JPH10506531A

JPH10506531A - マラリア病の治療

Info

Publication number: JPH10506531A
Application number: JP8511060A
Authority: JP
Inventors: カツリハルダー; サビンアンナロウアー
Original assignee: ザボードオブトラスティーズオブザリランドスタンフォードジュニアユニバーシティー
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 1998-06-30
Also published as: EP0782631A4; WO1996009405A1; EP0782631A1; US5976781A

Abstract

(57)【要約】マラリア原虫(Ｐlasmodium)は環状体及び初期栄養型の成熟にとって必要な阻害作用感受性のスフィンゴミエリンシンターゼ活性を有することが示される。したがって、阻害感受性のマラリア原虫スフィンゴミエリンシンターゼと哺乳動物のシンターゼとを区別することができる阻害剤は、マラリア感染症を治療するために用いることが可能である。重要な阻害剤には、1−フェニル−３−モルホリノ−２−アシル化−アミノプロパノール−１が含まれる。本発明の開発は、ＮIＨのグラントＲＯ１Ａ126670、ＢＲＳＧＲＲ05353の下で、そしてマッカーサー(ＭcＡrthur)財団によって、少なくとも部分的にサポートされている。政府は本発明において一定の権利を有する。

Description

【発明の詳細な説明】マラリア病の治療導入技術分野本発明の分野は、マラリア病の治療である。発明の背景マラリア病は、以前から、そして現在も主要な感染性疾患である。それはプラスモディウム(Plasmodium)属の原生動物寄生虫によって引き起こされる。熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)はヒトに感染する４つの種のうちの一つであり、最も重篤で致命的な疾患を引き起こす。マラリアを制御するために多くの薬物が用いられてきたが、薬剤耐性型が増殖する兆しがあるため、新しい治療様式が緊急に要求とされている。血液段階の感染が、完全にマラリア病の症状の原因であるが、それは赤血球に分裂小体(メロゾイト)が侵入することから始まる。赤血球内の寄生虫は形態学的に区別される環状体(リング)(０〜24時間)段階及び栄養型(トロフォゾイト)(24 〜36時間)段階を経て発育し、増員生殖(シゾゴニー)(36〜48時間)段階になり、そこで有糸分裂が起こって10〜16個の娘分裂小体(メロゾイト)が集合する。増員生殖の終わりでは、感染した赤血球が破壊し、放出された分裂小体が赤血球に再侵入して無性生殖周期が繰り返される。熱帯熱マラリア原虫のスフィンゴミエリンシンターゼ及びＥＲＤ２(小胞体(ＥＲ)における蛋白質保持のための受容体)は、ゴルジ体の明確な区画に局在するが、それが哺乳動物細胞の状況とは異なっていることが知られている。熱帯熱マラリア原虫において、ＥＲはＰfＥＲＤ２とは異なり薬物ブレフェルジンＡ(Ｂrefe ldin Ａ)によって再編成されるのに対して、スフィンゴミエリンシンターゼ部位はブレフェルジンＡによって再編成されず、このことはその動態が寄生体の系で異なることを示している。哺乳動物細胞とは異なり、熱帯熱マラリア原虫のスフィンゴミエリン生合成活性は、独特の分泌特性を有する。例えば、赤血球の細胞質内の寄生虫の原形質膜を越え卵管小胞膜網状構造(ＴＶＭ)が生長し、スフィンゴミエリンシンターゼ生合成活性の画分をこれらの膜へ輸出する。卵管小胞膜網状構造の生長を阻害することができれば、マラリア治療の手法に至る道が開けるであろう。関連文献米国特許第5,041,441号には、抗癌剤としての１−フェニル−２−アシルアミノ−３−モルホリノプロパノール−１の使用が開示されている。また該明細書に引用された参照文献も参照のこと。発明の概要本発明は、哺乳動物スフィンゴミエリンシンターゼと区別される熱帯熱マラリア原虫スフィンゴミエリンシンターゼ活性の同定及び単離、マラリアを診断するための該活性の使用、並びにマラリア治療のための該活性の阻害に関する。阻害剤としては２−Ｎ−アシル化１−置換−３−アミノプロパノール−１を用いることができる。図面の簡単な説明図１は、ＰＰＭＰによるマラリア原虫のスフィンゴミエリン合成の阻害のグラフを示す。特定の態様の説明本発明により、マラリア原虫に関連する新規なスフィンゴミエリンシンターゼ (Ｐ.スフィンゴミエリンシンターゼ)の同定、マラリア感染の指標としてのＰ.スフィンゴミエリンシンターゼの存在の検出、及びＰ.スフィンゴミエリンシンターゼの阻害剤を、単独で、又は他の抗マラリア薬と組み合わせて用いることによるマラリア感染の治療のための方法及び組成物が提供される。Ｐ.スフィンゴミエリンシンターゼは、哺乳動物スフィンゴミエリンシンターゼの阻害特性と比較して実質的に異なる阻害特性を有することを特徴とし、特に、約５μＭ以下の濃度で阻害され、通常は少なくとも約30％が阻害され、さらに一般的には少なくとも約50％が阻害され約0.01μＭの濃度にまで低下する。殆どの場合、哺乳動物スフィンゴミエリンシンターゼに類似するマラリア原虫に存在する第２のスフィンゴミエリンシンターゼを有意に阻害するには、少なくとも約 30％の阻害に対して少なくとも約100μＭを必要とする。選択的な阻害剤として、２−Ｎ−アシル化１−置換−２,３−ジアミノプロパノール−１を用いることができる。該化合物において、３−アミノ基が特定のヘテロ環部分として機能性である。多くの場合、阻害剤として用いることのできる化合物は、次の構造式の化合物を含む。式中、Ｒは、５〜15個、より一般的には５〜10個の炭素原子からなるハイドロカルビル基であり、それは脂肪族、脂環族または芳香族であって、特にフェニル基または全部で１〜３個の炭素原子のアルキル置換基を有するフェニル基である。Ｒ₁は置換されたアミノ基であり、ここでＲ₁は窒素原子を介して結合されていて、またここでＲ₁はカルコゲン(酸素または硫黄)である０〜１個のへテロ原子を有する３〜６個、通常は３〜５個の炭素原子であり、またここでＲ₁は非環式または環式であって、好ましくは環式であり、ヘテロ原子の全てがヘテロ環原子、特定するとモルホリノである。Ｒ₂は脂肪族鎖であり、それは直線状であっても枝分かれしていてもよいが好ましくは直線状であり、また飽和であっても不飽和であってもよいがあ通常は不飽和の部位を二箇所以上は有しておらず、特定するとエチレン性不飽和であり、そして９〜17個の炭素原子、より一般的には約９〜15個の炭素原子を有している。本発明の化合物は、立体異性体、例えばＤ体、Ｌ体、エリトロ体、トレオ体の混合物であってもよいし、個々の立体異性体、例えばトレオ体であってもよい。純粋な(＞90モル％の)トレオ体が好ましい。これらの化合物は、マラリア型スフィンゴミエリンシンターゼ活性のスクリーニングにおいて使用することができる。赤血球を宿主から採取し、細胞を溶解させ、スフィンゴミエリンシンターゼ活性を、スフィンゴミエリンシンターゼ阻害剤の非存在下、阻害剤感受性マラリア原虫スフィンゴミエリンシンターゼの阻害濃度の存在下、及び感受性の低いスフィンゴミエリンシンターゼの阻害濃度の存在下において測定した。スフィンゴミエリンシンターゼについての検定法は以前に記載されている。ハルダー(Ｈaldar)ら(1991)及びエルメンドルフ(Ｅlmendorf )ら(1994)(後記)を参照のこと。感受性のスフィンゴミエリンシンターゼは、約0 .5と５μＭの間の濃度に感受性であり、感受性の低いスフィンゴミエリンシンターゼは、少なくとも約100μＭの阻害剤を必要とする。感受性スフィンゴミエリンシンターゼの量は感受性の低いスフィンゴミエリンシンターゼの全体量に比べてかなり低いため、異なるスフィンゴミエリンシンターゼを多く含む画分を提供するためには溶解物の蛋白質成分を分離することが望ましいであろう。キャピラリー電気泳動を用いることによって、スフィンゴミエリンシンターゼ活性を有する少なくとも一つのバンドを得ることができる。続いて、スフィンゴミエリンシンターゼ活性を有するバンドいずれかが、低濃度の阻害剤の存在下で活性が実質的に減少するかどうかを調べた。このようなバンドの存在は、マラリア原虫感染の指標となる。別の手法には、ＨＰＬＣ、アフィニティクロマトグラフィーなどが含まれる。例えば、「Ｌandersら、(1993)Ｂio Ｔec hniques 14：98−111」、「分子生物学:実験マニユアル(Ｍolecular Ｂiology：ＡＬaboratory Ｍanual)、Ｓambrookら編、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1988」、「Ｎielsonら、(1991)Ｊ. Ｃhromatography 539:177」を参照のこと。本発明の阻害剤はまた、感受性の低いスフィンゴミエリンシンターゼから感受性の高いスフィンゴミエリンシンターゼを分離するため、アフィニティカラムにおいて用いることもできる。例えばラテックスビーズ、アガロースなどの支持体に共有結合した本発明の阻害剤を含むカラムに、感染した赤血球の溶解物を通過させることによって、スフィンゴミエリンシンターゼがそのアフィニティカラムに捕捉されるであろう。それからアイソクラチックまたは異なる溶媒の混合液を用いて溶出し、スフィンゴミエリンシンターゼ活性について画分をモニターすることができる。後方の画分に、感受性の高いスフィンゴミエリンシンターゼ活性が多くなるであろう。阻害剤感受性のスフィンゴミエリンシンターゼが多い画分は、続いて常法によりモノクローナル抗体を調製するために用いられる。モノクローナル抗体の調製方法については、「モノクローナル抗体:実験マニユアル(Ｍonoclonal Ａntibodi es:ＡＬaboratory Ｍanual)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、Ｈ arbor及びＬane編、1988」を参照のこと。スフィンゴミエリンシンターゼ活性を、免疫原として、完全フロイントアジュバントまたは他のアジュバントと共にマウスのフットパッドに注入し、続いて追加抗原注射を二週間後に行い、そして３日〜７日以内に脾臓を採取した。次に脾細胞を適当な骨髄細胞と融合させ、その抗体を阻害剤感受性スフィンゴミエリンシンターゼへの特異的な結合についてスクリーニングした。マラリア原虫の阻害剤感受性スフィンゴミエリンシンターゼと阻害剤感受性が低いスフィンゴミエリンシンターゼとを区別するこれらの抗体は、続いてその感受性のあるスフィンゴミエリンシンターゼなどを単離し、精製するために診断用検定法で用いられる。精製された阻害剤感受性Ｐ.スフィンゴミエリンシンターゼは、活性について薬物をスクリーニングするために用いることができる。阻害剤感受性スフィンゴミエリンシンターゼを、哺乳動物のスフィンゴミエリンシンターゼでの薬物活性と比較して薬物活性を試験するために用いることによって、スフィンゴミエリンシンターゼを特異的に阻害できる薬物を同定することができる。特に重要であるのは、感受性型Ｐ.スフィンゴミエリンシンターゼ活性を、哺乳動物スフィンゴミエリンシンターゼ活性、特にヒトのスフィンゴミエリンシンターゼ活性と比較して選択的に阻害することのできるスフィンゴミエリンシンターゼ阻害剤の使用である。宿主がマラリア感染の発病率が高い地域に入って行く可能性がある場合、適宜、本発明の薬物をマラリアワクチンとともに用いたり、または予防の目的で用いることができる。本発明の阻害剤の投与は、従来の手段、特定すると経口投与または非経口投与で、さらに特定すると血管内投与、噴霧器を用いた吸入、または他の簡便な方法によって行うことができる。何らかの生理学的に許容される担体、例えば生理食塩水、水、燐酸緩衝生理食塩水、植物油などを用いることができる。本発明の阻害剤は、徐放のためのマイクロカプセルとして投与したり、適当な容器に入れて投与したり、または阻害剤の濃度レベルを維持する他の手段として投与したりすればよい。一般的にはこの濃度レベルは、血流内で約10μＭ以上ではなく、好ましくは約５μＭ以上ではなくて、また少なくとも約0.01μＭ、通常は少なくとも約0.05μ Ｍであるだろう。本発明の薬物の投与は、長時間、即ち通常は少なくとも３時間で好ましくは少なくとも約６時間、一般的には１日またはそれ以上の日数にわたる治療を行っている期間、その濃度を維持できるように行わなくてはならない。特に重要な点は、他の抗マラリア薬と複合した、指示された濃度の本発明の阻害剤の使用である。このように、本発明の阻害剤が生理学的に有効な量の抗マラリア薬、例えばキニーネ(quinine)、クロロキン(chloroquine)、アトバクオーネ (atovaquone)、ハロファントリーネ(halofantrine)、例えばＡs及びＳbなどの重金属、メラルサプロール(melarsaprol)などと組み合わされた組み合わせ療法を、用いることができる。上記のような抗マラリア薬と、治療上有効な量の本発明の薬物とを含む組成物が、提供される。該組成物において、抗マラリア薬は、標準の治療用量または組合せに関連して減少させた用量であって、それは通常、治療用量の約10％以下ではなく、通常は治療用量の約50％以下ではない。減少させる量は、その組合せで観察される反応に経験的に基づいて、また従来の抗マラリア薬の好ましくない副作用に関連して決定することができる。この組合せ剤は、粉剤、液剤、分散剤、溶液などであってよく、この場合に様々な生理学的に許容される賦形剤、溶剤、分散剤などが用いられる。投与は、血流で有効阻害剤濃度が維持できるように標準的な方法により行われる。以下の実施例は、制限のためではなく、例示のために提示されている。実験の材料及び方法実施例１ＰＰＭＰ(dl−トレオ−１−フェニル−２−パルミトイルアミノ− ３−モルホリノ−１−プロパノール)によるマラリア原虫のスフィンゴミエリン生合成の阻害侵入から24時間後、１×10⁸個の感染細胞をＲＰＭI 1640中で洗浄して無血清にし、０〜５μＭまたは０〜500μＭのＰＰＭＰを含む１mlのＰＰＭI 1640中で3 7℃で30分間プレインキュベートした。(Ｃ６−ＮＢＤ−セラミド(Ｎ-[７−(４− ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアジド)]−６−アミノカプロイル−Ｄ− エリトロースフィンゴシン)を最終濃度５μＭでそれぞれの試料に添加し、続いてその試料を37℃で30分間さらにインキュベートして細胞の脂質を抽出した。Ｃ６−ＮＢＤ−スフィンゴミエリンをＴＬＣによって溶解して、以前に開示されているような蛍光スペクトロホトメトリーによって定量した。「Ｂligh，Ｅ．Ｇ．及びＤyer，Ｗ．Ｙ．(1959)、全脂質を抽出及び精製するための迅速な方法(Ａ r apid method for total lipid extraction and purification)、Can．Ｊ．Ｂioc hem，Ｐhysiol．37：911−917」、「Ｈaldar，Ｋ.，Ｕyetake，Ｌ.，Ａhori，Ｎ., Ｅlmendorf，Ｈ．Ｇ．及びＬu，Ｗ−ｌ．(1991)、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球における蛍光セラミド誘導体の蓄積及び代謝(Ｔhe accumulation and metabol ism of a fluorescent ceramide derivative in Ｐlasmodium falciparum−infe cted erythrocytes.)、Ｍo．Ｂiochem．Ｐarasitol．49:143−156」、「Ｅlmendor f，Ｈ．Ｇ．及びＨaldar，Ｋ．(1994)、熱帯熱マラリア原虫は赤血球の細胞質においてゴルジ体マーカーのスフィンゴシンシンターゼを卵管小胞膜網状構造へと輸出する(Ｐlasmodium falciparum exports the Ｇolgi marker sphingomyelin synthase into a tubovesicular network in the cytoplasm of mature erythro cytes.)、Ｊ．Ｃell Ｂiol．124:449−462」参照。得られたそれぞれの値は、５回の実験で３組の測定を行った平均を表している。矢状の線は、標準偏差を示している。その結果を図１に示す。実施例２低張により溶解した感染赤血球における、５μＭのＰＰＭＰによるスフィンゴミエリン生合成の阻害細胞をＰＢＳで洗浄して無血清にし、無傷の細胞をＰＢＳ中でインキュベートした。細胞を10倍量の低張の緩衝液に溶解した。10⁴×Ｇで４℃で10分間遠心分離することによってペレットと上清を分離した。スフィンゴミエリン生合成活性の阻害は、実施例１に記載されたように行った。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、寄生虫のサイトゾル活性を、10μＭのアルファケトグルタル酸と0.1μＭのＮＡＤＰＨを用いて37℃で１時間、分光光度計で340nmにおける吸収を測定することによって検定した。以下の表にその結果を示す。実施例３ dl−トレオＰＰＭＰ及びdl−トレオ−ＰＤＭＰ(dl−トレオ−１− フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール)が、熱帯熱マラリア原虫感染した赤血球の培養物中におけるスフィンゴミエリンの生合成と赤血球内生長を特異的に阻害する熱帯熱マラリア原虫株ＦＣＢを全ての実験において用い、トレイガー(Ｔrager )及びイェンセン(Ｊensen)の方法を変形してインビトロで培養した(Ｔrager，Ｗ．及びＪensen，Ｊ．Ｂ．(1976)、継代培養中のヒトマラリア(Ｈuman malaria i n continuous culture)、Ｓcience(Ｗash．Ｄ．Ｃ．)193:673−675、Ｈaldar，Ｋ.，Ｆerguson，Ｍ．Ａ．Ｊ．及びＣross，Ｇ．Ａ．Ｍ．(1985)、sn−1,2−ジアシルグリセロールを介した熱帯熱メロザイト表面抗原のアシル化(Ａcylation of a Ｐlasmodium falciparum merozoite surface antigen via sn−１，２−di acyl glycerol)、Ｊ．Ｂio．Ｃhem．260;4969−4974)。ＲＰＭI 1640を含む培養培地には、25ｍＭのヘルペス、pＨ7.4／11μＭのグルコース／92μＭのヒポキサンチン／0.18％の炭酸水素ナトリウム／25μＭのゲンタマイシン及び 10％のＡＢ＋ヒト血清を追加した。寄生虫は2.5〜５％のヘマトクリットでＡ＋赤血球中で増殖した。寄生虫の培養物は、パーコール(Ｐercoll)勾配で最初の段階と最後の段階を分離することによって同調させた。続いて、生活環中12〜24時間の細胞を得るために、培養物におけるこれらの段階を再培養した。５μＭの種々の化合物を用いたスフィンゴミエリン生合成活性の阻害を、実施例１に記載されているように行った。５μＭの種々の化合物を培養培地の０〜12時間環状体に添加して、その細胞を24時間後にギムザ染色法により検出した。以下の表にその結果を示す。実施例４種々の濃度のＰＰＭＰの影響下における培養物中の熱帯熱マラリア原虫の赤血球内生長侵入から12時間後の同調培養物を、異なる濃度のＰＰＭＰに供した。薬物処理した培養物の寄生虫を、二つの赤血球内周期の様々な時点で検出し、薬物の非存在下で培養した細胞と比較した。実施例５熱帯熱マラリア原虫感染した赤血球におけるＣ₅−ＤＭＢ−ＰＤＭＰの分布(Ｃ₅−ＤＭＢ−ＰＤＭＰ＝１−フェニル−２{Ｎ−(４,４−ジフロロ− ５,７−ジメチル−４−ボラ−３a,４a−ジアザ−５−インダセン−３−ペンタノイル)｝−３−モルホリノ−１−プロパノール) 侵入から24〜36時間後、感染細胞を洗浄し、無血清にしてから、２mg／mlの無脂肪ＢＳＡとＣ₅−ＤＭＢ−ＰＤＭＰを含む１mlのＲＰＭI 1640中に１×10⁸個の細胞を再懸濁して最終濃度を５μＭにした。細胞を60分間、37℃でインキュベートし、ＲＰＭI 1640中で洗浄することにより、過剰の標識を除去した。軽く固定された細胞(0.05％のグルタルアルデヒド)は、Ｓ.Ｊ.スミス(Ｓ．Ｊ．Ｓmith)( スタンフオード大学のＤepartment of Ｍolecular and Ｃell Ｐhysiology所属) によって設計された注文製のレーザー型コンフォーカル顕微鏡を用いて488nmの励起波長で観察した。生のコンフォーカルデータは、アドーベ・フォトショップ・ソフトウェア(Ａdobe Ｐhotoshop software)(モレキュラー・ダイナミクス社( Ｍolecular Ｄynamics，Inc.)、カリフォルニア州サニーベイル)をＷ.ジャング( Ｗ．Ｊung)(スタンフォード大学のＣell Ｓciences Imaging Ｆacilities所属) によって変形されたものを用いて処理した。得られた画像は、環状体後期から栄養体初期の段階の一つの感染した細胞を示している。赤血球の原形質膜は、外側の微かな環として現れた。寄生体は、赤血球の細胞の左下方に局在していた。大きな小胞構造及び管状構造が、その寄生虫の上部及び底部より現れた。実施例６侵入から12時間後(環状体)及び36時間後(栄養型)にＣ₅−ＤＭＢ− ヤラミド(４,４−ジフロロ−５,７−ジメチル−４−ボラ−３a,４a−ジアザ−５ −インダセン−３−ペンタノイル)−スフィンゴシン)で標識されたマラリア原虫感染した赤血球の連続切片パーコール法で単離した分裂体段階の寄生虫を、10％のヒト血清を含むＲＰＭ I 1640の存在下、または10％のヒト血清と５μＭのＰＰＭＰを含むＲＰＭI 1640 の存在下で侵入させた。適切な段階の１×10⁸個の感染赤血球を、２mg/mlの無脂肪ＢＳＡと20μＭのＣ₅−ＤＭＢ−セラミドを追加した１mlのＲＰＭI 1640中でインキュベートした。細胞を洗浄して実施例５に記載されたように固定した。連続的な顕微鏡写真を、Ｚ軸に沿って400nmの間隔で、注文製のレーザー型コンフォーカル顕微鏡を用いて撮影した。生データは、前述したように処理した。結果基質としてＮＢＤ−セラミドを用いた場合、感染した赤血球によって形成されるＮＢＤ−スフィンゴミエリンの量はスフィンゴミエリンシンターゼ活性の直接的な測定量である。図１に示したように、感染した赤血球に0.05〜0.5μＭのＰＰＭＰを添加すると、スフィンゴミエリンシンターゼ活性は最初に急速に減少する。１〜５μＭのＰＰＭＰではそれ以上の阻害がほとんど観察されず、これらの濃度では平均35％の阻害が観察される。しかしながら25μＭ以上の濃度では酵素活性はさらに減少して、500μＭのＰＰＭＰでは全細胞のスフィンゴミエリンシンターゼ活性の約80〜90％が阻害されている。図１の結果は、感染した赤血球が、ＰＰＭＰによる阻害に対して強い感受性があり、１〜５μＭの濃度の薬物で完全に阻害されるスフィンゴミエリンシンターゼ活性のプールを含んでいることを示している。曲線の形状は、100〜500μＭで定量的に阻害される酵素の第二のプールを伴い、様式が二相性であることを強く支持する。同様の阻害曲線はＰＤＭＰを用いた場合でも得られ、それは第２の一つの脂質アナログも感染赤血球のスフィンゴミエリンシンターゼの二つの異なるプールを検出することを示している。観察された選択的な活性についての説明を特定するために、感染赤血球を100 倍容の低張緩衝液で溶解し、その溶解物を５μＭのＰＰＭＰを用いて観察されたスフィンゴミエリンシンターゼ阻害の程度を検定した。薬物との接触が無傷の細胞での制限因子であるならば、図１に示された曲線から、すべてのスフィンゴミエリンシンターゼ活性及び生細胞が５μＭのＰＰＭＰによって阻害されるはずであると予測することができる。実施例２に示されているように、無傷の細胞では35％が阻害されたのと比較して、活性の33％のみが低張で溶解させた細胞画分で阻害された。これらの溶解物を10⁴×Ｇで遠心分離にかけ、上清と膜の画分に分離した場合、寄生虫のサイトゾルのマーカーであるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Ｖander−Ｊart，Ｄ．Ｌ．ら、(1982)、寄生虫の純度の指標としてのマラリア原虫及びヒト赤血球のマーカー酵素(Ｍarker enzymes of Ｐlasmodium falciparum and human erythrocytes as indications of parasite purity)、Ｊ．Ｐarasitol 68:1068−1071)はその上清に定量的に回収され、そのことから細胞が溶解したことが確認される。事実上すべてのスフィンゴミエリン生合成活性が低張の溶解物に回収されたが、このことはこの溶解手段が活性の消失を引き起こさなかったことを示している。この結果は、感染した赤血球には二つの異なる型の酵素が存在しているという結論を支持している。 dl−(トレオ)体のＰＰＭＰ及びＰＤＭＰで観察される阻害と対照的に、dl−( エリトロ)体のＰＤＭＰには効果がなく、このことは立体特異的な阻害を示している。薬物と共に６〜12時間のインキュベートを行った後でさえも、トレオ型を洗浄することにより、酵素活性の最初のレベルが完全に回復される。このことは、酵素の阻害が細胞における非特異的な変性効果によっているのではないことを示している。４つの他の脂質親和性アミンである、イミプラミン、ステアリルアミン、Ｕ−18666Ａ、dl−ジヒドロスフィンゴシンは酵素活性に影響がなく、このことはＰＰＭＰ及びＰＤＭＰによるスフィンゴミエリンシンターゼの阻害が、系中の脂質親和性アミンの一般的な毒性によるものではないことを示している。実施例３参照のこと。多くの真核細胞においてスフィンゴ脂質の代謝物でありプロテインキナーゼＣの強力な阻害剤であるスフィンゴシンも、効果を有していなかった。ＰＰＭＰ及びＰＤＭＰは、ＤＮＡ合成または蛋白質合成のいずれも阻害しなかった。一つの脂質アナログが、連続的な寄生虫増殖周期で長期間培養されている寄生虫の生育を阻害する効果を調査した。この調査は、10％の寄生体で、同調された若い環状体(0〜12時間)を用いて開始した。インビトロでマラリア寄生虫を完全な生育状態で生育させるために、培養物の寄生虫が10％過剰にならないようにする。それでも、通常の条件で寄生虫の３〜６倍の増加が各回の侵入で検出される。したがって、新しい周期ごとに、培養物を薬物の非存在下又は存在下で４倍に希釈して新鮮な赤血球にいれた。実施例４に示されているように、ＰＰＭＰ濃度を0.05〜1.0μＭに増加させると、寄生虫スフィンゴミエリンシンターゼを阻害するＰＰＭＰの効果と平行する生長阻害が観察され、それは徐々に増加していった。0.05μＭという低い濃度では、最初の周期の間は生育を停止しなかったが、増殖の効率が減少することによって長期間の培養は阻害され、このことは低濃度の薬物に長期間さらすことによっても寄生虫を最終的に殺傷できることを示唆している。３回の増殖周期を終えた時のＰＤＭＰの最低の有効な殺傷濃度は、1.0μＭである。ＰＰＭＰはＰＤＭＰよりも効果が大きい。この結果は、ＰＰＭＰが環状体の生長を遮断するのに有効であることを示している。低濃度であると後方段階への成熟が遅れ、５μＭの薬物で環状体の最初の周期の増殖が完全に阻害される。薬物はまた、栄養型段階の寄生虫の生長を阻害した。しかしながらその周期で40時間以上経過した分裂体は、５μＭのＰＰＭＰまたはＰＤＭＰの存在下で生長し破裂する。さらに放出された娘体の分裂小体は、赤血球に入り込んで、継続的な薬物の存在下で新しい環状体を形成する。このことは、寄生虫のスフィンゴミエリンシンターゼは、赤血球内での生長の最初の 30〜36時間において環状体及び栄養型に感染した赤血球細胞においてのみ、必要であるという結論を支持している。一つの脂質アナログがこれらの感受性段階においてどの部位に輸送されるかを検出するために、環状体及び栄養型をＰＤＭＰの蛍光アナログを用いて標識し、コンフォーカル顕微鏡で可視化した。５μＭのＣ₅ＤＭＢ−ＰＤＭＰを用いて標識した後期環状体／初期栄養型に感染した赤血球の一つの光学活性な切片が観察された。赤血球内のＴＶＭネットワークは、寄生体の周辺や寄生体の内部が顕著に標識されている。環状体と栄養型に感染した赤血球のスフィンゴミエリンシンターゼは、寄生体において検出されるのと同様にＴＶＭにおいても検出される。寄生体特異的なスフィンゴミエリンシンターゼ活性が、ＴＶＭの生長に必要であるかどうかを調べるために、赤血球内の生長が開始しないよう酵素を阻害された環状体感染赤血球を用いた。これらの環状体は、分裂体を５μＭのＰＰＭＰの存在下で未感染の赤血球とともにインキュベートすることによって得られ、それは分裂体の生長または栄養型の赤血球への侵入のいずれも遮断しないことが観察された。得られた環状体から薬物を洗浄除去した場合、培養物内で正常に生育し、それらが生存していることが示された。Ｃ₅ＤＭＢ−セラミドを用いて染色することによって得られる光学的に活性な切片が観察された。管状構造は赤血球内の大きな小胞に連結していると考えられる寄生虫の体内から広がっているのが観察された。ＰＰＭＰの存在下で形成される環状体では、赤血球内の構造は別個の部分であるらしく、３つ全ての切片でそれぞれ互いに分離している。細胞の20個の光学活性な切片を測定しても、隔離された構造の間の連結を示すことはできなかった。対照群とＰＰＭＰ処理群からランダムに選択された20個の細胞の全部で 240個の光学活性な切片は、前者には内部連結されたＴＶＭネットワークが存在すること、また後者には管状の連結部を顕著に欠いた蛍光の非関連「スポット」が存在することを確認した。したがって寄生虫のスフィンゴミエリン生合成活性の特異的な阻害により、ＴＶＭの内部連結された「卵管小胞組織」が、単離された赤血球内の成分、即ち環状体段階の寄生虫における「小胞」に変化するらしい。連続的なＰＰＭＰの存在下で、生活環の36時間までその細胞を生長させた場合、Ｃ₅ＤＭＢ−セラミドによって標識された赤血球内の構造は隔離されたスポットとして残る。対照の栄養型は、この段階の特徴である顕著に標識された環状のＴＶＭの広がりを示す。より小さい寄生虫では生育も遮断されることを示しており、それはＰＰＭＰがスクリーンの生長を遮断するという観察結果と一致する。スフィンゴミエリンシンターゼ生合成活性の阻害により、生育中の寄生虫で感染させた赤血球のＴＶＭにおける管状膜形態の出現は明らかに阻害されるが、赤血球内の空隙に予め存在する管状体は断片化されない。この酵素は、デノボの膜合成及びＴＶＭにおける管状の連結にとって必要である。マラリア原虫感受性スフィンゴミエリンシンターゼに対する阻害剤を用いることによって、予防的及び治療的な処置を行うことができることは、上記の結果から明らかである。阻害剤は、診断及び抗体の製造の際に用いられるマラリア原虫の感受性スフィンゴミエリンシンターゼを単離するために用いることができ、それは検定法においても用いることができる。組合せ療法を提供することによって、マラリア感染症の治療法をさらに確実に成功させることができる。この明細書に引用された全ての刊行物及び特許出願は、それぞれが個々に特別にかつ個別に参照として組み入れられているものとして、本明細書に参照として組み入れられる。前述した発明は、理解を明確にする目的で例示ないしは実施例の様式で説明して記載されているが、本発明の開示を参照することによりある種の変更または修飾を添付した請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく行うことができることは、当業者に容易に明らかとなろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ロウアーサビンアンナアメリカ合衆国カリフォルニア州パロアルトウォルターヘイズドライブ 256

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物のスフィンゴミエリンシンターゼ活性よりも実質的に強く阻害されるスフィンゴミエリンシンターゼ活性の存在を同定することを含む、試料中のマラリア原虫の存在を同定する方法。２．阻害剤が１−フェニル−２−アシル化−アミノ−３−モルホリノプロパノール−１である、請求項１に記載の方法。３．アシル化された基が10個〜18個の炭素原子からなるものである、請求項２に記載の方法。４．アシル化された基が16個の炭素原子からなるものである、請求項３に記載の方法。５．血液試料中の赤血球から蛋白質を単離し、該血液試料中のマラリア原虫の存在の指標として阻害剤感受性型のスフィンゴミエリンシンターゼを検出することを含む、血液試料中のマラリア原虫の存在を同定する方法。６．マラリア原虫の阻害剤感受性スフィンゴミエリンシンターゼを阻害する能力はあるが哺乳動物のスフィンゴミエリンシンターゼを阻害する能力はない、治療に有効な量のスフィンゴミエリンシンターゼ阻害剤を、哺乳動物の宿主に投与することを含む、哺乳動物の宿主におけるマラリア原虫の増殖を抑制する方法。７．阻害剤が１−フェニル−２−アシル化−アミノ−３−モルホリノプロパノール−１である、請求項６に記載の方法。８．アシル化された基が10個〜18個の炭素原子からなるものである、請求項７に記載の方法。９．アシル化された基が16個の炭素原子からなるものである、請求項８に記載の方法。 10．通常の治療用量の少なくとも10％の抗マラリア薬を宿主に投与することをさらに含む、請求項６に記載の方法。 11．阻害剤感受性のマラリア原虫スフィンゴミエリンシンターゼの阻害をもたらす有効量のスフィンゴミエリンシンターゼ阻害剤と、正常の治療用量の少なくとも10％の抗マラリア薬とを含む組成物。 12．阻害剤が１−フェニル−２−アシル化−アミノ−３−モルホリノプロパノール−１である、請求項11に記載の方法。 13．アシル化された基が10個〜18個の炭素原子からなるものである、請求項12に記載の方法。 14．アシル化された基が16個の炭素原子からなるものである、請求項13に記載の方法。 15．非経口投与用に製剤化された、請求項11に記載の組成物。 16．経口投与用に製剤化された、請求項11に記載の組成物。