JPH10506014A - ヒトパピローマウイルス６ａ型をコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、精製されたヒトパピローマウイルス６ａ型をコードするＤＮＡ分子及びそれから誘導される化合物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトパピローマウイルス６ａ型をコードするＤＮＡ 発明の分野 本発明は、精製されたヒトパピローマウイルス６ａ型をコードするＤＮＡ分子 及びその誘導体に関する。図面の簡単な説明 図１はＨＰＶ６ａヌクレオチド配列を示す。発明の背景 パピローマウイルス（ＰＶ）感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、サ ル、ヘビ、ウシを含む多数の動物で起こる。パピローマウイルスは上皮細胞に感 染し、一般的に感染部位に良性上皮腫瘍又は良性線維上皮腫瘍を誘起する。ＰＶ は種特異的感染因子であり、ヒトパピローマウイルスは非ヒト動物に感染しない 。 パピローマウイルスは感染する宿主に基づき種々の群に分類できる。更に、ヒ トパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、ＤＮＡ配列相同性に基づき７０を超える型 に分類される。パピローマウイルスの一つの型の感染に対する中和免疫は別の型 のパピローマウイルスに対して免疫を与えないという点で、ＰＶ型は型 特異的免疫原であるように考えられる。 ヒトにおいて、異なるＨＰＶ型は別の病気を引起こす。ＨＰＶ１、２、３、４ 、７、１０、２６〜２９型は、正常のヒト及び免疫低下したヒトの両方に良性イ ボを引起こす。ＨＰＶ５、８、９、１２、１４、１５、１７、１９〜２５、３６ 、４６〜５０型は、免疫低下のヒトに偏平病変を引起こす。ＨＰＶ６、１１、３ ４、３９、４１〜４４、５１〜５５型は、性器粘膜又は呼吸器粘膜の良性コンジ ローマを引起こす。ＨＰＶ１６、１８型は性器粘膜の上皮異形成を引起こし、そ の場所での侵入性の子宮癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、肛門管癌腫の大部分に関連 している。 パピローマウイルスは小さく（５０−６０ｎｍ）、エンベロープを有せず、正 二十面体のＤＮＡウイルスであって、８個までの初期遺伝子と２個の後期遺伝子 をコードする。このウイルスゲノムの読取り枠（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７、Ｌ１、 Ｌ２と命名されている（“Ｅ”は初期(early)、“Ｌ”は後期(late)を指す）。 Ｌ１とＬ２はウイルスカプシドタンパク質をコードする。初期（Ｅ）遺伝子は、 ウイルス複製と細胞の形質転換などの機 能に関連している。 Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、分子量５５−６０ｋＤａを 有する。Ｌ２タンパク質は少量のカプシドタンパク質であり、予測分子量５５− ６０ｋＤａを有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定された見掛けの 分子量７５−１００ｋＤａを有する。免疫学的データによると、Ｌ２タンパク質 の大部分はＬ１タンパク質より内側にあることが示唆される。Ｌ１のＯＲＦは異 なるパピローマウイルスの間で高度に保存されている。Ｌ２タンパク質では、異 なるパピローマウイルスの間での保存はより少ない。 Ｌ１遺伝子とＬ２遺伝子は免疫予防薬のための良好な標的として同定されてい る。初期遺伝子の幾つかもワクチン開発の可能性のある標的として証明されてい る。綿尾ウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）とウシパピローマウイルス（Ｂ ＰＶ）系での研究により、細菌で、又はワクシニアベクターを使用して発現され たこれらのタンパク質による免疫化はウイルス感染から動物を防御することが知 見された。バキュロウイルス発現系で、又はワクシニアベクターを使用してのパ ピローマウイルスＬ１遺伝子の発現により、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）のアッセ ンブリーが起り、それを使用して、ウイルス攻撃からの防御と関連する高力価の ウイルス中和抗体反応を誘起できた。 ＨＰＶ６、１１はまれにしか悪性に関連しないが、尖圭コンジローム、呼吸器 粘膜と性器粘膜の良性病変の約９０％の原因体である。ＨＰＶ６は、これらの病 変でＨＰＶ１１より３倍以上の頻度で検出される。 ＨＰＶ６の最初の単離株であるＨＰＶ６ｂの完全なヌクレオチド配列が決定さ れた(Schwarz,E.,ら、1983.EMBOJ.2:2341-8)。他のＨＰＶ６の亜型が制限酵素消 化パターンに基づき同定された(Gissmann,L．ら，1983．Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 80:560-3；Mounts,P.,ら、1982．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79:5425-9 )。 幾つかのグループが、ＨＰＶ６ａは米国と欧州の患者からの尖圭コンジローム 生検で見出される主要な亜型であることを証明した。最近の報告によるとＨＰＶ ６ａはＨＰＶ６の原型であることが示唆される(Kitasato,H.,ら、1994.J.Gen.Vi rol．75:1157-1162)。米国では、１５〜４９才群のすべての男女の約１％だけが 尖圭コンジロームに罹患して医師にかかることが推定される。不幸にもＨＰＶ関 連病気の効果的治療法はない。それ故、 ワクチンはかなり望まれる。しかし、予防ワクチン又は治療ワクチンの開発のた めに、最もありふれたＨＰＶ亜型の後期遺伝子と初期遺伝子の配列決定は決定的 に重要である。 ＨＰＶ６ａに関する限られた配列情報は長い制御領域(longcontrol region)（ ＬＣＲ）及びＥ６ ＯＲＦとＥ７ ＯＲＦに関する。本出願は、尖圭コンジロー ム生検からのＨＰＶ６ａのクローニング、その完全なウイルスＤＮＡ配列の決定 、ＨＰＶ６ａの主要な読取り枠（ＯＲＦｓ）の対応するアミノ酸配列を記載する 。 本発明は、精製されたヒトパピローマウイルス６ａ型（ＨＰＶ６ａ型；ＨＰＶ ６ａ）をコードするＤＮＡ分子及びそのＤＮＡ分子の使用に関する。発明の概要 本発明は、精製されたヒトパピローマウイルス６ａ型（ＨＰＶ６ａ型；ＨＰＶ ６ａ）をコードするＤＮＡ分子及びその誘導体に関する。発明の詳細な説明 本発明は、精製されたヒトパピローマウイルス６ａ型（ＨＰＶ６ａ型；ＨＰＶ ６ａ）をコードするＤＮＡ分子及びその誘導 体に関する。このような誘導体には、該ＤＮＡにコードされたペプチド及びタン パク質、該ＤＮＡに対する抗体又は該ＤＮＡにコードされたタンパク質に対する 抗体、該ＤＮＡを含むワクチン又は該ＤＮＡにコードされたタンパク質を含むワ クチン、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡにコードされたタンパク質を含む免疫学的組成物 、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡ由来のＲＮＡ又は該ＤＮＡにコードされたタンパク質を 含むキットがあるが、これらに限定されない。 ＨＰＶ６は尖圭コンジローム（呼吸器粘膜及び性器粘膜の良性病変）の主要な 原因体である。ＨＰＶ６の最初の単離株であるＨＰＶ６ｂの完全ヌクレオチド配 列が決定された。他のＨＰＶ６亜型は、制限酵素消化パターンに基づき同定され た。 幾つかのグループが、ＨＰＶ６ａは米国と欧州の患者からの尖圭コンジローム 生検で見出される主要な亜型であることを証明した。米国では、１５〜４９才群 のすべての男女の約１％だけが尖圭コンジロームに罹患して医師にかかることが 推定される。不幸にもＨＰＶ関連病気の効果的治療法はない。それ故、ワクチン はかなり望まれる。しかし、予防ワクチン又は治療ワクチンの開発のために、最 もありふれたＨＰＶ亜型の後期遺伝 子と初期遺伝子の配列決定は決定的に重要である。 ＨＰＶ６ａに関する限られた配列情報は長い制御領域（ＬＣＲ）及びＥ６ Ｏ ＲＦとＥ７ ＯＲＦに関する。本出願は、尖圭コンジローム生検からのＨＰＶ６ ａのクローニング、その完全なウイルスＤＮＡ配列の決定、ＨＰＶ６ａの主要な 読取り枠（ＯＲＦｓ）の対応するアミノ酸配列を記載する。本発明は、精製され たヒトパピローマウイルス６型をコードするＤＮＡ分子及びそのＤＮＡ分子の誘 導体に関する。 上記ＤＮＡ又は上記ＤＮＡにコードされるタンパク質を含む医薬として有用な 組成物は、医薬上許容可能な担体の添加によるなどの公知の方法で製造できる。 このような担体と製造方法はRemingtonのPharmaceutical Sciencesに記載されて いる。効果的な投与に適切な医薬として許容可能な組成物を製造するために、こ のような組成物は有効量の上記タンパク質又はＶＬＰを含む。このような組成物 はＨＰＶの複数の型由来のタンパク質又はＶＬＰを含んでもよい。 本発明の治療用組成物又は診断用組成物を、ＰＶ感染の治療又は診断に十分な 量を個体に投与する。有効量は各個人の状態、体重、性、年齢などの多数の因子 により異なる。他の因子には 投与方法がある。一般的には、組成物を約１μｇ〜約１ｍｇの範囲で投与する。 医薬組成物を、皮下、局所、経口、経粘膜、静脈内、筋肉内などの種々の経路 で各個体に投与する。 本発明のワクチンは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は該ＤＮＡによりコードされかつ宿主 において中和抗体の形成を誘起するのに必要な抗原決定基を含むタンパク質を含 む。このようなワクチンはまた、十分安全で臨床感染の危険がなく投与され、毒 性の副作用を有せず、効果的な経路で投与されうるし、安定であり、ワクチン担 体と混和性がある。 ワクチンは経口、非経口、皮下、経粘膜、静脈内、又は筋肉内などの種々の経 路で投与されうる。投与される投与量は各個体の状態、性、体重、年齢；投与経 路；ワクチンのＰＶ型によって変わる。ワクチンは、カプセル、懸濁液、エリキ シル剤、液体溶液などの投与形態で使用されうる。ワクチンは、免疫的に許容で きる担体と一緒に処方されうる。 ワクチンは治療上有効量、即ち免疫防御反応を生じさせるのに十分な量投与さ れる。治療上有効量はＰＶ型により変わりうる。ワクチンを１回又は多数回投与 できる。 本発明のＤＮＡ及びＤＮＡ誘導体は、免疫原組成物の製造に使用できる。この ような組成物は適切な宿主に導入されると、宿主に免疫反応を誘起できる。 ＤＮＡ又はその誘導体を使用して抗体を産生できる。本明細書で使用する“抗 体”という用語はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方並びに抗原 又はハプテンに結合できるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）₂フラグメントなどの前記 ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のフラグメントを含む。 本発明のＤＮＡ及びＤＮＡ誘導体を使用してＨＰＶ感染及びＨＰＶスクリーニ ングにおける血清型が分類できる。ＤＮＡ、組換えタンパク質、ＶＬＰ、及び抗 体は、ＨＰＶの検出とＨＰＶ血清型分類に適切なキットの製造を可能にする。こ のようなキットは、少なくとも一つの容器内に密封して保持するのに適した区分 けされた担体を含む。担体は更に、種々のＨＰＶ型を検出するのに適したＨＰＶ ６ａＤＮＡ、組換えＨＰＶタンパク質もしくはＶＬＰ、又は抗ＨＰＶ抗体のよう な試薬を含む。担体はまた標識された抗原又は酵素基質などの検出手段を含みう る。 ＤＮＡ及びそれ由来のタンパク質はまた分子量マーカー及び 分子サイズのマーカーとして有用である。 遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数 のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオ リゴヌクレオチドでコードされうる。そのセットの唯一のメンバーだけがＨＰＶ ６ａ配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下 でさえ適切な条件下でＨＰＶ６ａＤＮＡにハイブリダイズできるであろう。別の 条件下では、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドはＨＰＶ６ａＤＮＡに 依然としてハイブリダイズしＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡを同定、単離できる 。 本発明の精製されたＨＰＶ６ａＤＮＡ又はそのフラグメントを使用し、他の起 源からのＨＰＶ６ａの同族体及びフラグメントを単離精製できる。これを達成す るために、適切なハイブリダイゼーション条件下に最初のＨＰＶ６ａＤＮＡをＨ ＰＶ６ａの同族体をコードするＤＮＡを含むサンプルと混合できる。ハイブリダ イズしたＤＮＡ複合体を単離し、同族体ＤＮＡをコードするＤＮＡをそこから精 製できる。 特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（redundancy）が 実質量存在することが知られている。そのた め本発明は同一のアミノ酸に最終的に翻訳することになる代替コドンを含むＤＮ Ａ配列に関する。本明細書の目的のために、一つ又は複数の置換されたコドンを 有する配列は縮重変異体と定義される。発現されたタンパク質の最終的物理的性 質を実質的に変えないＤＮＡ配列又は翻訳されたタンパク質の変異も本発明の範 囲に含まれる。例えば、ロイシンをバリンに、リシンをアルギニンに、グルタミ ンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能を変化させないこともありう る。 ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然のペプチドの性質とは異なる性質を 有するペプチドをコードするように変更できることが知られている。ＤＮＡ配列 を変更する方法には部位特異的変異誘発があるがそれに限定されない。 本明細書で使用する“機能性誘導体”とは、ＨＰＶ６ａの生物活性に実質的に 類似の生物活性（機能的又は構造的）を有する化合物である。“機能性誘導体” という用語は、ＨＰＶ６ａの“フラグメント”、“変異体”、“縮重変異体”、 “アナログ”及び“同族体”、又は“化学的誘導体”を含むものとする。“フラ グメント”という用語はＨＰＶ６ａの任意のポリペプチドサブセットを指すもの とする。“変異体”という用語は、完 全なＨＰＶ６ａ分子又はそのフラグメントに構造的に機能的に実質的に類似の分 子を指すものとする。両方の分子が実質的に類似の構造を有するか、両方の分子 が類似の生物活性を有するならば、その分子は“実質的に類似である。そのため 、その２つの分子が実質的に類似の活性を有するならば、それらの分子の一方の 構造が他方に無くとも、又は２つのアミノ酸配列が同一でなくとも、それらの分 子は変異体と考えられる。“機能性誘導体”という用語は、ＨＰＶ６ｂを含まな い。 “アナログ”という用語は、完全なＨＰＶ６ａ分子又はそのフラグメントに機 能的に実質的に類似の分子を指す。 種々の方法を使用してＨＰＶ６ａＤＮＡを分子クローニングできる。これらの 方法としては、適切な発現ベクター系でのＨＰＶ６ａ含有ｃＤＮＡライブラリー 又はＨＰＶ６ａ含有ゲノムＤＮＡライブラリーの構築の後ＨＰＶ６ａ遺伝子の直 接的機能的発現が挙げられるがそれに限定されない。別の方法は、バクテリオフ ァージ又はプラスミドシャトルベクター中に構築されたＨＰＶ６ａ含有ｃＤＮＡ ライブラリー又はＨＰＶ６ａ含有ゲノムＤＮＡライブラリーを、ＨＰＶ６ａのア ミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングす ることである。更に別の方法は、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベ クター中に構築されたＨＰＶ６ａ含有ｃＤＮＡライブラリー又はＨＰＶ６ａ含有 ゲノムＤＮＡライブラリーを、ＨＰＶ６ａをコードする部分的ＤＮＡでスクリー ニングすることである。精製したＨＰＶ６ａのアミノ酸配列から縮重したオリゴ ヌクレオチドプライマーを設計して、ＨＰＶ６ａＤＮＡフラグメントの特異的ポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によりこの部分的ＤＮＡを得る。別の方法は 、ＨＰＶ６ａ産生細胞からＲＮＡを単離し、そのＲＮＡをin vitro又はin vivo 翻訳系でタンパク質に翻訳することである。ＲＮＡのペプチド又はタンパク質へ の翻訳により、例えばＨＰＶ６ａタンパク質の活性により、又は抗ＨＰＶ６ａ抗 体との免疫反応により同定できるＨＰＶ６ａタンパタ質の少なくとも一部を産生 できる。この方法では、ＨＰＶ６ａ産生細胞から単離されたＲＮＡのプールを分 析して、ＨＰＶ６ａの少なくとも一部をコードするＲＮＡの存在を明らかにする ことができる。ＲＮＡプールを更に分画して非ＨＰＶ６ａ ＲＮＡからＨＰＶ６ ａ ＲＮＡを精製できる。この方法により産生されるペプチド又はタンパク質を 分析してアミノ酸配列を得て、次にこのアミノ酸配列を使 用してＨＰＶ６ａ ｃＤＮＡの生産のためのプライマーを得ることができるし、 又翻訳のために使用されるＲＮＡを分析してＨＰＶ６ａをコードするヌクレオチ ド配列を得て、ＨＰＶ６ａｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのプロ ーブを産生できる。これらの方法は当業界で公知であり、例えばSambrook,J.,Fr itsch,E.F.,Maniatis,T.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY．1989に記載され ている。 ライブラリーの他の型並びに他の細胞又は他の細胞型から構築されるライブラ リーがＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡを単離するのに有用でありうることは明白 である。ライブラリーの他の型には、ＨＰＶ６ａ型を含む他の細胞又は他の細胞 系列由来のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムＤＮＡライブラリーがあるが、それ に限定されない。 ｃＤＮＡライブラリーの調製は種々の技術で行うことができる。ＣＤＮＡライ ブラリー構築技術は例えばSambrook,J.ら、上記、に記載されている。ＨＰＶ６ ａをコードするＤＮＡは適切なゲノムライブラリーから単離することもできるこ とは明白である。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は種々の技術で行う ことができる。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築技術はSambrook,J.ら、上記、 に記載されている。 本明細書に記載された方法で得られたクローン化ＨＰＶ６ａＤＮＡ又はそのフ ラグメントは、適切なプロモーターと他の適切な転写制御要素を含む発現ベクタ ーへの分子クローニングにより組換え的に発現されることができ、原核宿主細胞 又は真核宿主細胞に移入され組換えＨＰＶ６ａを産生できる。このような操作の 技術はSambrook,J.ら、上記、に十分に記載され、当業界で公知である。 発現ベクターは、適切な宿主での遺伝子のクローン化コピーの転写とそれらの ｍＲＮＡの翻訳のために必要なＤＮＡ配列と本明細書では定義する。このような ベクターを使用して、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞、菌類細胞、動物細胞 などの種々の宿主で真核遺伝子を発現させることができる。特別に設計されたベ クターは、宿主間、例えば細菌−酵母、細菌−動物細胞、細菌−真菌細胞、又は 細菌−無脊椎動物細胞間でＤＮＡのシャトリングをすることができる。適切に構 築された発現ベクターは、宿主細胞での自律複製のための複製起点、選択マーカ ー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための可能要 素、活性なプロモーターを含むべきである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラー ゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強い プロモーターとは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。発現ベ クターにはクローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計され たプラスミド又はウイルスがあるが、それらに限定されない。 種々の哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞でＨＰＶ６ａ ＤＮＡ 又はそのフラグメントを発現させることができる。組換えＨＰＶ６ａの発現に適 切でありうる市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏ ｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｘＴ１（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ ＡＴＣＣ３７５９３），ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０），ｐｄ ＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４），ｐＲＳＶｇｐ ｔ（ＡＴＣＣ３７１９９），ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８），ｐＳＶ２ −ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６），ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、λ ＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６ ５）があるが、それらに限定されない。 種々の細菌の発現ベクターを使用して細菌細胞でＨＰＶ６ａＤＮＡ又はそのフ ラグメントを発現させることができる。適切でありうる市販細菌発現ベクターに は、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ）、ｐｃＤＮＡII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）があるが、それらに限定されない。 種々の菌類細胞発現ベクターを使用して菌類細胞でＨＰＶ６ａ ＤＮＡ又はそ のフラグメントを発現させることができる。適切でありうる市販菌類細胞発現ベ クターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＰｉｃｈｉａ発現ベクター （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）があるが、それらに限定されない。 種々の昆虫細胞発現ベクターを使用して昆虫細胞でＨＰＶ６ａ ＤＮＡ又はそ のフラグメントを発現させることができる。適切でありうる市販昆虫細胞発現ベ クターには、ｐＢｌｕｅＢａｃ III（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）があるが、それ に限定されない。 ＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡ又はそのフラグメントを含む発現ベクターを使 用して、ＨＰＶ６ａタンパク質又はＨＰＶ６ ａタンパク質のフラグメントを、細胞、組織、器官、又は動物（ヒトを含む）で 発現させることができる。宿主細胞は原核又は真核でありえ、Ｅ．ｃｏｌｉなど の細菌、酵母などの菌類細胞、ヒト起源、ウシ起源、ブタ起源、サル起源、ゲッ 歯類起源の細胞系列を含むがそれらに限定されない哺乳動物細胞、ショウジョウ バエ由来細胞系列及びカイコ由来細胞系列を含むがそれらに限定されない昆虫細 胞が挙げられるがそれらに限定されない。適切でありえ、市販の哺乳動物種由来 の細胞系列には、Ｌ ｃｅｌｌｓ Ｌ−Ｍ（ＴＫ^-）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１．３ ）、Ｌ ｃｅｌｌｓ Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣ Ｃ ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３ Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５ ８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １ ６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）があるが、それらに限定 されない。 形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、 エレクトロポレーションを含むがそれらに限定されない多数の技術のいずれかに より、発現ベクターを宿主細胞に導入できる。発現ベクター含有細胞をクローン として殖やし、それらがＨＰＶ６ａタンパク質を産生するかを決定するためにそ れらを個々に分析する。抗ＨＰＶ６ａ抗体による免疫反応性、及びＨＰＶ６ａと ＨＰＶ６ａ特異的リガンドの相互作用により仲介される反応と定義されるＨＰＶ ６ａ特異的リガンド結合又はＨＰＶ６ａ特異的シグナル伝達などの宿主細胞連関 ＨＰＶ６ａ活性の存在を含むがそれらに限定されない幾つかの手段で、ＨＰＶ６ ａ発現宿主細胞クローンの同定を行うことができる。 ＨＰＶ ＤＮＡフラグメントの発現を、in vitro産生合成ｍＲＮＡ又は天然の ｍＲＮＡを使用しても行うことができる。合成ｍＲＮＡ又はＨＰＶ６ａ産生細胞 から単離されたｍＲＮＡを種々の無細胞系、並びに細胞をベースとした系で効率 的に翻訳できる。無細胞系には、コムギ胚芽抽出物と網状赤血球抽出物があるが それに限定されない。細胞をベースとした系にはカエ ル卵母細胞へのマイクロインジェクション（顕微注入）があるがそれに限定され ない。カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好ましい。 宿主細胞でのＨＰＶ６ａタンパク質（単数及び複数）の発現の後、ＨＰＶ６ａ タンパク質を回収してＨＰＶ６ａを精製型で得ることができる。幾つかのＨＰＶ ６ａ精製方法が利用でき、使用に適切である。ここで記載するが、塩分画、イオ ン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタ イト吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組合 せ、又は個々の適用により、細胞溶解液及び細胞抽出液から、組換えＨＰＶ６ａ タンパク質を精製できる。 更に、完全長のできたばかり（full-lengthnascent）のＨＰＶ６ａ又はＨＰＶ ６ａのポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル抗体又はポリクロー ナル抗体で製造した免疫親和性カラムを使用して、組換えＨＰＶ６ａを他の細胞 タンパク質から分離できる。モノクローナル抗体又は単一特異性抗体を、当業界 公知の種々の方法により調製できる。本明細書で使用するモノクローナル抗体又 は単一特異性抗体は、ＨＰＶ６ａに対 して均一の結合特性を有する単一種（single）の抗体又は多数種（multiple）の 抗体と定義される。本明細書で使用する均一の結合は、ある特定の抗原又はエピ トープに結合できる抗体種の能力を指す。 単一特異性抗体の生産方法を使用して、ＨＰＶ６ａポリペプチドフラグメント 又は完全長のできたばかりのＨＰＶ６ａポリペプチドに対する特異性抗体を産生 できることは明白である。特に、十分に機能あるＨＰＶ６ａ又はそのフラグメン トに特異的な単一特異性抗体を産生できることは明白である。 本発明はまた、ＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現、並びにＨＰ Ｖ６ａタンパク質の機能をin vivoで調節する化合物をスクリーニングする方法 に関する。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タン パク質、又は非タンパク性有機分子でありうる。化合物は、ＨＰＶ６ａをコード するＤＮＡ又はＲＮＡの発現、あるいはＨＰＶ６ａタンパク質の機能を増加させ 、又は減少させて調節しうる。ＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現 、あるいはＨＰＶ６ａタンパク質の機能を調節する化合物を、種々のアッセイで 検出できる。発現又は機能に変化があるかを決定するために、 アッセイは単純な“ｙｅｓ／ｎｏ”アッセイでありうる。標準サンプルでの発現 又は機能のレベルを、試験サンプルの発現又は機能と比較して、アッセイを定量 的にすることができる。 ＨＰＶ６ａ ＤＮＡ、ＨＰＶ６ａ ＤＮＡのフラグメント、ＨＰＶ６ａ ＤＮ Ａ又はＨＰＶ６ａタンパク質に対する抗体、ＨＰＶ６ａ ＲＮＡ又はＨＰＶ６ａ タンパク質、を含むキットを調製できる。このようなキットを使用して、サンプ ル中のＨＰＶ６ａ ＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ、又はＨＰＶ６ａタンパ ク質もしくはＨＰＶ６ａペプチドフラグメントの存在を検出する。このようなキ ャラクタリゼーションは、法医学解析と疫学研究を含むがそれらに限定されない 種々の目的に有用である。 ＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を、アンチセ ンス治療用に合成できる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオ エート又はメチルホスホネートなどの安定なＤＮＡ誘導体、２´−Ｏ−アルキル ＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体、あるいは他のＨＰＶ６ａアンチセンスオリゴ ヌクレオチド類似物でありうる。ＨＰＶ６ａアンチセンス分子を、マイクロイン ジェクション、リポソームカプセル 化により、又はアンチセンス配列を有するベクターからの発現により、細胞に導 入できる。ＨＰＶ６ａアンチセンス療法は、ＨＰＶ６ａ活性を減少させることが 有用な病気の治療のために特に有用である。 “化学的誘導体”という用語は、通常はベースとなる分子の一部ではない付加 的な化学部分を含む分子を指す。このような部分は、ベース分子の溶解性、半減 期、吸収などを改善しうる。あるいは、該部分はベース分子の望ましくない副作 用を軽減させうるか、又はベース分子の毒性を減少させうる。このような部分の 例は、RemingtonのPharmaceutical Sciencesなどの種々の書物に記載されている 。 本明細書で開示した方法によって同定された化合物を単独で、ルーチンな試験 で定められる適切な投与量使用して、ＨＰＶ６ａ又はその活性の最適の阻害を達 成し、可能性のある毒性を最小化できる。更に、他の薬剤との同時投与又は他の 薬剤との逐次的投与も望ましいこともありうる。 本発明の化合物は１日１回投与できるし、１日投与量の合計を数回に分けて投 与できるのも有利である。更に、本発明の化合物は、経鼻、経皮、座薬経路、経 口などを含むがそれらに限 定されない種々の経路で投与できる。 複数の活性な薬剤での組合せ治療の場合（複数の活性な薬剤が別の投与組成物 形態であるとき）、活性薬剤は同時に投与できるし、各々を時間をずらして投与 できる。 本発明の化合物を使用する投与法は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、 医学的状態；治療する疾病のひどさ；投与経路；患者の腎肝機能；使用する特定 の化合物を含む種々の因子に応じて選択される。通常の技術を有する医師ならば 、病気の進行を防止し、反撃し、又は阻止するのに必要な有効量の薬剤を決定し 、処方することが容易にできる。毒性がなく効果的な範囲の薬剤濃度を達成する ことを最適に決定するには、標的部位への薬剤利用性のキネチックスに基づいた 投与法が必要である。このことには、薬剤の分布、平衡、除去を考慮することが 必要である。 本発明の方法において、本明細書で詳細に記載した化合物は活性成分を形成で き、投与の意図した形態、即ち経口錠剤、カプセル、エリキシル剤、シロップ、 座薬、ゲルなどに関し適切に選択され、通常の製剤実務と一致する適切な医薬希 釈剤、賦形剤、又は担体（本明細書では集合的に“担体”物質という） と混和して投与されるのが典型的である。 例えば、錠剤又はカプセルの形態での経口投与の場合、活性薬剤成分を、エタ ノール、グリセロール、水などの経口、非毒性の医薬として許容可能な不活性の 担体と一緒にできる。更に、所望又は必要ならば、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊 剤、及び着色剤も混合物に導入できる。適切な結合剤には澱粉、ゼラチン、グル コース又はβ−ラクトースなどの天然の糖、トウモロコシ甘味料、アカシア，ト ラガカント，アルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成のゴム、カルボキシメチ ルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどがあるがそれらに限定さ れない。これらの投与形態で使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ス テアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸 ナトリウム、塩化ナトリウムなどがあるがそれらに限定されない。崩壊剤には澱 粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどがあるがそれ らに限定されない。 液体形態の場合、活性薬剤成分を、例えばトラガカント、アカシア、メチルセ ルロースなどの合成ゴム及び天然ゴムのような適切にフレーバーのある懸濁剤又 は分散剤と一緒にできる。 使用できる他の分散剤にはグリセリンなどがある。非経口投与の場合、滅菌懸濁 液及び滅菌溶液が望ましい。静脈注射が望まれるときには、一般的に適切な保存 剤を含む等張の製剤が望ましい。 活性薬剤成分を含む局所用製剤は、当業界周知の種々の担体物質、例えばアル コール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ、油、 鉱油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどと混和され、例えばアルコール溶 液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローション、 及びクリーム組成物又はゲル組成物形態のシャンプーを形成できる。 本発明の化合物はまた、リポソームデリバリーシステムの形態で、例えば小さ な単ラメラ小胞、大きな単ラメラ小胞、多重ラメラ小胞などの形態で投与されう る。リポソームは種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン又 はホスファチジルコリンから形成できる。 本発明の化合物分子が結合する個々の担体としてモノクローナル抗体を使用す ることにより、本発明の化合物を送達させることもできる。本発明の化合物はま た、標的指向化可能な薬剤 担体として可溶性ポリマーと結合できる。このようなポリマーとして、ポリビニ ル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミ ドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、又はパルミ トイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを挙げることができる 。更に、本発明の化合物は、薬剤の放出制御を達成するのに有用な生分解性ポリ マーの一群、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ 酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシア ノアクリレート及びヒドロゲルの架橋性又は両親媒性ブロックコポリマーと結合 できる。 以下の実施例で本発明を説明するが、本発明は実施例に限定されない。 実施例１ 生検からの核酸の抽出 大きな外陰部尖圭コンジローム病変部を、２５才の分娩後の女性患者から得た 。病変部の断片を液体窒素で凍結し、その後Braunmikro-dismembratorII(B.Brau n Instruments,Melsungen,独)で処理した。得られた材料を０．６％（ｗ／ｖ） ドデシル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化し、プロティナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）で処 理し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。ＤＮＡを エタノール沈殿させ、ＵＶ分光法で定量した。高分子量ＤＮＡの存在が、アガロ ース電気泳動、次のエチジウムブロミド染色で確認された。 実施例２ ＨＰＶ ＤＮＡの型分類 ViraType Plus(Digene Diagnostics，Beltsville，MD)として市販されている ハイブリッド捕捉アッセイを使用して、ＨＰＶＤＮＡ型を決定した。使用したＨ ＰＶプローブを２つのプールに分けた。その組成は各型の性器路悪性度との各型 の関連に基づく。Ａ群のプローブは“低リスク”のＨＰＶ６、１１、４２、４３ 、４４型を含み、Ｂ群のプローブは“高リスク”の１６、１８、３１、３３、３ ５、４５、５１、５２、５６型を含んでいた。全ＤＮＡをＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ 、ＨｉｎｄIIIで消化し、サザンブロットを高ストリンジェント条件（Ｔｍ−１ ５℃）で行いＨＰＶ亜型を決定した。 実施例３ ＨＰＶ６ａゲノムのクローニング ＨＰＶ６ａ陽性生検サンプルから抽出した全ＤＮＡをＨｉｎｄIIIエンドヌク レアーゼで消化した。０．８％低融点アガロース分取用ゲルによるサイズ分画の 後、約８キロ塩基対（ｋｂｐ）のＤＮＡに対応する領域をゲルから切出し、アガ ロースをＧｅｌａｓｅ^TM酵素(Epicentre Technologies,Inc.,Madison,WI)で消化 した。ＨｉｄIIIで消化して脱リン酸化しておいたｐＵＣ１８(Pharmacia，Inc. ，Piscataway，NJ)と、サンプルを連結した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ 細胞(Gibco，BRL，Gaithersburg,MD)を形質転換した後、ＨＰＶ６ｂＬ１遺伝子 の３´末端に相補的なアンチセンス³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチド（５´−ＧＡ Ｇ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＡＣ ＣＴＴ ＴＴＡ ＧＴＴ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧ Ｃ ＴＴＡ Ｃ−３´；配列番号１）を使用するコロニー−ハイブリダイゼーシ ョンにより、プラスミドライブラリーからＨＰＶ６ａ陽性コロニーをスクリーニ ングした。８．１ｋｂｐ ＨＰＶ６ａゲノムを含むｐＵＣ１８プラスミドを単離 し、制限酵素とサザンブロット分析により特徴付けをした。このプラスミドをｐ ＵＣ１８−ＨＰＶ６ａと命名した。Ｑｉａｇｅｎ^TMプラスミドマキシキット(Qia gen Inc.，Chatsworth，CA)を使用して、プラスミドＤＮＡ を調製した。 実施例４ ｐＵＣ１８−ＨＰＶ６ａの配列解析 完全なＨＰＶ６ａ配列を決定するために、公表されているＨＰＶ６ｂ配列に基 づいて配列決定用プライマーを合成した。製造業者(ABI，Inc.，Foster City，C A)の指示通りに、ＰＲＩＳＭ^TMキットとApplied Biosystems（ＡＢＩ）自動配列 決定機（＃３７３Ａ）を使用するジデオキチェインターミネーション法により、 完全８．１ｋｂ ｐＨＰＶ６ａゲノムの両鎖の配列決定をした。センス配列とア ンチセンス配列が一致しない場合には更にＨＰＶ６ａ特異的プライマーを合成し 、問題の区域上で両方向で再配列決定を行い、一致をみた。 公表されているＨＰＶ６ｂ配列と比較した完全ＨＰＶ６ａ配列を図１に示す。 ＨＰＶ６ａ配列の下に示してある塩基はＨＰＶ６ｂ配列に対応する。ＨＰＶ６ａ とＨＰＶ６ｂのＤＮＡ配列は９７％以上の相同性を示した。８０１０ｂｐのうち 合計２２９ｂｐの変化が同定された。ＨＰＶ６ｂ配列と比較した最も顕著な差異 はＬＣＲ（ｎｔ７２０５−ｎｔ１０６）で見出された。ＨＰＶ６ａＬＣＲにおけ る幾つかの単一ヌクレオチド （ｎｔ）変化の他に、ｎｔ７３５０での９４ｂｐ挿入とｎｔ７８０４でのもう一 つの１９ｂｐ挿入が見出された。ｎｔ７６１５で６塩基対がＨＰＶ６ａゲノムか ら欠失していた。 実施例５ ＨＰＶ６ｂと比較したＯＲＦのＨＰＶ６ａ配列の変異 読取り枠をＨＰＶ６ａ配列中で決定し、主要なＯＲＦをアミノ酸配列に翻訳し 、それぞれのＨＰＶ６ｂ配列と比較した。 主要カプシドタンパク質Ｌ１はＨＰＶ６ｂ配列と同一の唯一のＯＲＦであった 。他の全てのＯＲＦは表１に要約してあるアミノ酸変化を示した。マイナーのカ プシドタンパク質Ｌ２は５個のアミノ酸変化を示した。Ｅ６とＥ７のＯＲＦはそ れぞれ１個のアミノ酸変化を示した。Ｅ１タンパク質で６個のアミノ酸、Ｅ２タ ンパク質で１１個のアミノ酸が異なっていた。Ｅ４タンパク質で４個のアミノ酸 変化が検出された。Ｅ５ａＯＲＦは４個の位置で変化を有し、Ｅ５ｂＯＲＦで７ 個の位置に変化を有した。 実施例６ ＨＰＶ６ａ ｃＤＮＡの発現ベクターへのサブクローニング トランスフェクトされた宿主細胞でのＨＰＶ６ａタンパク質の発現とin vitro 転写／翻訳のために、ＨＰＶ６ａをコードするｃＤＮＡを幾つかのベクターに サブクローン化する。これらのベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ ＋（発現はＴ７プロモーター又はＴ３プロモーターにより行われる）、ｐｃＤＮ ＡＩ／Ａｍｐ（発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより行わ れる）、ｐＳＺ９０１６−１（発現はＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ ）プロモーターにより行われる）、ＨＰＶ６ａをコードしているＤＮＡ配列を含 む組換えバキュロウイルスを産生するためのバキュロウイルストランスファーベ クターｐＶＬ１３９３（発現はポリヘドリン（ＰＨ）プロモーターにより行われ る）がある。 ａ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋：ＨＰＶ６ａ 完全長のＨＰＶ６ａ ｃＤＮＡクローンを、ＥｃｏＲＩ制限消化によりラムダ バクテリオファージから回収し、ＥｃｏＲＩ開裂／ＣＩＰ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔII ＳＫ＋に連結した。ＨＰＶ６ａのセンス方向がＴ７プロモーター又は Ｔ３プ ロモーターの後にある別々のサブクローンを回収する。 ｂ）ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ：ＨＰＶ６ａ 直接的クローニングを容易にするため、ＨＰＶ６ａＤＮＡがＴ７プロモーター の下流にあるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋：ＨＰＶ６ａの精製されたプラ スミド調製物から、ＥｃｏＲＶとＸｂａＩを用いてＨＰＶ６ａを切出す。得られ るＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩ ＨＰＶ６ａフラグメントを精製し、ＨＰＶ６ａをコー ドするＤＮＡがＣＭＶプロモーターの下流にあるようにＥｃｏＲＶ−開裂、Ｘｂ ａＩ−開裂、ＣＩＰ−処理ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに連結する。 ｃ）ｐＳＺ９０１６−１：ＨＰＶ６ａ ＥｃｏＲＩ制限消化と次のアガロースゲルからの１．３Ｋｂフラグメントの精 製により、ＨＰＶ６ａをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋：ＨＰＶ６ａから切 出す。得られるＥｃｏＲＩＨＰＶ６ａフラグメントを、ＥｃｏＲＴ−開裂、ＣＴ Ｐ−処理ｐＳＺ９０１６−１に連結する。ＨＰＶ６ａのセンス方向がＨＩＶ Ｌ ＴＲプロモーターの下流にあるサブクローンを選択する。 ｄ）ｐＶＬ１３９３：ＨＰＶ６ａ及びｐＶＬ１３９３：Ｔ７ＨＰＶ６ａＨＡ ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ：ＨＰＶ６ａからＢａｍＨＩとＸｂａＩでＨＰＶ６ａを 切出し、得られる１．３ＫｂフラグメントをＢａｍＨＩ−開裂、ＸｂａＩ−開裂 、ＣＩＰ−処理ｐＶＬ１３９３に連結してｐＶＬ１３９３：ＨＰＶ６ａを産生し て、ＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡをバキュロウイルストランスファーベクター ｐＶＬ１３９３に直接的クローニングを行う。同様に、ＨＰＶ６ａ読取り枠の５ ´アミノ末端にＴ７標識を、３´カルボキシ末端にＦｌｕＨＡエピトープを結合 させて、ＨＰＶ６ａをエピトープ標識する。このように修飾したＨＰＶ６ａＤＮ ＡをｐＶＬ１３９３のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位に連結し、ｐＶＬ１３９３：Ｔ ７ＨＰＶ６ａＨＡを作製する。 実施例７ in vitro 転写／翻訳及び宿主細胞へのトランスフェクションによるＨＰＶ６ａ ポリペプチドの発現 ＨＰＶ ＤＮＡ配列を含むベクターを使用して、ウサギ網状赤血球溶解液、哺 乳動物宿主細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞においてＨＰＶ６ａポリペプチ ドの翻訳をさせる。実験方 法は本質的に製造業者の指示で概説されたものである。 ａ）in vitro 転写／翻訳 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIII ＳＫ＋：ＨＰＶ６ａプラスミドＤＮＡ（Ｔ７方 向にＨＰＶ６ａがある）を、ＨＰＶ６ａインサートの下流でのＢａｍＨＩ消化で 線状にする。線状化したプラスミドを精製し、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ の存在下Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するランオフ転写の鋳型として使用する 。得られるキャップの付いたＨＰＶ６ａ転写体をＬｉＣｌ沈殿で精製し、それを 使用して、ヌクレアーゼ−前処理ウサギ網状赤血球溶解物でＬ−［³⁵Ｓ］メチオ ニンの存在下ＨＰＶ６ａの番羽訳をさせる。 ｂ）哺乳動物細胞での発現 ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ：ＨＰＶ６ａ（ＣＭＶプロモーターの制御下）又はｐＳ Ｚ９０１６−１：ＨＰＶ６ａ（ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下）によるト ランスフェクションの後、哺乳動物宿主細胞で、ＨＰＶ６ａタンパク質を発現さ せる。後者の場合（ｐＳＺ９０１６−１：ＨＰＶ６ａ）、ＴＡＴ発現プラスミド ｐＳＺ９０１６１：ＴＡＴと一緒に同時トランスフェクトする。両方のＨＰＶ６ ａ発現プラスミドのために、ＤＥＡ Ｅ−デキストラン又はリポフェクタミン(BRL)によるリポフェクションを使用し てＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトする。 ｃ）昆虫細胞での発現 ＨＰＶ６ａ含有バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３：Ｔ ７ＨＰＶ６ａＨＡを使用して、in vivo相同組換えにより組換えバキュロウイル ス(Autographacalifornica)を作製する。ＨＰＶ６ａ含有組換えバキュロウイル スによる感染後、エピトープ標識ＨＰＶ６ａを、懸濁培養で生育したＳｆ９（Sp odoptera frugiperda ）昆虫細胞で発現させる。 実施例８ ＨＰＶ６ａ活性に影響する化合物は種々の方法で検出できる。ＨＰＶ６ａに影 響する化合物を同定する方法は、 ａ）ＨＰＶ６ａを含有する溶液と試験化合物を混合し、混合液を形成すること、 ｂ）混合液のＨＰＶ６ａ活性を測定すること、及び ｃ）混合液のＨＰＶ６ａを標準と比較すること、 を含む。 ＨＰＶ６ａ活性に影響する化合物は、医薬組成物に作製でき る。このような医薬組成物は、ＨＰＶ６ａ感染により特徴付けられる病気又は状 態を治療するのに有用でありうる。 実施例９ ＨＰＶ６ａをコードするＤＮＡに構造的に関連するＤＮＡは、プローブにより 検出される。適切なプローブは、図１のヌクレオチド配列の全部又は一部を有す るＤＮＡ由来、図１のヌクレオチド配列の全部又は一部を有するＤＮＡによって コードされるＲＮＡ由来、又は図１の配列の一部由来の縮重オリゴヌクレオチド 由来でありうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者 ホフマン，カスリーン・ジエイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトパピローマウイルス６ａ型をコードする単離精製されたＤＮＡ又はその 機能性誘導体。 ２．図１に示されるヌクレオチド配列を有する請求項１に記載の単離精製された ＤＮＡ又はその機能性誘導体。 ３．宿主中で請求項１に記載のＤＮＡ分子を発現するための発現ベクター。 ４．請求項１に記載のＤＮＡ分子によってコードされる本質的に精製されたタン パク質。 ５．ＨＰＶ６ａＬ２、ＨＰＶ６ａＥ１、ＨＰＶ６ａＥ２、ＨＰＶ６ａＥ４、ＨＰ Ｖ６ａＥ５ａ、ＨＰＶ６ａＥ５ｂ、ＨＰＶ６ａＥ６およびＨＰＶ６ａＥ７の群か ら選択される請求項４に記載のタンパク質又はその機能性誘導体。 ６．請求項１に記載のＤＮＡ分子、請求項１に記載のＤＮＡ分子に相補的なＲＮ Ａ、又は請求項１に記載のＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質から選択さ れる化合物と免疫学的に反応する単一特異性抗体。 ７．宿主中でヒトパピローマウイルス６ａ型タンパク質を発現 させる方法であって、 （ａ）請求項４に記載の発現ベクターを適切な宿主に移入させること、及び （ｂ）発現ベクターからヒトパピローマウイルス６ａ型タンパク質を発現させる 条件下で工程（ａ）に記載の宿主を培養すること、 を含む方法。 ８．ヒトパピローマウイルス６ａ型活性を調節する化合物を同定する方法であっ て、 （ａ）ヒトパピローマウイルス６ａ型活性を調節する可能性のある調節剤を、請 求項１に記載のＤＮＡ分子、請求項１に記載のＤＮＡ分子に相補的なＲＮＡ、又 は請求項１に記載のＤＮＡ分子によりコードされるタンパタ質と一緒にすること 、及び （ｂ）請求項１に記載のＤＮＡ分子、請求項１に記載のＤＮＡ分子に相補的なＲ ＮＡ、又は請求項１に記載のＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質に対する 前記調節剤の作用を測定すること、 を含む方法。 ９．請求項８に記載の方法で活性を有する化合物。 １０．請求項８に記載の方法で活性を有する化合物を含む医薬組成物。 １１．ヒトパピローマウイルス６ａ型が仲介する疾病のための治療の必要のある 非ヒト動物の治療方法であって、請求項９に記載の化合物を動物に投与すること を含む前記方法。 １２．請求項１に記載のＤＮＡ分子、請求項１に記載のＤＮＡ分子によりコード されるペプチド、請求項１に記載のＤＮＡ分子に相補的なＲＮＡからなる群から 選択される化合物、又はそれらの組合せを含む、治療される患者で免疫反応を誘 起できる組成物。 １３．ヒトパピローマウイルス感染の予防用又は治療用ワクチンであって、請求 項１に記載のＤＮＡ分子、、請求項１に記載のＤＮＡ分子によりコードされるペ プチド、請求項１に記載のＤＮＡ分子に相補的なＲＮＡからなる群から選択され る化合物、又はそれらの組合せを含む前記ワクチン。 １４．ヒトパピローマウイルスにより引起こされる感染又は病気に対する免疫反 応を誘起する方法であって、請求項１に記載のＤＮＡ分子、請求項１に記載のＤ ＮＡ分子に相補的なＲＮＡ、請求項１に記載のＤＮＡ分子によりコードされるタ ンパク質、 又はそれらの組合せを非ヒト動物に導入することを含む前記方法。