JPH10507084A - Ｉｉ型真性糖尿病のトランスジェニック動物モデル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＩＩ型真性糖尿病の種々な治療方法を試験するためのトランスジェニック動物モデルの作成を述べる。ＤＮＡ構築体が細胞株とトランスジェニック動物の両方においてラットインスリンＩＩプロモーターの調節下でのヒト膵島関連ポリペプチド（ＩＡＰＰ）の膵臓β細胞特異的発現を可能にする。このＤＮＡ構築体の１又は複数のコピーを微量注入法によって動物の胚に注入する、又はエレクトロポレーションによって樹立細胞株中に注入する。トランスジェニック動物は膵臓のランゲルハンス島におけるアミロイド斑沈着、空腹時高血糖症、糖尿及び糖尿病性糸球体硬化症を生後３〜５か月において発現する。細胞株をヒトＩＡＰＰの発現を阻害する治療に関してスクリーニングすることができ、トランスジェニック動物を、この疾患の表現型の進行を強化する又は阻害する処置に関してスクリーニングすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＩ型真性糖尿病のトランスジェニック動物モデル 発明の背景 本発明は、哺乳動物細胞株と動物とを、それらがヒト膵島アミロイドポリペプ チド(ＩＡＰＰ)遺伝子によってコードされるタンパク質を発現するように、遺伝 的に変化させる方法に関する。以前にはアミリンとして知られたＩＡＰＰは、非 インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者の膵臓において形成される膵島 アミロイドの主要タンパク質成分である。ＩＡＰＰ構造的及び機能的特徴につい ての最近の研究は、インスリン及び他のホルモンと共にＩＡＰＰが炭水化物代謝 に主要な役割を果たすことを示唆している。ＩＡＰＰは膵島における膵臓β細胞 によって産生され、貯蔵され、分泌される。これは筋肉及び肝臓組織におけるグ ルコース摂取及びグリコーゲン合成を阻害することによって、ＮＩＤＤＭに見ら れるインスリン耐性の現象を模倣することができる。ヒトにおけるアミロイド沈 着の発生はこのペプチドの中心部分（アミノ酸２０〜２９）の、βプリーツシー ト構造を形成する能力によると考えられる。齧歯類ＩＡＰＰはヒトＩＡＰＰとは 、アミノ酸２０〜２９のさもなくば高度に保存されるタンパク質の配列が保存さ れず、アミロイド沈着は齧歯類膵臓では形成されない点で異なる。実際的な仮説 は、ヒトＩＡＰＰの過剰発現が末梢組織におけるインスリン耐性を招来し、アミ ロイド沈着の形成を生じるということである。 トランスジェニック動物、特にマウスは複雑な系を詳細に分析して、ヒトの疾 患についての新しい情報を得るために非常に有用であることが判明している。こ のようなマウスにおけるヒト遺伝子の選択的な発現は、特に遺伝子の過剰発現が 疾患状態を生じるときに、疾患を研究するための新規なモデル系を形成している 。このようなトランスジェニックマウスによって、（１）発現の組織特異性；（ ２）特定の遺伝子の過剰発現が疾患を生じるという仮説の検討；（３）この過剰 発現によって影響される組織／器官の数と同定；及び（４）疾患表現型の進行又 は寛解に対する、薬物を含めた、種々な治療の効果に関する問題に対処すること がで きる。 これらの動物のいずれも糖尿病表現型を発現していないが、ヒトＩＡＰＰを発 現するトランスジェニックマウスの形成が文献において報告されている。Ｎｉｌ ｅｓ，Ｆｏｘ等（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３２３：４０〜４４［１９９３］ ）はラットインスリンプロモーター配列を、全ヒトＩＡＰＰ遺伝子（エクソン１ 〜３と、イントロン１と２）を含有するゲノムＤＮＡフラグメントに融合した導 入遺伝子(transgene)を構築した。膵臓、下垂体前葉及び脳において導入遺伝子 ＲＮＡ発現が検出されている。血漿ＩＡＰＰレベルは非トランスジェニックの同 腹仔に比べて５倍に上昇したが、この上昇の代謝結果は観察されていない。Ｃ． Ｂ．Ｖｅｒｃｈｅｒｅ等（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３７：７２５〜７２９［ １９９４］）は、全ヒトｐｒｏＩＡＰＰ配列をコードする６００ｂｐフラグメン トを用いた。これらのトランスジェニック動物は非トランスジェニック同腹仔対 照に比べて、ＩＡＰＰとインスリンの両方とも多い膵臓含量を示した。両方のホ ルモンの分泌の上昇も膵臓の灌流試験で検出されている。この貯蔵と分泌の増大 の臨床的発現は観察されていない。Ｈｏｐｐｅｎｅｒ等（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇ ｉａ，３６，１２５８〜１２６５（１９９３））は、マウス内分泌膵臓中にヒト ＩＡＰＰ又はラットＩＡＰＰのいずれかを発現する複数のトランスジェニック系 統の作成を述べている。Ｈｏｐｐｅｎｅｒのグループは、ゲノムＤＮＡフラグメ ントからヒト又はラットのＩＡＰＰの発現を促進するために７０３ｂｐラットイ ンスリンＩＩプロモーターフラグメントを用いていた。血漿ＩＡＰＰレベルは１ ５倍まで上昇したが、高血糖症も高インスリン血症も観察されなかった。その後 の研究では、ｉｎ ｖｉｖｏでアミロイド斑が蓄積するのが見られなかったが、 高血糖症を模倣する条件下でこれらのトランスジェニックからの膵島を培養した ときに細胞内アミロイドフィブリルと細胞外アミロイドフィブリルとが形成され た（Ｄｅ Ｋｏｎｉｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１， ８４６７〜８４７１［１９９４］）。 発明の概要 １実施態様では、本発明は非ＩＡＰＰプロモーターと、ヒトアルブミンイント ロン１コーディング配列に機能的に結合したヒトＩＡＰＰをコードする配列又は その活性フラグメントと、ヒトＧＡＰＤＨ停止コーディング配列と、ヒトＧＡＰ ＤＨポリアデニル化コーディング配列とを含み、適当な宿主に組み込まれたとき に糖尿病表現型の発現を生じる組換えＤＮＡに関する。 非ＩＡＰＰプロモーターがラットインスリンＩ、ラットインスリンＩＩ、ヒト インスリン、マウスＩＡＰＰ、ラットＢ細胞特異的グルコキナーゼ、グルコース トランスポーター２、ヒトチロシンアミノトランスフェラーゼ、ヒトアルブミン 、マウスアルブミン、ラット肝臓特異的グルコキナーゼ及びマウスメタロチオネ インの遺伝子のプロモーターから成る群から選択される組換えＤＮＡが特に好ま しい。 前記プロモーターがラットインスリンＩＩプロモーターである組換えＤＮＡも 好ましい。 ヒトＩＡＰＰをコードする前記配列又はその活性なフラグメントがｃＤＮＡの 特徴を有する組換えＤＮＡも特に好ましい。 ヒトＩＡＰＰをコードする前記配列又はその活性なフラグメントがゲノムＤＮ Ａの特徴を有する組換えＤＮＡがさらに好ましい。 前記配列が配列番号：４の配列である組換えＤＮＡもさらに好ましい。 ｃＤＮＡの前記配列が配列番号：５の配列である組換えＤＮＡも特にさらに好 ましい。 他の実施態様では、ヒトＩＡＰＰをコードするＤＮＡ配列を、マウスＩＡＰＰ をコードするＤＮＡ配列又はその活性なフラグメントによって置換し、前記マウ スＤＮＡが好ましくはｃＤＮＡの特徴を有する。 本発明は本発明の組換えＤＮＡ（配列番号：１）を含むベクターにも関する。 本発明は本発明の組換えＤＮＡを含む真核細胞株にも関し、好ましい細胞株は ラットインスリノーマ(rat insulinoma)（ＲＩＴ）細胞、ラットインスリノーマ （ＨＩＴ）細胞及びβ−ＴＣ３マウスインスリノーマ細胞から成る群から選択さ れる。 本発明は本発明の組換えＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物にも 関し、糖尿病表現型を示す、特に好ましいトランスジェニック哺乳動物はマウス とラットである。 他の実施態様では、本発明は、ＩＡＰＰ遺伝子産物の過剰発現を特徴とする疾 患を有する動物の治療方法であって、前記ＩＡＰＰ遺伝子産物の過剰発現の阻害 剤の治療有効量を前記動物に投与することを含む上記方法に関する。 さらに他の実施態様では、本発明は、前記治療剤(treatment)を投与し、ＩＡ ＰＰをコードする遺伝子の過剰発現の産物に対する前記治療剤の効果を評価する ことを含む方法に関する。 前記治療剤を動物に投与する方法が好ましく、特に好ましい動物はヒトである 。 本発明は、対象が糖尿病又は肥満の危険状態にあるかどうかを判定する方法で あって、前記対象を、危険状態を示唆するＩＡＰＰ遺伝子産物の過剰発現に関し て検査することを含む上記方法にも関する。 さらに他の実施態様では、本発明は、障害又は疾患状態に関して動物モデルを 評価する方法であって、前記動物モデルにおいてＩＡＰＰ遺伝子が所定レベルで 発現されるかどうかを判定することを含む上記方法に関し、好ましい方法では、 前記レベルが野生型又は正常な動物におけるレベルよりも高い。 図面の簡単な説明 図１ａはＲＩＰＨＡＴ導入遺伝子の線形マップである。ヒトＩＡＰＰｃＤＮＡ 配列は黒色で示される；ラットインスリンＩＩプロモーターは白色ボックスで示 され、ヒトアルブミンイントロンは暗く陰影を付けたボックスであり、ヒトＧＡ ＰＤＨポリアデニル化領域（ポリＡと標識）は明るく陰影を付けたボックスであ る。 図１ｂはコーディング領域の両端部の拡大であり、ヒトＩＡＰＰを他のｃＤＮ Ａに置換するために用いることができる制限酵素部位を示す。 図１ｃはプロモーター領域の両端部の拡大であり、ＲＩＰＨＡＴ導入遺伝子に おけるＲＩＰＩＩを他の適切なプロモーターに置換するために用いることができ る制限酵素部位を示す。 図２はプラスミドｐＳＶ２Ｄｏｇ１の環状マップである。ｐＳＶＤｏｇ１はＰ ＣＲ修飾ＣＡＴ遺伝子（ＢｓｐＭＩ／ＢａｍＨＩフラグメント）をＳＶ４０プロ モーター（ｐＬｕｘＦ３からのＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ部分的フラグメント）の下 流に挿入することによって構築した。得られたプラスミドはその５’末端におい て最適の哺乳動物翻訳配列と融合し、その３’末端においてホタルルシフェラー ゼ３’非翻訳領域及びポリＡ付加部位と融合したＣＡＴ遺伝子コーディング配列 を含有する。修飾ＣＡＴ遺伝子の発現はＳＶ４０プロモーターによって駆動され る。 図３はプラスミドｐＤｏｇ１５の構築に用いられるヒトグリセルアルデヒド３ ホスフェートデヒドロゲナーゼポリアデニル化領域を含有するプラスミドｐＳＶ ２Ｄｏｇ１１の環状マップである。ｐＳＶ２Ｄｏｇ１１はＰＣＲ増幅ヒトグリセ ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３’−非翻訳領域をＳｐｅＩ ／ＢａｍＨＩ消化ｐＳＶ２Ｄｏｇ１中に挿入することによって構築した。これは ＧＡＰＤＨ３’非コーディング配列をＣＡＴコーディング領域の下流に配置する 。 図３は、プラスミドｐＤｏｇ１５によって開始して、ｐＲＩＰＨＡＴ１を構築 するために用いられるクローニング方法の概略図である。 図４は、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩによって消化され、ＲＩＰＨＡＴ 導入遺伝子ＤＮＡ内の³²Ｐ標識ヒトＧＡＰＤＨフラグメントにハイブリダイズし た６種の尾のＤＮＡのゲノムＤＮＡサザンブロットのオートラジオグラムである 。６レーンはＲＩＰＨＡＴトランスジェニック系統ＲＧ雄とＦＶＢ／Ｎ野生型雌 との交配から生じた動物の同腹仔(litter)を表す。 図５は、ヒト膵臓と非トランスジェニックマウスとからの膵臓ＲＮＡの他にト ランシジェニック系統ＲＨＡ、ＲＨＦ及びＲＨＧから単離された総膵臓ＲＮＡの ノーザンブロットのオートラジオグラムである。このブロットを［α³²Ｐ］ｄＣ ＴＰで標識されたヒトＩＡＰＰｃＤＮＡフラグメントにハイブリダイズさせた。 図６は、膵臓β細胞の電子顕微鏡写真である。矢印は細胞内アミロイド斑沈着 を表示する。 図７は、ウサギ抗ヒトＩＡＰＰ抗体による細胞内アミロイド斑のイムノゴール ド(immunogold)染色の３７，０００倍拡大を示す電子顕微鏡写真である。 図８は、３頭の非トランスジェニック（ＦＶＢ／Ｎ系統）雄マウスに比較した ３頭の雄ＲＨＦホモ接合体マウスにおける高血糖症の発生を示すグラフである。 図９は、生後５週間のＲＨＦホモ接合体トランスジェニック雄（同腹仔＃ＲＨ Ｆ１１，ｎ＝５）と雌（同腹仔＃ＲＨＦ１１，ｎ＝３）に対して、年齢が一致し た非トランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスと比較して、おこなった経口グルコー ス耐性(glucose tolerance)試験の結果を示す。 発明の詳細な説明 プラスミド プラスミドｐＲＩＰＨＡＴ（ラットインスリンプロモーターヒトＩＡＰＰ導入 遺伝子）（配列番号：１）は５種類の異なるソース（３種類はヒト遺伝子、４種 類目はラットから、５種類目は商業的に入手可能なプラスミドベクターである） のＤＮＡフラグメントを含有する。これらはラットインスリンＩＩプロモーター （８７６ｂｐ）、（配列番号：２）ヒトＩＡＰＰコーディング配列（２７８ｂｐ ）（配列番号：３）、ヒトアルブミンイントロン１（７２０ｂｐ）（配列番号： ４）及びヒトグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ ＤＨ）遺伝子ポリアデニル化部位とＲＮＡ停止領域（５４６ｂｐ）（配列番号： ５）である。商業的に入手可能なプラスミドはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−） （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）（配列番号：６）である。 ライゲーション、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ合成反応及びＥ．ｃｏｌ ｉの形質転換を包含する、組換えＤＮＡの酵素処理を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ． ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９に述べられているような充分に確立された方法によってお こなった。 ヒトアルブミンイントロン１（配列番号：４）とＧＡＰＤＨ遺伝子フラグメン ト（配列番号：５）とはプラスミドｐＳＶ２Ｄｏｇ１５からＢａｍＨＩとＡｐａ ＬＩとによるこのプラシミドの消化と、これらの２領域を含有する１２６２ｂｐ フラグメントの単離とによって得られた。ｐＳＶ２Ｄｏｇ１５はＰｆｉｚｅｒ社 のＤａｖｉｄ ＬｌｏｙｄとＪｏｈｎ Ｔｈｏｍｐｓｏｎとによって構築された 。かれらはヒトアルブミンイントロン１配列を、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔ ｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから入手）と、ＤＮＡオリゴマー１８５０５ ．０２２（配列５’ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧ ＡＡＧＡＡＡＡ３’）（配列番号：８）と、１８５０５．０２４（配列５’ＧＧ ＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＧＴＡＡＧＡＡ ３’）（配列番号：９）とを用いて、アルブミン遺伝子のこの部分のポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．等編集，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９０）によ って形成した。これらのオリゴマーはそれらの末端に外因的ＸｂａＩ部位を包含 するので、得られたＰＣＲ生成物をＸｂａＩによって消化させて、ｐＳＶ２Ｄｏ ｇ１１中の適合性ＳｐｅＩ部位に挿入した。Ｄａｖｉｄ Ｌｌｏｙｄによって構 築された、このプラスミドは既にヒトＧＡＰＤＨポリアデニル化領域を含有して いた。これは鋳型としてのヒトゲノムＤＮＡと、ＰＣＲプライマーとしてのオリ ゴマー１８９７０．２４６（配列５’−ＣＡＡＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＴＧ ＡＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＴＣＡＧＣ−３’）（配列番号：１０）と、１８ ９７０．２４４（配列５’ＣＡＣＡＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣ ＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣ３’）（配列番号：１１）とを用いてＰＣＲクローニ ングによっても形成された。このようにして得られたＰＣＲ生成物をＳｐｅＩと ＢａｍＨＩとによって消化させて、ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＳＶ２Ｄｏｇ１ 中に挿入した（図２参照）。 １２６２ｂｐ，ＡｐａＬＩ／ＢａｍＨＩアルブミンイントロンＩ−ＧＡＰＤＨ ポリＡ領域ハイブリッドフラグメントを、ｐｒｅｐｒｏｌＡＰＰタンパク質産物 のコーディング領域を含有する２７８ｂｐＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントにライ ゲーションした。このフラグメントを鋳型としてのＩＡＰＰ ｃＤＮＡ（λファ ージ ＤＮＡ ｈＩＡＰＰ−ｃ１、Ｓｉｅｔｓｅ Ｍｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｒｉｊ ｋｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ ｔｅ ｕｔｒｅｃｈｔ，オランダから入手、Ｍ ｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｓ．等，Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．２４７，１５４〜１５８（１ ９８９）中に記載）と、ＰＣＲプライマーとしてのオリゴマー１９３８３．２８ ８（配列５’ＧＴＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＴＡＡＡＧＧＧＧＣＡＡＧＴＡＡＴＴＣ Ａ３’）（配列番号：１２）と、１９９８７．１１６（配列５’ＧＡＡＧＣＣＡ ＴＧＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡ３’）（配列番号：１３）と を用いて増幅した。得られた１５２３ｂｐフラグメントをｐＳｕｐｅｒＬｕｃ（ ｐＳＬ）にライゲーションさせて、プラスミドｐＳＬＡ１０を得た。ｐＳＬはル シフェラーゼレポーター遺伝子（Ｍｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｓ．等，ＦＥＢＳ Ｌｅ ｔｔ．２７１，３３〜３６（１９９０））を含有するＤＮＡプラスミドである。 この場合に、プラスミドは好都合なＮｃｏＩとＢａｍＨＩ制限部位の存在に関し てのみ用いられた。 ラットインスリンＩＩプロモーター（配列番号：２）と５’非翻訳リーダー領 域は、オリゴマー１９３８３．２８４（配列５’ＧＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡ ＴＣＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＴＣＣＡＡ−ＧＴ３’）（配列番号：１４）と１９３ ８３．２９２（配列５’ＡＣＡＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧＡ−Ｃ ＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡ３’）（配列番号：１５）とを用いてラットゲノムＤＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手，ｃａｔ＃６７５０−１）のＰＣＲ増幅によって形 成した。オリゴマー１９３８３．２９２が点変異を含有する；これは開始コドン の２残基５’側を１ヌクレオチド（ＡからＣ）変えることによって、フラグメン トの３’末端にＮｃｏＩ部位を導入するように設計された。８８３ｂｐＰＣＲ生 成物をＮｃｏＩによって切断して、１７５ｂｐブラント末端／ＮｃｏＩフラグメ ントと、２つのＮｃｏＩ末端を有する７０８ｂｐフラグメントとを得た。プラス ミドｐＳＬＡ１０をＸｂａＩによって消化させた。得られた５’オーバーハング をクレノウポリメラーゼとｄＮＴＰとによってうめこみ、ブラント末端を得た。 次いで、プラスミドをＮｃｏＩによって消化させて、１７５ｂｐブラント末端／ ＮｃｏＩラットインスリンＩＩフラグメントにライゲーションして、ｐＳＬＡ１ １を得た（図３参照）。 ｐＳＬＡ１１をＮｃｏＩによって消化させて、７０８ｂｐ ＮｃｏＩラットイ ンスリンＩＩフラグメントにライゲーションして、プラスミドｐＳＬＡ１２を得 た。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとによって消化させて、７０８ｂ ｐ ＮｃｏＩフラグメントの適当な配向を確認した。キメラ導入遺伝子（ラット インスリンＩＩプロモーターと５’非翻訳リーダー、ＩＡＰＰコーディング領域 、アルブミンイントロン１、ＧＡＰＤＨポリアデニル化領域）（配列番号：７） をｐＳＬＡ１２の部分的ＢａｍＨＩ消化によってｐＳＬバックボーンからＢａｍ ＨＩ線形化ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）に移して、ｐＲＩＰＨＡＴＩ（配列 番号：１）を得た。ラットインスリンＩＩプロモーターと、５’非翻訳リーダー 領域と、ＩＡＰＰコーディング領域とをＳａｎｇｅｒのジデオキシ連鎖停止方法 によって配列決定して、突然変異が導入されていないことを確認した。 導入遺伝子がマウス細胞中に発現されることを確認するために、ｐＲＩＰＨＡ Ｔ１（配列番号：１）をＭｏｓｓｅｌｍａｎ等が述べているように（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７１．３３〜３６，１９９０）エレクトロポレーションによってβ ＴＣ細胞中に一過性にトランスフェクトした。２４時間後に、総ＲＮＡを確立さ れた方法（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２ ，１５６〜１５９）によって単離した。導入遺伝子特異的ＲＮＡをこの総 ＲＮＡから逆転写によって誘導されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって検出した（ Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．等編集、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９０）。ＰＣＲ生成物のサイズと豊富さ (abundance)は、導入遺伝子が発現されたことと、導入遺伝子のヒトアルブミン イントロン部分がこれらの細胞中に効果的に接合された(spliced out)ことを実 証した。安定にトランスフェクトされた細胞株 上記プラスミドは、レシピエント細胞にゲネチシン（Ｇ４１８）耐性を与える プラスミドと共に、ＲＩＮ細胞とβＴＣ３細胞とにエレクトロポレーションによ って安定に導入された。βＴＣ３細胞はＳｈｉｍｏｎ Ｅｆｒａｔ ａｎｄ Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）から入手されたものであり、Ｅｆｒａｔ， Ｓ． 等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５，９０３７〜９０４１（１９ ８８）に説明されている。細胞は、半集密的単層のトリプシン処理、２回ペレッ ト化、無血清ＲＰＭＩ １６４０培地中での１回洗浄及びこの培地中での２ｘ１ ０⁷細胞／ｍｌの濃度での再懸濁によって用意した。日常的には、５０μｇの適 当なプラスミドを３．３μｇの選択プラスミドｐＨＡ２．３ｎｅｏ（Ｇ４１８耐 性を与える；Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｈｏｂａｒｔ，Ｐｆｉｚｅｒ社）と共に、エレ クトロポレーションキュベット（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ｓ［ＢＲＬ］，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中の０．５ｍｌの細胞に加え 、ＢＲＬ Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒエレクトロポレーション・ユニット上で２ ５０ｖ／ｃｍ電界に、８００μＦと低抵抗設定において暴露させた。細胞を２分 間静置させた。これらを次ぎに２倍量のＲＰＭＩ １６４０ １０％ウシ胎児血 清によって希釈し、Ｔ２５フラスコに移した。３６時間後に、生存能力ある細胞 を６孔クラスターディシュに移し、選択培地（５００μｇ／ｍｌの活性ゲネチシ ンを含み、上記と同じ）中で２ｘ１０⁵細胞の濃度で増殖させた。３週間後に、 コロニーが出現し、これらのコロニーを確立された方法によって、トリプシンと グリース被覆磁器クローニングリング(cloning ring)を用いて単離した。この処 置に耐えたクローンを大量培養まで増殖させ、凍結し、液体窒素中で貯蔵した。 クローンの総ＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって導入遺伝子発 現を確認した。さらに、ラジオイムノアッセイ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ ｌａｂｓ ｋｉｔ＃ＲＩＫ−７３２１，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）を総細胞タンパク質と周 囲培地の両方におこなって、ＩＡＰＰ含量と分泌との両方の増加を確認した。トランスジェニックマウス マウス系統ＦＶＢ／Ｎ（Ｔａｋｅｔｏ，Ｍ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．８８，２０６５〜２０６９（１９９１））からの胚を、上記プラス ミドから単離した線状ＤＮＡフラグメントと共に注入した。そのプラスミドから 、ＸｂａＩとＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼによる切断によって２３９５ｂｐ ＲＩＰＨＡＴ ＤＮＡフラグメントを取り出した。反応消化物(digest)の２ラ ウンドのアガロース（０．９％ＧＴＧアガロース、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ ｔ ｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｅ）ゲル電気泳動後に、２３９５ｂｐ導入遺伝子フラ グメントをエレクトロエリューション（６５Ｖ，３時間）によって単離した。こ のフラグメントを胚に注入する前にＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒとＳｃｈｕｅｌｌ Ｅ ｌｕｔｉｐ−ｄカラム上で製造者のＤＮＡ精製に関するＥｌｕｔｉｐ−ｄ基本プ ロトコールに従ってさらに精製した。胚の注入は、Ｈｏｇａｎ，Ｂ等，Ｍａｎｉ ｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６に 略述されているような、発表された方法に従っておこなった。最適発現と好ましい実施態様 上記プラスミドは、例えば種々な挿入、欠失及び／又は単一若しくは複数の塩 基対置換のように、導入遺伝子の発現を最適にするように変えることができる。 これは翻訳効率を最適にするためにルシフェラーゼの開始コドンの前の領域にお ける単一塩基対変化を包含する。ｐＲＩＰＨＡＴ １内のプロモーター領域を例 えばヒトＩＡＰＰ、ラットインスリンＩ、マウスインスリン、マウスＩＡＰＰ、 ラットグルコキナーゼ（肝臓及び／又はβ細胞特異的）ヒトガストリン、ヒト又 はマウスアルブミン、マウスメタロチオネイン及びヒトチロシンアミノトランス フェラーゼのような他のプロモーターと置換することができる（図１ｂ）。ラッ トインスリンＩＩプロモーターは暗く陰影を付けたボックスとして示され、コー ディング領域は黒色ボックスとして示され、ヒトアルブミンイントロンは白色ボ ックスとして示され、ヒトＧＡＰＤＨポリアデニル化領域はストリップ状ボック スとして示される。例えばマウスのような他の種のＩＡＰＰ ｃＤＮＡ、又はア ミロイドジェニック(amyloidogenic)部分若しくはインスリン耐性を誘導する部 分のいずれかを保持するヒトＩＡＰＰの突然変異機能形(mutated functional fo rm)をｐＲＩＰＨＡＴ１内のヒトＩＡＰＰ ｃＤＮＡ領域と置換することができ る（図１ｃ）。導入遺伝子ＤＮＡを他の系統のマウス胚に又は、Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ若しくはＣ５７ＢＬ／Ｋｓバックグラウンド上のｄｂ／＋、Ｏｂ／＋、Ａ^UY若 しくはＡ^uを包含するその突然変異体に注入することができる。或いは、これら のトランスジェニックマウスをこれらの遺伝的特徴を有する系統と交配させるこ とがで きる。 好ましい細胞株はβＴＣ３（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＲＩＮｍ５ｆ（Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．等，ＰＮＡＳ， ７７，３５１９〜３５２３［１９８０］，Ｗ．Ｃｈｉｃｋ，Ｕ．Ｍａｓｓ．，Ｗ ｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手）及びＨＩＴ（Ｓａｎ ｔｅｒｒｅ，Ｒ．Ｆ．等，ＰＮＡＳ，７８，４３３９〜４３４３［１９８１］， ＡＴＣＣ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手）を包含する。有用性 安定にトランスフェクトされた細胞株を用いて、薬物をそれらがヒトＩＡＰＰ の転写、ｍＲＮＡレベル、翻訳、蓄積又は分泌を変えることができる能力に関し てスクリーニングすることができる。特に、導入遺伝子ｍＲＮＡの定常状態レベ ルをＰＣＲ検出方法を用いて高いスループットでスクリーニングすることができ る。これらの細胞を上記プロセスを変化させることが分かっている候補薬物の作 用機序を知るために用いることができる。 トランスジェニック動物を用いて、薬物をそれらが細胞、組織、器官及び／又 は血漿中のヒトＩＡＰＰレベルを変えることができる能力に関してスクリーニン グすることができる。これらの細胞を用いて、全動物におけるヒトＩＡＰＰの過 剰発現の病理学的結果を研究することもできる。 実験 材料と方法 ＡｐａＬＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｃｏ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ、Ｘ ｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを包含する制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ ｏｌａｂｓから入手した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼとＴ４ ＤＮＡキナーゼとを包 含するＤＮＡ修飾酵素は同一の供給者から入手した。細菌性のアルカリフォスフ ァターゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した。商業的に入 手した酵素は全て、供給者が最適と表示している条件下で用いた。 培地 Ｅ．ｃｏｌｉの増殖培地は１０ｇのＢａｃｔｏ−トリプトンと、５ｇのＢａｃ ｔｏ−酵母抽出物と、５ｇのＮａＣｌとから構成された。全ての成分を添加した 後に、１０Ｎ ＮａＯＨによってｐＨを７．５に調節した。 ＤＮＡのエタノール沈殿 ３Ｍ，ｐＨ５．２ストック溶液からの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）をＤＮＡ サンプルに加えて、最終ＮａＯＡｃ濃度を２００ｍＭにした。２．５倍量の冷（ −２０℃）無水エタノールを１倍量の水性ＤＮＡサンプルに加えて、サンプルを −７０℃に１５分間又は−２０℃に一晩放置した。 ＤＮＡの電気泳動 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６（又はＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．６）、 １ｍＡ ＥＤＴＡ中のＤＮＡを１／５倍量の負荷緩衝液(loading buffer)と混合 した。負荷緩衝液は３０％グリセロールと、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．６と、２０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と、ブロムフェノー ルブルー，０．２５％（ｗ／ｖ）と、キシレンシアノール，０．２５％（ｗ／ｖ ）とから構成された。ＤＮＡを１Ｘ Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ ＥＤＴＡ（ＴＢ Ｅ）緩衝液（８９ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．３，８９ｍＭ Ｂｏｒａｔｅ，２ｍ Ｍ ＥＤＴＡ）中で電極間の距離１ｃｍにつき５〜１０ボルトにおいて０．８〜 １．２％（ｗ／ｖ）ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏ ｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）に通して電気泳動した。 ＤＮＡのエレクトロエリューション 清潔な片刃レーザーブレードによって問題の帯を含有するゲルスライスを切断 することによって、ＤＮＡ帯をゲルから取り出し、このゲルスライスを、０．５ ｘ ＴＢＥ緩衝液を充填した０．２５インチ直径透析管（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（長さはゲルス ライスのサイズによって変化）に入れた後に、透析管クリップによって両端部を シールした。充填した管を、０．５ｘ ＴＢＥ緩衝液を充填した標準電気泳動ゲ ルボックスに入れ、透析管の内側で電極間の距離１ｃｍにつき１０ボルトの電圧 をかけることによってゲルスライスからＤＮＡを１〜３時間溶離させた。この時 間の終了時に、ＤＮＡを含む緩衝液をエッペンドルフ管に移し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖ ａｃ装置（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社，Ｆａｍｉｎｇｄａｌｅ， Ｎ．Ｙ．）中で濃縮し、量を最小量の１００μｌに減じた。この量をプレパック ト(prepacked)Ｇ−５０Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔ ａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）スピンカラムに供給して、ＩＥＣ卓上型臨床遠心分離器 （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｅ ｄｈａｍ ＨＴＳ，ＭＡ）中、６００Ｇ力で３分間遠心分離した。これはＤＮＡ サンプルからのホウ酸塩の除去を可能にした。次ぎに、サンプルをエタノール沈 殿させ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６と１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁させた 。 ゲル中のＤＮＡ帯の可視化 アガロースゲルに通して電気泳動すべきＤＮＡに関して、１／１０量の１ｍｇ ／ｍｌの臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）をサンプルに加えた。電気泳動後に、３２ ０ｎｍの波長でＵＶ光線を放出するＵＶトランスイルミネーター上にゲルを載せ ることによって、ＤＮＡ帯を可視化した。この方法では、脱色操作(destaining procedure)は不必要であった。分取のために単離したゲルスライス中のＤＮＡ帯 を上述したようにエレクトロエリュートした(electroeluted)。ＤＮＡに結合し たＥｔＢｒはエタノール沈殿法によって除去した。 細菌プラスミドＤＮＡの調製 Ｍａｘｉｐｒｅｐ方法（１００〜２０００μｇ収量のプラスミドＤＮＡ） Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに述べられているような、アルカリ溶解（alkaline lys is)方法によって、このＤＮＡを調製した。“培地”の項で述べられているＬｕ ｒｉａブロス（０．５リットル）に適当なＥ．ｃｏｌｉ菌株の固定相培養物（０ ．１ｍｌ量）を接種した。１２５μｇの乾燥アンピシリン粉末を接種済み培地に 加えた後に、細菌を一晩振とうしながら３７℃においてインキュベートした。翌 朝、Ｓｏｒｖａｌｌ ＧＳ３ローター（Ｄｕｐｏｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎｅｗｔｏｎ， ＣＴ）中での４℃における５，０００ｒｐｍによる１０分間の遠心分離によって 、細菌をペレット化した。５０ｍＭ グルコースと、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ，ｐ Ｈ８．０と、１０ｍＭ ＥＤＴＡと５ｍｇ／ｍｌのリゾチームとから成る溶液（ ２０ｍｌ）中でペレット化細菌を再懸濁した。細菌を室温において１０分間放置 し、この時間後に、４０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ／１％ＳＤＳを加えた。溶解 した細菌をさらに１０分間室温で放置し、この時間後に、２０ｍｌの氷冷３Ｍ酢 酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加え、混合物を氷上で１０分間インキュベートし た。白色沈殿を最初の管に入れ、ＧＳ３ローター中での５，０００ｒｐｍによる １０分間の遠心分離によって、ペレット化した。上清を回収し、量を測定した。 等しい１倍量のイソプロパノールを加えて、ＤＮＡを沈殿させ、Ｓｏｒｖａｌｌ ＨＳＡローター中で４℃において７，５００ｒｐｍによって１５分間遠心分離 することによって、ペレット化した。ペレットを２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ中に溶解し、３．１０ｇのＣｓＣｌを含有する５ｍｌポリスチレン管に加 えた。このサンプルをＥｔＢｒの１０ｍｇ／ｍｌ溶液（５０μｌ）を含む３．９ ｍｌＢｅｃｋｍａｎヒートシール管に移し、水を充填し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬ Ｎ １００ローターに入れ、Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ Ｂｅｃｋｍａｎ卓上型Ｕｌ ｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａ ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中で１００，０００ｒｐｍにおいて４時間遠心分離した 。プラスミドＤＮＡの帯は裸眼に目視可能であり、２０Ｇ針と１ｃｃツベルクリ ン注射器とによって抽出した。プラスミド溶液を３Ｍ ＮａＣｌ飽和イソプロパ ノールによって抽出することによって、ＥｔＢｒを除去した。次いで、ＤＮＡを エタノール沈殿させ、−２０℃において貯蔵した。 Ｍｉｎｉｐｒｅｐ方法（１〜２０μｇ収量のプラスミドＤＮＡ） Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに述べられている沸騰水方法によって、このＤＮＡを調 製した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌の静置培養物（１．５ｍｌ）を１．５ｍｌエッペンドル フ管に注入した。培養物の残りは４℃に貯蔵した。管をＥｐｐｅｎｄｏｒｆマイ クロフュージ(microfuge)中で室温において１５秒間、１２，０００Ｇで遠心分 離した。上清を吸引によって除去し、ペレットを０．４ｍｌのＳＴＥＴ緩衝剤： ８％スクロース、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００界面活性剤、５０ｍＭ ＥＤＴ Ａ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０中に再懸濁させた。３５μｌの１ ０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを再懸濁した細胞に加えた。直ちに、この管を１００ ℃の水中に１分間入れた。管を沸騰水から取り出し、１２，０００Ｇにおいて１ ５分間遠心分離した。２００μｌの上清を新しい管に移し、２００μｌのイソプ ロパノールと混合した。サンプルを−７０℃において１５分間貯蔵した後に、沈 殿したＤＮＡを４℃において１２，０００Ｇで１０分間遠心分離することによっ て回収した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールによってすすぎ洗いし、風乾さ せた。ペレットを５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁させ、４℃において貯蔵した。 経口糖耐性試験 試験すべきマウスを＞１２時間絶食させ；血液サンプルを眼窩後方眼出血から 採取し；“ワンタッチ”グルコメーター(glucometer)（Ｌｉｆｅｓｃａｎ社、Ｍ ｉｌｐｉｔａｓ ＣＡ）を用いて血糖を測定した。血液採取は、グルコース負荷 の投与前（ｔ＝０）と、グルコース負荷後の３０分間、７５分間及び１２０分間 に実施した。グルコース負荷は２００ｍｇ／ｍｌのデキストロース溶液を１ｍｇ ／ｇ（体重）の濃度で１ｃｃ注射器とネズミ経口投与針とを用いて経口投与する ことから構成された。 細菌プラスミドＤＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに述べられているアルカリ溶 解方法によって調製した。 Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換 細菌菌株は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手されたＳＵＲＥ細胞又はＢｅｓ ｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ からのＤＨ５細胞を含む。コンピテント細胞はＣａＣｌ₂法（Ｍａｎｉａｔｉｓ 等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ，第２版，１９８９）に従って調製し、液体窒素中で急速に凍 結し、−７０℃において貯蔵した。問題のプラスミドによる、これらの菌株の形 質転換は、１０μｌのライゲーションミックスを８０μｌのコピテント細胞と共 にインキュベーションした後に、３７℃において２分間熱ショックを与え、０． ８ｍｌのＬｕｒｉａブロスを添加した後に３７℃において１時間さらにインキュ ベーションすることによって実施した。典型的に、１００μｌのこの混合物を、 選択剤として５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で培養した。 このプレートを３７℃において一晩インキュベーションした後にコロニーを採取 した。 実施例１：ｐＲＩＰＨＡＴの構築 ｐＳＶ２Ｄｏｇ１５の構築 ヒト グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼポリアデニル 化／転写停止領域（配列番号：５）を含有するＤＮＡフラグメントを、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって形成した。オリゴヌクレオチド１８９７０ ．２４４（配列番号：１１）と１８９７０．２４６（配列番号：１０）を３μｇ のヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＳａｎＣａｒｌｏｓ，ＣＡ）と共に、 標準のＰＣＲ条件（１μＭプライマー、３μｇターゲットＤＮＡ、２００μＭ ｄＮＴＰｓ２．５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）下 でインキュベートした。増幅条件は２５サイクル、９６℃において１分間、５８ ℃において２分間、７２℃において３分間に設定した。得られた５４５ｂｐフラ グメントを１０単位のＳｐｅＩと１０単位のＢａｍ ＨＩとによって消化させ（ ３７°Ｃ／３０分間）、１μｇのホスファターゼ処理した(phosphatased)Ｓｐｅ Ｉ／Ｂａｍ消化ベクターＤＮＡ ｐＳＶ２ｄｏｇ１にライゲーションさせて、プ ラスミドｐＳＶ２ｄｏｇ１１を形成した。次に、ｐＳＶ２ｄｏｇ１１自体をＳｐ ｅＩによって消化させ、アルカリホスファターゼによって処理した（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからの０．２５単位、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．５中、５５℃において２時間）。上記標準条件下でオリゴヌクレオチ ド１８５０５．０２２と１８５０５．０２４を用いて３μｇのヒトゲノムＤＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＰＣＲ増幅によって、ヒトアルブミンイントロンＩ（配 列番号：３）を含有するＤＮＡフラグメントを形成した。生成した７４０ｂｐフ ラグメントをＳｐｅＩで消化し、標準ライゲーション条件下でＳｐｅＩ−線状化 ｐＳＶ２ Ｄｏｇ１１にライゲーションさせて、プラスミドｐＳＶ２ Ｄｏｇ１ ５を生成した。イントロンフラグメントの方向(orientation)は、制限エンドヌ クレアーゼＡａｔ ＩによるｐＳＶ２ Ｄｏｇ１５の消化によって確認した。２ ０μｇのｐＳＶ２Ｄｏｇ１５を６０単位のＢａｍ ＨＩ及び２２．５単位のＮｃ ｏＩによって消化させて、エレクトロエリューションによってＮｃｏＩ／Ｂａｍ ＨＩフラグメントを単離した。３μｇのこのフラグメントを次に３７℃において ４時間、２０単位のＡｐａＬＩによって消化させた。生じた消化生成物を０．８ ％ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍ Ｅ）ゲル上で分離した。１２６５ｂｐのＢａｍ ＨＩ／Ａｐａ ＬＩフラグメン トをエレクトロエルーション（標準状態：透析バック中のゲルスライスを有する ０．５Ｘ ＴＢＥ（トリスーボレートーＥＤＴＡ ｐＨ８．３）中６０Ｖ／６０ 分によって）によって回収した。溶離したＤＮＡを、Ｇ５０樹脂を用いるスピン カラムクロマトグラフィーによって精製し、次にエタノール沈殿させた。このフ ラグメントは、その３’末端においてヒトＧＡＰＤＨポリアデニル化領域に融合 したヒトアルブミンイントロンを含有した。ｐＳＬＡ１０の構築 ＩＡＰＰメッセージのタンパク質コード領域のみを含有するヒトＩＡＰＰｃＤ ＮＡの一部（配列番号：２）を、ＰＣＲによって形成した。１μＭの濃度のオリ ゴヌクレオチド１９３８３．２８８（配列番号：１２）及び１９３８３．２９２ （配列番号：１５）を、鋳型として０．１ｎｇのクローン化したＩＡＰＰ ｃＤ ＮＡ Ｈｓｉａｐｐ１（Ｍｏｓｓｅｌｍａｎ等）と共にインキュベートした。上 記したような標準緩衝液及びＰＣＲサイクル条件を用いた。反応生成物をクロロ ホルムによって抽出して、残りの鉱油を除去し、そしてエタノール沈殿し、沈殿 したＤＮＡを、２０μｌの１Ｘ ＮＥＢ ４制限エンドヌクレアーゼ緩衝液及び １０単位の制限エンドヌクレアーゼＡｐａＬＩ中に再懸濁させた。消化生成物を １％ＧＴＧアガロースゲル中で電気泳動して、臭化エチジウム染色によって可視 化して、エレクトロエリューションによって回収して、１．１μｇの収量を得た 。このフラグメントを、１ｘＢＲＬライゲーション緩衝液プラス数単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼの総量２０μｌにおいて、Ｂａｍ ＨＩ／Ａｐａ ＬＩ（ｐＳＶ ２ Ｄｏｇ１５からの１２６５ｂｐフラグメント）にライゲーションさせた。こ の反応を１６℃において３日間インキュベートした。このインキュベーション後 に、この反応物中に存在する残りのリガーゼ活性を熱−不活化した（６５℃／１ ０分）。次に、このライゲーション反応を高塩制限緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣ ｌ、１０ｍｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）の存在下で１０ ０μｌまでに希釈し、５単位のＮｃｏＩによって３７℃において２時間消化させ た。得られたフラグメント（１５３３ｂｐ）を電気泳動と、その後のエレクトロ エリューションとによって単離した。 ２０μｇのレポータープラスミドｐＳｕｐｅｒｌｕｃ（ｐＳＬ）を９単位のＮ ｃｏＩと２０単位のＢａｍ ＨＩとによって３７℃において１００μｌの反応量 で３時間消化させることによって、このフラグメントをクローン化するためのシ ャトルベクターを製造した。この反応に、５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０ 及び２２単位のアルカリホスファターゼを加えた。次に、この反応を５０℃にお いて２時間進行させて、５’オーバーハング(overhangs)におけるホスフェート 基を除去し、従って次ぎのライゲーション段階におけるベクターのみの再環状化 を防止した。このホスファターゼ反応を、フェノール／クロロホルム抽出と、そ の後のエタノール沈殿によって停止させた。このＤＮＡを０．２μｇ／μｌの濃 度で１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＨＥ）に再懸濁させ た。 １ｘＢＲＬライゲーション緩衝液及び４００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼの総 量２０μｌにおいて、１．１μｇのインサートを０．２μｇのｐＳＬベクターに ライゲーションさせることによって、１５３３ｂｐ ＩＡＰＰ ｃＤＮＡ／アル ブミン イントロン／ＧＡＰＤＨ ポリＡ フラグメントをＮｃｏ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ−切断 ｐＳＬにクローン化した。この反応を１６℃において一晩インキ ュベートした。次の朝に、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ細胞（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を１０μｌのライゲーションミック スと共に０℃において２０分間インキュベートし、次ぎに３７℃において２分間 ヒートショックさせた。０．８ｍｌのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈをこのミックスに 加え、３７℃において６０分間インキュベートした。１００μｌのこのミックス を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ寒天プ レート上に広げた。１６個のアンピシリン耐性コロニーを取り出し、液体ブロス 中で培養した。これらの培養物の半分は、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡの消化によっ て測定したように（材料と方法に記載）適切なインサートを含むプラスミドを含 んだ。１つの培養物（ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＃３）をＮＤＡ ｍａｘｉｐｒｅｐ用 のＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ中で０．５リットルまで成長し、そのプラスミドはｐ ＳＬＡ１０と表示された。ｐＳＬＡ１１の構築 次ぎの工程は、ｐＳＬＡ１０へのラットインスリンＩＩプロモーター（ＲＩＰ ）（配列番号：２）の挿入に関する。ＲＩＰは内部ＮｃｏＩ部位を含有するので 、このプロセスは２段階で実施した。ＲＩＰ ＤＮＡフラグメント自身（８７６ ｂｐ：５’フランクの７００ｂｐプラス第１イントロンを包含する５’非翻訳リ ーダーの１７６ｂｐ）を、１μＭの各オリゴヌクレオチド１９３８３．２８４（ 配列番号：１４）及び１９３８３．２９２（配列番号：１５）を用いる標準条件 （上記）下でＰＣＲによって合成した；３μｇのラットゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎ ｔｅｃｈ）を鋳型として用いた。オリゴヌクレオチド１９３８３．２９２は、Ｎ ｃｏＩ部位を介するＲＩＰのＩＡＰＰコーディング領域へのライゲーションを可 能にするために、開始コドンから５’側に２ヌクレオチドの単一塩基変化（Ａか らＣ）を含有する。ＰＣＲ生成物は、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した 。このＤＮＡを、２０μｌの１Ｘ ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ ａｂｓ）４制限緩衝液中に５単位のＮｃｏ Ｉと共に再懸濁し、３７℃において ２時間インキュベートした。２種ＤＮＡフラグメントをこの消化から、１．０％ ＧＴＧアガロースによって電気泳動し、臭化エチジウム染色によって可視化し、 ゲルスライスからＤＮＡのエレクトロエリューションすることによって回収した ：転写開始部位及び５’リーダー領域を含有する２Ｎｃｏ Ｉ末端を有する７０ ８ｂｐ ＤＮＡ並びにラットインスリンＩＩプロモーターの５’に最も隣接する 配列を含有する１６８ｂｐブラント末端／Ｎｃｏ Ｉフラグメント。 このプラスミドｐＳＬＡ１０を最初にＸｂａＩによって切断した。１０μｇの ｐＳＬＡ１０を、１００μｌの量の１Ｘ高塩制限緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中で２０単位のＸ ｂａ Ｉによって３７℃において２時間消化した。この反応を、フェノール／ク ロロホルム抽出と、その後のエタノール沈殿によって停止させた。５’一本鎖Ｄ ＮＡオーバーハングを次の重合工程によって埋め込んだ：このＤＮＡを１０μｌ の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡの中で再懸濁し、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ 単位のクレノウ酵素及び２５μＭ ｄＮＴＰｓを含有する最終反応量１００μｌ に加えた。この反応を室温において一晩進行させた。次の朝に、埋め込み反応を ６５℃において１０分間加熱することによってクレノウ酵素を不活性化した；後 に、２μｌの５Ｍ ＮａＣｌ及び５単位の制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ Ｉを 加え、この反応を３７℃において２時間進行させた。この切断反応は、３０％グ リセロール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２０ｍＭ エチレンジ アミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ブロモフェノールブルー（０．２５％ｗ／ｖ） 及びキシレンシアノール（０．２５％ｗ／ｖ）からなるゲル負荷緩衝液の２０μ ｌを加えることによって停止させた；生じたミックスを０．８％ ＧＴＧアガロ ースゲルによって電気泳動した。この線状形の消化したｐＳＬＡ１０プラスミド を、エレクトロエリューションと、その後のＧ−５０スピンカラムによる遠心及 びエタノール沈殿とによって回収した。沈殿したＤＮＡを１０μｌの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡの中で再懸濁した。２μｌ（１μｇ ）のこの溶液を、ラットインスリンプロモーターの１７４ｂｐ ブラント末端／ Ｎｃｏ Ｉフラグメント（０．２５μｇ）、５単位のＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガ ーゼ及び１Ｘ ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）ライゲーション緩衝液（２０μｌの最終用量）と共に、１６℃にお いて一晩インキュベートした。次の朝に、１０μｌのライゲーション反応を用い て、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ細胞を形質転換した。Ｍｉｎｉｐｒｅ ｐ ＤＮＡを１６コロニーの培養物から（材料と方法に記載したように）調製し た；２つは正しいサイズのＢａｍ ＨＩフラグメントを示した。これらのクロー ンのうちの一つは、より多いプラスミドＤＮＡ及び所定の名称ｐＳＬＡ１１の調 製のための材料及び方法に記載したように、ＤＮＡ ｍａｘｉｐｒｅｐとして増 殖した。 ｐＳＬＡ１１を２００μｌの用量の１Ｘ ＮＥＢ４緩衝液中で７．５単位のＮ ｃｏ Ｉと共に３７℃において２時間インキュベートし、次ぎに１０μｌの１ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０及び２２単位のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ アルカリフォスファターゼを添加し、さらに５０℃において２時間イン キュベートした。次ぎに、３回連続してフェノール／クロロホルム抽出し、エタ ノール沈殿させた。０．３２μｇのこの線状形のｐＳＬＡ１１を、２０単位のＮ ＥＢＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有する１Ｘ ＢＲＬライゲーション緩衝液（２０ μｌの用量）中で０．５μｇの上記した７６０ｂｐ Ｎｃｏ Ｉラットインスリ ンＩＩプロモーターフラグメントにライゲーションさせた；この反応は、１６℃ において一晩インキュベートした。１０μｌのこのライゲーション反応を用いて 、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ細胞を（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに記載 したように）形質転換した。この形質転換イベントから生じた８コロニーのうち １つのｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ調製物は、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ によって消化した場合にＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤによって供給されたＤＮＡ分子量マーカー との比較によって測定されたような正確なサイズのバンドを示した。このプラス ミドをＢａｍ ＨＩによって部分的に消化して、導入遺伝子インサート（長さ２ ．４ｋｂ）をＢａｍ ＨＩ−消化Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）にライゲー ションさせて、ＤＮＡ配列決定を促進させるためにｐＲＩＰＨＡＴ（配列番号： １）を生成した。５つの独立的に誘導されたクローンの１つは、不適切な突然変 異を全く示さず、これを用いて微量注入法のための導入遺伝子インサートを調製 した。 微量注入法のためのＲＩＰＨＡＴ ＤＮＡの調製 ３００μｇのｐＲＩＰＨＡＴ（配列番号：１）を、６００μｌの全反応量にお いて各３００単位の各制限エンドヌクレアーゼＸｂａ Ｉ及びＸｈｏ Ｉによっ て３７℃において２時間消化した。この反応を、２１ｍＭの濃度までのＥＤＴＡ 添加と、その後の負荷緩衝液の添加及び０．５％ ＧＴＧアガロースゲルによる 電気泳動の２ラウンドによって停止させた。２．４ｋｂＤＮＡフラグメントを含 有するゲルスライスを回収し、このＤＮＡをエレクトロエリューション（６５Ｖ 、３時間）によって単離した。このＲＩＰＨＡＴ導入遺伝子フラグメント（２． ４ｋｂ（配列番号：７））を、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ Ｅｌ ｕｔｉｐ−ｄカラムを使用し、製造者のプロトコールに従って、さらに精製した 。収量は、５．６μｇの精製ＲＩＰＨＡＴフラグメントであった。ｐＲＩＰＨＡ Ｔ１は、１９９５年４月２７日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、名称ＡＴＣＣ６９７９４を受けた。このＤＮ Ａが微量注入のためにＰｆｉｚｅｒトランスジェニック施設に与えられた。 マウス胚の微量注入とトランスジェニックマウスの作成 マウス胚の微量注入とトランスジェニックマウスの作成とを発表されている方 法によっておこなった。マウスの用意、微量注入法、注入された胚の再移植、仮 親の維持、及びトランスジェニック系統の回収と維持を述べる詳細な方法は、Ｇ ｏｒｄｏｎ，ＪとＲｕｄｄｌｅ，Ｆ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ １０１，４１１−４３３（１９８３）に見いだすことができる。胚はＦ ＶＢ／Ｎ系統の同系交配の雌Ｆ１子孫から単離した。Ｗａｇｎｅｒ，Ｔ．等ＰＮ ＡＳ７８，６３７６−６３８０（１９８１）が述べているように、但し、培養管 中で５日間インキュベーションする代わりに、注入済み卵を直ちにドナーの雌に 移して、実施した。再移植イベントから得られたマウスを尾のバオプシーから単 離したＤＮＡのスロット／サザンブロッティングによってそれらのゲノムＤＮＡ 中の導入遺伝子の存在に関して試験した。これらの試験の陽性動物を反対の性の 非トランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスに交配した。これらの交配の子孫を、尾 のバイオプシーを得て、それらからゲノムＤＮＡを単離し、プライマー２２０１ ８．１３４−１（５’ＣＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＴＧＧＧＴＴＴＧＴ３’）（配列 番号：１６）と２２０１８．１３４−２（５’ＧＴＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＴＡＡ ＡＧＧＧＧＣＡＡＧＴＡＡＴＴＣＡ３’）（配列番号：１７）とを用いて導入遺 伝子配列をＰＣＲ増幅して、診断用８８３ｂｐＰＣＲ ＤＮＡ生成物を得ること によって、導入遺伝子の伝達に関して試験した。 トランスジェニック系統の確立 導入遺伝子の存在に関して陽性と試験された子孫をトランスジェニック系統の 確立のためにＦＶＢ／Ｎマウスに検定交配した(backcrossed)。２８０個のＦＶ Ｂ／Ｎ胚の注入は１０匹のＲＩＰＨＡＴの始祖となる動物を作成することができ た。これらの始祖動物の中の６匹は、子孫の尾のバイオプシーから単離したゲノ ムＤＮＡからの導入遺伝子配列のＰＣＲ増幅によって測定すると、導入遺伝子を それらの子孫に移すことができた。 導入遺伝子を発現する系統の同定 ６系統からの子孫の種々な組織（膵臓、肝臓及び腎臓を包含する）から総ＲＮ Ａを調製した。ＲＮＡは、２ｍｌのＴＲＩＳＯＬＶ^TM（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）変性剤中で６０秒間各組織をポリ トロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎ ．Ｙ．）によってホモジナイズしたものから、単離した。４ｍｌのクロロホルム を添加して、ホモジネートを上部水性相と下部フェノール／クロロホルム相とに 分離させた。各ホモジネートの水相に等量のイソプロパノールを添加することに よって、ＲＮＡを沈殿させた。イソプロパノール沈殿物を１２，０００Ｇで４℃ において１０分間遠心分離し、７５％エタノールによって１回洗浄して、風乾さ せた。ＲＮＡサンプルを２００μｌの１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁させ、それら の濃度をＵＶ分光測光法によって測定した。Ｍａｎｉａｔｉｓが述べているよう に、１．０％ＧＴＧホルムアルデヒドアガロースゲルを用いて、ナイロン膜上に ブロッティングし、ブロットを、ＲＩＰＨＡＴ導入遺伝子内のヒトＧＡＰＤＨポ リアデニル化領域に相当する³²Ｐ標識ＤＮＡフラグメントにハイブリダイズさせ ることによって、ノーザン分析を実施した。系統ＲＨＡ、ＲＨＦ及びＲＨＣにお いてＲＩＰＨＡＴ特異的ＲＮＡが検出され、ＲＨＡとＲＨＦの系統はＲＨＣ系統 よりも１０倍高い膵臓発現を示した。ＲＨＦ系統をコロニー拡大のために選択し た。 系統ＲＨＦホモ接合体の発生 トランスジェニック半接合体ＲＨＦ子孫に兄弟−姉妹交配をおこなって、１： ２：１の比の非トランスジェニック：半接合体：ホモ接合体子孫を得た。トラン スジェニック子孫は尾のバイオプシーのＰＣＲ分析によって同定し；このグルー プ内のホモ接合体は、トランスジェニック体を野生型ＦＶＢ／Ｎメイト(mate)に 試験交配して、非トランスジェニック子孫を発生させないような動物を同定する ことによって同定した（推定ホモ接合体につき＞２０子孫）。この方法で同定さ れたホモ接合体間で交配させて、ＲＨＦホモ接合体のコロニーを得た。 血漿ＩＡＰＰレベルとインスリンレベルの測定 代表的な非トランスジェニック同腹仔、半接合体及びホモ接合体動物をＣＯ₂ 窒息によって殺した。２０Ｇ針と１ｍｌツベルクリン注射器とによって、窒息し た動物の大静脈穿刺から全血を回収した。この全血を凝血を防止するために１． ０ｍｌ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ血漿分離管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ ｎ，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）に移し、２０００Ｇで２分間遠心させて、血 漿を単離させた。この血漿をドライアイス中で迅速冷凍させ、−７０℃において 分析まで貯蔵した。 薬物スクリーニングのためのＲＨＦ系統ホモ接合体の使用 典型的に、動物を一定試験化合物の各投与量に対して１０匹ずつの群に分割し た。１日目、投与前に、眼窩後方眼出血によってこれらの血漿グルコースレベル を測定する。投与は１日目〜４日目まで、１日あたり、例えば０．１、１．０及 び１０ｍｇ／ｋｇのようにおこなう。５日目に、動物から採血し、血糖降下効果 を知るために、それらの空腹時血糖レベルを測定する。或いは、動物に経口糖耐 性試験（ＯＧＴＴ）をおこない、糖耐性の改良を実証する。次ぎに、血漿インス リンレベルを測定するために動物を貧血させ、インスリン濃度の低下を実証する 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ソーラー，ウォルター・シー アメリカ合衆国コネチカット州06355，ミ スティック，リッジウッド・ドライブ 322

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非ＩＡＰＰプロモーターと、ヒトアルブミンイントロンＩコーディング 配列に機能的に結合したヒトＩＡＰＰをコードする配列又はその活性なフラグメ ントと、ヒトＧＡＰＤＨ停止コーディング配列と、ヒトＧＡＰＤＨポリアデニル 化コーディング配列とを含む組換えＤＮＡであって、適当な宿主に組み込まれた ときに糖尿病表現型を発現させる組換えＤＮＡ。 ２．非ＩＡＰＰプロモーターがラットインスリンＩ、ラットインスリンＩＩ 、ヒトインスリン、マウスＩＡＰＰ、ラットＢ細胞特異的グルコキナーゼ、グル コーストランスポーター２ヒトチロシンアミノトランスフェラーゼ、ヒトアルブ ミン、マウスアルブミン、ラット肝臓特異的グルコキナーゼ及びマウスメタロチ オネインの遺伝子のプロモーターから成る群から選択される、請求項１記載の組 換えＤＮＡ。 ３．前記プロモーターがラットインスリンプロモーターＩＩである、請求項 ２記載の組換えＤＮＡ。 ４．ヒトＩＡＰＰをコードする前記配列又はその活性なフラグメントがゲノ ムＤＮＡの特徴を有する、請求項１記載の組換えＤＮＡ。 ５．ヒトＩＡＰＰをコードする前記配列又はその活性なフラグメントがｃＤ ＮＡの特徴を有する、請求項５記載の組換えＤＮＡ。 ６．前記配列が配列番号：１の配列である、請求項１記載の組換えＤＮＡ。 ７．ｃＤＮＡの前記配列が配列番号：３の配列である、請求項５記載の組換 えＤＮＡ。 ８．ヒトＩＡＰＰをコードする配列をマウスＩＡＰＰをコードする配列又は その活性なフラグメントによって置換する、請求項１記載の組換えＤＮＡ。 ９．前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項８記載の組換えＤＮＡ。 １０．請求項１記載の組換えＤＮＡを含むベクター。 １１．請求項４記載の組換えＤＮＡを含むベクター。 １２．請求項５記載の組換えＤＮＡを含むベクター。 １３．請求項１記載の組換えＤＮＡを含む真核細胞株。 １４．請求項４記載の組換えＤＮＡを含む真核細胞株。 １５．請求項５記載の組換えＤＮＡを含む真核細胞株。 １６．細胞がラットインスリノーマ（ＲＩＴ）細胞、ラットインスリノーマ （ＨＩＴ）細胞及びβ−ＴＣ３マウスインスリノーマ細胞から成る群から選択さ れる、請求項１３記載の細胞株。 １７．細胞がラットインスリノーマ（ＲＩＴ）細胞、ラットインスリノーマ （ＨＩＴ）細胞及びβ−ＴＣ３マウスインスリノーマ細胞から成る群から選択さ れる、請求項１４記載の細胞株。 １８．細胞がラットインスリノーマ（ＲＩＴ）細胞、ラットインスリノーマ （ＨＩＴ）細胞及びβ−ＴＣ３マウスインスリノーマ細胞から成る群から選択さ れる、請求項１３記載の細胞株。 １９．請求項１記載の組換えＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動 物。 ２０．請求項４記載の組換えＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動 物。 ２１．請求項５記載の組換えＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動 物。 ２２．前記動物がマウスである、請求項１９記載のトランスジェニック非ヒ ト哺乳動物。 ２３．前記動物がマウスである、請求項２０記載のトランスジェニック非ヒ ト哺乳動物。 ２４．前記動物がマウスである、請求項２１記載のトランスジェニック非ヒ ト哺乳動物。 ２５．ＩＡＰＰ遺伝子産物の過剰発現を特徴とする疾患を有する動物の治療 方法であって、前記ＩＡＰＰ遺伝子産物の過剰発現の阻害剤の治療有効量を前記 動物に投与することを含む上記方法。 ２６．前記治療剤を投与し、ＩＡＰＰをコードする遺伝子の過剰発現の産物 に対する前記治療剤の効果を評価することを含む、治療の効果を評価する方法。 ２７．前記治療剤を動物に投与する、請求項２６記載の方法。 ２８．前記動物がヒトである、請求項２７記載の方法。 ２９．対象が糖尿病又は肥満の危険状態にあるかどうかを判定する方法であ って、前記対象を、危険状態を示唆するＩＡＰＰ遺伝子産物の前記過剰発現に関 して検査することを含む上記方法。 ３０．障害又は疾患状態に関して動物モデルを評価する方法であって、前記 動物モデルにおいてＩＡＰＰ遺伝子が所定レベルで発現されるかどうかを判定す ることを含む上記方法。 ３１．前記レベルが野生型又は正常な動物におけるレベルよりも高い、請求 項３０記載の方法。