JPH10507346A - 増強された抗原性ヘリコバクターｓｐ．の作出方法およびそれを含むワクチン - Google Patents

増強された抗原性ヘリコバクターｓｐ．の作出方法およびそれを含むワクチン

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Abstract

(57)【要約】 腸内細菌の抗原または毒力因子(virulence factor)の発現を誘導または増強するための、in vitroプロセスを用いる方法を開示する。本方法はそれゆえ抗原的に増強された腸内細菌をもたらす。抗原的に増強された腸内細菌の使用方法、並びに該腸内細菌を含有するワクチンも開示する。特定すると、腸内細菌またはその構成成分がヘリコバクター(Helicobacter)種により提供される。開示した本発明にとって有用な腸内細菌はほかにも存在する。一つのタイプがカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)であり、C．jejuniの表面抽出物の加水分解産物からの単糖類の高速液体クロマトグラフィーの結果がグラフにより示さる。

Description

【発明の詳細な説明】 増強された抗原性ヘリコバクター sp.の作出方法 およびそれを含むワクチン 本出願は、1994年10月５日付けの係属中の米国特許出願第08/318,409号の一部 継続出願である。 １．発明の分野 本発明は、一般的には、腸内細菌の抗原および／または毒力因子(virulencefa ctor)の発現を誘導または増強することによって抗原的に増強された腸内細菌を 作出するin vitro方法、抗原的に増強された腸内細菌を用いる方法、ならびに抗 原的に増強された腸内細菌を含有するワクチンに関する。 ２．発明の背景 従来の培地と条件を使ってin vitroで培養した細菌は、その天然の棲息場所（ 動物宿主内の正常な微生物相または病原体のin vivo棲息を含む）での成長中に 発現される特性とは異なる特性を発現することが広く認められている。したがっ て、このようにin vitroで成長させた病原性細菌はワクチン成分として使用する には好適でないかもしれない。しかし、毒力因子、問題となる生理学的特性、ま たは外表面抗原を含めた抗原の発現を誘導または増強する条件を規定することが 可能であれば、重要な生産物や治療剤（例えば、ワクチン用の新抗原、抗生物質 用の新標的、および診断に応用できる新規な細菌の特性）がすみやかに同定され るだろう。 細菌の毒力決定因子の発現に影響を与える環境要因がいくつか確認されている (Mekalanos，J.J.，J．Bacteriol．174:1-7，1992)。例えば、鉄と細菌の毒力と の関係を研究する歴史は長く、特に、Shigella（赤痢菌）（Payne，Mol.MicroBi ol.，3:1301-1306，1989）、Neisseria（ナイセリア）（Payne and Finkelstein ，J．Clin．Microbiol.，6:293-297，1977）およびPasteurella (パスツレラ菌)（Gilmourら，Vaccine，9:137-140，1991）に関して研究されて いる。 植物と動物のさまざまな細菌の同調調節される毒力決定因子の発現をコントロ ールすることが判明した他の環境シグナルとして、フェノール性化合物、単糖、 アミノ酸、温度、容量オスモル濃度、その他のイオン類がある(Mekalanos，J.Ba cteriol.，174:1-7，1992)。 腸から（すなわち、経口的に）動物宿主に侵入する病原菌は、細菌の生理や毒 力因子の発現に影響を及ぼしうる数多くの宿主環境成分および条件に出くわす。 こうした成分および条件には、胆汁、胆汁酸またはその塩、胃ｐＨ、微好気性条 件（腸内は高ＣＯ2で低Ｏ2である）、容量オスモル濃度、そしてまだ確定されて いない多くの他の要因が含まれる。侵襲性の腸内病原菌は内在化を行うためにde novoタンパク質合成を必要とする(Headley and Payne，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，87:4179-4183，1990)。それゆえ、細菌はin vitroでは通常存在しないあ る種の環境シグナルに応答するときだけこれらの侵入因子を最適に生産しうる。 この仮説は、従来の方法で成長させたC．jejuniに特異的な抗血清がin vitro内 在化を阻止するのに不十分な効果しか発揮しないという報告により支持される（ Konkelら，J．Infect．Dis.，168:948-954，1993）。しかし、侵入を増強する条 件である上皮細胞の単層の存在下で成長させたCampylobacter(カンピロバクター 菌)の抽出物でウサギを免疫すると、結果的にこの細菌の内在化を顕著に阻害す る抗血清が産生された。 問題となる毒力因子を同定するために、研究者らは腸内環境のもとでの細菌の 成長を研究してきた。例えば、ウサギの回腸ループ内で成長させたCampylobacte r 81-176株は、通常の実験室のin vitro培養条件下では発現しなかったタンパク 質を発現する（Panigrahiら，Infect．Immun.，60:4938-4944，1992）。INT407 細胞の単層とともに培養したCampylobacterでは、上皮細胞の不在下で培養した 該細菌と比べて、タンパク質の新たな合成または増強された合成が見られた（Ko nkelら，J．Infect．Dis.，168:948-954，1993）。さらに、こうした変化はC．j ejuniの侵襲力増加とも一時的に関連していた。C．jejuniの無毒性株においては 、その他の変化、例えば細胞の形態、鞭毛の消失、新しい外 膜タンパク質の発現、細胞表面の炭水化物の変化などが、ニワトリの胚に静脈内 および漿尿膜通過させるとき、誘導または増強された（Fieldら，J．Med．Micro biol.，38:293-300，1993）。 胆汁酸やその塩のような他の腸内成分は一部の細菌にとって抑制的であること が知られているが、胆汁酸は細菌による毒力発現に影響を与えることによって別 の役割を果たしているのかもしれない。 PopeとPayne（93rd Am．Soc．Microbiol.，B-147，1993）は、ケノデオキシコ ール酸ナトリウムを含有する培地で成長させたShigella flexneri（フレクスナ ー赤痢菌）が３〜５倍高いHeLa細胞単層への感染力を示したと報告した。しかし 、彼らは、他の胆汁塩や界面活性剤、例えばコール酸塩、グリココール酸塩、タ ウロデオキシコール酸塩、CHAPS系列、ジギトニン、トリトンX100およびそのナ トリウム塩などはS．flexneriの侵襲力に全く影響を及ぼさなかったと報告した 。その上、ケノデオキシコール酸塩を含有する彼らの培地はE．coliや他のShige llaの無毒性株の侵襲力に対して何も影響を及ぼさなかった。 S．flexneriの新タンパク質の合成はまた、増殖培地のｐＨ、温度およびイオ ン組成を変えることによっても誘導される（Mekalanos，J．Bacteriol．174:1-7 ，1992）。 1993年11月11日に公開されたＰＣＴ出願公開番号WO 93/22423には、ホスファ チジルセリンのような脂質または粘液の存在下で細菌を増殖させる方法、および ホスファチジルセリンの存在下で増殖させることにより発現が高められたタンパ ク質を単離する方法が記載されている。この文献は増強された毒力または抗原特 性を有する腸内細菌を作出するという本発明の方法を開示も示唆もしていない。 CampylobacterやShigellaなどの多くの腸内病原菌に対するワクチンは今のと ころ入手不能であるが、これらの病原菌の疫学によれば、こうしたワクチンが重 要な目標となる。細菌性赤痢は世界中に広がっている風土病であり、開発途上国 では毎年下痢により死亡する500万人の子供の約10%を占めている。Campylobacte rは、つい最近腸内病原菌であると同定されたものであるが、今では開発途上国 と低開発国の両方において下痢疾患の主要な原因の一つであると理解されている 。Campylobacterによる下痢は毎年概算で４〜５億の症例が発症し ており、200万以上の症例が米国で発生している。 細菌性赤痢は結腸粘膜の細菌侵襲の結果である。この侵襲はすべての侵襲性分 離株に見られるプラスミドの存在と関連している（Sansonettiら，Infect．Immu n.，35:852-860，1982）。このプラスミドの断片は侵入プラスミド抗原(Ipa)遺 伝子のIpa A，-B，-Cおよび-Dを含んでいる。Ipa B，-Cおよび-Dタンパク質は侵 入過程において不可欠である(Baudryら，J．Gen．Microbiol.，133:3403-3413， 1987)。 Ipaタンパク質は論理にかなったワクチン候補であるが、その防御効果は明確 には確立されていない。Ipa BとIpa Cは免疫優性タンパク質である（Haleら，In fect．Immun.，50:620-629，1985）。さらに、62kDaのIpa Bタンパク質（細胞侵 入を開始させ、膜結合ファゴサイト液胞の溶解において機能するインベーシン） (Highら，EMBO J.，11:1991-1999，1992)は、Shigella菌種の間で高度に保存さ れている。Shigella Ipaに対する重要な粘膜抗体を持ち合わせていない発育不良 の子供たちに観察された長期の病気は、Ipaに対する粘膜抗体の存在が感染の広 がりや重症度を制限しうることを示唆している。 Shigellaの多数のワクチン候補がヒトと動物において試験されたが、成功した ものはまだ存在しない。毒力におけるIpaタンパク質の潜在的重要性にもかかわ らず、細菌性赤痢に対して開発された大部分のワクチン候補は血清型特異的決定 基をもっているリポ多糖抗原に基づくものである。非経口的に投与される多糖− タンパク質複合ワクチンも開発されたが、これはまだ動物において有意な防衛を 示していない(Robbonsら，Rev．Inf．Dis.，13:S362-365，1991)。同様に投与さ れるリボソームワクチンは粘膜免疫を引き出すが、その防御効力はまだ証明され ずに残っている（Levensonら，Arch．Allergy Appl．Immunol.，87:25-31，1988 ）。 Campylobacter感染の病因はShigella感染ほどにはよく理解されていない。in vitro細胞侵入研究（Konkelら，J．Infect．Dis.，168:948-954，1993）および 組織病理学的検査（Russellら，J．Infect．Dis.，168:210-215，1993）から、 結腸への侵入も重要であることが提唱された。この結論は、Campylobacterによ り引き起こされる下痢が重症であり、血便を伴うという観察と一致する。これら の作用は免疫優性の62kDaのフラジェリンタンパク質と関係があるらしい。最近 の報告から、Campylobacterが分極した上皮細胞単層を通過するには鞭毛の存在 が不可欠であることがわかった（Grantら，Infect．Immun.，61:1764-1771，199 3）。 特定のCampylobacter抗原はどれも防御抗原として確立されていない。しかし 、低分子量（28〜31kDa）タンパク質、つまりPEBタンパク質、および免疫優性鞭 毛タンパク質はこれに関して有望であると考えられる(Pavlovskisら，Infect．I mmun.，59:2259-2264，1992; Blaser and Gotschilch，J．Bio．Chem.，265:145 29-14535，1990)。鞭毛タンパク質の重要性は腸のコロニー形成およびLiorサブ グループ内の感染に対する交差菌株防御との関連により示される（Pavlovskisら ，Infect．Immun.，59:2259-2264，1992）。しかしながら、鞭毛タンパク質をベ ースとするCampylobacterワクチンは、８−10の最も臨床的に関係のあるLior血 清グループに由来する鞭毛タンパク質抗原を含む必要があるかもしれない。 したがって、本発明の対象は、１）侵入活性および／またはある種の細胞特性 （細胞表面特性を含む）を最適に誘導または増強する、腸内細菌を培養または処 理するためのin vitro培養条件；２）相互に関連のある改変された侵入性または 細胞特性（抗原プロフィールの変化を伴う表面特性を含む）；３）小動物モデル におけるこれらの微生物の増大した毒力；および４）従来の方法で成長させた細 菌に対する抗血清よりもin vitroまたはin vivoチャレンジに用いた生存微生物 を中和するのに有効である、侵入性を増強したまたは特性（表面特性を含む）を 改変した微生物に対する抗血清；を包含する。本発明はこれらのおよび他のニー ズに対処するものである。 上述した文献はどれも本発明のin vitro方法と抗原的に増強された腸内細菌を 含有する本発明のワクチンを教示も示唆もしていない。本節または本明細書の他 の節で引用した文献は、かかる文献が本発明に対する先行技術として利用可能で あることを示すものと解釈されるべきでない。 ３．発明の概要 本発明は、毒力因子およびその他の抗原の存在を誘導または増強するための、 腸内細菌の増殖培地に組み入れる成分および規定された培養条件を提供する。好 ましくは、こうした抗原は免疫原性がある。より好ましくは、免疫原性のある抗 原は毒力指数と関係がある。 腸内細菌は該細菌が自然界でさらされるいくつかのin vivo状態を模倣する状 態および成分の存在下で成長させる。本発明の方法は、細胞あたりの総タンパク 質量の増加、新タンパク質または増加した個々のタンパク質、表面炭水化物の変 化または増加、表面リポ多糖の変化、付着力の増加、侵入力の増加および／また は細胞内遊走(swarming)の増加といった表現型の変化を伴う、抗原的に増強され た腸内細菌をもたらす。さらに、本発明の方法は商業的使用のために実際的なス ケールアップ発酵に適応させることができる。 前記の抗原的に増強された腸内細菌は、不活化全細胞ワクチンやサブユニット ワクチンのような防御ワクチンをつくるために、抗体の産生や病原性腸内細菌の 検出といった診断目的に、または抗生物質の生産に用いることができる。さらに 、本発明の増強された腸内細菌により誘導された抗体は受身ワクチンとして使用 することができる。 したがって、本発明の目的は、増強された抗原特性を有するCampylobacter sp .（カンピロバクター sp.）、Yersinia sp.（エルシニア sp.）、Helicobacter sp.（ヘリコバクター sp.）、Gastrospirillum sp.(ガストロスピリラム sp.)、 Bacteroides sp.(バクテロイデス sp.)、Klebsiella sp.（クレブシェラ sp.） 、Enterobacter sp.（エンテロバクター sp.）、Salmonella sp.(サルモネラ sp .)、Shigella sp.（シゲラ sp.）、Aeromonas sp.(アエロモナス sp.)、Vibrio sp.（ビブリオ sp.）、Clostridium sp.(クロストリジウム sp.)、Enterococcus sp.（エンテロコッカス sp.）およびEscherichia coli(エシェリキア・コリ)よ り成る群から選ばれる腸内細菌の作出方法であって、該方法は、腸内細菌を、ａ ）0.05〜3%の胆汁または0.025〜0.6%の１以上の胆汁酸もしくはその塩、30〜42 ℃の温度で、早期対数増殖期付近、早期対数期と定常期の間、または定常期付近 の成長相まで、空気中または微好気性条件下（例えば5〜20%CO2と80〜95%空気、 5〜20%CO2と80〜95%N2、または5〜10%O2と10〜20%CO2と70〜85%N2）で、場合に より２価カチオンキレート剤（例え ば、限定するものではないが、0〜100μM、好ましくは25μMのBAPTA/AM、0〜10m MのEGTA、および0〜100μMのEGTA/AM）の存在下で；またはｂ）２価カチオンキ レート剤（例えば、1.0〜100μM、好ましくは25μMのBAPTA/AM、0.5〜10mMのEGT A、および1〜100μMのEGTA/AM）の存在下、および胆汁、胆汁酸または胆汁塩の非存在下 で行うことを除いてａ）と同じ条件；を含む組合せ条件を用いてin vit roで成長させることを含んでなる。 本発明によれば、各胆汁酸またはその塩の濃度は0.025〜0.6%、好ましくは0.0 5〜0.5%、より好ましくは0.05〜0.2%であり、0.05%または0.1%が最適である。胆 汁酸またはその塩がデオキシコール酸（塩）またはグリココール酸（塩）を含む 方法が好適である。 本発明の更なる目的は、増強された抗原特性を引き出すために、ａ）0.05〜3% の胆汁または0.025〜0.6%の１以上の胆汁酸もしくはその塩、30〜42℃の温度で 、早期対数増殖期付近、早期対数期と定常期の間、または定常期付近の成長相ま で、空気中または微好気性条件下（例えば5〜20%CO2と80〜95%空気、5〜20%CO2 と80〜95%N2、または5〜10%O2と10〜20%CO2と70〜85%N2）で、場合により２価カ チオンキレート剤（例えば、限定するものではないが、0〜100μM、好ましくは2 5μMのBAPTA/AM、0〜10mMのEGTA、および0〜100μMのEGTA/AM）の存在下で；ま たはｂ）２価カチオンキレート剤（例えば、1.0〜100μM、好ましくは25μMのBA PTA/AM、0.5〜10mMのEGTA、および1〜100μMのEGTA/AM）の存在下、および胆汁 、胆汁酸または胆汁塩の非存在下で行うことを除いてａ）と同じ条件；を含む組 合せ条件のもとでin vitroで成長させてなる、Campylobacter sp.（カンピロバ クター sp.）、Yersinia sp.（エルシニア sp.）、Helicobacter sp.（ヘリコバ クター sp.）、Gastrospirillum sp.(ガストロスピリラム sp.)、Bacteroides s p.(バクテロイデス sp.)、Klebsiella sp.（クレブシェラ sp.）、Enterobacter sp.（エンテロバクター sp.）、Salmonella sp.（サルモネラ sp.）、Shigella sp.（シゲラ sp.）、Aeromonas sp.(アエロモナス sp.)、Vibrio sp.（ビブリ オ sp.）、Clostridium sp.(クロストリジウム sp.)、Enterococcus sp.（エン テロコッカス sp.）およびEscherichia coli(エシェリキア・コリ)より成る群か ら選ばれる腸内細菌である。 本発明の別の目的は、増強された抗原特性を有するCampylobacter sp.（カン ピロバクター sp.）、Yersinia sp.（エルシニア sp.）、Helicobacter sp.（ヘ リコバクター sp.）、Gastrospirillum sp.(ガストロスピリラム sp.)、Bactero ides sp.(バクテロイデス sp.)、Klebsiella sp.（クレブシェラ sp.）、Entero bacter sp.（エンテロバクター sp.）、Salmonella sp.（サルモネラ sp.）、Sh igella sp.（シゲラ sp.）、Aeromonas sp.(アエロモナス sp.)、Vibrio sp.（ ビブリオ sp.）、Clostridium sp.(クロストリジウム sp.)、Enterococcus sp. （エンテロコッカス sp.）およびEscherichia coli(エシェリキア・コリ)より成 る群から選ばれる完全な腸内細菌もしくはその構成成分、またはその免疫原性断 片もしくは誘導体、および場合により製剤学的に許容される担体または希釈剤、 を含有するワクチンである。 不活化された抗原的に増強された腸内細菌を含有するワクチンが好適である。 本発明の更なる目的は、アジュバントをさらに含むワクチンである。 本発明の更なる目的は、本発明の腸内細菌の少なくとも１つの抗原決定基に特 異的に結合することができる抗体（抗血清、精製ＩｇＧまたはＩｇＡ抗体、Ｆａ ｂ断片などを含むが、これらに限らない）に向けられる。このようなポリクロー ナルおよびモノクローナル抗体は、動物または動物由来の生物学的サンプル中に 存在する腸内細菌を検出するためのイムノアッセイ試薬として有用である。また 、本発明のポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、腸内細菌による感染お よび疾病の防衛に用いる受身ワクチンとしても有用である。 本発明の更なる目的は、Campylobacter sp.(カンピロバクター sp.)、Yersini a sp.（エルシニア sp.）、Helicobacter sp.（ヘリコバクター sp.）、Gastros pirillum sp.(ガストロスピリラム sp.)、Bacteroides sp.(バクテロイデス sp. )、Klebsiella sp.（クレブシェラ sp.）、Enterobacter sp.（エンテロバクタ ー sp.）、Salmonella sp.（サルモネラ sp.）、Shigella sp.（シゲラ sp.）、 Aeromonas sp.(アエロモナス sp.)、Vibrio sp.（ビブリオ sp.）、Clostridium sp.（クロストリジウム sp.）、Enterococcus sp.（エンテロコッカス sp.）お よびEscherichia coli(エシェリキア・コリ)より成る群から選ばれる、増強され た抗原特性を有する腸内細菌を潜在的な抗菌剤と接触させ、殺菌ま たは静菌効果を調べる工程を含んでなる、潜在的な抗菌剤のin vitroアッセイ法 である。 本発明のさらに他の目的は、宿主由来の生物学的サンプルを、Campylobacter sp.(カンピロバクター sp.)、Yersinia sp.（エルシニア sp.）、Helicobacter sp.（ヘリコバクター sp.）、Gastrospirillum sp.(ガストロスピリラム sp.)、 Bacteroides sp.(バクテロイデス sp.)、Klebsiella sp.（クレブシェラ sp.） 、Enterobacter sp.（エンテロバクター sp.）、Salmonella sp.（サルモネラ s p.）、Shigella sp.（シゲラ sp.）、Aeromonas sp.(アエロモナス sp.)、Vibri o sp.（ビブリオ sp.）、Clostridium sp.(クロストリジウム sp.)、Enterococc us sp.（エンテロコッカス sp.）およびEscherichia coli(エシェリキア・コリ) より成る群から選ばれる、増強された抗原特性を有する本発明の腸内細菌、その 抗原またはそれに対する抗体と接触させ、抗体：抗原相互作用をスクリーニング する工程を含んでなる、宿主の抗体産生を検出するための、または動物もしくは 動物由来の生物学的サンプル中の腸内細菌を検出するためのin vitro法である。 本発明の別の目的は、Campylobacter sp.(カンピロバクター sp.)、Yersinia sp.（エルシニア sp.）、Helicobacter sp.（ヘリコバクター sp.）、Gastrospi rillum sp.(ガストロスピリラム sp.)、Bacteroides sp.(バクテロイデス sp.) 、Klebsiella sp.（クレブシェラ sp.）、Enterobacter sp.（エンテロバクター sp.）、Salmonella sp.（サルモネラ sp.）、Shigella sp.（シゲラ sp.）、Ae romonas sp.(アエロモナス sp.)、Vibrio sp.（ビブリオ sp.）、Clostridium s p.(クロストリジウム sp.)、Enterococcus sp.（エンテロコッカス sp.）および Escherichia coli(エシェリキア・コリ)より成る群から選ばれる、増強された抗 原特性を有する腸内細菌またはそれに対する抗体、および他の全ての必須キット 成分を含んでなる、腸内細菌に対する宿主の抗体産生を検出するための、または 腸内細菌を検出するための診断用キットに関する。 本発明の種々の面で関係する好適な腸内細菌は、Campylobacter jejuni（カン ピロバクター・ジェジュニ）、Campylobacter coli（カンピロバクター・コリ） 、Yersinia enterocolitica(エルシニア・エンテロコリチカ)、Yersinia pestis(ペスト菌)、Yersinia pseudotuberculosis(偽結核エルシニア菌)、Esche richia coli（エシェリキア・コリ）、Shigella flexneri(フレクスナー赤痢菌) 、Shigella sonnei(ソネ赤痢菌)、Shigella dysenteriae（志賀赤痢菌）、Shige lla boydii(ボイド赤痢菌)、Helicobacter pylori(ヘリコバクター・ピロリ)、H elicobacter felis(ヘリコバクター・フェリス)、Gastrospirillum hominus(ガ ストロスピリラム・ホミヌス)、Vibrio cholerae(コレラ菌)、Vibrio parahaemo lyticus(ビブリオ・パラヘモリチクス)、Vibrio vulnificus(ビブリオ・バルニ フィクス)、Bacteroides fragilis（バクテロイデス・フラギリス）、Clostridi um difficile(クロストリジウム・ディフィシル)、Salmonella typhimurium（ネ ズミチフス菌）、Salmonella typhi（チフス菌）、Salmonella gallinarum(トリ チフス菌)、Salmonella pullorum(サルモネラ・プロラム)、Salmonella cholera esuis(豚コレラ菌)、Salmonella enteritidis（腸炎菌）、Klebsiella pneumoni ae(肺炎杆菌)、Enterobacter cloacae（エンテロバクター・クロアカ）、および Enterococcus faecalis（エンテロコッカス・フェーカリス）である。好適なEsc herichia coli（エシェリキア・コリ）としては腸管毒性株、腸管出血性株、腸 管侵入性株、腸管病原性株、または他の菌株があり、これらに限らない。 本発明は、一部には、本発明の抗原的に増強された腸内細菌が、従来の培養条 件を用いて成長させた同じ腸内細菌により誘導される免疫応答よりも、同一細菌 種のより広範囲の菌株または血清型に対して交差防御的な免疫応答を誘導すると いう驚くべき発見に基づいている。少なくとも一例において、本発明の抗原的に 増強された腸内細菌により誘導された免疫応答は、腸内細菌の異なる種に対して 交差防御的である。 ４．図面の簡単な説明 図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、C．jejuni 81-176の表面抽出物の加水分解産物か らの単糖類の高速液体クロマトグラフィーの結果をグラフにより示す。図１Ａ： 標準品：フコース“Fuc”、N-アセチル-ガラクトサミン“GalNac”、N-アセチル -グルコサミン“GlcNac”、ガラクトース“Gal”、グルコース“Glc”、マンノ ー ス“Man”。図１Ｂ：従来の方法で成長させた細菌の表面抽出物“BHI”。図１Ｃ ：本発明の方法で成長させた細菌の表面抽出物“DOC”。 図２は、従来の方法“BHI”で成長させた、または本発明の方法（0.8%Oxgall 胆汁酸“OX”または0.1%デオキシコール酸塩“DOC”）で成長させたC．jejuni81 -176の全細胞（カラム1、2および3）または表面抽出物（カラム5および6）のタ ンパク質の比較を示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（SDS-PAGE）の結果である。 図３は、C．jejuni 81-176の全細胞を感染させることにより産生されたフェレ ットＩｇＡ含有粘液により結合されたタンパク質の比較を示すウエスタンブロッ ト分析の結果である。従来の方法で成長させたC．jejuni 81-176の全細胞“１” ；または本発明の方法で成長させたC．jejuni 81-176の全細胞：0.8%Oxgall胆汁 酸“２”または0.1%デオキシコール酸塩“３”；または従来の方法で成長させた C．jejuni 81-176の表面抽出物“４”；本発明の方法（0.1%デオキシコール酸塩 ）で成長させたC．jejuni 81-176の表面抽出物“５”。 図４は、本発明の方法で成長させた“３”、従来の方法で成長させた“２”、 または本発明の方法により発酵槽内で成長させた“１”C．jejuni 81-176の全細 胞由来のフラジェリン特異的モノクローナル抗体により結合されたタンパク質の 比較を示すウエスタンブロット分析の結果である。 図５は、従来の方法で成長させた(カラム“１”)、または本発明の方法（0.1% デオキシコール酸塩）で成長させた（カラム“２”）S．flexneri 2457Tの全細 胞のリポ多糖類(LPS)の比較を示すSDS-PAGEの結果である。 図６は、本発明の方法で成長させたC．jejuni 81-176の免疫交差反応性の増強 をグラフにより示す。従来の方法で、または実施例５に示すように本発明の方法 (DOC)で成長させたC．jejuni 81-176細胞を用いて抗体を誘導した。種々のC.jej uni血清型に対する２種類の抗体（すなわち、BHIで培養したときの抗C．jejuni 81-176およびDOCで培養したときの抗C．jejuni 81-176）の凝集活性を示す。詳 細については第９節の実施例３２を参照のこと。 図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、C．jejuni 81-176生存細胞の鼻腔内投与チャレン ジからマウスを防御する場合の不活化C．jejuni 81-176全細胞含有ワクチンの効 力をグラフにより示す。リン酸緩衝溶液（PBS;実線）、PBS+LTアジュバント（ア ジュバント；破線）、実施例５にしたがって成長させ回収したアジュバント不含 有（CWC;白丸／実線）またはLTアジュバント含有（CWC+アジュバント；黒丸／実 線）のホルマリン不活化C．jejuni 81-176全細胞をマウスに接種した。ワクチン の効力は腸管定着アッセイを用いて試験した。図７Ａ（上のパネル）は、１回に つき１０5個の不活化細菌粒子を３回経口接種することにより付与された防御の 結果を示す。図７Ｂ（中のパネル）は、１回につき１０7個の不活化細菌粒子を ３回経口接種することにより付与された防御の結果を示す。図７Ｃ（下のパネル ）は、１回につき１０9個の不活化細菌粒子を３回経口接種することにより付与 された防御の結果を示す。詳細については第１１節の実施例３４を参照のこと。 図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、C．jejuni 81-176生存細胞の経口投与チャレンジ からマウスを防御する場合の不活化C．jejuni 81-176全細胞含有ワクチンの効力 をグラフにより示す。図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃの簡単な説明に記載したとおりに マウスにワクチンを接種した。ワクチンの効力は腸管定着アッセイを用いて試験 した。図８Ａ（上のパネル）は、１回につき１０5個の不活化細菌粒子を３回経 口接種することにより付与された防御の結果を示す。図８Ｂ（中のパネル）は、 １回につき１０7個の不活化細菌粒子を３回経口接種することにより付与された 防御の結果を示す。図８Ｃ（下のパネル）は、１回につき１０9個の不活化細菌 粒子を３回経口接種することにより付与された防御の結果を示す。実験の詳細に ついては第９節の実施例３４を参照のこと。 図９は、Shigella flexneri 2457T細胞の侵入性に及ぼすShigella flexneri培 養物の成長相の影響をグラフにより示す。Shigella flexneri 2457T細胞は従来 の方法(BHI)、または実施例９に示した本発明の方法(DOC-EL)（培養物が早期対 数期にあるとき細胞を収穫する）、または実施例９に従うが培養物を後期対数期 に至らせた後に細胞を収穫する方法(DOC-LL)で成長させた。これらの異なる細胞 調製物の侵入性を示す。詳細については第１２節の実施例３５を参照のこと。 図１０は、Shigella細胞を本発明の方法を用いて培養したときの該細胞の侵入 性の増強をグラフにより示す。S．sonneiとS．dysenteriae 3818を従来の方法(B HI)、または実施例９に示した本発明の方法により培養した。INT-407細胞に 対するこれらの異なるShigella細胞調製物の侵入性を示す。詳細については第１ ２節の実施例３５を参照のこと。 図１１は、本発明の方法にしたがって成長させたShigellaの免疫交差反応性の 増強をグラフにより示す。実施例９に示した本発明の方法により成長させたS．f lexneri 2457Tを用いて抗体を誘導した。従来の方法(BHI)、または実施例９に示 した本発明の方法により成長させたS．flexneri、S．sonnei、S．dysenteriaeお よびS．boydiiに対する誘導抗体の凝集活性を示す。詳細については第１２節の 実施例３６を参照のこと。 図１２は、Helicobacter pylori NB3-2細胞の付着性に及ぼす胆汁濃度およびH elicobacter pylori培養物の成長相の影響をグラフにより示す。0%、0.025%、0. 05%または0.1%の胆汁を含む培地でH．pylori NB3-2細胞を成長させ、接種の８、 10、12および18時間後に収穫した。H．pylori NB3-2細胞のこれらの異なる調製 物のINT-407細胞に対する侵入を示す。詳細については第１４節の実施例３８を 参照のこと。 図１３は、Helicobacter pylori G1-4細胞の付着性に及ぼす胆汁濃度およびHe licobacter pylori培養物の成長相の影響をグラフにより示す。0%、0.1%または0 .2%の胆汁を含む培地でH．pylori G1-4細胞を成長させ、接種の６、８、10、12 、14および16時間後に収穫した。H．pylori G1-4細胞のこれらの異なる調製物の INT-407細胞に対する侵入を示す。詳細については第１５節の実施例３８を参照 のこと。 ５．発明の詳細な説明 本発明の方法は、抗原および／または毒力因子の発現を誘導または増強するた めに選択された、ある種の条件とある種の成分との組合せの存在下で腸内細菌を in vitroで成長させることに関する。 本明細書および請求の範囲で用いる「腸内」とは、動物の胃腸管のいずれかの 部分に常在するかまたはそれと関連している細菌、および動物の胃腸管のいずれ かの部分において感染を引き起こす細菌を指す。このような腸内細菌にはグラム 陽性とグラム陰性の両方の細菌が含まれる。 本明細書および請求の範囲で用いる「成分」および「条件」とは、腸内細菌の 天然のin vivo環境およびその他の要因と関連している多くの要因を指す。この ような成分および条件として、胆汁、胆汁酸またはその塩またはコレステロール などのその生物学的前駆物質、ｐＨ、微好気性条件、容量オスモル濃度、所望の 細菌成長相で細菌を収穫または回収することなどがある。 本明細書および請求の範囲で用いる「抗原」とは、細胞の形態または細胞の運 動性に関与する巨大分子、タンパク質、特に表面タンパク質、リポ多糖類および 炭水化物を含むがこれらに限らない抗原を指す。かかる抗原は免疫原性があるこ とが好ましい。 本明細書および請求の範囲で用いる「免疫原性」とは、本発明により作出され た全細菌または全細菌の断片を含有する組成物に動物をさらした後に、該動物の 体内で抗体産生を誘導する能力のことである。 本明細書および請求の範囲で用いる「抗原的に増強された」または「増強され た抗原特性」または「増強された」とは、本発明の方法にしたがって成長させた 腸内細菌の抗原状態をいう。このような細菌は、従来の方法を用いて成長させた 同一の細菌と比べて、より高いレベルの特定の免疫原性抗原および／または新た な免疫原性抗原を有する。 本明細書および請求の範囲で用いる「従来」とは、先行技術において知られて いるものを指す。 本明細書および請求の範囲で用いる「微好気性条件」とは、嫌気性条件または 上昇したCO2濃度、例えば5〜20%CO2と80〜95%空気、5〜20%CO2と80〜95%N2、ま たは5〜10%O2と10〜20%CO2と70〜85%N2を指す。 本明細書および請求の範囲で用いる「毒力」とは、宿主に付着しかつ／または 宿主内に侵入しかつ／または宿主内で生存しかつ／または病理学的状態を引き起 こす能力と関連した腸内細菌の因子を指す。 本明細書および請求の範囲で用いる「免疫交差防御」とは、ある細菌株または 血清型（全細胞または他のもの）により誘導された免疫応答が同一属の異なる細 菌株、血清型または種による同一宿主の感染を防止または軽減できることを意味 する。 本明細書および請求の範囲で用いる「免疫交差反応」とは、ある細菌株または 血清型（全細胞または他のもの）により誘導された体液性免疫応答（すなわち、 抗体）が同一属の異なる細菌株、血清型または種と交差反応（すなわち、抗体結 合）することができることを意味する。免疫交差反応性は細菌免疫原の免疫交差 防御能力を示しており、その逆もいえる。 本明細書および請求の範囲で用いる「宿主」とは、動物におけるin vivoまた は動物細胞培養物におけるin vitroのいずれかを指す。本明細書および請求の範 囲で用いる「動物」としては、哺乳類や鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョ ウ、アヒルなど）のような全ての温血動物が含まれるが、これらに限らない。 本発明によると、抗原的に増強された腸内細菌またはその免疫原性断片もしく は誘導体を含有するワクチンにおいて、腸内細菌は生きている細菌であっても不 活化されていてもよく、ミョウバン、油−水エマルジョン、毒素原性大腸菌由来 の熱不安定性トキシン（ＬＴ）、その非毒性形態（例えば、ｍＬＴ）および／ま たはその各サブユニット、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）、またはフロイント アジュバントのようなアジュバントをさらに含むことができ、また、生理食塩水 、デキストロースまたは他の水溶液を含むがこれらに限らない適当な製剤上の担 体をさらに含むことができる。他の適当な製剤上の担体はこの分野での標準的な 参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company に記載されている。本明細書および請求の範囲で用いる「ワクチン」は、病原菌 （その感染または疾病の防御が求められている）と特異的に結合する抗体を含有 する「受身ワクチン」をも包含する。 本明細書および請求の範囲で用いる「不活化細菌」とは、感染能および／また は定着能のない腸内細菌のことであり、死滅した細菌ばかりでなく弱毒化された ものをも含む。弱毒化細菌は複製しうるが、感染や疾病を引き起こすことはない 。細菌の不活化は当業者に知られたどのような方法で行ってもよい。例えば、細 菌を化学的に（例えばホルマリン固定により）不活化することができ、また、物 理的に（例えば熱処理、音波処理、照射により）不活化することもできる。こう して細菌は複製能および／または感染能および／または病気を引き起こす能力を 失うこととなる。 有効量のワクチンが投与されるべきであり、ここで「有効量」とは被験者にお いて免疫応答を生じさせることができる腸内細菌またはその免疫原性断片もしく は誘導体の量として定義される。必要とされる量は用いる細菌、断片または誘導 体の抗原性、並びにワクチンを接種すべき被験者の種および体重により変化する であろうが、標準的な手法を用いて確かめることができる。本発明の好適な非限 定的実施態様では、有効量のワクチンが抗細菌抗体の抗体価をワクチン接種前の 抗体価の少なくとも２倍に上昇させる。本発明の好適な特定の非限定的実施態様 では、約１０7から１０11の細菌、好ましくは１０8から１０10の細菌が宿主に投 与される。不活化された全細菌を含有するワクチンが好適である。 受身ワクチンに適用される「有効量」とは、細菌による疾病または感染を防止 または軽減することができる抗体の量である。必要とされる量は抗体の種類およ び抗体価、並びにワクチンを接種すべき被験者の種および体重により変化するで あろうが、標準的な手法を用いて確かめることができる。 本発明のワクチンは、静脈内、皮下、筋肉内、膣内、鼻腔内、経口または他の 粘膜経路を含むがこれらに限らない当技術分野で公知の方法により局所的におよ び／または全身的に投与することができる。 ワクチンは適当な無毒性の製剤上の担体とともに投与しても、マイクロカプセ ル内に保持させても、かつ／または持続放出インプラント内に保持させてもよい 。 抗体レベルを維持するためにワクチンを間隔をおいて数回投与することが望ま しい。 本発明のワクチンは他の殺菌法または静菌法と併用することができる。 本発明の抗体は、Antibodies A Laboratory Manual(E．Harlow，D．Lane，Col d Spring Harbor Laboratory Press，1989)に記載の方法を含むがこれに限定さ れない、当業者に公知の従来法により得られる。一般的には、動物（広範囲の脊 椎動物種を使用でき、通常はマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ である）をアジュバントまたは免疫原の有効性を増強しうる物質の非存在下また は存在下で本発明の抗原的に増強された腸内細菌の全細胞または免疫原性断片も しくは誘導体により免疫し、一定の間隔で追加免疫を施す。好適な方法で所望の 抗体の存在について動物の血清をアッセイする。この動物の血清または血液を ポリクローナル抗体の供給源として使用することができる。 モノクローナル抗体に関しては、動物を上記のように処置する。許容できる抗 体価が検出されたら、動物を安楽死させ、融合のために脾臓を無菌的に摘出する 。脾細胞を特に選択された不死のミエローマ細胞系と混合し、次に細胞の融合を 促進する薬剤（典型的にはポリエチレングリコールなど）にこの混合物をさらす 。これらの状況のもとではランダムな選択で融合が起こり、得られる産物は各タ イプの未融合細胞と融合細胞の混合物である。用いるミエローマ細胞系は、ＨＡ Ｔ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）のような選択培地の使用 により、融合混合物から培養下で生き残る細胞が免疫したドナー由来の細胞とミ エローマ細胞とのハイブリッド細胞だけになるように特別に選ばれる。融合後、 細胞を希釈して選択培地で培養する。所定の抗原に対して所望の特異性を有する 抗体の存在について培地をスクリーニングする。最適の抗体を含む培養物を、そ の細胞培養物の起源が１個の細胞であることを提示できるようになるまで限界希 釈法でクローニングする。本発明の抗体は腸内細菌による感染および疾病に対す る受身ワクチンとして有用である。 宿主中の抗体または上記細菌の検出法としてはイムノアッセイがある。このよ うなイムノアッセイは当技術分野で公知であり、例えばラジオイムノアッセイ（ ＲＩＡ）、エンザイム結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イム ノアッセイおよび蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）が含まれるが、これらに 限らない。 別の実施態様として、本発明にしたがって所望のイムノアッセイを行うために 必要不可欠な試薬類をすべて含んでなる診断用キットがある。この診断用キット は必要な試薬類を保持する１以上の容器の組合せとして商業包装形態で提供され 得る。かかるキットは、本発明の腸内細菌および／または本発明のモノクローナ ルもしくはポリクローナル抗体を、いくつかの通常のキット成分とともに含んで なる。通常のキット成分は当業者には明白であり、Antibodies A Laboratory Ma nual(E．Harlow，D．Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)を含 めた多数の刊行物に記載されている。通常のキット成分としては、例えばマイク ロタイタープレート、アッセイ混合物のｐＨを維持する緩衝液、例えばTris、 HEPESなど、複合第二抗体、例えばペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（また は第一抗体を誘導させた動物に対する抗ＩｇＧ）、その他の標準試薬類といった 品目がある。 本発明の方法は、腸内細菌を、適当な基礎必須培地で、例えばブレインハート インフュージョン培地（ＢＨＩ）、ルリア培地（ＬＢ）、ヒツジ血液寒天（ＳＢ Ａ）、ブルセラ培地、ミュラー−ヒントン培地、プロテオースペプトンビーフ抽 出物培地などで、種々の条件および成分を用いて、例えば0.05〜3%の胆汁または 0.025〜0.6%の１以上の胆汁酸もしくはその塩またはコレステロールのようなそ の生物学的前駆物質、30〜42℃の温度で、早期対数増殖期付近、早期対数期と定 常期の間、または定常期付近の成長相まで、空気中または微好気性条件下（例え ば5〜20%CO2と80〜95%空気、5〜20%CO2と80〜95%N2、または5〜10%O2と10〜20%C O2と70〜85%N2）で、場合により２価カチオンキレート剤、例えば、限定するも のではないが、0〜100μM、好ましくは25μMのBAPTA/AM（2'(エチレンジオキシ) ジアニリンn,n,n',n'-四酢酸／アセトキシメチルエステル；Molecular Probes， Eugene，OR）、0〜10mMのEGTA(エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)-四酢酸 ；Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)、または0〜100μMのEGTA/AM（エチレン ビス(オキシエチレンニトリロ)-四酢酸／アセトキシメチルエステル；Molecular Probes，Eugene，OR）の存在下で成長させることを含む。こうした条件および 成分の組合せが抗原的に増強された腸内細菌を生み出す。 別の実施態様によると、本発明の方法はまた、２価カチオンキレート剤、例え ば、限定するものではないが、1.0〜100μM、好ましくは25μMのBAPTA/AM、0.5 〜10mMのEGTA、または1.0〜100μMのEGTA/AMの存在下で、かつ胆汁、胆汁酸また は胆汁塩の非存在下で行うことを除いて上記のように腸内細菌を成長させること を含む。 本発明にとって有用な胆汁、胆汁酸またはその塩としては、肝臓から分泌され て通常は胆嚢で濃縮される天然の胆汁化合物、当業者には公知の合成胆汁酸、例 えば“OXGALL”(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)、ウシ胆汁（Sigma C hemicals，St．Louis，Missouri）または他の市販されている調製物、コール酸 、 デオキシコール酸、タウロコール酸およびグリココール酸がある。一部の腸内細 菌がコロニーを形成している遠位小腸および大腸部位にin vivoで存在している 、市販の胆汁酸であるデオキシコール酸（ＤＯＣ）が好適である。グリココール 酸（ＧＣ）も好ましい。 本発明によると、Campylobacter sp.(カンピロバクター sp.)、Yersinia sp.( エルシニア sp.)、Helicobacter sp.（ヘリコバクター sp.）、Gastrospirillum sp.(ガストロスピリラム sp.)、Bacteroides sp.(バクテロイデス sp.)、Klebs iella sp.（クレブシェラ sp.）、Enterobacter sp.（エンテロバクター sp.） 、Salmonella sp.（サルモネラ sp.）、Shigella sp.（シゲラ sp.）、Aeromona s sp.(アエロモナス sp.)、Vibrio sp.（ビブリオ sp.）、Clostridium sp.(ク ロストリジウム sp.)、Enterococcus sp.（エンテロコッカス sp.）およびEsche richia coli(エシェリキア・コリ）より成る群から選ばれる腸内細菌培養物を当 業者には公知の方法で凍結ストックとして調製して、将来の使用のために-80℃ で維持することができる。例えば、Campylobacter jejuniのストックは、該微生 物を、5%脱繊維素ヒツジ赤血球を含むトリプチカーゼソイ寒天(SBA)上で5%O2、1 0%CO2、85%N2（微好気性条件“MC”）中37℃で20時間成長させることにより調製 できる。Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Helicobacter pyloriお よびShigella flexneriのストックは、該微生物をブレインハートインフュージ ョン培地(BHI)中で成長させることにより調製できる。凍結のために細菌を収穫 するには公知の方法を使用し、例えば、培養物をスワブで集めて取り出し、30% グリセロール含有BHI中に再懸濁する。分析実験用または生産発酵用の培養物を 調製するには、公知の方法で、例えば、微生物を1.5%寒天含有BHI上で37℃でMC または大気条件下に成長させ、次に単一のコロニーを培地に移して、ここに記載 の本発明の方法にしたがって培養する。細菌を使用する際には、当業者に公知の 方法で、例えば遠心分離により収穫することができる。 好ましい実施態様では、Campylobacter sp.（好ましくはjejuniまたはcoli種 、最も好ましくはjejuni 81-176株）の抗原的に増強された細胞を基礎必須培地 、好ましくは約0.1%DOCまたは約0.8%胆汁を追加的に含むBHI培地中37 ℃で約10〜20%CO2と約80〜90%空気の混合気体下に成長させ、該培養物の成長が だいたい後期対数期から定常期に達した後（典型的には接種の約20時間後）に収 穫する。 その他の好ましい実施態様では、Shigella sp.（好ましくはflexneriまたはdy sentariae種、最も好ましくはflexneri2457T株）の抗原的に増強された細胞を基 礎必須培地、好ましくは約0.1%DOCまたは約0.8%胆汁を追加的に含むBHI培地中37 ℃で空気下に成長させ、該培養物の成長がだいたい早期対数期に達した後（典型 的には早期から中間対数期にある培養物を接種した約30分後）に収穫する。 更なる好ましい実施態様では、Helicobacter pylori（好ましくはATCC49503株 、NB3-2またはG1-4）の抗原的に増強された細胞を基礎必須培地、好ましくは約0 .05〜0.2%胆汁または約0.05%グリココール酸(GC)を追加的に含むBHI培地中37℃ で約5〜20%CO2と約80〜95%空気または約10%CO2と約5%O2と約85%N2の混合気体下 に成長させ、該培養物の成長がだいたい対数期または定常期に達した後で収穫す る。より好ましい実施態様では、該培養物がだいたい対数期に達した後で細胞を 収穫する。 本発明の方法で培養した腸内細菌は改変された形態および／または細胞運動性 を有し、かつ／また、いくつかの新しいタンパク質、リポ多糖類および／または 炭水化物および／または基礎培地のみで培養した細胞と比べて変化したレベルの 上記巨大分子を産生する。細胞の収量および病原性指数を高める最適な培養条件 を同定することができる。これらの培養条件を用いて、増強または誘導される毒 力関連抗原を同定することができる。 運動性と全体的な形態の変化は未処理のまたは染色した細菌の顕微鏡検査によ り観察し得る。本発明の方法からは電子顕微鏡や蛍光顕微鏡によって見ることが できるような他の形態変化が生じる可能性がある。 本発明の方法で培養した腸内細菌の形態および粘液様特性は、莢膜および／ま たは表面層の発現が誘導されうることを示唆する。莢膜の生産を試験するために 、タンパク質、炭水化物、リポ多糖類などの表面成分のフェノール抽出物を調製 することができる。増加した炭水化物は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で調 べ ることができる。 毒力を増強する本発明の成長条件下で成長させた腸内細菌から調製された外膜 のタンパク質プロフィールをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動(SDS-PAGE)で特徴づけて、従来の培地で成長させた微生物から得られた ものと比較することができる。SDS-PAGEは、抗原を増強するまたは変化させる条 件に応答して細菌細胞タンパク質および抽出タンパク質において生じた変化を評 価するために行われる。これらのデータは、増大した侵入性または改変された抗 原性と関連した表面変化に関する定性的および定量的情報を提供する。 誘導または改変されたタンパク質抗原の免疫原能力はウエスタンブロッティン グで確認することができる。SDS-PAGEにより同定された、誘導または改変された 細菌タンパク質の免疫原性は、後述するような、一般的に受け入れられているウ エスタンブロッティングの手法を用いて評価しうる。回復期の免疫ウサギまたは フェレット血清（従来の方法または本発明の方法で成長させた生存微生物を経口 的に感染させた動物由来の抗体の供給源）、腸粘液（ＩｇＡ抗体の供給源）、ポ リクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体、例えば、C．jejuniフラジェ リンと交差反応するもの、などの抗体のどのような供給源も細菌抗原のアッセイ に使用できる。 これらの細菌抗原のいくつかの生産増加は毒力と関連した性質の増強と同時に 起こる。こうした性質としては、培養したヒト腸上皮細胞への付着と侵入、およ びコンゴーレッド色素の結合がある。コンゴーレッド色素結合アッセイは毒力を 予測するための一般的に認められている方法で、後述されるが、Andrewsら(Infe ct．Immun.，60:3287-3295，1992)およびYoder（Avian Dis.，33:502-505，1989 ）に記載されている。細菌のコンゴーレッド結合はヘミン結合能を示し、このヘ ミン結合能は毒力と相関関係がある。コンゴーレッド結合はまた上皮細胞の増大 した細菌侵入とも関連している。 以前、従来法で成長させたC．jejuni Lior血清型はほとんどが免疫交差反応性 でないことが明らかにされている。この情報に基づくと、Campylobacterに対す る広範な防御を得るために、数種のLior血清型株のワクチンを多数作るかまたは 混合ワクチンを作って投与することが必要であろう。本発明の方法により作出さ れた抗原的に増強されたCampylobacterは、従来法で成長させたCampylobacterを 用いて得られたものより広範囲のLior血清型に対して免疫交差反応性を示す。同 様に、本発明の方法により作出された抗原的に増強されたShigellaは、従来法で 成長させたShigellaを用いて得られたものより広範囲のShigella種に対して免疫 交差反応性で、免疫交差防御的である。これらの免疫交差反応および免疫交差防 御の特性は、後述する凝集アッセイとワクチン研究の結果により示される。 抗原的に増強された腸内細菌を作出する本発明の方法は小動物モデルでの増強 された毒力に相関する。ヒトのCampylobacter疾患のモデルとして数種類の家畜 を使用することができる。免疫感作の有効性の観点からいちばん多く研究された ものは可逆的な腸管結紮で、Caldwellらの成熟ウサギ下痢症（RITARDモデル）(I nfect．Immun.，42:1176-1182，1983)である。このモデルはLior血清型と交差菌 株防御との関連をも実証した。しかし、このモデルは病気に対する抵抗性よりも むしろ定着（コロナイゼーション）に対する抵抗性を判定するものである。Bell らのフェレットモデル(Infect．Immun.，58:1848-1852，1990)はより有望なモデ ルかもしれない。なんとなれば、この動物はヒトのCampylobacter疾患の症状に よく似た症状を呈するからである。比較的最近のモデルはBagarのマウス・コロ ナイゼーションモデル（Infection and Immunity，63:3731-3735，1995）である 。このモデルは、免疫感作とこれに続く免疫マウスへの生存Campylobacterによ る鼻または経口チャレンジ、その後に糞便中のCampylobacterの存在をモニター することによる腸管定着の試験を必要とする。Shigellaに関しては、Mallettら により記載されたマウス鼻チャレンジアッセイ（下記の第１３節参照）を用いて 毒力とワクチンの有効性を評価する。Helicobacter pyloriに関しては、Chenら( Lancet，339:1120-1121，1992)により記載されたHelicobacter felis胃コロナイ ゼーションモデルを用いて、本発明の方法により作出されたH．pyloriのワクチ ン効力を評価する。 腸内細菌の侵入および感染に関係した他の動物モデルも存在し、それらは本発 明の方法により増強された腸内細菌のワクチン効力を試験するために用いられる 。 本発明の方法により作出された抗原的に増強された腸内細菌を用いて、基本型 の死滅全細胞ワクチンまたはサブユニットワクチンを調製する。これらのワクチ ンは、動物に投与したとき抗体を誘導し、かくしてワクチンの防御能を樹立する ことがわかる。細菌細胞におけるこれら抗原の増強または誘導は、より有効なワ クチンをつくる細胞をもたらす。 本発明の方法により作られたワクチン候補調製物は、腸の免疫応答を引き出す ために種々の粘膜免疫法とともに使用することができる。その後、抗原性を増強 させたまたは増強させてない病原菌でチャレンジした動物を保護するために、成 功した免疫感作プロトコールを用いる。また、ワクチンを混合ワクチンとして調 製し、試験することもできる。例えば、Shigella細胞とCampylobacter細胞また はそれらの構成成分を単一のワクチンとして組み合わせることができる。 下記の実験的手法は表面抗原の変化と他の特性（増強された侵入性と関連して いる特性）の変化の検出を可能にする。これらの変化は定性的かつ定量的である 。最も重要なことは、こうした実験により、本発明の方法が侵入性を増強しかつ 免疫原として関わりのある抗原を誘導する、ということが確立されたことである 。このような抗原的に増強された細菌は、従来法で成長させた細菌と比べて、よ り広範囲の細菌株、血清型および／または種による感染に対して防衛的な免疫応 答を引き出し、それゆえ、有効なワクチンとして使用しうる。 当業者には公知の十分に確立されたモデルがいくつか存在しており、これらは 後述するように増強された抗原特性、細菌の毒力およびワクチンの効力を評価す るのに有用である。 本発明の非限定的な実施例を以下に記載する。 ６．実施例：増強された抗原性細菌の作出方法 実施例１ Campylobacter jejuni８１−１７６株を血液寒天プレート（トリプチカーゼソ イ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤血球を含有）上にストリークし、微好気性Ga sPakジャー（BBL，Cockeysville，MD）中３７℃で２０時間インキュベーション した。細菌叢をスワブで取り上げ、0.8％OXGALL（Difco，Detroit，MI）を含む １０%ＣＯ2、９０％空気に前平衡化されたＢＨＩ培地１リットルを含有するフラ スコ中に接種した。培養物を、密閉フラスコ中１０％ＣＯ2、９０％空気、３７ ℃で振盪しながら、２０時間インキュベーションし、ついで上記のとおり収穫し た。 実施例２ Campylobacter jejuni８１−１７６株を血液寒天プレート（トリプチカーゼソ イ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤血球を含有）上にストリークし、微好気性Ga sPakジャー（BBL，Cockeysville，MD）中３７℃で２０時間インキュベーション した。細菌叢をスワブで取り上げ、０.０１％〜０.１％デオキシコール酸ナトリ ウム（ＤＯＣ）を含む１０％ＣＯ2に前平衡化されたＢＨＩ培地１リットルを含 有するフラスコ中に接種した。（該ＢＨＩ培地とは別のストック溶液としてＤＯ Ｃを調製し、高圧滅菌し、該細菌の接種直前に、最終濃度が０.０１％〜０.１％ になるまでそれをＢＨＩ培地に無菌的に加えることが重要である。）。培養物を 、５％Ｏ2、１０％ＣＯ2、８５％Ｎ2中３７℃で振盪しながら、２０時間までの 種々の時間インキュベーションし、ついで上記のとおり収穫した。 実施例３ Campylobacter jejuni８１−１７６株を血液寒天プレート（トリプチカーゼソ イ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤血球を含有）上にストリークし、微好気性Ga sPakジャー（BBL，Cockeysville，MD）中３７℃で２０時間インキュベーション した。細菌叢をスワブで取り上げ、０.０１％〜０.１％デオキシコール酸ナトリ ウムを含む１０％ＣＯ2に前平衡化されたブルセラ培地１リットルを含有するフ ラスコ中に接種した。培養物を、５％Ｏ2、１０％ＣＯ2、８５％Ｎ2中３７℃で 振盪しながら、２０時間インキュベーションし、ついで上記のとおり収穫した。 実施例４ Campylobacter jejuni８１−１７６株を血液寒天プレート（トリプチカーゼソ イ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤血球を含有）上にストリークし、微好気性Ga sPakジャー（BBL，Cockeysville，MD）中３７℃で２０時間インキュベーション した。細菌叢をスワブで取り上げ、０.０１％〜０.１％デオキシコール酸ナトリ ウムを含む１０％ＣＯ2に前平衡化されたミューラー・ヒントン培地１リットル を含有するフラスコ中に接種した。培養物を、５％Ｏ2、１０％ＣＯ2、８５％Ｎ2 中３７℃で振盪しながら、２０時間インキュベーションし、ついで上記のとお り収穫した。 実施例５ Campylobacter jejuni８１−１７６株を血液寒天プレート（トリプチカーゼソ イ寒天および５％脱繊維素ヒツジ赤血球を含有）上にストリークし、微好気性Ga sPakジャー（BBL，Cockeysville，MD）中３７℃で２０時間インキュベーション した。細菌叢をスワブで取り上げ、０.１％デオキシコール酸ナトリウムを含む １０％ＣＯ2に前平衡化されたＢＨＩ培地１リットルを含有するフラスコ中に接 種した。培養物を、１０％ＣＯ2、９０％空気中３７℃でゆっくり撹拌しながら ２０時間インキュベーションし、ついで上記のとおり収穫した。 実施例６ Vibrio choleraeをＢＨＩ寒天プレート（トリプチカーゼソイ寒天および５％ 脱繊維素ヒツジ赤血球を含有）上にストリークし、空気中３７℃で２０時間イン キュベーションした。細菌叢をスワブで取り上げ、０.１％デオキシコール酸ナ トリウムを含むＢＨＩ培地１リットルを含有するフラスコ中に接種した。培養物 を、空気中３７℃で振盪しながら２０時間インキュベーションし、ついで上記の とおり収穫した。 実施例７ Salmonella cholerasiusをＢＨＩ寒天プレート上にストリークし、空気中３７ ℃で２０時間インキュベーションした。細菌叢をスワブで取り上げ、０.１％デ オキシコール酸ナトリウムを含むＢＨＩ培地１リットルを含有するフラスコ中に 接種した。培養物を、空気中３７℃で振盪しながら２０時間インキュベーション し、ついで上記のとおり収穫した。 実施例８ Salmonella typhimuriumをルリアブロス寒天プレート上にストリークし、空気 中３７℃で２０時間インキュベーションした。細菌叢を、０.１％デオキシコー ル酸ナトリウムを含むＢＨＩ培地１リットルを含有するフラスコ中に接種した。 培養物を、１０％ＣＯ2、９０％空気中３７℃で振盪しながら２０時間インキュ ベーションした。０.１％ＤＯＣを含有するＬＢ１リットルにコロニー１個を移 し、ゆっくり振盪しながら上端密閉フラスコ中３７℃でインキュベーションした 。１２時間後、該培養物６０mlを同じ新鮮な加温培地１リットル中に希釈し、さ らに３０分インキュベーションし、ついで上記のとおり収穫した。 実施例９ Shigella flexneri２４５７Ｔをコンゴーレッド寒天プレート上にストリーク し、空気中３７℃で２０時間インキュベーションした。ＢＨＩ培地１リットルを 含有するフラスコ中に赤色コロニー１個を接種し、振盪しながら１２時間インキ ュベーションした。ついで、この培養物５０mlを用いて、０.１％デオキシコー ル酸ナトリウムを含有する加温ＢＨＩ培地２５０ｍｌに接種した。振盪しながら 空気中３７℃で４時間、該培養物をインキュベーションした。ついで、ＯＤ600 が約０.１７になるまで、０.１％ＤＯＣを含有する加温ＢＨＩでこの培養物を希 釈し、空気中３７℃で振盪しながら３０分間インキュベーションし、ついで上記 のとおり収穫した。 実施例１０ Campylobacter jejuni８１−１７６、８１−１１６またはＨＣ（３０％グリセ ロールを含むＢＨＩ中）を急速解凍し、ヒツジ血液寒天（ＳＢＡ、０.１ml／プ レート）上にプレーティングした。CampyPack Plus微好気性環境ジェネレーター の付いたGasPakジャー（BBL，Cockeysville，MD）中３７℃で２０時間、該接種 プレートをインキュベーションした。該細菌叢をスワブにより該プレートから取 り、該細菌をＢＨＩ１０mlに再懸濁した。２リットルフラスコ中１０％ＣＯ2、 ９０％空気に前平衡化した、ＢＨＩ培地単独または０.１％ＤＯＣを含有するＢ ＨＩ培地１リットルに該細菌懸濁液を接種した。ＯＤ625が０.０５に等しくなる まで、該接種物を前平衡化培地に加えた。該接種フラスコを１０％ＣＯ2、９０ ％空気に戻し、３７℃で２０時間、ゆっくり撹拌した。この時点で上記のとおり 該細菌を収穫した。 実施例１１ ４％子ウシ血清を含むＢＨＩ培地にHelicobacter pyloriを加えた。接種後、 該フラスコを５％Ｏ2、１０％ＣＯ2、８５％Ｎ2でフラッシュし、振盪しながら ３７℃で２２時間インキュベーションした。このインキュベーションの後、４％ 子ウシ血清を含むＢＨＩ培地またはさらに０.０５％グリココール酸ナトリウム を含有する同じ培地を含有するフラスコへ該培養物２.５mlを移した。これらの 培養物を微好気性気体混合物（５％Ｏ2、１０％ＣＯ2、８５％Ｎ2）で再度フラ ッシュし、３７℃で２０〜２４時間インキュベーションした。該細胞を上記のと おり収穫した。 実施例１２ Salmonella typhimurium（３０％グリセロールを含むＬＢ中）をＬＢ寒天プレ ート上にストリークし、空気中３７℃で１８〜２０時間培養した。コロニー１個 を拾い、１０％ＣＯ2、５％ＣＯ2、８５％Ｎ2でフラッシュしたフラスコ中のＬ Ｂまたは０.１％ＤＯＣ含有ＬＢ１リットル中へ移し、密閉し、振盪しながら３ ７℃で１２時間インキュベーションした。ついで、ＯＤ600が０.１７になるまで 同じ培地中で該細菌を希釈し、該培養物が初期対数期に達するまで、典型的には 希釈後３０分間、同じ条件下でインキュベーションした。細胞を上記のとおり収 穫した。 実施例１３ Salmonella typhimuriumをＬＢ寒天プレート上にストリークし、空気中３７℃ で１８〜２０時間培養した。コロニー１個を拾い、ＬＢまたは０.１％ＤＯＣ含 有ＬＢ１リットル中へ移し、空気中３７℃で１２時間インキュベーションした。 ついで、該培養物を同じ新鮮培地中で希釈（１／５）し、同じ条件下でさらに４ 時間インキュベーションした。ついで、ＯＤ600が０.１７になるまで同じ新鮮培 地中で該培養物を希釈し、該培養物が対数期に達するまで、典型的には希釈後３ ０分間、同じ条件下でインキュベーションした。細胞を上記のとおり収穫した。 実施例１４ Klebsiella pneumoniaeをＢＨＩ寒天プレート上にストリークし、空気中３７ ℃で１８〜２０時間インキュベーションした。コロニー１個を拾い、ＢＨＩまた は０.１％ＤＯＣ含有ＢＨＩ１リットルに接種し、空気中３７℃で１２時間振盪 した。ついで、ＯＤ600が０.１７になるまで同じ培地中で該細菌を希釈し、さら に３０分間増殖させ、ついで上記のとおり収穫した。 実施例１５ Enterobacter cloacaeをＢＨＩ寒天プレート上にストリークし、空気中３７℃ で１８〜２０時間インキュベーションした。コロニー１個をＢＨＩまたは０.１ ％ＤＯＣ含有ＢＨＩ１リットルに接種し、３７℃で１２時間振盪した。ついで、 ＯＤ600が０.１７になるまで同じ培地中で該細菌を希釈し、さらに３０分間増殖 させ、ついで上記のとおり収穫した。 実施例１６ Escherichia coliＯ１５７：Ｈ７株をヒツジ血液寒天プレート上にストリーク し、空気中３７℃で１８〜２０時間インキュベーションした。コロニー１個を１ リットルのＢＨＩまたは０.１％〜０.２％ＤＯＣ含有ＢＨＩを含むフラスコ中に 接種し、３７℃で１２時間振盪した。ついで、ＯＤ600が０.１７になるまで該細 菌を希釈し、さらに３０分間増殖させ、ついで上記のとおり収穫した。 実施例１７ Enterococcus faecalisをヒツジ血液寒天プレート上にストリークし、空気中 ３７℃で１８〜２０時間インキュベーションする。コロニー１個を１リットルの ＢＨＩまたは０.１％ＤＯＣ含有ＢＨＩを含むフラスコ中に接種し、３７℃で１ ２時間振盪する。ついで、ＯＤ600が０.１７になるまで該細菌を希釈し、さらに ３０分間増殖させ、ついで上記のとおり収穫する。 実施例１８ Clostridium difficile（３０％グリセロールを含む改良細切肉培地）を、１. ５％寒天を含む嫌気性菌用ビーフ肝臓培地のプレート上にストリークし、微好気 性条件下（５％ＣＯ2および９５％Ｎ2）３７℃で培養する。コロニー１個を改良 細切肉培地または０.１％ＤＯＣを含む同じ培地の１リットルに移す。該細菌を 微好気性条件下３７℃で１２時間培養し、上記のとおり収穫する。 実施例１９ Bacteroides fragilis（３０％グリセロールを含む改良細切肉培地）を、改良 細切肉培地寒天プレート上にストリークし、微好気性条件下（５％ＣＯ2および ９５％Ｎ2）３７℃で培養する。コロニー１個を改良細切肉培地または０.１％Ｄ ＯＣを含む同じ培地の１リットルに移す。該細菌を微好気性条件下３７℃で１２ 時間培養し、上記のとおり収穫する。 実施例２０ Yersinia pseudotuberculosis（３０％グリセロールを含有するルリア培地） をルリア培地寒天プレート上にストリークし、３０℃でインキュベーションする 。コロニー１個をＬＢ１リットルへ移し、３０℃で１２時間インキュベーション する。この培養物をＬＢまたは０.１％ＤＯＣ含有ＬＢ中で希釈（１／５）し、 ３７℃で４時間インキュベーションする。ついで、ＯＤ600が０.１７になるまで 同じ培地中で該培養物を希釈し、さらに３０分間インキュベーションし、ついで 上記のとおり収穫する。 実施例２１ ４％子ウシ血清を含むＢＨＩ培地にHelicobacter pyloriを加えた。接種後、 該フラスコを５％Ｏ2、１０％ＣＯ2、８５％Ｎ2でフラッシュし、振盪しながら ３７℃で２２時間インキュベーションした。このインキュベーションの後、４％ 子ウシ血清を含むＢＨＩ培地またはさらに約０.１％〜約０.２％ウシ胆汁を含有 する同じ培地を含有するフラスコへ該培養物２.５mlを移した。これらの培養物 を微好気性気体混合物（５％Ｏ2、１０％ＣＯ2、８５％Ｎ2）で再度フラッシュ し、３７℃で２０〜２４時間インキュベーションした。該細胞を上記のとおり収 穫した。 ７．実施例：増強された抗原性細菌 実施例２２ 湿封入（wet mounted）細菌の顕微鏡的検査により、運動性および全形態を観 察した。墨汁（ニグロシン（nigrosine））による莢膜染色により表面層を観察 した。風乾後、該細胞をクリスタルバイオレット（crystal violet）により対比 染色した。すべての観察は１０００倍の倍率で行った。 本発明方法により培養した細菌（以下、「増強」細菌と称する）の形態は、基 礎培地単独中で培養したもの（従来法で成長させた）と比べて変化していた。例 えば、「増強」C．jejuniは集合し、細胞の大きなクランプを形成したのに対し 、従来法で成長させた細胞は単生のものが優勢であった。細菌表面の変化が本発 明方法で培養することにより起こったことは莢膜染色（データは示していない） から明らかであった。実際、この表面変化の結果、該染色からのニグロシン粒子 の「増強」細胞による結合が増加した。該「増強」細菌の運動性は高く維持され た。 実施例２３ フェノール抽出により、C．jejuni表面成分を分析した。抽出物は、従来法で 成長させたか、または上記実施例２により培養したC．jejuni８１−１７６から 得た。上記のとおり遠心分離により培地からC．jejuni細胞を収穫した。室温で ２時間、１％フェノールで該細胞ペレットを抽出した。４５分間の遠心分離によ り無傷細胞を抽出物から分離した。抽出された細菌表面成分を含有する上清を、 蒸留水に対して一晩透析した。該保持物質を１０５，０００×ｇ、４℃で３時間 遠心分離した。該抽出ペレットを１０％ＮａＣｌ中に再溶解し、２倍容の冷９５ ％エタノールで沈殿させた。該沈殿を繰り返し、該サンプルを凍結乾燥した。つ いで、さらに分析するために、該サンプルを水に１mg／mlで溶解した。 グルコースを基準に用いる一般に許容されているフェノール−硫酸法により、 該抽出物の炭水化物含量を測定した。カルバゾール試薬を用いるDischeの方法に より、該抽出物のウロン酸含量を測定した。ビシチン酸（biccichinoic）アッセ イキット（Pierce Chem．Co.，Rockford，IL）を用いて該フェノール抽出物の総 タンパク含量を評価した。 該抽出物にウロン酸が存在しないことは注目に値した。多数の典型的な細菌莢 膜はウロン酸ポリマーよりなる。驚くべきことに、C．jejuni８１−１７６の表 面抽出物は実際にはタンパク質が優勢であった。しかしながら、該「増強された 」細胞抽出物の総炭水化物含量は、通常に増殖させた細胞に対して増加していた 。 該抽出物のタンパク質に対する炭水化物の比率を以下の表１に示す。 該培地中のＤＯＣの含有量と該細菌からの表面抽出可能炭水化物の増強された レベルとの間には直線的関係があった（表１）。本発明の方法により培養した細 菌では、表面抽出可能炭水化物は８倍以上増加したのに対し、通常に増殖させた 細菌では増加が全く見られなかった。ＤＯＣ培地中で培養した細菌細胞の凝集は 、該表面抽出物の成分に起因するようであった。 再水和に際して、該抽出物は水中で高いゲル化能を有し、これは該溶液を高粘 性かつ粘液状にするものであり、該凝集細菌と類似の性質であった。該抽出物の この機能性はムチン様糖タンパク質に類似していた。 個々の単糖類を分析するために、密閉バイアル中１Ｎトリフルオロ酢酸中で抽 出物を加水分解した。該サンプルを窒素下で２時間乾燥し、蒸留水に再懸濁した 。Dionex Corpクロマトグラフィーマトリックスおよび溶媒として３％の０.５Ｎ ＮａＯＨ／９７％Ｈ2Ｏよりなる溶媒系を用いるＨＰＬＣにより糖を分離した。 電流滴定検出により分離された単糖類を定量した。また、フコース、ガラクトサ ミン、グルコサミン、ガラクトース、グルコースおよびマンノースよりなる真正 単糖類標品をＨＰＬＣ分析に付して比較した。 該加水分解表面抽出物のＨＰＬＣ分析により、類種の単糖類の存在が示された （図１）。通常に増殖させたかまたは上記実施例２の方法により増殖させた細菌 からの抽出物の炭水化物組成に、定性的相違は全くないようであった。しかしな がら、主要ではない定量的相違は明らかであった。 実施例２４ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより細菌タンパク質を分 析した。Lugtenbergら（FEBS Letters 58:254-258，1975）のゲル系を用いた。 該ゲル系は、低アクリルアミド（典型的には４％）スタッキングゲル（pＨ６.８ ）およびより高い割合のアクリルアミド分離ゲル（pＨ８.８）よりなる不連続ゲ ルである。両ゲルおよび用いたすべての緩衝液にＳＤＳ（０.１％）が含まれて いた。タンパク質分離は分子の大きさにより行い、８または１２％アクリルアミ ド分離ゲルを用いた。分離タンパク質の可視化は固定ゲルの銀染色により、分子 の大きさの測定は標準として用いた公知タンパク質のＭr値に基づいて行った。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりC．jejuni細胞タンパク質を分離し、銀染色により可 視化した。６２ｋＤａのタンパク質を含む４つのタンパク質が、ＤＯＣを用いて 培養した細胞中で誘導または増強された（図２）。 実施例２５ フェノール抽出によりS．flexneri ＬＰＳを分析した。通常に増殖させたまた は上記実施例９で例示される本発明により増殖させたＳ．flexneri細胞を、上記 のとおり遠心分離により培地から収穫した。WestphalおよびJann（R．Whistler 編，Methods in Carbohydrate Chemistry, vol 5; p．83，1965）の方法により 、リポ多糖（ＬＰＳ）を抽出した。簡単に言えば、ＢＨＩ中でまたは上記実施例 ９で例示したとおりに培養した細胞を遠心分離により収穫し、ＰＢＳ中で１回洗 浄した。ついで、水中の４５％フェノールを用いて６８℃で１５分間、該細胞を 抽出した。該抽出物を１０℃に冷却し、遠心分離した。ＬＰＳ含有上部水相を吸 引し、蒸留水に対して透析した。該保持物質を８０,０００×ｇ、４℃、７時間 で１回、およびそれぞれ１０５,０００×ｇ、３時間で３回遠心分離した。該最 終ペレットを凍結乾燥した。分析前に、該ＬＰＳを水に再懸濁した（１mg／ml） 。該精製ＬＰＳを上記のとおり炭水化物含量に関して、および下記および図５に 示すとおりドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）により特徴づけした。 この特定のＳＤＳ−ＰＡＧＥ系を用いて分析した場合には、S．flexneriタン パク質プロフィールは、通常培養細胞と「増強」細胞との間の大きな相違を全く 示さなかった。「増強」細胞からのＬＰＳに対する炭水化物の乾燥重量比は、Ｂ ＨＩ細胞からの抽出物と比べて減少した。しかしながら、S．flexneri ＬＰＳの ＳＤＳ−ＰＡＧＥついで酸化および銀染色により、ＬＰＳ構造の大きな変化が示 された（図５）。該ゲルのレーン「２」に示されるとおり、「増強」S．flexner iからのＬＰＳのＯ−抗原画分は、長さが減少した。この結果は、炭水化物／「 増強」細胞からのＬＰＳの乾燥重量比の減少という知見を補足するものであった 。 これらの結果は、「増強」細胞上のより短いＯ−抗原側鎖の提示を示唆し、潜 在的に該細菌をより疎水性にするかもしれない。より疎水性の細菌は、腸管内の 疎水性表面とのより大きな相互作用を有しうる。 実施例２６ ウエスタンブロットによりタンパク質の免疫原性を定量した。通常に増殖させ たまたは上記実施例１または５に例示される本発明方法により増殖させた細菌か らのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ついで電気泳動的にニトロセ ルロースまたはＰＶＤＦ膜に移し、標準ブロッキンク剤［３％ＢＳＡ、５０mＭ トリス（pＨ８.５）、５０mＭＮａＣｌ、０.２％TWEEN20］でブロッキングした 。第１抗体をブロッキング緩衝液中に適用し、ついで該ブロットを洗浄し、第２ 抗体リポーター同族体を適用した。洗浄後、光またはクロモフォア生成基質で該 ブロットを可視化した。用いたリポーター部分は西洋ワサビペルオキシダーゼま たはアルカリホスファターゼであった。 図３は、ＩｇＡ含有免疫ウサギ粘液によるウエスタンブロッティングからのタ ンパク質を示す。該６２ｋＤａタンパク質は主要抗原であったことがわかる。Ｄ ＯＣまたは胆汁を用いて培養した細胞中では、該６２ｋＤａタンパク質の抗原性 が非常に増強されていた。また、このタンパク質は、ＤＯＣを用いて培養した細 胞の表面抽出物中の優勢抗原であった。 Campylobacterフラジェリンと交差反応するマウスモノクローナル抗体を用い て、該増強タンパク質はC．jejuniフラジェリンであることが示された（図４） 。C．jejuniフラジェリンが病原に関与しており該細菌の侵入性に関連している ことが数名の研究者により示されているため、これは重要な知見であった。 実施例２７ コンゴーレッド染料結合により毒力を測定した。ＢＨＩ寒天プレート（０.０ ２５％コンゴーレッド含有）上で通常に増殖させた（ＢＨＩ）または本発明方法 により増殖させた（「増強」）腸内細菌を蒸留水に再懸濁し、アセトンで１０分 間抽出した。遠心分離により細胞残渣をペレット化し、４０％アセトン、６０％ 水のブランク溶液を用いて該染料のＯＤ488を測定した。６６０ｎｍでの該染料 の吸光度を該細胞の吸光度と比較し、ＯＤ488／ＯＤ660の比率として表した。該 データを以下の表２に示す。 表２は、本発明方法により培養した数種の腸内細菌の場合にはコンゴーレッド 染色結合が増強されたことを示す。これらの結果は、本発明のin vitro法が、毒 力および他の細菌種に関するin vivo病原性と相関していることが知られている 他の性質を誘導するのに有用であることを示す。 実施例２８ 培養上皮細胞への細菌付着を分析した。GalanおよびCurtiss（Proc ．Natl．Ac ad．Sci．USA ，86:6383-6387，1989）により記載されているとおりに細菌付着を アッセイした。組織培養細胞（ＩＮＴ−４０７またはヘンレ細胞（ATCC#CCL6） およびＣａＣｏ−２（ATCC#HTB37）ヒト小腸細胞系）を２４−ウェル組織培養プ レート（３７℃、５％ＣＯ2）上、６０〜８０％の密度で培養した。該培地は用 いる細胞系によるが、ヘンレ細胞には１０％ウシ胎児血清およびそれぞれ５０mg ／mlのペニシリンＧおよびストレプトマイシンを含むダルベッコの改良イーグル （Dulbecco's modified Eagle's）培地を使用し、ＣａＣｏ−２細胞の培養には １０％ウシ胎児血清およびそれぞれ５０mg／μlのペニシリンＧおよびストレプ トマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。アッセイの少なくとも３時 間前に、該培地を除き、マグネシウムおよびカルシウムを含むハンクス平衡塩溶 液（ＨＢＳＳ）で該細胞を２回洗浄した。ついで、抗生物質を含まない増殖培地 で単層を重層した。 付着アッセイのために、該細菌を以下のとおり調製した。Campylobacter、Hel icobacterなどの増殖の遅い腸内細菌の場合、ＯＤ625が０.１になるまで新鮮な 前平衡化培地で該細菌培養密度を希釈し、ついで該アッセイに用いた。Shigella および他の増殖の速い腸内細菌の場合、ＯＤ625が０.１７になるまで新鮮な前平 衡化培地で該細菌培養を希釈し、ついで該アッセイに用いた。飽和を避けるため に１０細菌／細胞の感染多重度にて該細菌を該上皮細胞に加えた。該組織培養ウ ェル中に接種した細菌の数をプレート計数により計算した。５％ＣＯ2下、Campy lobacterの場合には２時間の、Shigellaの場合には３０分間の感染の後、０.１ ％デオキシコール酸塩による該単層の溶解および付着測定のためのプレーティン グの前にＨＢＳＳで洗浄することにより、非結合細菌を除いた。 通常に増殖させたまたは上記実施例５に例示される本発明方法により増殖させ たC．jejuni ８１−１７６によるＩＮＴ−４０７細胞への付着に対する温度の影 響を、以下の表３に示す。 通常に増殖させたまたは本発明方法により増殖させたC．jejuniのいくつかの 株の付着の相違を、以下の表４に示す。 パーセント付着は、該単層から回収したコロニー形成単位（ＣＦＵ）数を該単 層上へ接種したＣＦＵ数で割り１００倍した数として表されている。 侵入アッセイでは、付着アッセイについて上記した方法により上皮細胞を増殖 させ調製した。飽和を避けるために１０細菌／細胞の感染多重度にて、通常に増 殖させたまたは本発明方法により増殖させた細菌を該上皮細胞に加えた。該組織 培養ウェル中に接種した細菌の数をプレート計数により計算した。５％ＣＯ2下 、Campylobacterの場合には２時間の、Shigellaの場合には３０分間の感染の後 、該感染細菌を吸引し、すべての細胞外細菌を殺すためゲンタマイシンを含有す る増殖培地で該単層を重層した。この時点で残っているすべての培養可能細菌は 、該上皮細胞単層に侵入している。C．jejuni感染細胞の場合には３時間、Shige lla感染細胞の場合には１.５時間、ＣＯ2下で該インキュベーションを継続した 。単層をＨＢＳＳで洗浄してゲンタマイシンを除き、０.１％デオキシコール酸 塩を加えることにより溶解した。プレート計数により該ライゼート中の細菌を数 え、接種細菌数と比較したゲンタマイシン耐性細菌の数としてパーセント侵入を 表し た。 侵入は、ゲンタマイシン処理後に該単層から回収したコロニー形成単位（ＣＦ Ｕ）数を該単層上へ接種したＣＦＵ数で割り１００倍した数として求めた、該単 層に侵入する細胞のパーセントとして表している。 通常に増殖させたまたは上記実施例５の方法により増殖させたC．jejuni ８１ −１７６によるＩＮＴ−４０７細胞への侵入に対する温度の影響を、以下の表５ に示す。 通常に増殖させたまたは本発明方法により増殖させたC．jejuniのいくつかの 株によるＩＮＴ−４０７細胞への侵入における相違を、以下の表６に示す。 通常に増殖させたまたは上記実施例５の方法により増殖させたC．jejuni ８１ −１７６によるＩＮＴ−４０７細胞への付着および侵入に対するＤＯＣの影響を 、以下の表７に示す。 通常に増殖させたまたは上記実施例５の方法により増殖させたShigellaによる ＩＮＴ−４０７細胞への付着および侵入に対するＤＯＣの影響を、以下の表８に 示す。 C．jejuni（すなわち８１−１１６、８１−１７６およびＨＣ）のいくつかの ヒト単離物による培養ＩＮＴ−４０７細胞への付着および侵入は、該培地への胆 汁またはデオキシコール酸塩の添加により非常に増強された（表４および６を参 照されたし）。最も効果的なＤＯＣ用量は０.１％であった（表７）。４２℃（C ampylobacterを通常に増殖させる温度）でなく３７℃で最大反応が得られた（表 ３および５）。 Shigella flexneriで同様の知見を得た（表８）。本発明方法により増殖させ たShigellaは、非常に増強された付着能および侵入能を共に有していた。 これらのデータは、本発明方法が腸内病原体の侵入および付着を増強すること を示す。 実施例２９ 免疫交差反応性を示すために、急速スライド凝集アッセイを用いた。通常に増 殖させたまたは実施例５に例示される本発明方法により増殖させたC．jejuni株 を、通常にまたは本発明方法（例、実施例５）のいずれかにより増殖させたC．j ejuni８１−１７６（Lior 5）で免疫した動物からの血清ＩｇＧにさらした。該 ＩｇＧ抗体をプロテインＡコートラテックスビーズ上に固定化した。試験血清型 とLior 5血清型に対して生成した抗体との間に交差反応エピトープがあれば、該 細胞のほとんど即時性のクランピング(すなわち凝集)を見ることができる。該反 応を短時間進行させた後、０〜３のスケール（ここで、０は観察可能なクランピ ングが全くないことを意味し、３は高度の凝集を意味する）に基づきこのクラン ピングを評価した。４株の結果を以下の表９に示す。 表９は、増強C.jejuni８１−１７６Lior血清型Ｌ５で免疫した動物から生成し た抗体と交差反応させた４つの試験Lior血清型（L5，L2，L8，L21）のすべてを 示す。ＩｇＡよりなる、C．jejuni８１−１７６に感染させたウサギの腸からの 粘液洗浄物は、Lior 5血清型株に対する抗体と交差反応した（以下の表１６を参 照されたし）、本発明方法により増殖させたC．jejuniの１０個の主要臨床血清 型（すなわちヒト病原体）のうちの８個と反応した。この結果は、本発明方法が 、C．jejuniのLior 5血清型株で免疫した動物からの抗血清と交差反応するLior 血清型の数を有意に増加させることを示す。 また、通常に増殖させたのでなく本発明方法により増殖させたShigellaのいく つかの種は、ＤＯＣを用いて増殖させたShigella flexneri ２４５７Ｔで免疫し た動物からのＩｇＧ抗体と交差反応する。 ８ 実施例：ワクチンの効力 実施例３０ ヒトで見られる３つの疾病発現のうちの２つがフェレットの感染により再現可 能に生じるため、コロニー形成および／または疾病に対する防御におけるワクチ ンの効力を評価するためのモデルとして、Campylobacterの病原性を調べるため のフェレットモデルを用いることができる。 ２４匹の７〜９週齢の雄のフェレットを、ＰＢＳ（対照として）、または通常 に増殖させた（ＢＨＩ）または実施例５の方法により増殖させた（増強）ホルマ リン固定C．jejuni８１−１７６株のいずれかで経口的に免疫した。血清を単離 し、ベースラインＩｇＧ力価を測定した。アジュバントＬＴの存在下、１週間間 隔で２回（０日目および７日目、「ワクチン接種」）、すべてのワクチンおよび ＰＢＳを投与した。１週間後（１４日目）（「ワクチン接種後」）に血清を集め 、ＩｇＧ抗体力価を測定した。ワクチン接種４週間後（チャレンジ）、該フェレ ットをＡＣＥプロマジン−ケタミンで麻酔し、生きたC．jejuni８１−１７６（ １×１０10ＣＦＵ）を含有する１０mlＰＢＳ溶液で経口的にチャレンジした。そ の後毎日、粘液性下痢、菌血症、Campylobacterの糞便放出、体重変化、潜血お よび糞便白血球について該動物を監視した。麻酔したフェレットの頸静脈から１ 〜２mlの血液を取り、該試料を通気トリプチカーゼソイ培地培養中でインキュベ ー ションすることにより菌血症を検出した。チャレンジ後２、５および７日目に、 血液寒天プレートへの継代培養を行った。免疫前（ベースライン）、第２免疫の １週間後およびチャレンジ時およびチャレンジの１週間後に血清サンプルを集め てＩｇＧ力価を測定した。 糞便材料をヘマカルトカード（hemacult card）上で調べることにより、潜血 を検出した。糞便白血球を検出するために、糞便材料をスライド上塗抹標本にし メチレンブルーで染色した。Campylobacterの糞便放出は、直腸スワブからの塗 抹をCampylobacter選択性培地プレート（トリプチカーゼソイ寒天、５％ヒツジ 血液、トリメトプリム、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、セファロチンおよび アンホテリシンＢ、Remel，Lenexa，KS）上で培養することにより確認した。こ れらの実験からの結果を以下の表１０および１１に示す。 表１０は、生のチャレンジに際して、本発明の不活化全細胞ワクチンで免疫し た動物がコロニー形成および疾病に対して防御されたことを示す。表１１のデー タは、通常に増殖させた腸内細菌（ＢＨＩ）からよりも一層高いＩｇＧ抗体力価 が本発明のワクチン（増強）から得られることを示す。 これらの結果は、本発明のワクチンにより免疫原性（表１１）および感染から の防御（表１０）が得られ、これらは、通常に増殖させた細菌を用いて動物にワ クチン接種した場合に見られるものより大きいことを示す。したがって、本発明 方法により生産される細菌は、哺乳動物を感染から防御するワクチンとして有用 である。 実施例３１ マウスは、フェレットのように自然にはCampylobacterまたはShigella感染症 を発症しないが、免疫動物の経口チャレンジの際の腸コロニー形成に対する抵抗 性または免疫動物の肺感染による疾病に対する抵抗性を示すために当業者に用い られている。したがって、他の動物やヒトで使用するためのワクチンの効力を予 測するために、マウス鼻腔内接種モデルを用いることができる。このアッセイは 、Malletら（Vaccine, 11:190-196，1993）により記載されている。 １０匹の約１６週齢の雌Balb/cマウスの群をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） 、通常に増殖させたC．jejuni（ＢＨＩ）または実施例５により増殖させたC．je juni（増強）により、約１０7ＣＦＵまたは１０9ＣＦＵにて経口的に免疫し、つ いでチャレンジした。各群の小腸内粘液からのＩｇＡ力価をＥＬＩＳＡ法で測定 した。これを以下の表１２に示す。 表１２は、本発明方法により増殖させた細菌で免疫した動物が、通常に増殖さ せた細菌で免疫した動物より高い小腸ＩｇＡ抗体力価を有する（これは応答動物 のより大きいパーセントで示される）ことを示す。 ９ 実施例：ＤＯＣによる抗原変化または増強の機構 実施例３２ 本発明がいずれかの特定の作用機構により限定されることを意図するものでは ないが、本発明者らは、デオキシコール酸塩（ＤＯＣ）が腸内細菌の抗原性の変 化または増強で２倍の作用を有するようだと示唆する証拠を得た。証拠が示すと ころによれば、ＤＯＣはカルシウムに結合し培地中のカルシウム濃度を低下させ るため、ＤＯＣの作用の１つの態様はカルシウム依存性作用により仲介される。 その証拠は以下のとおりである。C．jejuni８１−１７６を膜透過性カルシウム キレート剤ＢＡＰＴＡ／ＡＭを用い、かつ、ＤＯＣを用いないで培養する場合、 ＩＮＴ−４０７細胞へのその侵入性は約１０倍増強される（以下の表１３を参照 されたし）。しかしながら、ＢＡＰＴＡ／ＡＭ処理単独では、C．jejuni８１− １７６細胞の免疫交差反応性を増強しない。 表１３に示す結果は、０.１％ＤＯＣの代わりに２５μＭＢＡＰＴＡ／ＡＭを 使用する以外は実施例５に記載したプロトコルに従い培養したC．jejuni８１− １７６を用いて得た。該侵入アッセイは、上記第７節の実施例２８に記載のとお りに行い評価した。 胆汁またはＤＯＣなどの胆汁塩により抗原増強または変化を受けやすいいくつ かの細菌属（例、Campylobacter、Shigella、Helicobacter）は、Yersiniaから の低カルシウム応答（lcr）遺伝子と相同な遺伝子を有する。該lcr座は、低カル シウムレベルに応答してYersiniaの毒力を調節することが知られている。侵入に 必要なフラジェリン発現および組立てに関与している２つのCampylobacter遺伝 子（flaA，flbA）は、lcr産物により一部調節されている。通常に増殖させたま たは本発明の毒力増強条件下で増殖させたCampylobacter flaAおよびflbB突然変 異体の挙動分析により、侵入（コンゴーレッド染料結合または交差反応性の増加 ではなく）はカルシウム依存的であることが示されている（以下の表１４を参照 されたし）。 表１４に示す結果は、通常に培養したまたは実施例５で例示される本発明方法 により培養したC．jejuniを用いて得た。該侵入アッセイは上記実施例２８に記 載のとおりに行い評価した。 該C．jejuni flaAおよびflbA突然変異体は、ＤＯＣを用いて培養した場合には 、有意に増強されたコンゴーレッド結合および免疫交差反応性を示さない（それ ぞれ表１５および図６を参照されたし）。表１５および図６に示す結果は、通常 に培養したまたは上記実施例５で例示される本発明方法により培養したC．jejun iを用いて得た。コンゴーレッド染料結合アッセイ（表１５にその結果を示す） は、上記実施例２６に記載のとおりに行った。免疫交差反応性（図６にその結果 を示す）は、上記実施例２９に記載のとおりに行った。 該flaA突然変異体は、フラジェリンを発現することができない。該flaA突然変 異体およびflaA-flaB二重突然変異体（C．Grant，NIHから得た）は共にＤＯＣ処 理後であっても非侵入性であり、このことは侵入にはフラジェリンが必要である ことを示す。興味深いことに、これらのfla突然変異体の同系親株とC．jejuniの 他のあるLior血清型との間で観察された正常に発現された（すなわちＤＯＣで誘 導していない）免疫交差反応性は該突然変異体にはない。しかしながら、ＤＯＣ 処理により、これらフラジェリンの無い突然変異体を誘導して、増強された免疫 交差反応性およびコンゴーレッド結合を発現させることができる。 これらの知見は、ＤＯＣがカルシウム依存的（例、侵入性）およびカルシウム 非依存的（例、コンゴーレッド染料結合）機構により腸内細菌における毒力機能 を調節することを示す。さらに、これらの知見は、ＤＯＣにより誘導される免疫 交差反応性およびコンゴーレッド結合の増強が少なくとも部分的にはフラジェリ ン非依存的であることを示唆する。 １０ 実施例：ＤＯＣは、Campylobacter jejuniの増強された血清型および種 免疫交差反応性を誘導する 実施例３３ 本発明方法により増殖させたCampylobacter jejuniの血清型免疫交差反応性を 急速スライド凝集アッセイにより調べた。このアッセイでは、免疫および非免疫 ウサギからの小腸粘液を用いて、Campylobacterの非相同株の交差反応性に対す る培養条件の変化の影響を判定した。通常に増殖させた生きたC．jejuni８１− １７６でウサギを免疫した。該粘液抗体の凝集活性は、ＢＨＩ−ＹＥ培地中で通 常に増殖させたまたは実施例５で例示される本発明方法により増殖させた、１８ の血清型よりなる２４のCampylobacter株に対して試験した。 該凝集アッセイの結果は、非相同Campylobacter株の交差凝集は、該株を本発 明方法により増殖させた場合には通常に増殖させた場合より広く、多くの場合、 強いことを示す。特に、非相同的凝集反応性では２倍を越える増加があった。す なわち、抗８１−１７６免疫粘液において、通常に増殖させた非相同の２４株の うちの６株が＋またはそれを越えるレベルで凝集したのに対し、ＤＯＣ条件下で 増殖させた同じ２４株のうちの１４株が＋またはそれを越えるレベルで凝集した 。さらに、１８株の非相同株は、通常に増殖させた場合には弱い（±）凝集を示 したかまたは全く凝集を示さなかったが、増強培養条件（例、ＤＯＣ含有培地） 下で増殖させた場合にはこれらの同じ株の１１株が増強された凝集応答を示した 。 表１６は、通常に増殖させた（ＢＨＩ−ＹＥ）または実施例５の方法により増 殖させた（増強）２２株よりなる１９の非相同Lior血清型に対する抗８１−１７ ６免疫ウサギ粘液の交差反応性を示す。この実験が公知のLior血清型の画分をア ッセイするにすぎない場合であっても、この結果は、本発明方法がLior血清型間 の実質的な免疫交差反応性を誘導することを示す。この結果はさらに、Campylob acterにおけるＤＯＣ増強または誘導抗原が、Campylobacterによる腸感染に対す る抵抗性およびこれからの回復に関連した分泌ＩｇＡ応答に重要と思われること を示す。 さらに、Lior血清型８の株が、異なる種であるCampylobacter coliであること に注目すべきである。抗８１−１７６免疫ウサギ粘液において、この血清型の２ 株の一方（ＶＣ１６７）は強く凝集する（３＋）。この結果は、C．jejuni株（ 例、Lior 5）由来のワクチンが、同種内のみならず他のCampylobacter種（例、C ampylobacter coli）の非相同血清型に対しても交差防御することを示す。Lior 血清型１、２、４、９および１１が世界的に最も一般的な疾病関連血清型に挙げ られることにも注目する価値がある。それらはすべて、このアッセイで検出可能 な交差反応性を示した。 １１ 実施例：Campylobacterのワクチンの効力の追加的実験 実施例３４ 本発明方法により増殖させたホルマリン固定全細胞Campylobacter jejuniの防 御的効力は、Bagar（Infect ．& Immun.，63:3731-3735，1995）により報告され ているマウスコロニー形成モデルを用いて判定した。 C．jejuni８１−１７６は、実施例５に従い増殖させ収穫し、上記のとおり０. ０７５％ホルマリンにより不活化した。１０5、１０7または１０9個の不活化細 菌粒子を単独でまたはE．coliからの２５μgの熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ ）と共に含有する３経口用量（エンドトキシンを含まないＰＢＳ中０.２５ml／ 用量）を、５匹の６〜８週齢雌Balb/cマウスの群に投与した。投与は４８時間間 隔で、および胃の酸性を中和するために５％炭酸水素ナトリウム溶液（pＨ８.５ ）０.５mlの２用量を１５分間隔で投与した直後に行った。対照として、動物群 にＰＢＳ単独でまたはＬＴアジュバントと組み合わせてワクチン接種した。第３ 用量の投与の約２８日後に、ワクチン接種した動物を、通常に増殖させた生きた C．jejuni８１−１７６の約１０8のコロニー形成単位（ＣＦＵ）で鼻内または経 口投与のいずれかでチャレンジした。９日間にわたり毎日糞便放出を監視するこ とにより、腸コロニー形成の持続時間を測定した。糞便材料を無菌ＰＢＳ中に乳 化し、アリコートをCampylobacter血液寒天上にプレーティングした。プレート を微好気性条件（Campylobacter GasPak，BBL）下３５℃で３〜５日間インキュ ベーションしてC．jejuniを増殖させた。コロニー形成の結果は、ある試料採取 日にCampylobacter生物を放出する動物のパーセントで表す。 図７に示すとおり、すべての鼻内チャレンジ動物は免疫したものも対照も共に 、チャレンジ直後（１日目）に生物を放出した。該対照動物の８０〜１００％が チャレンジ後９日間コロニーを形成したままであった。これとは対照的に、該ワ クチン接種群では、その９日間のアッセイ期間中に生物を放出した動物は有意に 少なかった。チャレンジ生物のクリアランスの程度および時間は、投与したワク チン量に依存していた。低い（１０5粒子／用量）および中程度（１０7粒子／用 量）のワクチン用量は、ゆるやかで不十分なクリアランス速度を与えた。アジュ バントの存在はこれらの用量での防御の程度を増加させた。驚くべきことに、試 験した最も高い用量（１０9粒子／用量）では、匹敵用量をＬＴアジュバントと 共に投与した場合に得られるものと同等または若干これを上回る程度の防御が非 アジュバント化ワクチンにより得られた。 経口的にワクチン接種した動物にその後経口的にチャレンジした場合に同様の 結果が得られた（図８を参照されたし）。これらの結果は、本発明方法により増 殖させた不活化Campylobacterでの免疫によりその後の生きたCampylobacterのチ ャレンジに対する防御が得られ、アジュバントを用いないで経口的に投与した場 合であっても該免疫が有効であることを示す。 本発明方法（例えば実施例５を参照されたし）により増殖させたホルマリン固 定全細胞Campylobacter jejuniを腹腔内（ＩＰ）投与した場合の防御的効力も評 価した。これらの実験のために、エンドトキシンを含まないＰＢＳ０.５ml中の １.３×１０10、２.５×１０9、５.０×１０8、１.０×１０8または２.０×１０7 個の不活化C．jejuni粒子の単一用量をアジュバントなしで２０匹の雌Balb/cマ ウスの群に投与した。１４日後、生きたC．jejuni８１−１７６（エンドトキシ ンを含まないＰＢＳ中約１.０×１０10ＣＦＵ）の単一致死用量で該動物の腹腔 内へチャレンジした。４日間毎日、死亡率について動物を監視した。 表１７に示すとおり、５.０×１０8個の不活化C．jejuni粒子の単一の腹腔内 用量により、生きたC．jejuniチャレンジに対して動物を防御するのに十分な免 疫応答が誘導された。 １２ 実施例：ShigellaのＤＯＣ増強侵入性、コンゴーレッド結合および免疫 交差反応性 実施例３５ in vitroで増殖させたShigella sp.の侵入性は、培養の増殖期に影響される。 通常に増殖させた（ＢＨＩ）または実施例９で例示される本発明方法により増殖 させた（ここでは、該細胞は初期対数期培養からのものである）（ＤＯＣ−ＥＬ ）、または実施例９により増殖させた（ただし、該細胞を収穫する前に該培養を 後期対数期に到達させた）（ＤＯＣ−ＬＬ）Shigella flexneri２４５７Ｔ細胞 の侵入性を、実施例２８に記載の方法により調べた。その結果は、ＤＯＣによる 培養が侵入性を増強し、初期対数増殖期に最大増強が得られることを示す（図９ を参照されたし）。 本発明方法によるＤＯＣを用いた培養は、他のShigella種であるS．sonneiお よびS．dysentariaeの侵入性も増強する（図１０を参照されたし）。分極上皮細 胞では、増強されたShigellaの侵入性は、該細菌が該上皮細胞に基底外側で感染 した場合にのみ観察された。この知見は、in vivoで観察される侵入過程と一致 する。 比較研究は、本発明方法により増殖させたShigellaが、Popeら（Infect ．& Im mun. ，63:3642-3648 1995）により記載されている方法により調製したShigella より約１０倍高い侵入性を有することを示す。 実施例３６ 本発明方法により培養したShigellaは増強されたコンゴーレッド結合も示す。 通常に増殖させた（ＢＨＩ）または実施例９で例示される本発明方法により増殖 させたS．flexneri２４５７ＴおよびS．sonneiを、それらの染料結合能について 上記実施例２６に記載の方法によりアッセイした。その結果は、ＤＯＣ中の増殖 がその２つのShigella種によるコンゴーレッド結合を１０〜２０倍増強したこと を示す（表１８を参照されたし）。 Shigellaは４つの種および種々の血清型に分けられる。本発明方法により増殖 させたShigella flexneriの免疫交差反応性を、実施例２８に記載の凝集アッセ イにより検討した。該アッセイでは、免疫ウサギからの抗血清を使用して、異な るShigella種の免疫交差反応性に対する培養条件の影響を判定した。実施例９の 方法により増殖させたホルマリン固定Shigella flexneri２４５７Ｔで該ウサギ を免疫した。該免疫動物から得たＩｇＧ抗体の凝集活性を、ＢＨＩ培地中で通常 に増殖させたまたは本発明方法（例、実施例９）により増殖させた４つのShigel la種すべてに対して調べた。該凝集アッセイの結果は、ＤＯＣを用いた増殖が、 抗S．flexneri抗体に対する相同Shigella flexneriの凝集活性ならびに３つの非 相同Shigella種の凝集活性を有意に増強したことを示す（図１１を参照されたし ）。 １３ 実施例：Shigellaのワクチン効力 実施例３７ 本発明方法により増殖させたホルマリン固定全細胞Shigella flexneriの防御 効力を、C．P．Mallettら（Vaccine, 11:190-196，1993）により開発されたマウ ス鼻内チャレンジモデルを用いて判定した。簡単に言えば、実施例９で例示され る方法によりShigella flexneriを増殖させ収穫し、実施例３０に記載のとおり に０.０７５％ホルマリンで不活化した。約１０7個の不活化細菌粒子を用いて、 １４〜１６週齢の雌Balb/cマウスにワクチン接種した。エンドトキシンを含まな い無菌ＰＢＳに該不活化S．flexneriを１０8粒子／mlの濃度で懸濁し、この物質 ３５μlを１０匹の軽く麻酔した動物群に鼻内投与した。１４日間隔で合計３回 の免疫を行った。 Shigella全細胞ワクチンの防御能に対するアジュバントの影響を調べるために 、不活化ワクチンおよびE．coliからの５μgの熱不安定エンテロトキシン（ＬＴ ）を含有する懸濁液を用いて動物群を免疫した。第３免疫の１４日後に、生きた S．flexneriまたはS．sonneiのいずれかの亜致死消耗用量（sublethal wasting dose）（１０5ＣＦＵ）で動物を鼻内チャレンジした。該チャレンジ直前および 該チャレンジ後１、２、５、および７日目に動物の体重を測り、平均群体重を求 めた。結果を表１９に示す。 実施例９に従い増殖させた１０7の不活化S．flexneriよりなるワクチンで、各 群の１０匹のマウスを３回鼻内免疫した。 本発明方法により増殖させた不活化S．flexneriよりなるワクチンで免疫した マウスは、生きたS．flexneri生物によるチャレンジに対して防御されていた。 それらのマウスは、ワクチン接種を受けていないマウス（すなわち、擬似対照群 ）と比べて、体重減少が少なく、体重の回復が速かった。驚くべきことに、S. f lexneriワクチンは、生きたS．sonneiによるチャレンジに対してもマウスを防御 した。興味深いことに、ＬＴアジュバントなしでワクチンを単独で投与された動 物は、アジュバント化ワクチンを投与された動物と同程度に、相同S．flexneri チャレンジに対して防御された。また、S．flexneriワクチンは単独で、S．sonn eiによる非相同チャレンジに対する防御を与えた。しかしながら、該ＬＴアジュ バントを含有させることにより、S．sonneiによるチャレンジに対する防御が増 強されたことは注目に値する。これらの知見は、本発明方法により調製された不 活化Shigellaよりなるワクチンが、認められたShigella疾病モデルに有効であり 、種々のShigella感染を予防または弱めるのにアジュバントは必要でないことを 示す。 １４ 実施例：動物細胞に対するH．pyloriの付着性に影響を及ぼす因子 実施例３８ H．pyloriの付着は、グリココール酸塩または胆汁中の増殖により強化される 。H．pyloriのＮＢ３−２またはＧ１−４株の細胞を、４％子ウシ血清を含むＢ ＨＩ培地へ加えた。接種後、該フラスコを１０％ＣＯ2−５％Ｏ2−８５％Ｎ2で フラッシュし、振盪しながら３７℃で２２時間インキュベーションした。このイ ンキュベーションの後、種々の濃度（０.０２５％〜０.２％）のウシ胆汁を含有 する４％子ウシ血清を含むＢＨＩ培地１リットルを含有するフラスコへ１〜１０ 倍に該培養物を希釈した。これらの培養物を同じ気体混合物で再度フラッシュし 、３７℃でインキュベーションした。１８時間までの種々の時点で該細胞を収穫 し、実施例２８に記載した方法により、ＩＮＴ−４０７細胞に対するそれらの付 着をアッセイした。その結果は、胆汁と共に培養することにより、ＩＮＴ−４０ ７細胞に対するH．pyloriの付着性が増強されることを示す（図１２および１３ を参照されたし）。ＮＢ３−２株の場合、ピーク付着（非増強培養物の付着に対 して４〜６倍の増加）は増殖の約８時間後に生じた（図１２）。Ｇ１−４株では 、ピーク付着（非増強培養の付着に対して２〜３倍の増加）は０.２％胆汁中で １２〜１４時間の増殖の間に生じた（図１３）。一般に、これらの「ピーク」時 は、各株の培養が対数増殖期にある時期に対応する。 １５ 実施例：本発明方法により増殖させたHelicobacterのワクチン効力 実施例３９ 本発明方法により増殖させたホルマリン固定全細胞Helicobacter pyloriの防 御効力を、Chenら（Lancet，339:1120-1121，1992）により記載されているマウ スHelicobacter felis胃コロニー形成モデルを用いて判定した。４％子ウシ血清 を含有するＢＨＩ培地中、１０％ＣＯ2、９０％空気下３７℃で２２時間、Helic obacter pyloriＧ１−４株を種培養として増殖させた。この培養物のアリコート を用いて、０.１％（v/v）ウシ胆汁を含有する１０倍容の同じ培地に接種した。 ３７℃で１２〜１４時間増殖させた後、該細胞を遠心分離により収穫し、室温に て原容量の１／１０のハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁した。細胞を再 度遠心分離し、原容量の１／１００のＨＢＳＳに再懸濁した。該緩衝化細胞懸濁 液にホルマリンを０.０７５％の濃度になるまで加え、該懸濁液を室温で６時間 撹拌し次いで該溶液を４℃で１８時間冷却することにより該細胞を不活化した。 Helicobacterを有さない６〜８週齢の雌Balb/cマウスにこの不活化全細胞ワク チンの３用量を、０、７および１４日目または０、７および２１日目に経口投与 することにより、ルーチンに防御潜在性を測定した。１用量あたり１０9個の細 菌粒子の用量をE．coliの熱不安定エンテロトキシンと組み合わせて評価した。 第３免疫量投与の１４日後に、生きたH．felisの単一用量（１０7ＣＦＵ／用量 ）で動物を経口チャレンジした。 チャレンジの２週間後に該動物を犠牲にし、ウレアーゼ活性に関して洞胃セグ メント（antral stomach segment）を分析してH．felisの存在を判定した。ウレ アーゼ活性は、洞組織サンプルをスチュアートウレアーゼ培地（Remel）０.５ml 中室温で４〜２４時間インキュベーションすることにより測定した。この時間内 に生じた透明から赤への変色を陽性ウレーゼの結果とみなした。 表２０に示すとおり、H．pyloriＧ１−４株を用いて調製した増強Helicobacte r全細胞ワクチンの投与により、H．felis経口チャレンジに対して動物が防御さ れた。 これらの実験の結果は、増強された腸内細菌の性質とin vivo免疫原性との関 連性を示す。 本発明の方法は、防御的免疫応答誘導能を有する細菌を生産するため、ワクチ ンとして有用である。 １６ 微生物の寄託 以下の微生物は、American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive ，Rockville，Maryland 20852，USAに寄託されており、以下に示す受託番号を有 する。 当業者であれば本発明の方法の他の均等物を容易に決めることができ、かかる 均等物も本発明に包含されると意図される。以上の開示は、特許請求する発明を 当業者が実施するのを可能にするために必須と考えられるすべての情報を含む。 該引用特許または刊行物はさらに有用な情報を提供しうるため、本明細書中に引 用した資料はその全体を出典明示により本明細書の一部とする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 フレイ，スティーヴン，エム. アメリカ合衆国 20874 メリーランド州, ジャーマンタウン，クロス リッジ ウェ イ 12529

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．増強された抗原特性を有するヘリコバクター(Helicobacter)菌の作出方法で あって、ヘリコバクター菌の培養物をin vitroで、 ａ）約0.05%〜約3%の胆汁、または約0.025%〜約0.6%の１種以上の胆汁酸も しくはその塩； ｂ）約30℃と約42℃の間の温度； ｃ）空気中または微好気性条件下、ここで微好気性条件はｉ）約5%〜約20% のCO2と約80%〜約95%の空気、またはii）約5%〜約10%のO2と約10%〜約20%のCO2 と約70%〜約85%のN2からなる；および ｄ）0〜約100μMのBAPTA/AM、0〜約10mMのEGTA、および0〜約100μMのEGTA/ AMよりなる群から選ばれる２価カチオンキレート剤； を含む条件の組合せのもとで、該培養物が早期対数期付近、早期対数期と定常 期の間、または定常期付近の成長相に至るように十分な時間成長させることを含 んでなる方法。 ２．胆汁塩または胆汁酸がグリココール酸塩またはグリココール酸を含む、請求 項１に記載の方法。 ３．ヘリコバクター菌がヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)または ヘリコバクター・フェリス(Helicobacter felis)である、請求項１に記載の方法 。 ４．ヘリコバクター菌がヘリコバクター・ピロリ49503株、NB3-2株またはGl-4株 である、請求項３に記載の方法。 ５．前記条件の組合せが ａ）約0.05%のグリココール酸塩である胆汁塩または約0.1%〜約0.2%の胆汁 ； ｂ）約37℃の温度； ｃ）約10%〜約20%のCO2と約80%〜約90%の空気、または約10%のCO2と約5%のO2 と約85%のN2； を含み、前記培養物が対数期に至るように十分な時間該培養物を成長させる、 請求項４に記載の方法。 ６．増強された抗原特性を有するヘリコバクター菌の作出方法であって、ヘリコ バクター菌の培養物をin vitroで、 ａ）約1.0〜約25μMのBAPTA/AM、約0.5〜約10mMのEGTA、および約1.0〜約10 0μMのEGTA/AMよりなる群から選ばれる２価カチオンキレート剤； ｂ）約30℃と約42℃の間の温度；および ｃ）空気中または微好気性条件下、ここで微好気性条件はｉ）約5%〜約20% のCO2と約80%〜約95%の空気、またはii）約5%〜約10%のO2と約10%〜約20%のCO2 と約70%〜約85%のN2からなる； を含む条件の組合せのもとで、該培養物が早期対数期付近、早期対数期と定常 期の間、または定常期付近の成長相に至るように十分な時間成長させることを含 んでなる方法。 ７．増強された抗原特性を有するヘリコバクター菌であって、 ａ）約0.05%〜約3%の胆汁、または約0.025%〜約0.6%の１種以上の胆汁酸も しくはその塩； ｂ）約30℃と約42℃の間の温度； ｃ）空気中または微好気性条件下、ここで微好気性条件はｉ）約5%〜約20% のCO2と約80%〜約95%の空気、またはii）約5%〜約10%のO2と約10%〜約20%のCO2 と約70%〜約85%のN2からなる；および ｄ）0〜約25μMのBAPTA/AM、0〜約10mMのEGTA、および0〜約100μMのEGTA/A Mよりなる群から選ばれる２価カチオンキレート剤； を含む条件の組合せのもとでin vitroで成長させたヘリコバクター菌の培養物 から回収され、該ヘリコバクター菌の培養物が早期対数期付近、早期対数期と定 常期の間、または定常期付近の成長相にあるヘリコバクター菌。 ８．胆汁塩または胆汁酸がグリココール酸塩またはグリココール酸を含む、請求 項７に記載のヘリコバクター菌。 ９．ヘリコバクター菌がヘリコバクター・ピロリまたはヘリコバクター・フェリ スである、請求項７に記載のヘリコバクター菌。 10．ヘリコバクター菌がヘリコバクター・ピロリ49503株、NB3-2株またはGl-4 株である、請求項９に記載のヘリコバクター菌。 11．前記条件の組合せが ａ）約0.05%のグリココール酸塩である胆汁塩または約0.1%〜約0.2%の胆汁 ； ｂ）約37℃の温度； ｃ）約10%〜約20%のCO2と約80%〜約90%の空気、または約10%のCO2と約5%のO2 と約85%のN2； を含み、前記培養物が対数期付近にある、請求項７に記載のヘリコバクター菌 。 12．ヘリコバクター菌がヘリコバクター・ピロリまたはヘリコバクター・フェリ スである、請求項11に記載のヘリコバクター菌。 13．増強された抗原特性を有するヘリコバクター菌であって、 ａ）約1.0〜約25μMのBAPTA/AM、約0.5〜約10mMのEGTA、および約1.0〜約10 0μMのEGTA/AMよりなる群から選ばれる２価カチオンキレート剤； ｂ）約30℃と約42℃の間の温度；および ｃ）空気中または微好気性条件下、ここで微好気性条件はｉ）約5%〜約20% のCO2と約80%〜約95%の空気、またはii）約5%〜約10%のO2と約10%〜約20%のCO2 と約70%〜約85%のN2からなる； を含む条件の組合せのもとでin vitroで成長させたヘリコバクター菌の培養物 から回収され、該ヘリコバクター菌の培養物が早期対数期付近、早期対数期と定 常期の間、または定常期付近にあるヘリコバクター菌。 14．請求項７、９、11、12または13に記載のヘリコバクター菌、またはその免疫 原性断片もしくは誘導体を含有するワクチン。 15．製剤学的に許容される担体または希釈剤をさらに含有する、請求項14に記載 のワクチン。 16．ヘリコバクター菌が不活化されている、請求項14に記載のワクチン。 17．ヘリコバクター菌がホルマリン処理で不活化されている、請求項16に記載の ワクチン。 18．前記ワクチンが粘膜投与または非経口投与または粘膜および非経口投与に適 している、請求項14に記載のワクチン。 19．アジュバントをさらに含有する、請求項14に記載のワクチン。 20．請求項７、９、11、12または13に記載のヘリコバクター菌を潜在抗菌剤と接 触させ、ヘリコバクター菌に対する該抗菌剤の殺菌または静菌作用をアッセイす ることを含んでなる、潜在抗菌剤のアッセイ法。 21．動物または動物由来の生物学的サンプル中のヘリコバクター菌に対する宿主 の抗体を検出する方法であって、ａ）該生物学的サンプルを請求項７、９、11、 12または13に記載のヘリコバクター菌またはその断片と接触させ、ｂ）ヘリコバ クター菌またはその断片の抗体結合をスクリーニングする、各工程を含んでなる 方法。 22．動物または動物由来の生物学的サンプル中のヘリコバクター菌を検出する方 法であって、ａ）該生物学的サンプルを請求項７、９、11、12または13に記載の ヘリコバクター菌またはその断片と結合する抗体と接触させ、ｂ）該抗体とヘリ コバクター菌またはその断片との結合をスクリーニングする、各工程を含んでな る方法。 23．請求項７、９、11、12または13に記載のヘリコバクター菌またはそれに対す る抗体、および所望のイムノアッセイを行うのに必要不可欠な他のすべてのキッ ト成分を含んでなる、ヘリコバクター菌に対する抗体の宿主生産を検出するため の、またはヘリコバクター菌を検出するための診断用イムノアッセイキット。 24．動物を請求項７、９、11、12または13に記載のヘリコバクター菌を含む有効 量の免疫原で免疫することを含んでなる、ヘリコバクター菌またはその構成成分 と結合する抗ヘリコバクター抗体を動物において産生する方法。 25．動物に請求項７、９、11、12または13に記載のヘリコバクター菌を含む有効 量の免疫原を投与することを含んでなる、動物においてヘリコバクター菌による 感染または疾病を防止し、軽減しまたは治癒させる免疫応答を刺激する方法。
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