【発明の詳細な説明】
慢性関節リウマチを治療するためのメトトレキセートとテニダップ
との組合せ物
本発明は、慢性関節リウマチの治療法、および慢性関節リウマチに対する有利
な治療薬である、テニダップ（tenidap）とメトトレキセートとを含んだ医薬用
組成物に関する。
参照文献
本明細書において引用した学術文献を以下に列記する。明細書本文中では、著
者と報告年が記載してある。
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発明の背景
Kadinによる米国特許第4,556,672号は、３-位にアシル置換基を有する特定の
２−オキシインドール−１−カルボキサミド化合物を開示しており、これらはシ
クロ−オキシゲナーゼ（CO）酵素およびリポキシゲナーゼ（LO）酵素の阻害剤で
ある。これらの化合物は哺乳動物における鎮痛剤として有用であり、また痛み（
例えば、手術や外傷から回復する患者が受ける痛み）を和らげたり又は取り除い
たりする際に有用である。これらの化合物はさらに、慢性病の症状（例えば、慢
性関節リウマチや変形性関節症に付きものの炎症や痛み）を軽くするために、哺
乳動物への長期にわたる投与に対して有用である。Kadinは特に、哺乳動物被験
体における鎮痛反応を顕現させる方法、および哺乳動物被験体における炎症性疾
患を治療する方法を特許請求しており、後者の方法は、前記哺乳動物被験体を２
−
オキシインドール−１−カルボキサミド類から選ばれる有効量の化合物で治療す
ることを含む。
テニダップナトリウム、すなわち(２)(Ｚ)−５−クロロ−３−(α−ヒドロキ
シ−２−テニリデン)−２−オキソ−１−インドリン−カルボキサミドのナトリ
ウム塩は新規の抗リウマチ薬であり、オキシインドール類という新しい薬物種の
最初のものである。テニダップナトリウムは、非ステロイド系の抗炎症薬（NSAI
D）、疾患緩和性の抗リウマチ薬（DMARD）、およびコルチコステロイドを含めた
他のいかなる抗リウマチ薬とも化学的には無関係である。現在、慢性関節リウマ
チ（RA）の治療に対する研究が行われている。
テニダップは、シクロオキシゲナーゼの作用を抑制するけれども（Cartyら、1
988; Moilanenら、1988）、シトキンを調節する能力においてNSAIDとは明らかに
異なる（Looseら、1993）。テニダップは、幾つかのインビトロではシトキンの
生成と活性を抑制することが示されている。例えばテニダップは、培養されたヒ
トの末梢血液単球において、インターロイキン(IL)−１、IL−６、および腫瘍壊
死因子アルファ（TNF(α)）の生成を抑制するが（Sipeら、1992）、同じ実験に
おいてナプロクセンはこうした効果を示さない。シトキン媒介による急性期タン
パク質（acute phase proteins; APPs）の生成は、ヒトのHep3B細胞においては
テニダップによって抑制され（Pazolesら、1993）、またテニダップは、豚の軟
骨外植片中の軟骨に対するIL-1媒介による異化作用を実質的に抑制する（Dingle
ら、1993）。テニダップは、シトキンを含めた多種類の薬剤によって刺激される
マウス頭蓋冠中の骨吸収を抑制する（Al-Humidanら、1991）。こうした事実は、
RAにおける疾患プロセスの根底にあるシトキン媒介事象にテニダップが影響を及
ぼすということを示している。
臨床実験によって、テニダップがRAの治療に有効であることが判明している。
テニダップ（120mg/日）とジクロフェナック（Wylie，1993）、ヒロキシカム（K
raskaら、1993）、またはナプロクセン（Kirbyら、1993）とを比較した実験にお
いて、テニダップで治療した患者は、臨床的および生化学的な効力パラメーター
において、NSAIDで治療した患者より大幅な改良を示した。テニダップはさらに
、
オーラノフィンとジクロフェナックのDMARD/NSAID組合せ物（Leeming，1993）、
およびヒドロキシクロロキンとピロキシカムのDMARD/NSAID組合せ物（Kraska，1
993）と同程度に有効であることがわかっている。これら実験の全てにおいて、
テニダップは、疾患活性、急性相タンパク質（APP）、Ｃ−反応性タンパク質（C
RP）、および血清アミロイド（SAA）のマーカーの血清濃度の大幅な低下をもた
らした。テニダップは、テニダップ治療後の急性相タンパク質、ESR、およびIL-
6のレベルがより低いという点でピロキシカム等のNSAIDとは異なり、また急性相
タンパク質やIL-６に及ぼすテニダップのこれらの影響は、たとえ患者がプレド
ニゾン、メトトレキセート、あるいはこれら両方によるバックグラウンド治療を
受けているとしても起こる（Littmanら、1995）。Ｘ線撮影法によって評価され
る疾患進行状況がCRPの血清濃度に関係していること、およびDMARD（NSAIDでは
ない）がRA患者におけるCRPのレベルを低下させることが多くの実験により示さ
れた（Amosら、1977; Dawesら、1986; Mallyaら、1982; van Leeuwenら、1994）
。CRPの血清レベルに及ぼすテニダップ治療の影響は、テニダップがシトキンの
作用を調節する能力を有するというさらなる証拠をもたらす。なぜなら、シトキ
ン（特にIL-6）はAPPの放出を媒介することが見いだされているからである（Hei
nrichら、1990）。
メトトレキセート、すなわち(２)Ｌ−(＋)−Ｎ−[ｐ[[(２,４−ジアミノ−６
−プテリジニル)メチル]メチルアミノ]ベンゾイル]グルタミン酸は葉酸の代謝拮
抗物質であり、最初は抗腫瘍薬として使用されたが、幾つかの非悪性疾患（特に
、乾癬や慢性関節リウマチなど）の治療に対してより少ない投与量で使用される
ようになった（Horton，1990）。RAの治療に関してDMARD間の効力を調べた実験
のメタ解析により、メトトレキセートの効力は、金チオリンゴ酸ナトリウム、ス
ルファサラジン、およびペニシラミンと同等であるが、ヒドロキシクロロキンと
オーラノフィンはメトトレキセートより効力が劣る、ということがわかった（Fe
lsonら、1990）。RA患者に対しては、低投与量のメトトレキセートが臨床的に有
効であることがわかっている（Nordstromら、1987）。
発明の要約
本発明は、慢性関節リウマチを治療する方法を提供し、このとき前記方法は、
慢性関節リウマチの治療を必要とする患者に有効量のテニダップとメトトレキセ
ートを投与することを含む。
他の態様においては、本発明は、テニダップとメトトレキセートとを含んだ医
薬用組成物を提供する。
さらに他の態様においては、本発明は、テニダップとメトトレキセートの日用
量を含有した用量パックもしくは治療パック、あるいは決められた期間にわたっ
て投与すべきテニダップとメトトレキセートを組み合わせて含有した用量パック
もしくは治療パックを提供する。
発明の詳細な説明
RAの治療におけるメトトレキセートの使用は、その効力、作用速度、および安
全性の点からここ数年にわたってかなり増えてきている（Emery，1989）。しか
しながら、インドメタシン（Maiche，1986; Gabrielliら，1987）、ナプロキセ
ン（Singhら，1986）、およびジクロフェナック（Gabrielliら，1987）を含めて
、NSAIDと共投与したときのメトトレキセートの毒性について幾つかの報文があ
る。相互作用のメカニズムは明らかではないが、メトトレキセートのタンパク質
結合部位からの置き換え、あるいはメトトレキセートのクリアランスの低下をき
たすことになる腎臓への直接的な影響が原因であると思われる。メトトレキセー
トが種々の抗菌剤と相互作用するという証拠がある。例えば、ペニシリンはメト
トレキセートのクリアランスを著しく低下させる（Bloomら，1986）。メトトレ
キセートはさらに、抗腫瘍薬や免疫抑制薬（例えばシクロスポリン）と共投与し
たときに骨髄毒性および免疫抑制が増大する（Powlesら，1986）。このように、
メトトレキセートが薬物相互作用に対して潜在能力を有していることは明らかで
あり、したがってその薬物特異性の相互作用を評価しなければならない。
テニダップは、他の薬物との臨床的な相互作用を殆ど示さない（Pullar，1995
）。それにもかかわらず、テニダップの１つの作用はシクロオキシゲナーゼの作
用を阻害することであり、またシクロオキシゲナーゼ阻害剤は、共投与するとメ
トトレキセートの毒性とリンクするので、テニダップがメトトレキセートの代謝
を変
えるかどうかを調べることが必要であった。このことはとりわけ重要なことであ
る。なぜなら、RAに対する新しい治療法では多剤投与を行うのが好ましく(Wlike
とCloughにより概説，1991)、したがって両方の薬物の組合せ物を統合治療プロ
グラムの一部として使用して患者を治療できるからである。テニダップをメトト
レキセートと共投与したとき、メトトレキセートの投与量を調節する必要はなか
った。
テニダップは、慢性関節リウマチの患者に対し、滑膜組織中のストロメリシン
（STR）mRNAのレベルを低下させることが見いだされている。ストロメリシンmRN
Aのこうした変化はESRおよびCRPの変化と強く相関しており、このことはテニダ
ップによる治療の結果、関節の損傷が少なくなるということを示している。コラ
ゲナーゼに対して及ぼすテニダップの影響は、STRに対して及ぼす影響ほど大き
くはない。
メトトレキセートによる治療は、滑膜組織におけるCOL mRNAの発現を少なくす
ること、またSTR mRNAに対しては全く影響を及ぼさないことがわかっている（Fi
resteinら）。
テニダップとメトトレキセートとの組合せ物は、慢性関節リウマチの患者にお
いてCOL mRNAとSTR mRNAの発現を少なくするので、関節損傷の顕著な減少をもた
らす有利な治療薬となる。
テニダップとメトトレキセートは、例えば個別の錠剤の形で別々に、あるいは
医薬用組成物中における二成分の物理的混合物の形で投与することができる。
ヒト被験体に使用するとき、日用量は普通処方医師によって決められるが、一
般には、単独で使用にて処方する際のテニダップとメトトレキセートの用量以下
である。好ましい割合は、テニダップが一日当たり80〜120mg、およびメトトレ
キセートが一週間当たり一回にて2.5〜25mgである。
テニダップは酸性であり、塩基塩（base salt）を形成する。このような塩基
塩の全てが本発明の範囲内であり、これらは従来法にしたがって製造することが
できる。例えば、状況に応じて水性媒体、非水性媒体、または部分水性媒体中に
おいて、通常は化学量論比にて酸性物質と塩基性物質とを結合させることによっ
て、
あるいはある塩を別の塩で相互転換することによって容易に製造することができ
る。状況に応じて、濾過することにより、他の溶媒で沈澱させた後に濾過するこ
とにより、溶媒を蒸発除去することにより、あるいは水溶液の場合においては凍
結乾燥することにより塩を回収する。好ましいのはナトリウム塩である。本明細
書で言う“テニダップ”は遊離酸と塩基塩の両方を表している。
テニダップとメトトレキセートとの組合せ物は、慢性関節リウマチの症状を緩
和するために、そしてそれによる痛みを軽減させるために、哺乳動物に長期にわ
たって投与するのに有用である。
テニダップとメトトレキセートとの組合せ物を抗炎症薬または疾患緩和薬とし
て使用する場合、ヒト被験体に対し、それ単独で投与することも、あるいは好ま
しくは標準的な製薬学的手順にしたがって、医薬用として許容しうるキャリヤー
もしくは希釈剤と組み合わせて医薬用組成物の形で投与することもできる。こう
した組合せ物は、経口でも非経口でも投与することができる。非経口投与として
は、静脈内投与、筋内投与、腹膜内投与、皮下投与、および局所投与などがある
。
テニダップとメトトレキセートを含んだ医薬用組成物においては、キャリヤー
と活性成分との重量比は、通常は１:４〜４:１の範囲であり、好ましくは１:２
〜２:１の範囲である。しかしながら、それぞれのケースにおいて選定される比
は、活性成分の溶解性、意図する投与量、および正確な投与経路などのファクタ
ーによって異なる。
テニダップとメトトレキセートの経口使用に対しては、組合せ物は、例えば、
錠剤やカプセルの形で、あるいは水溶液もしくは懸濁液として投与することがで
きる。錠剤を経口使用する場合、通常使用されるキャリヤーとしてはラクトース
やコーンスターチなどがあり、普通はステアリン酸マグネシウム等の滑剤が加え
られる。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤はラクトースと乾燥コ
ーンスターチである。経口使用のために水性懸濁液が必要とされるときは、活性
成分を乳化剤や沈澱防止剤と組み合わせる。必要であれば、特定の甘味剤および
／または風味剤を加えることができる。筋内、腹膜内、皮下、および静脈内使用
の場合、通常は活性成分の無菌溶液を調製し、溶液のpHを適切に調節して緩衝剤
処理しなければならない。静脈内使用の場合は、溶質のトータル濃度を調節して
製剤を等張性にしなければならない。
テニダップとメトトレキセートの組合せ物をヒト被験体に使用する場合、日用
量は通常処方医師によって決定される。さらに、投与量は、個々の患者の年齢、
体重、および反応によって、ならびに患者の症状程度や投与する特性製剤の効能
によって異なる。一方、場合によってはこれらの限度を超えた投与量を使用する
ことが必要なときもある。
慢性関節リウマチの治療に対しては、テニダップは通常、一日１回、80〜120m
gの割合で投与する。メトトレキセートは通常、一週間に１回または２回、2.5〜
25mgの割合で投与する。当然のことながら、主治医であれば、特定のケースにお
いてはこれらの範囲を外れた投与量を使用することが望ましいことを見いだすで
あろう。
テニダップとメトトレキセートは、単一の剤形において同時に投与することも
、あるいは別々の剤形においても同時に投与することもできる。本発明は、はっ
きり区別された期間（例えば、一週間または一ヶ月）にわたって必要とされるテ
ニダップとメトトレキセートの投与量をもたらすよう設計された用量パックおよ
び治療薬パックを含む。一週一回の用量パッケージは、７服のテニダップと１ま
たは２服のメトトレキセート、あるいはこれとは別に、５または６服のテニダッ
プと１または２服のテニダップ・メトトレキセート組合せ物、を含有することが
できる、錠剤とカプセルが好ましい剤形である。
実施例１
方法
患者． 21才を越える年齢の男性と女性の慢性関節リウマチ外来患者は、本実
験に組み込むのに適格であった。これらの外来患者が、アメリカリウマチ協会の
RAに関する1987年の改定基準に適合し（Arnettら，1988）、活性のRAに罹ってい
れば（３ヶ月以上の期間にわたって）、そして本実験に組み込む前に、最低３ヶ
月にわたって7.5〜15mg/週という固定された単一用量の経口メトトレキセートを
摂取していれば、これらの患者を本実験に組み込んだ。女性の場合は、彼女ら
に対し、本実験を開始する前に少なくとも３ヶ月、安全な避妊処置を施さねばな
らなかった。
実験の前に、患者らは、充分な健康診断と12-リードECG（12-lead ECG）を受
けた。正確な医療経緯を確認し、臨床化学および血液学の評価のために血液サン
プルを採取した。患者が、公知の血液学的疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、内分泌腺
疾患、肺疾患、神経学的疾患、精神医学的疾患、または心臓血管疾患に罹ってい
れば、あるいはアスピリンや他のNSAIDに対して不耐性であれば、こうした患者
を除外した。さらに、スクリーニングにて下記のような実験室的異常性を示した
場合は、こうした患者も除外した：すなわち、SGOT、SGPT、またはアルカリ性リ
ン酸塩の濃度が２×ULNより大きい；ビリルビンのトータル濃度がULNに対し10％
より高い；白血球のトータルカウント数が3500細胞/mm3未満である；多形核細胞
のカウント数が1500細胞/mm3未満である；血小板のカウント数が100,000細胞/mm3
未満である；ヘモグロビンが、女性に対しては9.5g/dl未満であり、男性に対し
ては10.5g/dl未満である；クレアチニンのクリアランスが60ml/分以下である（C
ockcroftとGaultによる説明にしたがって算出，1976）；あるいはBUNがULNに対
し10％より大きい。Ｂ型肝炎表面抗原、尿中における薬物の存在、および出産年
齢の女性の妊娠に関する検討に入る前に患者をスクリーニングした。患者らはさ
らに、調査の開始時において、また各病院への入院前において、酒気検査が陰性
でなければならなかった。患者は、検討に入る前の少なくとも４週間にわたって
いかなる研究用薬物も摂取していてはならず（メトトレキセートは除く）、また
書面によるインフォームド・コンセントを行っておかねばならなかった。
プロトコル． これは、21日という期間にわたって行った、オープンラベルで
一定投与量による検討であった。検討に入る前に、少なくとも48時間という短い
半減期を有するいかなる従来のNSAIDも、また１ヶ月という長い半減期を有する
いかなる従来のNSAIDも、患者への投与を停止した。検討を開始する少なくとも
２ヶ月前にDMARD（メトトレキセートを除く）の投与を停止した。
各患者は、通常の一定投与量の経口メトトレキセートを摂取し続け、検討中は
これを変えなかったが、さらに120mgのテニダップナトリウムを毎日摂取した。
薬
物はすべて、一晩絶食後に経口投与した。各患者から０日目と21日目に、血液サ
ンプルと24時間尿サンプル（24-hour urine sample）を得た。これらのサンプル
を使用して、メトトレキセートの薬物動力学およびテニダップの血漿濃度を評価
した。０日目と21日目のメトトレキセート投与後に、患者を臨床研究ユニットに
24時間拘束した。
メトトレキセートの薬物動力学による評価： 血清。 メトトレキセートの濃
度を求めるための４mlの血清を得るのに充分な血液を、０日目と21日目のメトト
レキセートの投与の直前に、および投与の0.5、１、２、３、４、６、８、12、1
6、20、24、28、および32時間後に採取した。イオン交換クロマトグラフィーに
よってメトトレキセート濃度の分析が行われるまで（LankelmaとPoppe，1978）
、血清を−20℃に貯蔵した。アッセイの動的範囲（dynamic range）は2.5〜1000
ng/mlであった。１時間の後用量（post-dose）と４時間の後用量との間で採取し
た血清サンプルをプールし、これらのサンプルを使用してメトトレキセートの未
結合フラクション（fu）を測定した。
血清中におけるメトトレキセートの最大濃度（Ｃmax）およびメトトレキセー
トのＣmaxが達成される時間（ｔmax）を実験データから直接求めた。ターミナル
ログ−リニヤ相における濃度−時間曲線の最小二乗回帰分析を使用して、ターミ
ナル相速度定数（Ｋel）を求めた。半減期は0.693/Ｋelと算出された。
時間ゼロから時間Ｔ（存在する計量可能なメトトレキセートによる最後のサン
プリング時間）までの濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣ0-T）を、線形台形近
似法（linear trapezoidal approximation）を使用して求めた。時間Ｔから無限
大までのＡＵＣ（ＡＵＣT- ∞）をＣest/Ｋelと評価した（このときＣestは時間
Ｔにおける推定濃度である）。曲線の下の全面積（ＡＵＣ0- ∞）は、（ＡＵＣ0- ∞
＋ＡＵＣT- ∞）の合計値であると評価した。
メトトレキセートの薬物動力学による評価： 尿。 メトトレキセート投与後
の０日目と21日目に、最大24時間まで尿サンプルを採取した。３つの期間（０〜
４時間、４〜８時間、および８〜24時間）にわたって尿を採取した。各採取サン
プルから、50mlアリコートを抜き取ってクレアチニン、尿酸、全タンパク質、お
よびアルブミンの濃度を測定し、また別の50mlアリコートを抜き取って、イオン
交換クロマトグラフィーによるメトトレキセート濃度の分析前に−20℃で凍結さ
せた（LankelmaとPoppe，1978）。
腎クリアランス（ＣＬR）は、尿中に排出されたメトトレキセートの量（ＸＵ0 -24
）とメトトレキセート投与後の最初の24時間に対するＡＵ0-24との比である
と評価した。
血漿のテニダップ濃度。 血漿のテニダップ濃度を求めるための血液サンプル
を、１日目、２日目、および21日目の薬物投与の直前に、そして21日目の薬物投
与の24時間後に、ヘパリンで凝血防止したチューブ中に採取した。紫外線検知に
よるＨＰＬＣでテニダップの濃度を分析する（Gardnerら，1995）まで、血漿（
２ml）を−20℃で凍結させた。本アッセイの動的範囲は0.1〜40μg/mlであった
。
タンパク質への結合。メトトレキセートのタンパク質結合を調べるために、血
清の５mlアリコート（血清のメトトレキセート濃度を求めるために採取した１、
２、３、及び４時間ポイントからのサンプルをプールすることによって得られる
）に、0.1μCiのトリチウム化メトトレキセート（比放射能32.1mCi/mg; Amersha
m，USA）を補充した。ＹＭＴ膜（カットオフサイズ20,000kDa）（Amicon）を収
容した限外濾過装置中にこれらのサンプルを配置し、2000×ｇにて37℃で20分遠
心分離機にかけた。血清のアリコート（100μl）と限外濾過液のアリコート（10
0μi）を、５mlのシンチレーション流体中でカウントした（Ultima Gold，Packa
rd，USA）。プールした各血清サンプルに対し（同じことを３回）、また各限外
濾過液に対し（同じことを２回）、液体シンチレーションカウンター中で放射能
の量を測定した（Packard 2200，Packard，USA）。
メトトレキセートの未結合フラクション（fu）を、限外濾過液中の放射能の量
と等容積の血清中の放射能の量との比として評価した。
統計的な方法論と評価。ＡＵＣ0- ∞とＣmaxの値をメトトレキセートの12.5mg
用量に正規化した。これらの値を自然対数変換し、21日目における平均値と０日
目における平均値との比を90％信頼区間で解析した。ｔmax、Ｋel、およびＣＬR
に関して、21日目における未変換平均値と０日目における未変換平均値との差を
90
％信頼区間で解析した。
安全性。 １日目、７日目、14日目、および21日目においてテニダップを投与
する前に、そして21日目に投与した24時間後に、以下のような実験室的試験をス
クリーニングにて行った：すなわち、ディファレンシャルカウントおよび血小板
カウントによるＣＢＣ、顕微鏡による尿検査、および臨床化学。全ての被験者に
対し、スクリーニングにて、そして１日目と21日目の薬物投与の前に、12-リー
ドＥＣＧを得た。異常なＥＣＧを有した患者の場合は、本検討の組み込みまたは
継続から除外した。患者に対し、トライアル全体にわたって副作用があるかどう
かをモニターした。
結果
患者。 本検討に組み込んだ10人の患者（３人が男性、７人が女性）のうち、
８人の患者が本検討を完了した。人口統計学によるこれら患者のベースライン特
性を表Ｉに示す。ＡＲＡ分類によれば、患者はいずれも段階ＩまたはIIのＲＡに
罹っていた。２人の患者の検討を中止した。１人の患者は、治療に関連した副作
用（腹痛、むかつき、および嘔吐）のためにテニダップ治療の９日後に検討を中
止し、そしてもう１人の患者は、静脈ラインを確保できなくなったので20日目に
検討を中止した。
薬物動力学的パラメーター。 メトトレキセートの薬物動力学的パラメーター
に対する平均値を表IIに示す。平均Ｃmaxは、12.5mgの投与量に関して正規化す
ると、０日目に対して364.3ng/ml、そして21日目に対して305.6ng/mlであって、
このことは約16％の減少を示している。平均ｔmaxは、０日目に対して1.3時間で
あり、21日目に対して1.1時間であった。
メトトレキセートの平均Ｋelは、０日目に対して0.2169/時間であり、21日目
に対して0.1475/時であった。この減少は、０日目に対する3.2時間から21日目に
対する4.7時間への半減期増大に対応した。平均ＡＵＣ0- ∞は、メトトレキセー
トの12.5mg投与量に関して正規化すると、０日目と21日目の間で約６％増大した
。
メトトレキセートの平均ＣＬRは、０日目に対する115.3ml/分から21日目に対
する88.0ml/分まで約24％減少した。さらに、血清中の未結合メトトレキセート
の
平均パーセントは、０日目に対する33％から21日目に対する42％まで約26％増大
した。
血漿のテニダップコンセッション（plasma tenidap concession）。 血漿中
におけるテニダップの平均予備投与量濃度は、２日目の6.0μg/mlから21日目の9
.0μg/mlまで増大した。血漿中の予備投与量濃度の目視検査により、21日目に定
常状態が達成されていることがわかった。
安全性。 ３人の患者は、治療に関連した副作用を起こした（表IIIを参照）
。これら患者のうちの１人はひどいむかつきを起こし、腹痛と断続的な嘔吐を伴
ったので治療の検討を中止した。他の全ての副作用は、マイルドであるか又は中
程度であった。影響を受けた他の２人の患者のうち、１人の被験者は若干のむか
つきと中程度の消化不良を起こし、もう１人の被験者は若干の消化不良を起こし
た。報告された副作用はすべて治療に関連したものであると考えられた。
治療に関連すると考えられるような実験室的試験による異常はなかった。さら
に、検討中においては、ＥＣＧにおける明らかな傾向や明確な変化は認められな
かった。
実施例２
臨床検討の設計： 二重盲式でマルチセンターで12週間のクロスオーバー検討
を行い、６週間のピロキシカム（20mg/日）治療と、６週間のテニダップ（120mg
/日）治療における患者の生化学的および臨床的影響を比較した。プロトコル設
計の詳細とこの検討結果（49人の完了患者に基づいている）は既に報告されてい
る（Littman，1995）。これら49人の完了患者のうちの10人のサブセットに対し
て滑液のバイオプシーを行った。全体的な検討において、これらの生検患者は、
活性疾患（active disease）と1.5mg/dl以上のＣＲＰを示した。これらの患者は
さらに、活性膝関節滑膜炎に罹っており、３つの経皮的ニードル滑液バイオプシ
ーを12週間の検討期間にわたって受けることに同意した。これら10人の患者に対
するベースラインの人口統計学的データを表IVに示す。
患者は、ベースラインビジット（baseline visit）の前日に最後の投与を行っ
た後、それまでのＮＳＡＩＤ治療を中止するよう指示された。ベースラインにて
、患者を、テニダップまたはピロキシカムを使用する二重盲式治療にランダムに
割り当てた。最初の６週間（週１〜６）の治療後、患者に対し、洗浄することな
く他の薬剤を使用する６週間（週７〜12）の治療に変えた。ベースラインおよび
１、３、６、７、９、および12週にて患者を評価した。各ビジットにて、実験室
的安
全性の検討や標準的な臨床測定を行い、ＥＳＲ、ＣＲＰ、およびＳＡＡを測定し
、そしてシトキンを測定するための血漿を全てのビジット（１週と７週のビジッ
トを除く）において得た。ベースライン、最初の治療（６週）の終了時、および
二番目の治療（12週）の終了時において、滑液のバイオプシーを行った。各バイ
オプシーは、個々の患者に対して同じ膝関節から得た。滑液バイオプシーの結果
、およびこれらの結果と疾患活性の全身性マーカー（systemic marker）との関
係を以下に説明する。
統計的方法： テニダップ治療時およびピロキシカム治療時におけるｍＲＮＡ
の発現の変化量を算出し、予備治療レベルからのパーセント変化を各患者に関し
て求めた。しかしながら、これは洗浄期間のないクロスオーバー検討なので、そ
れぞれの治療時におけるｍＲＮＡ発現の変化は追加分析なしで与えられ、主要な
統計解析は、テニダップに対する最終値とピロキシカムに対する最終値との内部
患者比較（a within patient comparison）に基づいて行った（2-tailed paired
T-test）。ｍＲＮＡの発現に対しては、相当な期間にわたって影響は見られな
かった。
内部患者治療差データ（the within patient treatment difference data）を
使用して、滑液組織であるｍＲＮＡと、ＥＳＲレベル、ＣＲＰレベル、および血
漿シトキンレベルとの間の関係を最小二乗回帰分析によって評価した。最後に、
最初の６週間治療に対する10人の患者からのデータ（各患者から２回以上データ
を使用することは避ける）および最小二乗回帰分析を使用して、我々は、メタロ
プロテイナーゼとＴＭＰ ｍＲＮＡの発現量の変化と、シトキン、ＣＲＰ、およ
びＥＳＲの変化との相関性を調べた。すべての回帰分析に対して、回帰線の勾配
（ゼロとは異なる）の有意性を調べた。
Ｃ-反応性タンパク質（ＣＲＰ）と血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）： 速度比濁
法アッセイを使用して、中央研究所（SmithKline Bio-Science Laboratories）
により血清サンプルに対してＣＲＰを測定した。本アッセイの下限は0.1mg/dlで
あり、これより低い値は0.09mg/dlであると考えられた。
ウェスターグレン（Westergren）赤血球沈降速度（ＥＳＲ）： 患者の訪問時
に、局部的にＥＳＲを測定した。
シトキンのアッセイ： ＩＬ-６、ＩＬ-１β、及びＴＮＦαに対するＥＬＩＳ
Ａアッセイを前述のように行った（Littman，1995）。特定の抗体を使用してシ
トキンの読み取り値が完全に無効化されること、本アッセイがＲＡ血漿中に加え
られたシトキンを100％検出できること、および全ての読み取り値が標準曲線の
直線部分に位置することを確認することによって、先ず最初に全てのシトキンア
ッセイ法を有効にした。全ての血漿サンプルを冷凍遠心分離機（４℃）中での分
離によって新たに得て、試験するまで−70℃で冷凍保存した。ある患者からのサ
ンプルも全て一緒に分析した。ＩＬ-６とＩＬ-１βに対する検出範囲は１〜190p
g/mlであった。１pg/ml未満の値は0.9pg/mlとして処理した。ＴＮＦαアッセイ
に対する範囲は４〜150pg/mlであり、４pg/ml未満の値は3.9pg/mlとして処理し
た。
滑液組織： 14−ゲージのParker-Pearsonニードルを使用して（１回の処置当
たり５〜10ピース）、各患者における同じ膝関節に対して経皮的な滑液バイオプ
シーを行った。組織を２−メチルブタンと液体窒素の中でスナップ凍結させ、使
用するまで−70℃で貯蔵した。凍結セクション（４μm）を４％パラホルムアル
デヒド中に固定し、全く同じ２つもしくは３つのセクションと関節の隣接エリア
からのセクション（同じ処置で得られる他のピース）を一緒に処理した。さらに
、同じ患者から異なった時間にて採取したバイオプシーも、一緒に処理した（７
）。
その場での雑種形成（in situ hybridization）： 各患者からのバイオプシ
ースライドをシーケンスに関してブラインドにし、一緒に処理した。標識付けし
たアンチセンス、ならびにコラゲナーゼ（ＣＯＬ）、ストロメリシン（ＳＴＲ）
、およびメタロプロテイナーゼ−１（ＴＭＰ）の組織インヒビターに対するセン
スプローブ（sense probe）を使用して、前述のように（Littman，1995）その場
での雑種形成を行った。同様に、対照標準として、アクチン（ＡＣＴ）ｍＲＮＡ
に対して特異的なリボプローブによる雑種形成を行った。写真エマルジョン（ph
otographic emulsion）を施し、スライドを現像した。オートラジオグラフィー
処理した後、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。前述のように（Littma
n，1995）、コンピューター援用画像解析を使用して、グレインによって覆われ
た滑
液ライニングのエリアを定量化した。各バイオプシーに対し、３〜４つの個体組
織サンプルからの滑液脈管内膜ライニングの５つの代表的区域全部を分析し、平
均値を算出した。これらの平均値を、平均のＣＯＬ、ＳＴＲ、またはＴＭＰグレ
インエリアを隣接セクション上の平均ＡＣＴグレインエリアで除して得られる比
として表すことによって、結果を正規化した。
炎症スコア（inflammation score）： 滑液の炎症を前述のように分析した（
Littman，1995）。簡単に言えば、炎症スコアとは、３つの成分、すなわち滑液
ライニングの厚さ（１−２細胞＝０，２−４細胞＝１＋，５−８細胞＝２＋およ
び＞８細胞＝３＋）、サブ脈管内膜単核細胞への浸潤（５％未満のフィールド＝
０，５−33％＝１＋，33−67％＝２＋および＞67％＝３＋）、およびリンパ性凝
集体（非存在＝０、および存在＝１＋）を合わせたものである。各組織を２回読
み取り、２つのスコアの平均値を最終炎症スコアとして使用した。
結果
ＣＯＬ、ＳＴＲ、およびＴＭＰ ｍＲＮＡの発現の変化： テニダップ治療中
の10人の患者およびピロキシカム治療中の７人の患者から、６週間の治療前と治
療後の充分なバイオプシーが得られた。各被験者に対する各治療におけるＳＴＲ
、ＣＯＬ、およびＴＭＰｍＲＡに対するアクチン−正規化された値の変化を、予
備治療値（pretreatment value）のパーセントとして表示した。テニダップ治療
中の10人の患者のうち７人において、またピロキシカム治療中の７人の患者のう
ち１人において、ＳＴＲ ｍＲＮＡが減少した。テニダップの減少は23％〜96％
の範囲であったが、３人の患者は大幅な増大を示した。ピロキシカム治療中、１
人の患者を除く全ての患者において、ＳＴＲ ｍＲＮＡのレベルが増大した。一
貫した治療パターンをもたない患者間では、ＣＯＬおよびＴＭＰ ｍＲＮＡの変
動がより大きかった。
ｍＲＮＡの発現： 内部患者比較（within patient comparison）： ｍＲＮ
Ａの発現に及ぼすテニダップとピロキシカムの影響の違いによる治療差（treatm
ent differences）を、両方の治療後に充分なバイオプシーを行った７人の患者
において評価した。値が負であるということは、当該患者においては、ピロキシ
カム治
療後に比較してテニダップ治療後において、ｍＲＮＡの発現がより少なくなった
ということを示している。ＳＴＲ、ＣＯＬ、及びＴＭＰに対するＡＣＴ-正規化
した結果を表Ｖに示す。ＳＴＲ ｍＲＮＡに対する平均・メジアン治療差は約−2
.9であるが、ＣＯＬとＴＭＰに対する治療差はほとんどゼロに近い、という点に
留意しなければならない。さらに、テニダップ治療後の値は、ピロキシカム治療
後の値に比較してかなり低かった（ｐ＝0.037，2-tailed paired t-test）。
この知見がＡＣＴ ｍＲＮＡレベルの系統的変化によるものではなかったこと
、またＳＴＲ ｍＲＮＡもＴＭＰ ｍＲＮＡによって正規化されたことを理解して
おかなければならない。７人の患者のうち６人に対しては治療差が負の値であり
、１人の患者だけがピロキシカム治療後により低いＳＴＲ/ＴＭＰを示した。し
たがって、テニダップとピロキシカムの及ぼす影響間の主要な差は、ＳＴＲ ｍ
ＲＮＡのレベルに対する差であった。
ベースラインからのパーセント変化の相関性： 少なくとも最初の２つのバイ
オプシーを行った10人の患者において、６週間に対するベースラインから滑液ｍ
ＲＮΛの変化を評価することができた（治療を無視して）。ＳＴＲ ｍＲＮＡの
変化は、ＥＳＲの変化（Ｒ＝0.853，ｐ＝0.0035）及びＣＲＰの変化（Ｒ＝0.734
，ｐ＝0.016）と強く相関していた。滑液ＳＴＲ ｍＲＮＡの変化とシトキンのレ
ベルとの強い関連性、あるいはＣＯＬもしくはＴＭＰ ｍＲＮＡの発現と急性相
およびシトキンレベルとの強い関連性は認められなかった。
治療差の相関性： ＣＯＬ ｍＲＮＡと血漿ＴＮＦαに対する治療差は強い相
関性を示した（Ｒ＝0.877，ｐ＝0.022）。ＣＯＬ、ＳＴＲ、またはＴＭＰに対す
る治療差と、他のシトキン、ＥＳＲまたはＣＲＰに対する治療差との間に強い相
関性は見られなかった。
実施例３
テニダップのナトリウム塩とメトトレキセートとを含有した経口カプセル剤形
下記の成分をブレンドし、875mlの水で湿潤粒状化し、そして最後に乾燥して
水分を５％にした（カールフィッシャーによる）。
テニダップのナトリウム塩 590ｇ（テニダップ遊離酸550ｇ）
メトトレキセート 55ｇ
微結晶質セルロース（Avicel PH101） 885.75ｇ
水和コーンスターチ 236.25ｇ
ポビドン（PVC-30） 105.00ｇ
乾燥し、湿潤粒状化した粉末を、さらに下記の成分とブレンドした：
スターチグリコール酸ナトリウム（Explotab） 210.00ｇ
ステアリン酸マグネシウム 42.00ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム 21.00ｇ
100mgのテニダップと10mgのメトトレキセートを含有した軟質ゼラチンカプセ
ル（最終ブレンド物の重量は385mg）を従来のカプセル充填機により作製した。
【手続補正書】
【提出日】１９９７年１１月１０日
【補正内容】
特許請求の範囲を次のように補正する。
『１． テニダップとメトトレキセートとを含んだ医薬用組成物。
２． 限定された期間にわたって投与すべきテニダップとメトトレキセートの
用量を含んだ用量パックまたは治療パック。
３． 前記の限定された期間が１週間である、請求項２記載の用量パックまた
は治療パック。
４． ７用量のテニダップと１または２用量のメトトレキセートとを含んだ、
請求項３記載の用量パックまたは治療パック。
５． テニダップの用量と請求項１記載の医薬用組成物の用量とを含んだ用量
パックまたは治療パック。
６． テニダップの５または６用量と、テニダップとメトトレキセートの組合
せ物の１または２用量とを含んだ、請求項５記載の用量パックまたは治療パック
。』