを96ウエルマイクロイタイタープレートに接種し、そしてこれらPCRクローン
由来の各コロニーを、標準的なプラスミドミニプレップ手順で精製したプラスミ
ドDNAの配列決定によって分析する。
新規なチロシンキナーゼドメインのセグメントを含有するクローン化フラグメ
ントを、cDNAライブラリーから全長cDNAクローンを得るために、ハイブリダイゼ
ーション用プローブとして使用する。
８．実施例：Dmkの組織特異的発現
8.1 材料および方法
Dmkのチロシンキナーゼドメインを含有する680ntフラグメントを放射性標識し
、様々なラット組織特異的RNAのノーザン分析に利用した。ラット組織特的RNAを
１％アガロース-ホルムアルデヒドゲルによる電気泳動によって分画し、引き続
いて10×SSCを用いてナイロン膜の毛管現象を利用してトランスファーした。RNA
を紫外線照射によって膜に架橋し、そして放射性標識したDmkプローブを、0.5M
NaPO4(pH7)、１％牛血清アルブミン(Fraction V,Sigma)、７％SDS、1mM EDTA、
および100ng/ml超音波処理した変性サケ精子DNAの存在下で、65℃でハイブリダ
イズした。そのフィルターを２×SSC、0.1％SDSを用い65℃で洗い、そして-70℃
で１枚の増強スクリーン、Ｘ線フィルムを用いた５日間のオートラジオグラフィ
ーに供した。ゲルのエチジウムブロマイド染色は、等レベルの総RNAが、異なっ
た試料に対してアッセイされていることを示した。
8.2 結果
Dmkプローブは、成体組織中(図２)において除神経骨格筋由来の７kbの転写物
には強く、正常な筋肉、網膜、卵巣、心臓そして脾臓由来の転写物には弱く、ハ
イブリダイズした。また、より弱いレベルの発現が、肝臓、腎臓および肺にも見
られ得た。それはまた、大脳、脊髄および小脳中の約６kbのより短いDmk転写物
に、弱くハイブリダイズする。
胚組織においては(図３)、Dmk転写物は、胴体(body)、脊髄、胎盤、および頭
部(Ｅ12およびＥ13において)に見られ得る。
筋および神経組織中でのヒトDmkの高発現は、本発明あるいはDmkに関連したリ
ガンドが、神経系の障害、特に運動ニューロン(考察、上記を参照)および神経筋
接合部に影響を及ぼす広範な神経障害を処置することに利用し得ることを示唆す
る。さらに、心臓組織でのDmkの高発現は、本発明、あるいはDmkに関連するリガ
ンドが、心臓病の処置に利用し得ること、そして、例えば心疾患(cardiac event
)中または心疾患後の筋損失の防止における予防的用途(考察、上記を参照)を有
し得ることを示唆する。網膜組織でのDmkの発現は、本発明が、色素性網膜炎を
包含するがこれに限定されない、網膜に関連した障害の治療に利用し得ることを
示唆するものである。卵巣でのDmkの発現は、Dmk、あるいはDmkに関連したリガ
ンドが、卵巣に関連した疾病あるいは障害の処置に有用であり得ることを示唆す
るものである。最後に、脾臓でのDmkの発現は、Dmk、あるいはDmkに関連したリ
ガンドが、脾臓に関連した疾病あるいは障害の処置に有用であり得ることを示唆
する。
95．微生物の寄託
以下のクローンは、Amrican Type Culture Collection(12301 Parklawn Drive
，Rockville，Maryland 20852)に、1993年７月13日に寄託した。
受託番号
pBluescript SK-containing dmk
本発明は本明細書中に記載した特定の実施態様による範囲内に限定されるもの
ではない。実際、本明細書中に記載したものに加えて、様々な本発明の改変が前
記の説明および添付の図から、当業者には明らかとなる。そのような改変は添付
の請求の範囲内にあることが意図される。
様々な参考文献が本明細書に引用される(これらの開示内容は、そのまま参考と
して援用される)。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ
，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，
ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＭ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．(a)図１に示される核酸配列あるいは(b)その配列の一部であって、図１に 示されるアミノ酸配列の細胞外ドメイン、膜貫通部分、または細胞内ドメインを コードする配列あるいは(c)その配列の一部であって、図１に示されるアミノ酸 配列の細胞外ドメイン、膜貫通部分および細胞内ドメインをコードする配列を含 む実質的に精製された組換え核酸分子。 ２．ａ）図１の192〜1610のヌクレオチド； ｂ）図１の1611〜1697のヌクレオチド； ｃ）図１の1698〜2738のヌクレオチド；または ｄ）図１の192〜2738のヌクレオチド を含む、請求項１に記載の核酸。 ３．ａ）図１に示されるアミノ酸配列を含有するか；あるいは ｂ）細胞外ドメイン、膜貫通部分、または細胞内ドメインを含有する(ａ) のタンパク質の一部を含有するか；あるいは ｃ）細胞外、膜貫通および細胞内領域を含有する(ａ)のタンパク質の一部 を含有するか； ｄ）ａ)、ｂ)、またはｃ)のタンパク質と機能的に等価であるか；あるい は ｅ）ａ)、ｂ)、またはｃ)のタンパク質と実質的な類似性を有する、 実質的に精製されたタンパク質。 ４．図１の20〜492のアミノ酸を含有する、請求項３に記載のタンパク質。 ５．請求項３または４に記載のタンパク質をコードする核酸分子に、作動的に 連結させた発現調節配列を含有する、発現ベクター。 ６．請求項１または２に記載の核酸分子に、作動的に連結させた発現調節配列 を含有する、請求項５に記載の発現ベクター。 ７．即時性遺伝子プロモーターを含有する、請求項５または６に記載のベクタ ー。 ８．前記即時性遺伝子プロモーターがfosプロモーターまたはjunプロモーター である、請求項７に記載のベクター。 ９．請求項５〜８のいずれかにおいて定義される発現ベクターを保有する、細 胞。 １０．請求項５〜８のいずれかに記載の発現ベクターを保有する、微生物。 １１．PC12細胞株またはNIH 3T3細胞株由来の細胞で、請求項７または８にお いて定義されるベクターを保有する、請求項９に記載の細胞。 １２．即時性遺伝子プロモーターの制御下で、発現可能な検出マーカーをコー ドする遺伝子をさらに含有する、請求項１１に記載の細胞。 １３．無血清培地中で成長因子依存的であり、そして請求項６〜８のいずれか に記載の発現ベクターを含有する、繊維芽細胞株。 １４．請求項１、５または６に記載の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオ チド配列であり、そして該配列が正常な筋よりも除神経筋においてより高いレベ ルで発現されるチロシンキナーゼをコードする、ヌクレオチド配列。 １５．請求項３または４に記載のタンパク質に結合するリガンドを同定するプ ロセスであって、 ａ）無血清培地中では生存しない成長因子依存性細胞を、請求項１におい て規定される核酸または請求項５〜８のいずれかにおいて規定される発現ベクタ ーで形質転換する工程； ｂ）そのような形質転換細胞を潜在的Dmk結合リガンドの存在下、無血清 培地中で培養する工程；および ｃ）無血清培地中で該形質転換細胞の生存を支持するようなリガンドを同 定する工程、 を包含するプロセス。 １６．請求項１５に記載の方法で同定されるリガンド。 １７．健常人と比較した患者中のDmkタンパク質の発現レベルの差が、患者の 障害が一次的または二次的にDmk代謝と関連し得ることを示唆する場合において 、患者のサンプル中の請求項３または４において定義されるDmkタンパク質の発 現レベルと、健常人由来の比較用サンプル中の請求項３または４において定義さ れるDmkタンパク質の発現レベルとを比較する工程を包含する、患者における筋 肉障害または他の障害のエクスビボ診断法。 １８．前記障害が特発性ねじれ失調症である、請求項１７に記載の方法。 １９．筋肉障害または他の障害を患うヒトあるいは動物の身体を処置する方法 における用途のための、請求項３または４において同定されるタンパク質、ある いは該タンパク質のペプチドフラグメントまたは誘導体。 ２０．チロシンキナーゼレセプター遺伝子の少なくとも一部をクローニングす る方法であって、 （i）cDNA分子の収集物をテンプレートとして用い、そしてa)配列番号３ に基づく縮重プライマー；およびb)配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列 番号１１および配列番号１３からなる群から選択される配列 に基づく縮重プライマーを包む、オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせ、 または、以下の配列：c)配列番号４；ならびにd)配列番号６、配列番号８、配列 番号１０、配列番号１２および配列番号１４からなる群から選択される配列を有 するプライマーを含むオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたポリメラーゼ連 鎖反応によって、チロシンキナーゼをコードする核酸配列を増幅する工程；なら びに； （ii）適切なベクターに該増幅核酸をクローニングする工程、 を包含する方法。 ２１．請求項２０に記載の方法によりクローン化された実質的に精製された核 酸。 ２２．請求項２１に記載の核酸分子を保有する細胞。 ２３．請求項２１に記載の核酸分子を保有する微生物。 ２４．ATCC寄託番号75498を有する微生物。
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