JPH10506016A

JPH10506016A - アポリポ蛋白質（ａ）［ＡＰＯ（ａ）］を阻害することによる血漿リポ蛋白質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］のレベルに関連する疾患または状態のリボザイム治療

Info

Publication number: JPH10506016A
Application number: JP8511069A
Authority: JP
Inventors: スティンチコーム，ダン・ティー; マクスウィゲン，ジェームズ; ニュートン，ロジャー・エス; ラムハラック，ランディ
Original assignee: リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1994-09-23
Filing date: 1995-09-21
Publication date: 1998-06-16
Also published as: US5877022A; WO1996009392A1; MX9702204A; CA2199727A1; AU3720295A; US5599706A; EP0782622A1

Abstract

(57)【要約】ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡを切断する酵素的ＲＮＡ分子。リポ蛋白質Ａのレベルに関連する状態、例えばアテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、脳溢血、再狭窄および心臓疾患の処置における、これらの触媒的ＲＮＡ分子の使用。

Description

【発明の詳細な説明】アポリポ蛋白質（ａ）［ＡＰＯ（ａ）］を阻害することによる血漿リポ蛋白質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］のレベルに関連する疾患または状態のリボザイム治療発明の属する技術分野本発明はアテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、脳溢血および再狭窄等の、Ｌｐ（ａ）レベルに関連する疾患または状態の治療または診断のための、治療用組成物および方法に関する。発明の背景以下はＬｐ（ａ）の生理学的役割の簡潔な説明である。本論議は完璧なものではなく、以下の発明を理解するためにのみ提供されるものである。この要約は、下記の研究のいずれも特許請求される発明に対する従来技術であることを認めるものではない。低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）は主としてコレステロール、リン脂質および単一の疎水性蛋白質であるアポリポ蛋白質Ｂ（ａｐｏＢ）からなる。それらはヒト血漿中、主なコレステロールのキャリアーであると考えられている（総説としてＵｔｅｒｍａｎ，Ｇ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６，９０４−９１０を参照されたい）。Ａｐｏ（Ｂ）はＬＤＬの唯一の蛋白質サブユニットであり、細胞表面上のＬＤＬ受容体を認識し、これに結合する。このＬＤＬ−ＬＤＬ受容体の相互作用は、ＬＤＬの内在化を生じ、そして結果としてコレステロールが細胞内に放出される。ＬＤＬの修飾された型は、リポ蛋白質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］と称され、１９６３年に発見された（Ｂｅｒｇ，Ｋ．（１９６３）ＡｃｔａＰａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．５９，３６９）。追加の糖蛋白質であるａｐｏ（ａ）のＬＤＬへの共有結合は、Ｌｐ（ａ）をＬＤＬから区別する。最近いくつかの研究は、ヒト血漿中のＬｐ（ａ）の高レベルが心臓疾患につながることを示唆してきた（Ｇｕｒａｋａｒら，（１９８５）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ５７，２９３−３０１；Ｌｅｒｅｎら，（１９８８）Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ７３，１３５−１４１；Ｕｔｅｒｍａｎｎ，前掲）。１０００倍以上のＬｐ（ａ）レベル域および血漿Ｌｐ（ａ）レベルが上位４分の１である個人は進行性アテローム性動脈硬化症を発症する２〜５倍高い可能性を有する。アロテーム性動脈硬化症は、血管壁の硬化と弾力性の喪失を伴う疾患である。ヒト血漿中のＬｐ（ａ）の形態の高濃度のコレステロールは、アロテーム性動脈硬化症の原因の最も重要な要因の１つである。動脈壁に関連するマクロファージおよび平滑筋細胞内でのコレステロールの付着は、隣接する平滑筋細胞の増殖を引き起こす斑点（じゅく状病変）を生じさせる。時が経つにつれて、それらの斑点はサイズが大きくなり、動脈壁の硬化および弾力性の喪失を引き起こし、次に動脈壁の決裂、血液凝固および血管内の血流の閉塞を引き起こす（詳しくはＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆｍｅｄｉｃａｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙＧｕｙｔｏｎ，Ａ．Ｃ．，（ＳａｕｎｄｅｒｓＣｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９１）ｐｐ．７６１−７６４を参照されたい）。Ｌｐ（ａ）および／またはａｐｏ（ａ）レベルは、アテローム性動脈硬化症、および心筋梗塞、脳溢血および再狭窄等のそれに続く徴候の危険性の増加とよく相関している。ａｐｏ（ａ）蛋白質はヒト、旧世界の霊長類およびハリネズミに特有である；慣用的な実験動物にそれが欠損しているため、ａｐｏ（ａ）レベルの生理学的な役割を探求することは困難であった。近年、ａｐｏ（ａ）をコードするヒト遺伝子を発現するトランスジェニックマウスが構築された（Ｌａｗｎら，（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３６０，６７０−６７２）。トランスジェニックマウスは大動脈中の脂質に富む領域の発達に対して対照同腹仔よりも感受性が高い。さらに、ヒトａｐｏ（ａ）発現は脂肪付着領域に局在する。すなわち、ａｐｏ（ａ）の過剰発現は、実験動物に動脈硬化様病変を直接引き起こす。この所見はヒトにおけるａｐｏ（ａ）の高レベルがアテローム性動脈硬化症の一因であることの仮説の信憑性を高くする。アポリポ蛋白質（ａ）は３００〜８００ＫＤａの種々の大きさの巨大糖蛋白質である。ヒト血漿中から３４の異性体が確認されている。現在入手可能な唯一のヒトｃＤＮＡクローンは、ａｐｏ（ａ）をコードする１４ｋｂのメッセージを包含する（ＭｃＬｅａｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３３０，１３２−１３７）。ａｐｏ（ａ）のｍＲＮＡの３’末端部分に相当するベンガルザルのｃＤＮＡもまた、クローン化され配列決定された（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら，１９８９Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，５９５７−５９６５）。クローン化したｃＤＮＡの配列解析は、ａｐｏ（ａ）の構造の２つのユニークな面を明らかに示した。第１に、ａｐｏ（ａ）ｃＤＮＡは著しい反復構造である。再構築したａｐｏ（ａ）ｃＤＮＡは、４５２９アミノ酸の蛋白質をコードする；残基の４２１０は、それぞれが１１４アミノ酸の３７回反復中に存在する。反復単位はそれ自身非常に相同性である；２４はヌクレオチド配列が同一であり、４つは３つのヌクレオチドにおいてのみ異なる配列を共有しており、残りの反復は１１〜７１塩基のみ異なる。第２に、アポリポ蛋白質（ａ）はセリンプロテアーゼであるプラスミノーゲンと高い相同性を有する。プラスミノーゲンはクリングルと称される５つの反復相同領域（それらはアミノ酸配列で約５０％の相同性を有する）および続くトリプシン様プロテアーゼ領域からなる。プラスミノーゲンのクリングルIVはａｐｏ（ａ）の３７の反復と高い相同性を有する（蛋白質レベルで７５−８５％）。さらに、プラスミノーゲンの５’非翻訳領域、シグナルペプチド領域、クリングルＶ、プロテアーゼ領域、および３’非翻訳領域は、ａｐｏ（ａ）の配列とそれぞれ９８％、１００％、９１％、９４％および８７％の相同性を有する。プラスミノーゲンと比較して、ａｐｏ（ａ）はクリングルＩ、IIおよびIIIを欠失しており、上記に述べたように広範囲に重複したクリングルIVを有する。高い相同性にもかかわらず、ａｐｏ（ａ）は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔｐＡ）によってプロテアーゼに転換されることができない。これは、ａｐｏ（ａ）中では、ｔＰＡによるプラスミノーゲン活性部位上で１つのアミノ酸が置換されているためである（Ｕｔｔｅｒｍａｎ（前掲））。インビトロ実験は、ａｐｏ（ａ）およびＬｐ（ａ）がプラスミノーゲン受容体およびフィブリンへの結合についてプラスミノーゲンと競合することを示し、このことは、高いＬｐ（ａ）レベルと心筋梗塞との間の相関関係を支持する（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｒｏｎｏｗら，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８，２３７４−２３７８；Ｈａｊｊａｒら，（１９８９）Ｎａｒｕｒｅ３３９，３０３−３０５；Ｍｉｌｅｓら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３３９，３０１−３０３）。最近のヒト（Ｍｏｌｉｔｅｒｎｏら，１９９３Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８８，９３５−９４０）およびサル（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９９３Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１３，５４８−５５４）におけるインビボ実験は、凝固溶解の予防におけるＬｐ（ａ）の役割を支持する。ａｐｏ（ａ）とプラスミノーゲンとの間の驚くべき相同性は、薬物開発にいくつかの障壁を与える。ａｐｏ（ａ）の小分子阻害剤は、プラスミノーゲン機能に負の影響を与えることなくａｐｏ（ａ）に選択的に結合しなければならないだろう。同様に、アンチセンス方法は、２つの遺伝子間の総ヌクレオチド配列相同性により制限されるであろう。現在の食餌および薬物療法（Ｇｕｒａｋａｒら、前掲；Ｌｅｒｅｎら、前掲）は、ニコチン酸を除いて、ａｐｏ（ａ）レベルに対してほとんどあるいは全く影響を及ぼさない。出願人は、それらの同じ制限がリボザイム療法の好機であることをここに示す。リボザイムの切断部位特異性は、プラスミノーゲンのｍＲＮＡには全く存在しないが、ａｐｏ（ａ）のｍＲＮＡ上に存在するリボザイム標的部位を同定することを可能にする。例えば、高度に保存されたａｐｏ（ａ）のクリングル上にプラスミノーゲンのクリングルIVには存在しない１３のハンマーヘッド切断部位が存在する。同様に、ａｐｏ（ａ）の最後のクリングル反復、プロテアーゼ領域および３’非翻訳領域は、プラスミノーゲン上には存在しないがａｐｏ（ａ）上に存在する２１のハンマーヘッドリボザイム切断部位を含む。すなわち、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡを標的とするリボザイムは、アロテーム性動脈硬化症の高い危険性を持つ者の治療および診断のための、独特な治療および診断道具である。発明の概要本発明は、ａｐｏ（ａ）をコードするｍＲＮＡ種の切断を指示するリボザイム、もしくは酵素的ＲＮＡ分子に関する。特に、出願人は、このＲＮＡを切断しうるリボザイムの選択および機能、およびここに議論される疾患を治療するために、種々の組織中でａｐｏ（ａ）レベルを減少するためのそれらの使用を記述する。ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡを切断するリボザイムは、アロテーム性動脈硬化症の新規な治療法を提示する。リボザイムは、それらの触媒特性およびその固有の二次または三次構造のために、アンチセンス分子よりもすぐれた耐久性またはより低い有効投与量を示すことができる。このようなリボザイムは、触媒活性および高い部位特異性を有し（下に記述するように）、アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも強力かつ安全な治療的分子である。出願人は、それらのリボザイムがａｐｏ（ａ）の発現を阻害しうること、およびリボザイムの触媒活性がその阻害効果のために必要であることを示す。当業者は、記載された例からａｐｏ（ａ）をコードする標的ｍＲＮＡを切断する他のリボザイムを容易に設計することができ、これらも本発明の範囲に含まれることが明らかであることを理解するであろう。現在天然に生ずる酵素的ＲＮＡの６つの基本的な変種が知られている。それぞれは、生理学的条件下でＲＮＡのホスホジエステル結合の加水分解をトランスに触媒することができる（従って他のＲＮＡ分子を切断することができる）。表Ｉはそれらのリボザイムの特徴のいくつかを要約したものである。一般的に、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することにより作用する。この結合は、標的ＲＮＡを切断するよう作用する分子の酵素的部分に近接して保持された、酵素的核酸の標的結合部分により行なわれる。すなわち、酵素的核酸はまず標的ＲＮＡを認識し、次に相補的塩基対合により標的ＲＮＡに結合し、適正な部位にいったん結合すると、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、それがコードする蛋白質の合成を指令する能力を破壊するであろう。酵素的核酸は、そのＲＮＡ標的に結合して切断させたのち、そのＲＮＡから離脱して他の標的を探し、新たな標的に反復的に結合して切断することができる。リボザイムの酵素的性質は他の手法、例えばアンチセンス法（この場合は核酸分子が単に核酸標的に結合して、そのプロセシングおよび翻訳を阻止するだけである）より有利である。療法処置を行なうのに必要なリボザイムの濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより低いからである。この利点は、リボザイムが酵素的に作用する能力を反映している。すなわち１個のリボザイム分子が多数の標的ＲＮＡ分子を切断することができる。さらにリボザイムは特異性の高い阻害剤であり、その阻害の特異性は、標的ＲＮＡへの結合の塩基対合メカニズムのみならず、標的ＲＮＡの切断のメカニズムにも依存する。切断部位の近くにおける一つのミスマッチまたは塩基置換は、リボザイムの触媒活性を完全に除去することができる。アンチセンス分子中の同様のミスマッチはそれらの作用を妨害しない（Ｗｏｏｌｆ，Ｔ．Ｍ．ら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，７３０５−７３０９）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同一のＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドのものより高い。本発明の好ましい態様においては、酵素的核酸分子はハンマーヘッドまたはヘアピンのモチーフで形成されるが、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮａｓｅＰＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列に関するもの）またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡのモチーフで形成されてもよい。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら，１９９２，ＡｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＨｕｍａｎＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８，１８３により記載され；ヘアピンモチーフの例はＨａｍｐｅｌら，“ＲＮＡＣａｔａｌｙｓｔｆｏｒＣｌｅａｖｉｎｇＳｐｅｃｉｆｉｃＲＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｓ” 、１９８９年９月２０日出願、１９８８年９月２０日出願の米国特許出願第０７／２４７，１００の一部継続出願、ＨａｍｐｅｌａｎｄＴｒｉｔｚ，１９８９Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,２８,４９２９,およびＨａｍｐｅｌら、１９９０ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１８，２９９により記載され；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａａｎｄＢｅｅｎ,１９９２Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１６により記載され、ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋｅｄａら，１９８３Ｃｅｌｌ，３５，８４９により記載され；ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡリボザイムのモチーフの例は、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅａｎｄＣｏｌｌｉｎｓ,１９９０Ｃｅｌｌ，６１，６８５−６９６；ＳａｖｉｌｌｅａｎｄＣｏｌｌｉｎｓ（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８２６ −８８３０；ＣｏｌｌｉｎｓａｎｄＯｌｉｖｅ，１９９３Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，２７９５−２７９９）により記載され；グループＩイントロンの例はＣｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。これらの具体的なモチーフは本発明を限定するものではなく、本発明の酵素的核酸分子において重要なすべては、それが１または２以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に対して相補的な特異的基質結合部位を有し、かつその基質結合部位内またはその周囲にその分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することであることは、当業者には認識されるであろう。本発明は、所望の標的のＲＮＡに高い特異性を示す、一群の酵素的切断剤を製造する手法を提供する。酵素的核酸分子は、好ましくは、１つまたはいくつかの酵素的核酸を用いて疾患および状態の特異的な処置を提供しうるように、ａｐｏ（ａ）をコードする標的ｍＲＮＡの高度に保存された配列領域を標的とする。このような酵素的核酸分子は、要求されるように特定の細胞に対して外的に送達することができる。あるいは、リボザイムは特定の細胞に送達されるＤＮＡベクターから発現させることができる。１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は、自動化された方法を用いては困難であり、そのような分子の療法経費は著しい。本発明においては、小型の酵素的核酸モチーフ（例えばハンマーヘッドまたはヘアピン構造のもの）を外的送達に用いる。これらの分子の構造が簡単であることは、酵素的核酸がｍＲＮＡ構造の標的領域内へ侵入する能力を高める。しかし、それらの触媒的ＲＮＡ分子は真核生物のプロモーターから細胞中で発現させることもできる（例えば、Ｓｃａｎｌｏｎ，Ｋ．Ｊ．ら，１９９１Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ，Ｍ．ら，１９９２ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ，Ｂ．ら，１９９２Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ，Ｍ．ら，１９９１Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ，Ｊ．Ｏ．ら，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．，ら，１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ，Ｈ．，ら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５）。当業者は適当なＤＮＡベクターから任意のリボザイムを真核細胞中で発現しうることを理解する。二次リボザイムによって一次転写産物からリボザイムを放出させることにより、このようなリボザイムの活性を増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒら、ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９，およびＳｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５（これらの内容のすべてを本明細書の一部としてここに引用する）；Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．ら、１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍ．Ｓｅｒ．，２７,１５−６；Ｔａｉｒａ,Ｋ.ら，１９９１,ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ，Ｍ．ら，１９９３，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１，３２４９−５５）。すなわち、本発明の第１の観点においては、本発明は、ａｐｏ（ａ）の産生を阻害するリボザイムを特徴とする。これらの化学的または酵素的に合成したＲＮＡ分子は、それらの標的ｍＲＮＡのアクセス可能な領域に結合する基質結合領域を含む。ＲＮＡ分子はまたＲＮＡの切断を触媒する領域を含む。ＲＮＡ分子は好ましくはハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムである。結合した後、リボザイムはａｐｏ（ａ）をコードする標的ｍＲＮＡを切断し、翻訳および蛋白質の蓄積を妨げる。標的遺伝子が発現しないため、治療的効果を観察することができる。 “阻害”とは、ａｐｏ（ａ）をコードするｍＲＮＡの活性またはレベルが、リボザイムの不在下で観察されるものより、および好ましくはｍＲＮＡ上の同一の部位に結合しうるがそのＲＮＡを切断できない不活性ＲＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより減少することである。このようなリボザイムは、上に述べたような疾患および状態、および細胞または組織中のａｐｏ（ａ）活性のレベルに関連する他の疾患または状態の予防に有用である。“関連する”とは、ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡ転写の阻害、すなわちａｐｏ（ａ）のレベルの減少が、疾患または状態の症状をある程度軽減することを意味する。リボザイムは、直接加えるか、または陽イオン性の脂質と複合体を作るか、リポソーム内にパッケージングするか、または他の方法により標的細胞に送達する。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、カテーテル、注入ポンプまたはステントを使用することにより、バイオポリマー中に取り込むかまた取り込ませることなく、適切な組織に局所的に投与することができる。好ましい態様においては、リボザイムは表II、IV、VI、およびVIIの配列に相補的な結合アームを有する。このようなリボザイムの例は、表III、Ｖ、VIおよびVIIに示される。このようなリボザイムの例は、本質的にこれらの表に定義される配列からなる。“本質的に・・・からなる ”とは、活性リボザイムがこの例のものと均等の酵素中心、および標的部位での切断が生ずるようにｍＲＮＡに結合しうる結合アームを含むことを意味する。そのような切断を妨害しない他の配列が存在していてもよい。本発明の他の観点においては、標的分子を切断しａｐｏ（ａ）活性を阻害するリボザイムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはウイルスベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。好ましくは、リボザイムを発現しうる組み換えベクターは、上記のように局所的に送達され、標的細胞中に一時的に存在する。いったん発現されると、リボザイムは標的ｍＲＮＡを切断する。組み換えベクターは、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはアデノウイルスベクターである。しかし、ＲＮＡ発現を指示する他の哺乳動物細胞ベクターをこの目的のために使用してもよい。本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい態様の記載および特許請求の範囲から明らかであろう。好ましい態様の記載まず、図面を簡単に説明する。図面図１は、本技術分野において知られるハンマーヘッドリボザイム領域を図示したものである。ステムIIは２塩基対以上の長さであるか、または塩基対のないループ領域でありうる。図２ａは、本技術分野において知られるハンマーヘッドリボザイム領域を図示したものである；図２ｂはＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７Ｎａｔｕｒｅ，３２７，５９６−６００）によって基質および酵素部分に分割されたハンマーヘッドリボザイムを図示したものである；図２ｃはＨａｓｅｌｏｆｆａｎｄＧｅｒｌａｃｈ（１９８８Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５−５９１）によって２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様な図である；そして、図２ｄはＪｅｆｆｒｉｅｓａｎｄＳｙｍｏｎｓ（１９８９Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，］７，１３７１−１３７１）によって２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様な図である。図３は、本技術分野において知られるヘアピンリボザイム領域の一般的構造を示したものである。ＨはＡ、ＵまたはＣである。ＹはＵまたはＣである。ＮはＡ、Ｕ、ＧまたはＣである。Ｎ’はＮの相補的配列である。ヘリックス４は２塩基対以上の長さでありうる。図４は、本技術分野において知られるデルタ肝炎ウイルスリボザイム領域の一般的構造を図示したものである。図５は、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡ酵素モチーフの一般的構造を図示したものである図６は、ＲＮａｓｅＨのアクセス可能性試験を図示したものである。特に、図６の左側は、標的ＲＮＡ上のアクセス可能な部位に結合した相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドの図である。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＡ、Ｂ、およびＣで標識した広い線で示す。標的ＲＮＡは細いねじれた線で示す。図５の右側は切断されていない標的ＲＮＡを切断された標的ＲＮＡからゲル分離する模式図である。標的ＲＮＡの検出はボディラベルしたＴ７転写産物のオートラジオグラフィーによる。それぞれのレーンに共通のバンドは非切断標的ＲＮＡを表す；それぞれのレーンに特徴的なバンドは切断された生産物を表す。リボザイム本発明のリボザイムは、ａｐｏ（ａ）の発現をある程度妨害し、疾患の治療またはそのような疾患の診断に使用することができる。リボザイムは培養中の細胞あるいはＬｐ（ａ）の動物モデルの組織中に送達されるであろう。これらの系におけるａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡのリボザイム切断は、疾患の症状または状態を予防または軽減することができる。標的部位有用なリボザイムの標的は、Ｄｒａｐｅｒら(前掲)、Ｓｕｌｌｉｖａｎら（前掲）、ならびにＤｒａｐａｒ，“Ｍｅｔｈｏｄａｎｄｒｅａｇｅｎｔｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｒｔｈｒｉｔｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ” と題する米国特許出願（１９９３年１１月１２日出願、米国特許出願０８／１５２，４８７号（この内容のすべてを本明細書の一部としてここに引用する）に開示されるようにして決定することができる。これらの文書に記載された手引きをここに繰り返さずに、このような方法の特定の例を下記に提供するが、これらは当業者を制限するものではない。このような標的に対するリボザイムは、それらの出願に記載されたように設計し、また記載されるようにインビトロおよびインビボで試験すべく合成する。このようなリボザイムは記載されたように最適化して送達することもできる。サルおよびヒトのＲＮＡに対する特定の例が提供されるが、当業者は、記載されたヒトＲＮＡ標的の均等物を下記のとおり使用しうることを認識するであろう。すなわち、同一の標的を使用することができるが、ヒトＲＮＡ配列を標的化するために適切な結合アームがリボザイム中に存在する。そのような標的もまた下記のとおり選択することができる。ヒトおよびサルのａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡの配列は、コンピューター折り畳みアルゴリズムを用いてアクセス可能な部位についてスクリーニングすることができる。二次折りたたみ構造を形成せず、潜在的ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム切断部位を含むｍＲＮＡの領域を同定することができる。それらの部位は、表II、IVおよびVI-VIIに示されている（すべての配列は表の５’から３’方向である）。サルおよびヒトの配列をスクリーニングして、次にリボザイムを設計することができるが、ヒトを標的とする配列は最も有用である。しかし、ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、“ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｆｏｒＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＲｅｓｔｅｎｏｓｉｓａｎｄＣａｎｃｅｒＵｓｉｎｇＲｉｂｏｚｙｍｅｓ”と題する米国特許出願（１９９３年５月１８日出願、米国特許出願第０８／２４５，４６６号；本明細書の一部としてここに引用する）において議論されるように、サルを標的とするリボザイムはヒトの試験に先立ってリボザイムの作用の有効性を試験するのに有用である。表中、ヌクレオチド塩基位置は、表示されるタイプのリボザイムによって切断されるべき位置として示されている。リボザイム標的部位を、切断部位がａｐｏ（ａ）のｍＲＮＡ上に存在するがプラスミノーゲンのｍＲＮＡには全く存在しないように選択した（表II、IV、VIおよびVII）。これはａｐｏ（ａ）とプラスミノーゲンとの間に驚くべき相同性が存在するからである（上記参照）。コンピューターに基づくＲＮＡ折り畳みアルゴリズムによって予想された位置が潜在的な切断部位に相当することを確立しなければならない。ハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムは、リボザイム配列が結合しうるように設計し、コンピューター折り畳みにより個々に分析して、適当な二次構造に折り畳まれるかどうか評価する（Ｊａｅｇｅｒら、１９８９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６−７７１０）。結合アームと触媒中心との間に好ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外される。活性を最適化するために種々の結合アーム長さを選択することができる。一般的には、各アーム上の少なくとも５塩基が標的ＲＮＡと結合することができるか、さもなければ標的ＲＮＡと相互作用することができる。図６に示されるように、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ（“Ａｓｓａｙｆｏｒｒｉｂｏｚｙｍｅｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ”と題する米国特許出願（１９９２年５月１日出願、米国特許出願第０７／８８３，８４９号；本明細書の一部としてここに引用する）に一般的に記載される方法により、アクセス可能な切断部位についてｍＲＮＡをスクリーニングする。簡単には、潜在的ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム切断部位を表すＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ヒトまたはサルのａｐｏ（ａ）のｃＤＮＡクーロンから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写の基質を生じさせる。ラベルしたＲＮＡ転写産物をインビトロで２つの鋳型から合成する。オリゴヌクレオチドおよびラベルした転写産物をアニーリングし、ＲＮａｓｅＨを加え、混合物を３７℃で設定した時間インキュベートする。反応を止め、ＲＮＡを配列決定用ポリアクリルアミドゲルで分離する。切断された基質の百分率はホスファーイメージングシステムを用いてオートラジオグラフィー定量により決定する。これらのデータから、ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム部位を、最もアクセス可能な部位として選択する。ハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフのリボザイムをｍＲＮＡメッセンジャーの種々の部位にアニーリングするように設計する。結合アームは、上記の標的部位の配列に相補的である。リボザイムを化学的に合成する。用いた合成方法は、Ｕｓｍａｎら、１９８７Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５ −７８５４およびＳｃａｒｉｎｇｅら、１９９０ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１８，５４３３−５４４１に記載されているような、通常のＲＮＡ合成の手順に従い、５’末端にジメトキシトリチルおよび３’末端にホスホルアミデートのような一般的な核酸の保護およびカップリング基を使用する。平均的な段階カップリング収率は＞９８％であった。不活性なリボザイムは、Ｇ５をＵに、Ａ１４をＵに置換することによって合成する（番号はＨｅｒｔｅｌら、１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，３２５２に従う）。ヘアピンリボザイムは２つの部分で合成し、アニーリングして活性リボザイムを再構築する（ＣｈｏｗｒｉｒａａｎｄＢｕｒｋｅ，１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，２８３５−２８４０）。すべてのリボザイムは、５’および３’末端の両方で２’−Ｏ−メチル基で５つのリボヌクレオチドを修飾することによって、安定性を高めるために修飾する。リボザイムは、一般的方法を使用してゲル電気泳動により精製するか、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｕｓｍａｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＮＡａｎｄｒｉｂｏｚｙｍｅｓ（１９９４年５月１８日出願、米国特許出願第０８／２４５，７３６号）に記載されており、この内容のすべてを本明細書の一部としてここに引用する）によって精製し、水に再懸濁した。本研究に有用な化学的に合成したリボザイムの配列を、表III、Ｖ、VIおよびV IIに示す。当業者は、これらの配列が、リボザイムの酵素的部分（結合アームを除くすべて）が活性に影響するように変更されているはるかに多くのこのような配列の代表例にすぎないことを認識するであろう。例えば表IIIおよびＶに記載されたハンマーヘッドリボザイムのステムループII配列（５’−ＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣ−３’）は、最小で２つの塩基対合したステム構造が形成しうるかぎり任意の配列を含むように変更（置換、欠失、および／または挿入）することができる。同様に、。表VIおよびVIIに記載されたヘアピンリボザイムのステムループIV配列（５’−ＣＡＣＧＵＵＧＵＧ−３’）は、最小で２つの塩基対合したステム構造が形成しうるかぎり任意の配列を含むように変更（置換、欠失、および／または挿入）することができる。表III、Ｖ−VIIに記載される配列は、リボヌクレオチドまたは他のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドから形成することができる、そのようなリボザイムは表に特に記載されるリボザイムと均等である。リボザイム活性の最適化リボザイム活性は、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（前掲）に記載されたように最適化することができる。詳細はここに繰り返さないが、リボザイムの結合アームの長さを変更すること（ステムＩおよびIII、図２ｃを参照されたい）、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を妨げるよう修飾したリボザイムを化学的に合成すること（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９０Ｎａｔｕｒｅ，３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎら、１９９１Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，３１４；ＵｓｍａｎａｎｄＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎら、国際公開ＷＯ９３／１５１８７；およびＲｏｓｓｉら、国際公開ＷＯ９１／０３１６２、ならびにＵｓｍａｎｓ，Ｎら、米国特許出願第０７／８２９，７２９およびＳｐｒｏａｔ、ヨーロッパ特許出願第９２１１０２９８．４および米国特許５，３３４，７１１およびＪｅｎｎｉｎｇｓら、ＷＯ９４／１３６８８（これらは酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に行いうる種々の化学修飾を記載しており、これらのすべての刊行物を本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい）、細胞内におけるこれらの効力を増強するよう修飾すること、およびＲＮＡ合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するためにステムII塩基を除去することを含む。Ｓｕｌｌｉｖａｎら（前掲）は、酵素的ＲＮＡ分子の送達の一般的方法を記載する。リボザイムは当業者に知られる種々の方法によって細胞に投与することができる。この方法には、リポソーム中へのカプセル化、イオントホレシスによるもの、あるいはヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生物吸着性マイクロスフェアのような他のベヒクル中に取り込ませることによるものを含むが、これらに限定されない。ＲＮＡ／ベヒクル組み合わせ物を直接注入により、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により局所的に送達する。別の送達経路には、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアゾール吸入、経口（錠剤または丸薬の形で）、局所、全身、眼、腹空内、および／または鞘内投与が含まれるが、これらに限定されない。リボザイムの送達および投与のより詳細な記載は、本明細書の一部としてここに引用したＳｕｌｌｉｖａｎら（前掲）、およびＤｒａｐｅｒら（前掲）によって提供されている。細胞内に高濃度のリボザイムを蓄積させる他の手段は、ＤＮＡ発現ベクターにリボザイムをコードする配列を取り込ませることである。リボザイム配列の転写は真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）、ＲＮＡポリメラーゼII（ｐｏｌ II）、またはＲＮＡポリメラーゼIII（ｐｏｌ III）のプロモーターから進められる。ｐｏｌ IIまたはｐｏｌ IIIプロモーターからの転写産物は、すべての細胞内で高レベルで発現されるであろう；一定の細胞タイプ中における一定のｐｏｌ IIプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞内で発現される限り、原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用される（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎａｎｄＭｏｓｓ，１９９０Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；ＧａｏａｎｄＨｕａｎｇ１９９３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕら１９９０Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。幾人かの研究者は、このようなプロモーターから発現されたリボザイムが哺乳動物細胞中で機能しうることを実証してきた（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら、１９９２ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ,８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎら、１９９２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ.,２０,４５８１−９;Ｙｕら、１９９３Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２ＥＭＢＯＪ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４）。上記のリボザイム転写ユニットは哺乳類細胞に導入するための種々のベクター中に取り込ませることができる。ベクターには、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルスまたはアデノ関連性ウイルスのベクター等）、またはウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルス，シンビスウイルス、セムリキフォレストウイルスのベクター等）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の好ましい態様においては、ａｐｏ（ａ）ＲＮＡを切断するリボザイムを発現する転写ユニットをプラスミドＤＮＡベクター、レトロウイルスＤＮＡウイルスベクター、アデノウイルスＤＮＡウイルスベクターまたはアデノ関連性ウイルスベクター中に挿入する。これらのおよび他のベクターは、生存動物に遺伝子を伝達し(総説については、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，１９８９Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４，１２７５−１２８１；ＲｏｅｍｅｒａｎｄＦｒｉｅｄｍａｎ，１９９２Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８，２１１−２２５を参照されたい) 、および一時的または安定な遺伝子発現を導くために使用されてきた。ベクターは、組み換えウイルス粒子として送達される。ＤＮＡは単独でまたはベヒクルとの複合体（ＲＮＡについて上述したような）で送達することができる。ＤＮＡ、ＤＮＡ／ベヒクル複合体、または組み換えウイルス粒子は、処置部位に、例えばカテーテル、ステントまたは注入ポンプを使用して局所的に投与される。例１：ａｐｏ（ａ）ハンマーヘッドリボザイムリボザイムモチーフを工作することによって、我々はａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡ配列に対するいくつかのリボザイムを設計してきた。これらはそのヌクレアーゼ耐性を改善するような修飾を有するように合成された。これらのリボザイムはインビトロでａｐｏ（ａ）標的配列を切断する。ａｐｏ（ａ）を発現する細胞にリボザイムを外的送達することにより、インビボでの機能について試験する。リボザイムはリポソームに取り込ませることによって、陽イオン性脂質と複合体を作ることによって、マイクロインジェクションによって、またはＤＮＡベクターから発現させることによって送達する。ａｐｏ（ａ）の発現は、ＥＬＩＳＡ、間接免疫蛍光法、および／またはＦＡＣＳ分析によってモニターする。ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡのレベルは、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析、ＲＮａｓｅ保護、プライマー延長分析、または定量的ＲＴ−ＰＣＲ技法により評価する。ａｐｏ（ａ）蛋白質およびｍＲＮＡの誘導を９０％以上妨害するリボザイムが同定される。診断使用本発明のリボザイムは、羅患細胞内での遺伝的浮動および突然変異を試験する診断道具として使用することができる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係は、標的ＲＮＡの塩基対合および三次元構造を変更する分子の任意の領域において突然変異を検出することを可能とする。本発明に記載される多数のリボザイムを用いることによって、インビトロでのならびに細胞中および組織中でのＲＮＡの構造および機能に重要なヌクレオチド変化を位置決定することができる。リボザイムによる標的ＲＮＡの切断を用いて、遺伝子発現を阻害し、疾患の進行中における特定の遺伝子産物の役割（本質的な）を特定することができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要な媒体として特定することができる。これらの実験は、組合せ治療を可能とすることにより、疾患の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば、異なる遺伝子を標的とする多数のリボザイム、既知の小分子阻害剤に結合させたリボザイム、またはリボザイムおよび／または他の化学的または生物学的分子の組み合わせを用いる断続的な治療）。本発明のリボザイムの他のインビトロ使用は当該技術分野でよく知られており、これにはａｐｏ（ａ）関連状態と関連するｍＲＮＡの存在を検出することが含まれる。このようなＲＮＡは標準方法を用いてリボザイムで処理した後、切断産物の存在を判定することによって検出される。特定の例においては、標的ＲＮＡの野性型または変異型のみを切断しうるリボザイムをアッセイに使用する。第１のリボザイムを用いて試料中に存在する野性型ＲＮＡを同定し、第２のリボザイムを用いて試料中の突然変異ＲＮＡを同定する。反応対照として、野性型および突然変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方のリボザイムにより切断することにより、反応中のリボザイムの相対的な効力および“非標的”ＲＮＡ種の切断の欠失が実証される。合成基質からの切断産物は試料集団中の野性型および突然変異型ＲＮＡの分析用のサイズマーカーを生ずるのにも役立つであろう。すなわち、それぞれの分析に２つのリボザイム、２つの基質および１つの未知試料が必要であり、これらを組み合わせて６つの反応とする。切断生産物の存在は、それぞれのＲＮＡの全長および切断フラグメントがポリアクリルアミドゲルの１つのレーンで分析できるように、ＲＮＡｓｅ保護アッセイを用いて判定される。突然変異ＲＮＡの発現および標的細胞内における所望の表現型変化の推測される危険性を見抜くためには、結果を定量化することが絶対的に必要というわけではない。その蛋白質生成物が表現型（すなわちａｐｏ（ａ））の発生に関係しているようなｍＲＮＡの発現は、危険性を立証するのに適当である。類似した比活性のプローブを両方の転写産物について使用する場合には、ＲＮＡレベルの定性的比較が適当であり、初期の診断の経費を削減するであろう。ＲＮＡレベルが定性的または定量的に比較されるかにかかわらず、突然変異型対野性型の比が高ければ高いほど、より高い危険性と関連があるであろう。他の具体例は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ニュートン，ロジャー・エスアメリカ合衆国ミシガン州48105，アン・アーバー，バーズタウン・トレイル 1425 (72)発明者ラムハラック，ランディアメリカ合衆国ミシガン州48105，アン・アーバー，アンティータム・ドライブ 2465

Claims

【特許請求の範囲】１．ａｐｏ（ａ）ｍＲＮＡを切断する酵素的ＲＮＡ分子。２．その結合アームが表II中のいずれかの配列により定義されるいずれか１つの配列に相補的な配列を含む、請求項１記載の酵素的ＲＮＡ分子。３．その結合アームが表IV、VIおよびVIIのいずれか１つにおいて定義される配列に相補的な配列を含む、請求項１記載の酵素的ＲＮＡ分子。４．前記ＲＮＡ分子がハンマーヘッドモチーフのものである、請求項１、２または３に記載の酵素的ＲＮＡ分子。５．前記ＲＮＡ分子が、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａＶＳＲＮＡまたはＲＮａｓｅＰＲＮＡモチーフのものである、請求項１、２または３に記載の酵素的ＲＮＡ分子。６．前記リボザイムが前記ｍＲＮＡに相補的な１２から１００塩基を含む、請求項５記載の酵素的ＲＮＡ分子。７．前記リボザイムが前記ｍＲＮＡに相補的な１４から２４塩基を含む、請求項６記載の酵素的ＲＮＡ分子。８．本質的に表III、Ｖ、VIおよびVIIに示される配列からなる群より選択されるいずれかの配列からなる酵素的ＲＮＡ分子。９．請求項１、２または３に記載の酵素的ＲＮＡ分子を含む哺乳動物細胞。１０．前記細胞がヒト細胞である、請求項８記載の細胞。１１．請求項１、２または３に記載の１つの酵素的ＲＮＡ分子または多数の酵素的分子をコードする核酸を、その酵素的ＲＮＡ分子が哺乳動物細胞中で発現する様式で含む発現ベクター。１２．請求項１１記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。１３．前記細胞がヒト細胞である請求項１３記載の細胞。１４．患者に請求項１、２または３に記載の酵素的核酸分子を投与することにより上昇した血漿Ｌｐ（ａ）レベルに関連する状態を処置する方法。１５．患者に請求項１１記載の発現ベクターを投与することにより上昇した血漿Ｌｐ（ａ）レベルに関連する状態を処置する方法。１６．前記患者がヒトである、請求項１４または１５に記載の方法。１７．前記状態が、および心臓疾患からなる群より選択される、請求項１５記載の方法。１８．前記状態が再狭窄である、請求項１７記載の方法。