JPH10506792A - 方 法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 プセウドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）種の微生物でジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体の混合物を処理することを含むジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体の混合物を分割する方法。分割したジヒドロキシジヒドロインデン類は医薬および農薬のような生物学的に活性な化合物の合成に有用な中間体である。

Description

【発明の詳細な説明】 方法 本発明はラセミ体のジオール（ｄｉｏｌ）類の分割方法、特にラセミ体のシス −ジオール（ｃｉｓ−ｄｉｏｌ）類の分割方法，より詳しくはラセミ体の芳香族 シス−ジオール類、ラセミ体の脂環式シス−ジオール類およびラセミ体の複素環 式シス−ジオール類、具体的にはジヒドロキシジヒドロインデン（ｄｉｈｙｄｒ ｏｘｙｄｉｈｙｄｒｏｉｎｄｅｎｅ）類、より具体的にはビシナル（ｖｉｃｉｎ ａｌ）−シス−ジヒドロキシジヒドロインデン類の分割方法に関する。 分割したジヒドロキシジヒドロインデン類は医薬や農薬のような生物学的に活 性な化合物を合成するための有用な中間体である。 分割したジオール類、具体的にはジヒドロキシジヒドロインデン類、更に具体 的にはビシナル−シス−ジヒドロキシジヒドロインデン類を、適当な微生物を用 いる生物変換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって高度のエナンチ オマー過剰率（ｅｎａｍｔｉｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ：ｅ．ｅ．）でかつ良 好な総括収率で都合よく製造できることが今回見いだされた。 本発明はプセウドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ） 種の微生物を用いてジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体（ｅｎａｎｔｉｏ ｍｅｒ）類の混合物を処理することを含むジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異 性体類の混合物の分割方法を提供する。 ジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体類の混合物は、好ましくは、一般式 （１）の化合物を含む。 式中、ＲおよびＲ⁴はそれぞれ独立してＨ，ハロゲン、−Ｎ₃、−ＯＨ，−ＣＮ， アルキル、アルケニル、アリール、−ＣＸ₃、−ＯＲ¹、−ＳＲ¹、−ＮＲ¹Ｒ²、 −ＰＲ¹Ｒ²、−ＣＯＲ¹、−ＣＯ₂Ｒ¹、その内、Ｘはハロゲン、並びにＲ¹および Ｒ²はそれぞれ独立してアルキル、アリール、アルケニルまたはアルアルキル（a ralkyl）である。 Ｒ，Ｒ¹、Ｒ²およびＲ⁴であらわしたアルキル基、アルケニル基、アリール基 およびアルアルキル基はそれぞれ−ＮＯ₂、−ＣＮ，−Ｆ，−Ｃｌ，−Ｂｒ，− Ｉ，−Ｃ_1-6−アルキル、−Ｃ_1-6−アルコキシ、−ＣＦ₃、−ＯＨ，−ＯＲ³から 選択し、置換されてもよく、その場合Ｒ³はアルキル、アリール、アルケニルま たはアルアルキル基である。 Ｒ，Ｒ¹，Ｒ²、Ｒ³またはＲ⁴の１つがアルキルの時、好ましくはＣ_1-10−アル キル、より好ましくはＣ_1-6−アルキル、特にＣ_1-4−アルキルである。 Ｒ，Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³またはＲ⁴の１つがアルケニルである時、好ましくはＣ_2-10 アルケニル、より好ましくはＣ_2-6−アルケニルである。Ｒ，Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³また はＲ⁴の１つがアリールの時、フエニル基であるのが好ましい。 Ｒ¹，Ｒ²またはＲ³の１つがアルアルキルである時、好ましくはＣ_1-6−アルキ ルフエニル、より好ましくはベンジル基である。 ＲおよびＲ⁴はそれぞれ独立して好ましくは−Ｈ，−Ｆ，−Ｃｌ，−Ｂｒ，− Ｉ，−Ｎ₃、−ＯＨ，−ＣＮ，アルキル、アルケニル、アリール、−ＣＸ₃、−Ｏ Ｒ¹、−ＳＲ¹または−ＣＯＲ¹であり、式中、Ｘはハロゲンであり、Ｒ¹はアルキ ル、アリール、アルケニルまたはアルアルキルであって、より好ましくは，−Ｈ ，−Ｆ，−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ，−Ｎ₃、−ＯＨ，−ＣＮ，−Ｃ_1-6−アルキル、 Ｃ_2-6−アルケニル、フエニル、−ＣＦ₃、−ＣＣｌ₃、−ＯＣ_1-6−アルキル、− ＳＣ_1-6−アルキルまたは−ＣＯＣ_1-6−アルキルであり；並びに特に−Ｈ，−Ｆ ，−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ，−Ｎ₃、−ＯＨ，−ＣＮ，−ＣＨ₃、−Ｃ₂Ｈ₅、−ＯＣ Ｈ₃、−ＳＣＨ₃または−ＣＯＣＨ₃である。 式（１）の化合物は好ましくは式（２）の化合物である。 式中、ＲおよびＲ⁴は前に定義した通りである。 式（１）と式（２）の特に好ましい化合物は、Ｒが前に定義した通りであり、 Ｒ⁴がＨか、アルキルまたはアルコキシである化合物である。 Ｒが−Ｈ以外の置換基である場合、Ｒが結合している炭素原子はキラル中心で ある。本発明は５員環の１位、２位および３位に３個のキラル中心を持ち、それ 故に、本発明の更に別の特徴を成すジヒドロキシジヒトロインデン類を分割する 方法を提供する。 Ｒ、Ｒ⁴またはＸの１つがハロゲンである場合、好ましくは、−Ｆ，−Ｃｌ， −Ｂｒまたは−Ｉ，より好ましくは−Ｆ，−Ｃ１または−Ｂｒである。 本願方法は好ましくは水性の媒質中で、より好ましくは緩衝化された水性の媒 質中で実施する。適当な緩衝剤は無機物であっても有機物であってもよく、好ま しくは媒質のｐＨを４から９の範囲に、より好ましくは６から８の範囲に、特に ｐＨ７に調整する緩衝剤である。緩衝剤は好ましくは無機物、より好ましくはア ルカリ金属のリン酸塩、特にリン酸カリウムである。特に適当な水性の媒質は０ ．１Ｍリン酸カリウムである。 もしそう望むならば、ＮＡＤＨ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）再循環を提供する補基質（ｃｏ−ｓｕｂｓｔｒａｔ ｅ）を必要に応じて水性の媒質に加えてもよい。好ましい補基質はピルビン酸ナ トリウムのようなα−ケト酸、およびエタノール、イソプロパノールまたはグル コースのようなアルコールである。 本発明の方法は好ましくは０℃から１００℃の温度、より好ましくは２０℃か ら４５℃，特に２８℃から３２℃の温度で実施することが好ましい。 反応が２、３時間から数多くの日数までのうち適当な期間続行した後に、例え ば、遠心分離法で微生物を除却すること、および／またはその反応物を５℃未満 まで冷却すること、などの適当な手段によって反応を終結することが可能である 。 生成物は、酢酸エチルのようなエステルを用いて溶媒抽出により反応混合物か ら単離してもよい。生成物は、カラムクロマトーグラフィーのような任意の好適 な手段、例えば、溶離液としてメタノールまたはメタノールとジクロロメタンと の混合物を用いるシリカゲル若しくはキーゼルゲル（Kieselgel）Ｃ６０からの 溶離によって、または酢酸エチル／ヘキサンのようなエステル／アルカンの混合 物を用いる再結晶法によって精製してもよい。 ジヒドロキシジヒドロインデン混合物は、好ましくは、シス−ジヒドロキシジ ヒドロインデン鏡像異性体の混合物、並びに更に好ましくは、シス−ジヒドロキ シジヒドロインデン鏡像異性体のラセミ体混合物である。好ましいジヒドロキシ ジヒドロインデン混合物は、一般式（１）また（２）においてＲおよびＲ⁴が両 方ともＨであるジヒドロキシジヒドロインデン混合物である。プセウドモナス・ プチダ種の選択は、鏡像異性体の一方の不斉分解（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｄｅ ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を可能にする。それ故、本発明の最初の好ましい具体例は 、シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデン類の混合物をプセウ ドモナス・プチダＮＣ１ＭＢ８８５９で処理してシス−［１Ｓ：２Ｒ］−ジヒド ロキシ−１，２−ジヒドロインデンを生成することである。 本発明の第２の好ましい具体例は、シス−１，２−ジヒドロキシジヒドロイン デン類の混合物をプセウドモナス・プチダＮＣ１ＭＢ１１７６７またはＮＣＩＭ Ｂ１２１９０で処理してシス−［１Ｒ：２Ｓ］−ジヒドロキシ−１，２−ジヒド ロインデンを生成することである。 以下の実施例によって、本発明を更にくわしく説明する。実施例１ プセウドモナス・プチダＮＣ１ＭＢ８８５９を用いる生物変換 １．微生物源（Source of microorganism） プセウドモナス・プチダＮＣＩＭＢ８８５９（以後、ＮＣＩＭＢ８８５９と記 す）をザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マ リン・バクテリア・リミテッド、エイビー２ １アールワイ、スコットランド、 アバディーン、セント マシャール ドライブ ２３（The Nationa1 Co11ectio ns of Industrial and Marine Bacteria Ltd.，23，St Machar Drive，Aberdeen ,Scot1and,AB2 1RY）から凍結乾燥培養物として得た。 ２．ＮＣＩＭＢ８８５９菌株の増殖 ＮＣＩＭＢ８８５９を、固体のナフタレンを炭素源として加えた定められた最 少培地上で増殖させた。最少培地は下記のものを含んでいた： ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．９６ｇ／ｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．２３ｇ／ｌ ＮＨ₄Ｃｌ ３．００ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．４０ｇ／ｌ 微量元素溶液 １．９ｍｌ／ｌ 微量元素溶液は下記のものをを含んでいた： Ｎａ₂ＥＤＴＡ ５０．００ｇ／ｌ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２．２０ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂ ５．５４ｇ／ｌ ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ ５．０６ｇ／ｌ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ５．００ｇ／ｌ （ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂Ｏ １．１０ｇ／ｌ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ １．５７ｇ／ｌ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ １．６１ｇ／ｌ 構成成分は上記の順番で溶解して溶液とした。ｐＨは上記ＥＤＴＡ塩を加えた 後、並びに最後の成分を加えた後に２Ｍ ＫＯＨを加えてｐＨ６．０になるよう に調整した。 殺菌（ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔｉｏｎ）後、２ｇ／ｌのナフタレンを唯一の炭素 源として最少培地に加えた。培養物にＮＣＩＭＢ８８５９株の寒天平板からの単 一のコロニー、または、ＮＣＩＭＢ８８５９株菌のナフタレン増殖液体培養物の いずれかで接種した。 オービタルシェイカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）（３００ｒｐｍ）に のせた４００ｍｌの最少培地を含む複数の２リットルのシェイクフラスコ（ｓｈ ａｋｅｆｌａｓｋ）中で３０℃でバッチ培養によりＮＣＩＭＢ８８５９を増殖さ せた。生物変換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）に利用する前に、後期指 数的生長相（ｌａｔｅ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｇｒｏｗ ｔｈ）においてＮＣＩＭＢ８８５９混合物を採取し、この混合物を初めにグラス ウールを通してろ過し、余分のナフタレンを取り除いた。 ３．（１Ｒ：２Ｓ／１Ｓ：２Ｒ）−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロイ ンデンのラセミ体の製造 水（２．５ｃｍ³）、アセトン（５ｃｍ³）およびｔｅｒｔ−ブタノール（１． ５ｃｍ³）の混合体中にあるインデン（０．５ｇ，４．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液 に、４−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（０．６ｇ，５．９ｍｍｏｌ）および 四酸化オスミウムの四塩化炭素溶液（０．００５ｇ／０．５ｃｍ³）を加えた。 反応混合物を室温で３日間撹拌した後で、メタ重亜硫酸ナトリウムの飽和水溶液 （０．５ｃｍ³）を加え、撹拌をもう一時間継続した。反応混合物を水（５０ｃ ｍ³）で薄め、酢酸エチル（２ｘ５０ｃｍ³）で抽出し、硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ ＳＯ₄）で乾燥した。有機相の抽出物から溶剤を減圧蒸留すると、粗製の（１Ｒ ：２Ｓ／１Ｓ：２Ｒ）１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンの灰色 がかった白色のふわふわした結晶（０．６３ｇ，９７％）が得られた（融点：９ ８−１００℃）． ４．シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンのラセミ体の生物 変換 上記の工程２の後で得られたＮＣＩＭＢ８８５９混合物を遠心分離機にかけて （８ｋ ｒｐｍ，１５分，２５℃）細胞ペレットを得た。次いでこの細菌細胞を ０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再度懸濁させて、６００ｎｍ で３．０８の最終光学濃度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を得た。それか ら、（既に緩衝液に溶解した）ラセミ体のシス−１，２−ジヒドロキシ−１，２ −ジヒドロインデン基質を反応混合物に加えて０．４２ｇ／ｌの最終濃度を得た 。 ピルビン酸ナトリウムを補基質として加えた。３８０ｃｍ³の反応容量に対し て、１５．２ｃｍ³の１０％ピルビン酸ナトリウム溶液を加え３５ｍＭの最終濃 度を得た。 生物変換混合物（３９５．２ｃｍ³）をオービタルシェイカー（３００ｒｐｍ ）にのせた２リットルのシェイクフラスコ中において３０℃で２４時間インキュ ベートした。この時間の終わりに、遠心分離によって（８ｋ ｒｐｍ，１５分， ４℃）反応を停止させ、生成物を精製する前に上澄み液を４℃で保存した。 ５．生成物の精製 上記の工程４で得た上澄み液を減圧下でその重量の１／５まで濃縮し、その濃 縮液を塩化ナトリウムで飽和させた。この飽和溶液を酢酸エチルで２回（２ｘ８ ０ｃｍ³）抽出し、抽出液を一緒にして無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで蒸 発乾固した。粗生成物を酢酸エチル／ヘキサンで再結晶し、シス−［１Ｓ：２Ｒ ］−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデン（３５％，＞９８％ｅ．ｅ．）を 得た（このｅ．ｅ．値はジメチルテルフタル酸エステル誘導体類の¹Ｈ−ＮＭＲ 分析およびキラル固定相高速液体クロマトグラフイー（ｃｈｉｒａｌ ｓｔａｔ ｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ）によって得た）。 ６．ラセミ体の３−置換シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデ ン類の生物変換 複数のラセミ体の基質（ｒａｃｅｍｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、すなわち、 ［１Ｓ：２Ｒ：３Ｒ／１Ｒ：２Ｓ：３Ｓ］−３−メチル−シス−１，２−ジヒド ロキシ−１，２−ジヒドロインデン，または［１Ｓ：２Ｒ：３Ｓ／１Ｒ：２Ｓ： ３Ｒ］−３−メチル−シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデン （対応するアルケンである１−メチルインデンのＯＳＯ₄酸化によって得られた ）の個々の部分動力学的分割（ｐａｒｔｉａｌ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕ ｔｉｏｎｓ）を、プセウドモナス・プチダＮＣＩＭＢ８８５９を用いて、上記工 程 ４において記載した条件と同様の条件下で、但しより短い生物変換時間（１６時 間）にわたって実施した。回収した複数の基質は、各々の場合において、１種の 鏡像異性体、すなわち、（−）−［１Ｓ：２Ｒ：３Ｒ］（５０％ｅ．ｅ）および （＋）−［１Ｓ：２Ｒ：３Ｓ］（４８％ｅ．ｅ）の含有量が高められ、キラル固 定相ＨＰＬＣ分析によればそれぞれ３０％および５４％の収率であることが分か った。ラセミ体のシス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンに関 するこの酵素を触媒とする動力学的分割方法の時間−進行（ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒ ｓｅ）研究によって、十分な時間と十分に高い細胞密度（ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉ ｔｙ）が与えられれば、全分割（ｔｏｔａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を達成す ることが可能であることが示された。ラセミ体基質である［１Ｓ：２Ｒ：３Ｒ／ １Ｒ：２Ｓ：３Ｓ］−３−メチル−シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒ ドロインデンおよび［１Ｓ：２Ｒ：３Ｓ／１Ｒ：２Ｓ：３Ｒ］−３−メチル−シ ス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロインデンの動力学的分割を最適化 する同様な試みはいずれについてもなされていないが、全分割は後者のタイプの 最適化を必要とするであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ボイド，デレク・レイモンド イギリス国ノーザン・アイランド，ベルフ ァースト ビーティー９ ６エルキュー, マローン・ロード，メアリーヴィル・パー ク 91 (72)発明者 ダルトン，ハワード イギリス国ウォーリックシャー シーブイ 23 ８キュービー，ロング・イチントン, シェイカーズ・レーン，グローヴズ・ミル （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プセウドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）種の 微生物でジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体の混合物を処理することを含 むジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体の混合物を分割する方法。 ２．ジヒドロキシジヒドロインデン鏡像異性体の混合物はシス−ジヒドロキシ ジヒドロインデン鏡像異性体の混合物である請求項１に記載の方法。 ３．ジヒドロキシジヒドロインデンの混合物が式（１） （式中、ＲおよびＲ⁴はそれぞれ独立して−Ｈ、ハロゲン、−Ｎ₃、−ＯＨ，−Ｃ Ｎ，アルキル、アルケニル、アリール、−ＣＸ₃、−ＯＲ¹、−ＳＲ¹、−ＮＲ¹Ｒ² 、−ＰＲ¹Ｒ²、−ＣＯＲ¹、または−ＣＯ²Ｒ¹であり、式中、Ｘはハロゲンであ り、並びにＲ¹およびＲ²はそれぞれ独立してアルキル、アリール、アルケニルま たはアルアルキルである）の化合物を含む請求項１または２記載の方法。 ４．式（１）の化合物が式（２） である請求項３記載の方法。 ５．プセウドモナス・プチダ種がＮＣＩＭＢ８８５９，ＮＣＩＭＢ１１７６７ およびＮＣＩＭＢ１２１９０から選択される請求項１ないし４のいずれか１項記 載の方法。 ６．シス−ジヒドロキシジヒドロインデンがシス−１，２−ジヒドロキシ−１ ，２−ジヒドロインデンであり、プセウドモナス・プチダ種がプセウドモナス・ プチダＮＣＩＭＢ８８５９である請求項２記載の方法。 ７．シス−ジヒドロキシジヒドロインデンがシス−１，２−ジヒドロキシ−１ ，２−ジヒドロインデンであり、プセウドモナス・プチダ種がプセウドモナス・ プチダＮＣＩＭＢ１１７６７である請求項２記載の方法。 ８．シス−ジヒドロキシジヒドロインデンがシス−１，２−ジヒドロキシ−１ ，２−ジヒドロインデンであり、プセウドモナス・プチダ種がプセウドモナス・ プチダＮＣＩＭＢ１２１９０である請求項２記載の方法。 ９．ｐＨが４から９の範囲内に調整された水性の緩衝媒質の中で実施される請 求項１ないし８のいずれか１項記載の方法。 10．温度が０℃から１００℃までの間である請求項１ないし９のいずれか１項 記載の方法。