JPH10507366A

JPH10507366A - Ｐｃｒによるテロメアｄｎａの可変性の特性決定法

Info

Publication number: JPH10507366A
Application number: JP8513716A
Authority: JP
Inventors: ベイアード，ダンカン・マーティン; ロイル，ニコラ・ジェーン; ジェフリーズ，アレック・ジョン
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-19
Publication date: 1998-07-21
Also published as: EP0787203A1; US6235468B1; GB9521447D0; GB2294322A; WO1996012821A1

Abstract

(57)【要約】ゲノムＤＮＡの試験試料を特性決定する方法であって、該試験試料と型特異的プライマーとを接触させて、テロメア反復配列中でその型の内部反復単位を選択的に開始させ、そして該型特異的プライマーを適当なヌクレオシド三リン酸およびそれらの重合剤の存在下で伸長させて、その型の内部反復単位から少なくともテロメア反復配列の末端まで伸長した増幅生成物セットを生じることを含む上記方法。

Description

【発明の詳細な説明】ＰＣＲによるテロメアＤＮＡの可変性の特性決定法本発明は、遺伝的特性決定法に関する。特に、本発明は、テロメア反復配列の分析に基く方法に関する。Ｘｐ／Ｙｐ偽常染色体部分（ＰＡＲ１）は充分に特性決定されており、それは長さ２．６ｍｂであり、少なくとも６個の遺伝子を含み、そしてそれは近位のＡｌｕ要素および遠位末端のテロメアによって定義される（ラポルド（Rappold）、1993年）。多数のヒト常染色体のプロ末端部分に共通して、ＰＡＲ１は、高ＧＣ含量を有し且つ多数の超可変高ＧＣミニサテライトを含有する。雄性減数分裂の際に、染色体対合はＸおよびＹ染色体の相同部分の間に生じ、そしてＰＡＲ１は強制的組換え結果の部位である（クック（Cooke）ら、1985年、シムラー（Sim mler）ら、1985年）。最近、雌性組換えホットスポットが、遺伝子座ＤＸＹＳ２０（３ｃｏｓＰＰ）およぴＤＸＹＳ７８（ｐＭＳ６００）間で且つテロメアから僅か２０〜８０ｋｂのＰＡＲ１中に定義された（ヘンケ（Henke）ら、1993年）。明らかに、ＰＡＲ１は、雄性生殖系列において極めて特殊な機能を与えるが、それはまた、ヒト常染色体のプロ末端部分に起因した物理的および遺伝的性質のいくつかに関与している。ＰＡＲ１のテロメアを含めた末端配列はクローン化された（ブラウン（Brown ）、1989年、ロイル（Royle）ら、1992年）。ＤＸＹＳ１４（２９Ｃ１によって検出された、イングルハーン（Inglehearn）およびクック、1990年）は、テロメアの２０ｋｂ中にある最も遠位の超可変ミニサテライトである。このテロメアの１ｋｂ中の配列は、制限フラグメント長さ変異を全く示さない別のＰＡＲ１特異的ミニサテライトおよびＳＩＮＥの切断されたコピーを含有する（ロイルら、19 92年）。ゲノム中にはＳＩＮＥのこの系列の推定２０，０００コピーが存在する（ラ・マンチャ（La Mantia）ら、1989年）。テロメアは、分解および他の染色体に対する融合から直鎖状染色体を保護し、そして細胞周期中に時々、核基質に対する結合部位であると考えられる。全ヒト染色体のテロメアは、テロメアに対して５′〜３′に配向した高Ｇ鎖を含む（ＴＴＡＧＧＧ）反復単位の可変長さ配列から構成される。（ＴＴＧＧＧＧ）およびＴＧＡＧＧＧ）などの種々のテロメア反復単位が識別されたが、ヒトテロメアの近位末端にありがちである（オールシャー（Allshire）ら、1989年）。テロメア結合タンパク質と結合したテロメア反復体は、機能性テロメアに必要とされる全てであり、それゆえ、それらは分解、他の染色体に対する融合から直鎖状染色体を保護し、そしてそれらは細胞周期中に時々、核基質に対する結合部位であると考えられる（ビースマン（Biessmann）およびメイソン（Mason）、1993年）。テロメア長さは、複製および有糸細胞分裂の周期の増加に伴って体細胞組織中で減少し（ハスティー（Hastie）ら、1990年、ハーリー（Harley）ら、1990年）、そしてついには、機能性テロメアが染色体から失われ、そしてゲノムが脱安定化すると推測される。テロメア反復体の損失は、（ＴＴＡＧＧＧ）反復体を de novo で加える特殊な逆転写酵素であるテロメラーゼの活性によって相殺されうるが（グライダー（Greider）およびブラックバーン（Blackburn）、1989年、モリン（ Morin）、1989年）、多くの結果は、テロメラーゼがヒト生殖系列において活性であるにすぎないことを示唆している。最近、テロメラーゼ活性が卵巣癌において検出されたが、その患者の正常組織では検出されず（カウンター（Counter）ら、1994年）、テロメラーゼの再活性化は、腫瘍進行においておよび培養中の細胞の不死化において不可欠な工程であることが示唆された（グライダー、1994年）。タンデム反復体の配列から成る配列は、サテライトＤＮＡからミクロサテライトで見出されたジヌクレオチド反復体の短い配列までである。ミニサテライト遺伝子座の対立遺伝子の内部構造の分析は、共通反復体からの配列変異を示す反復単位の分布を地図で示すことによって達成された（ＭＶＲ−ＰＣＲ、ジェフリーズ（Jeffreys）ら、1991年）。この方法は、いくつかの遺伝子座の対立遺伝子変異の実際の程度を示し（モンクトン（Monckton）ら、1993年、アーマー（Armour ）ら、1993年、ニール（Neil）およびジェフリーズ、1993年、ブアード（Buard ）およびバーグノード（Vergnaud）、1994年）、そして生殖系列で生じる突然変異対立遺伝子の発生に関与した過程を識別するのに用いられた（ジェフリーズら、 1994年）。テロメア反復配列は変異を示すと予想されうるが、これまでに識別された、個体およびそれからの情報提供の間の対立遺伝子可変性の程度は制限された。本発明者はここで、無関係の対立遺伝子間で広範な変異を示した、ＰＣＲによるテロメア変異反復地図作成（telomere variant repeat mapping by PCR：ＴＶＲ−ＰＣＲ）と称される新規なシステムを提供する。したがって、本発明の第一の態様において、本発明者は、ゲノムＤＮＡの試験試料を特性決定する方法であって、該試験試料と型特異的プライマーとを接触させて、テロメア反復配列中でその型の内部反復単位を選択的に開始させ、そして該型特異的プライマーを適当なヌクレオシド三リン酸およびそれらの重合剤の存在下で伸長させて、その型の内部反復単位から少なくともテロメア反復配列の末端まで伸長した増幅生成物セットを生じることを含む上記方法を提供する。テロメア反復単位の２種類またはそれ以上の特定の型を増幅させて、対応した増幅生成物セットを生じることができる。１種類または複数の増幅生成物セットは、テロメア反復配列に隣接する遺伝子座まで伸長し、そしてその隣接する遺伝子座に対してハイブリッド形成し且つ適当なヌクレオシド三リン酸およびそれらの重合剤の存在下で伸長して増幅生成物セットを増幅する共通プライマーの鋳型として作用する。上の増幅手順を、必要に応じて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応で繰り返すことができる。ゲノムＤＮＡの試験試料は、全ゲノムＤＮＡまたは部分分解したＤＮＡでありうる（但し、分析されるテロメア反復配列の全部または適切な部分が影響されない状態のままであるという条件付きである）。型特異的プライマーは、合成法によって製造されたかまたは天然に存在する配列に由来するオリゴヌクレオチドであり、それは、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下において、すなわち、適当な緩衝液および適当な温度での適当なヌクレオシド三リン酸および重合剤の存在下において起こった場合の合成の開始点として作用することができる。本明細書にその内容が援用される欧州特許第0332435号明細書において、本発明者は、１塩基程度で僅かに異なる鋳型配列の選択的増幅法、並びに該選択的増幅法で用いるための型特異的プライマーを開示し且つ請求の範囲に記載している。本発明において用いるための型特異的プライマーは、したがって、本発明者の上述の欧州特許公開第0332435号明細書を参照して設計することができる。選択的増幅法を、ここで、増幅不応性突然変異系（ＡＲＭＳ）と一般的に称する。ＡＲＭＳは、ゼネカ・リミテッド（Zeneca Limited）の商標である。他に（ジェフリーズら、Nature，1994年，354,204-209）、増幅生成物は、前のサイクルからの増幅生成物上で内部的に開始する型特異的プライマーのために、それぞれの増幅サイクルで漸進的に短くなりうることが報告された。ジェフリーズらは、意外にも、共通プライマーの伸長生成物中の尾部配列の補体に対してハイブリッド形成し且つ適当なヌクレオシド三リン酸およびそれらの重合剤の存在下で伸長して共通プライマー増幅生成物を増幅する尾部特異的プライマーの使用によってこの問題を克服しうることを発見した。要約すると、尾部配列および相補的配列が、タンデム反復部分に対してまたは隣接した部分に対してハイブリッド形成しないという条件ならば、型特異的プライマー上の尾部配列は、共通プライマーの伸長生成物中のその補体(complement)が、尾部特異的プライマーに好都合な鋳型を提供するように選択される。好都合な尾部配列長さの例としては、最大５０個まで、最大４０個まで、最大３０個まで、そして最大２０個までのヌクレオチドがある。尾部付きプライマーの使用に関する更に詳細は、本明細書中に援用される英国特許出願公開第2259138号明細書で開示されている。驚くべきことに、本発明者は、ＴＶＲ−ＰＣＲにおいて、上記のような非相補的尾部によってプライマーを「標識」することは不可欠でないことを発見した。上記手順にしたがって製造された増幅生成物セットは、ポリメラーゼ連鎖反応で好都合に増幅される。ポリメラーゼ連鎖反応は、ストックトン・プレス（Stoc kton Press）−ロンドン／ニューヨークによって１９８９年に発行されたヘンリーＡ．エーリッヒ（Henry A.Ehrlich）監修の「PCR Technology」で好都合に記載されている。必要ならば、型特異的プライマー上の尾部配列は、尾部特異的プライマーが、それぞれの増幅サイクルで所望の型の内部反復単位を開始することを確実にする。増幅生成物セットは、任意の好都合な手順にしたがって試料コードを提供するように分離されるが、但し、その分離は、テロメア反復配列中の特定の型の個々のテロメア反復単位の自然のままの（ゲノム）順序に基いて行われるという条件付きである。試料コードが、該セット中の任意の好都合な増幅生成物数から与えられることができ且つ自然のままの順序内の位置の任意の好都合な数を表すことは理解されるであろう。概して、分離は、増幅生成物の相対寸法に基いて行われ、そしてこれらは既知のゲル電気泳動技術によって好都合に分離されて、試料コードを表す増幅生成物のラダーを生じる。増幅生成物の直接的可視化、例えば、染色法および具体的には臭化エチジウムの使用は好ましい。しかしながら、必要ならば、増幅生成物は、例えば、タンデム反復部分に対してまたは隣接する部分に対して特異的にハイブリッド形成するプローブを用いて識別することができる。該プローブは、任意の好都合な放射性標識またはマーカー成分を含んでいてよい。好ましくは、米国特許第4959182号明細書で開示され且つ請求の範囲に記載されたトリガー性化学発光１，２−ジオキセタン化合物ルミホス（Lumi-Phos）⁵ ³⁰ などの非放射性標識を用いる。ルミホス⁵³⁰は、ルミジェン・インコーポレーテッド（Lumigen Inc.）の商標である。上記の初めの方で示したように、本発明の方法を用いて、テロメア反復配列中のテロメア反復単位の少なくとも二つの特定の型を分析するのに用いることができる。これは、得られた試料コードの情報提供をかなり増加させる。型特異的プライマーを用いて増幅が行われる場合、これはまた、非型特異的内部反復単位に対する何等かのミスプライミングの内部対照を与える。したがって、例えば、増幅生成物は上記のように分離されて、増幅生成物の二つまたはそれ以上の型特異的ラダーを与える。概して、本発明の方法は、１種類またはそれ以上の対照に関して行われる。特に、該方法は、既知のプロフィールの対照試料に関して行われる。したがって、例えば、増幅生成物が型特異的ラダーとして与えられる場合、個々の「段（rung s）」の位置を対照試料のラダープロフィールと比較する。対照試料のラダープロフィールはまた、試料コード中に含まれた特定の型の内部反復単位のテロメア反復配列中の基準位置を好都合に与えることができる。理想的に、特定の型のおよび試料コード中に含まれた内部テロメア反復単位は不変の長さを有する。これは、例えば、増幅生成物の１種類または複数の型特異的ラダーの分析を簡単にする。隣接する遺伝子座は、試験試料をこの遺伝子座での任意の情報提供配列多形に関して更に特性決定することができるので、多形であるのが好都合である。「情報提供配列多形性」によって、本発明者は、分析される集団中の有用な程度の情報を与える任意の配列多形性を意味する。好都合な多形性は、概して、ある与えられた集団の約１％〜５０％で、例えば、最大２％まで、最大５％までまたは最大１０％までの個体で検出される。共通遺伝子座のある選択された配列変異体の増幅は、本発明の反復単位型特異的プライマーと全く類似した方法で、型特異的、すなわち、対立遺伝子特異的共通プライマーを用いて好都合に行われる。したがって、その対立遺伝子特異的共通プライマーは、適当なヌクレオシド三リン酸およびそれらの重合剤の存在下で伸長して、選択された配列変異体を含む増幅生成物セットを増幅する。対立遺伝子特異的共通プライマーは、型特異的プライマーに関して上記の初めの方におよび本発明者の欧州特許公開第0332435号明細書に記載のように好都合に設計され且つ製造される。本発明の上記態様は、対立遺伝子を先に分離することなく、母性および父性対立遺伝子のどちらかかまたは両方に関してゲノムＤＮＡの試験試料を特性決定するのに好都合に用いることができる。例として、共通遺伝子座のある選択された変異体に対してヘテロ接合性である個体からの試料ＤＮＡは、一つの対立遺伝子からの型特異的共通プライマー増幅生成物を生じるだけであろう。同様に、選択された変異体を有していない個体からの試料ＤＮＡは、いずれの共通プライマー増幅生成物も生じないであろう。このような結果はいずれも、同様の共通遺伝子座で非型特異的共通プライマーを用いて両方の対立遺伝子に対する増幅生成物を与えることによって好都合に実証されうる。概して、日常的特性決定目的に対して、非型特異的共通プライマーは、両方の対立遺伝子から情報を得るのに用いられるであろう。本発明者は、ＰＡＲ１テロメアに隣接した配列を研究し、そして高頻度の塩基置換多形性および１種類の挿入／欠失多形性を識別した。多形位置の７個を広範にわたって研究し、そしてそれらは、互いにほぼ完全な連鎖不平衡を示し、３種類のハプロタイプだけを同定した。該ハプロタイプは、異なった種族集団間で頻度が異なる。ＰＡＲ１テロメア自体の中に存在する対立遺伝子変異を研究するために、本発明者は、上記で開示されたＴＶＲ−ＰＣＲ系を開発した。ＰＡＲ１テロメア反復配列と一緒に用いるための隣接するプライマーの設計は簡単ではなかった。多数の独特の配列プライマーは、情報提供できるような方法でテロメア反復配列を増幅することはできなかった。本発明者は、意外にも、ＰＡＲ１テロメアに隣接する短い散在反復要素（ＳＩＮＥ）が、対立遺伝子特異的増幅に適した多形部位を含むことを発見した。これは、ＳＩＮＥＳのこの系列がゲノム中に少なくとも２０，０００コピーを有し、それが対立遺伝子特異的増幅にとってよい徴候ではないので、少なからず意外である。Ｘｐ／Ｙｐ偽常染色体部分（ＰＡＲ１）テロメア反復配列中で、本発明者は、多形遺伝子座を同定した（図１Ａを参照されたい）。本発明のもう一つ態様において、本発明者は、ゲノムＤＮＡの試験試料を特性決定する方法であって、該試験試料と対立遺伝子特異的プライマーとを接触させて、適当なヌクレオシド三リン酸および重合剤の存在下においてＸｐ／Ｙｐ偽常染色体部分（ＰＡＲ１）テロメア反復配列の１キロベース中の１個またはそれ以上の多形遺伝子座で選択的に開始させ、そして１種類または複数のプライマー伸長生成物の存在または不存在に関して対立遺伝子変異体を検出することを含む上記方法を提供する。一つの対立遺伝子特異的プライマーのプライマー伸長生成物は、ポリメラーゼ連鎖反応において種々の多形遺伝子座のための対立遺伝子特異的プライマーの鋳型として作用しうる。具体的に、本発明者は、Ｘｐ／Ｙｐ偽常染色体部分（ＰＡＲ１）テロメア反復配列の末端から決定される−１３位、−３０位、−１７６位、−４１４位、−４２７位、−６５２位、−８４２位から選択される１種類またはそれ以上の多形性の分析を開示する。更に具体的に、共通プライマーは、請求項１４に記載の−１３、−３０および−１７６多形性の一つに対する対立遺伝子特異的プライマーである。増幅生成物の寸法は、主として実際的要件によって支配される。慣用的なポリアクリルアミドゲル上では、最大約１キロベースまでの生成物が可能であり、好都合に、最大６００塩基までを充分に分割することができる。本発明者の請求の範囲に記載の方法の有意の利点は、試験されるゲノムＤＮＡ試料が、入念な前処理を全く必要としないことである。所望ならば、適当な前消化を用いてよい。したがって、ＤＮＡ試料は、ミトコンドリアＤＮＡを含めた全てのゲノムＤＮＡを含んでいてよい。「ゲノムＤＮＡ」によって、本発明者は、ヒト、ウシおよびウマ、特にヒトなどの任意の好都合な動物または植物種からのＤＮＡなどの核酸を意味する。既知のＤＮＡ類別法は、既に広範囲の種について行われている。本発明の方法のもう一つの態様において、示差的に標識された増幅生成物の２種類またはそれ以上のセットを同時に製造する。好都合な標識としては、ビオチン／アビジンなどの特異的結合物質、そして更に免疫原性の特異的結合物質がある。更に好都合な標識としては、発色団および／または発蛍光団、例えばフルオレセインおよび／またはローダミンがある。概して、適切なプライマーを標識するが、標識された増幅生成物を提供する他の方法を除外しない。本発明の適切な前述の態様のいずれにおいても、種々の型特異的および／または対立遺伝子特異的プライマーは、増幅生成物の分離を容易にする異なった尾部配列を含むことができる。本発明の方法の有意の利点は、それが、ゲノムＤＮＡ試料に対して個々に試料コードを与えることである。１種類または複数の増幅生成物セットを分離するのに用いられる手順に応じて、試料コードは既に、例えば、走査およびディジタルコード化に適当な機械読取可能な形でありうる。したがって、本発明のもう一つの態様により、本発明者は、本発明の前述の態様のいずれかによって作成された個々の試料コードを提供する。試料コードは、少なくとも２などのコーディング状態の任意の好都合な数、例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８または少なくとも９のコーディング状態に基くことができる。上記はいずれも、コーディング状態の独立した且つ好都合な数である。本発明者は、更に、上記のように作成された個々の試料コードの多重性を含むデータベースを提供する。上記データベースは、個体の識別および個々の関係の確定の場合のような、何等かの好都合な特性決定目的に対して決定され且つ用いられうる。本発明者は、更に、本発明の方法で用いるためのプライマーであって、の内の一つによって特異的に識別可能な遺伝子座に対してハイブリッド形成する上記プライマーを提供する。本発明者は、更に、本発明の方法で用いるためのプライマーであって、の内の一つによって特異的に識別可能な遺伝子座に対してハイブリッド形成する上記プライマーを提供する。本発明者は、更に、本発明の方法で用いるためのプライマーであって、の内の一つによって特異的に識別可能な遺伝子座に対してハイブリッド形成する上記プライマーを提供する。本発明者は、更に、本発明の方法で用いるための１種類またはそれ以上の型特異的プライマー、および／または対立遺伝子特異的および／または共通プライマーを含む試験キットを提供する。該試験キットは、上記で定義の少なくとも２種類の相補的な型特異的プライマーと、上記に定義の任意の共通プライマーおよび／または上記に定義の任意の尾部特異的プライマーとを一緒に含んでいてよく、該試験キットは、適当な緩衝液、包装および使用説明書を更に含む。試験キットは、好都合に、適当なヌクレオシド三リン酸および／またはそれらの重合剤を更に含む。試験キットに包含される更に別の任意の品目としては、既知のプロフィールの対照ＤＮＡ、テロメア反復配列に対する場合により標識されたプローブおよびプローブ検出システムがある。本発明は、更に、上記に定義の個々の試料コードを記録するプログラムが作成された場合の計算機に関する。本発明の更に独立した態様は、上記に定義の個々の試料コード間の類似性を探索するプログラムが作成された場合の計算機および上記に定義のデータベースを質問するプログラムが作成された場合の計算機に関する。本発明者は、更に、遺伝した若しくは後天性の疾患の個体からの試験試料での検出のための、または遺伝した若しくは後天性の疾患に対する素因の検出のための本発明の使用を開示する。特に、本発明の方法は、癌を含めた異常な細胞分裂および／または増殖の診断において用いることができる。「タンデム反復」という用語は、本明細書中において、ある与えられた集団において少なくとも一つの配列多形性を含む配列の少なくとも２個の反復を意味するのに用いられる。概して、本発明の方法で用いられるタンデム反復部分は、少なくとも５個、または少なくとも１０個、または少なくとも１５個のタンデム反復、例えば、少なくとも２０個または少なくとも３０個、４０個、５０個若しくは少なくとも１００個のタンデム反復を含む。「増幅生成物セット」という用語は、本明細書中において、タンデム反復部分中の特定の型の内部反復単位の相対位置を規定する複数の増幅生成物を意味するのに用いられる。増幅生成物の任意の好都合な数は、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個の増幅生成物のようなセットで含まれる。「反復単位の二つ以上の型」という用語は、本明細書中において、情報提供配列変異によって区別されうるタンデム反復部分中の内部反復単位の型を意味するのに用いられる。例として、反復単位中の特定の制限部位の存在または不存在は、反復単位の二つの型、すなわち、特定の制限部位を含む第一の型の反復単位および特定の制限部位を含まない第二の型を提供する。したがって、反復単位の第一および第二の型は、「特定の型の内部反復単位」である。内部反復単位間の更に別の情報提供配列変異は、反復単位の更に別の型を提供し、そしてタンデム配列反復部分の更に別のおよび独立した特性決定を可能にすることは理解されるであろう。「情報提供配列変異」という用語は、本明細書中において、分析される集団中の有用な程度の情報を提供する配列変異を示すのに用いられる。「ヌクレオシド三リン酸」という用語は、ＤＮＡかまたはＲＮＡ中に存在するヌクレオシドを意味するのに用いられ、したがって、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを塩基として包含するヌクレオシドを含み、糖残基はデオキシリボースまたはリボースである。概して、デオキシリボヌクレオシドは、ＤＮＡポリメラーゼと組合わせていられるであろう。しかしながら、慣用的な塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの内の一つと塩基対合することができる他の修飾塩基を用いることができることは理解されるであろう。このような修飾塩基としては、例えば、８−アザグアニンおよびヒポキサンチンがある。本明細書中で用いられる「ヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡかまたはＲＮＡ中に存在するヌクレオチドを意味することができ、したがって、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを塩基として包含するヌクレオチドを含み、糖残基はデオキシリボースまたはリボースである。しかしながら、慣用的な塩基、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの内の一つと塩基対合することができる他の修飾塩基を、本発明において用いられる診断用プライマーおよび増幅プライマー中で用いることができることは理解されるであろう。このような修飾塩基としては、例えば、８−アザグアニンおよびヒポキサンチンがある。更に、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等の意味は、糖−リン酸主鎖が、そのハイブリダイゼーション特性は破壊されていないという条件で修飾されているおよび／または置換されている類似の種を包含するということは理解されるであろう。例として、主鎖は同等の合成ペプチドによって置換されうる。「実質的に相補的」によって、本発明者は、プライマー配列がハイブリッド形成条件下においてそれらの規定された目的を果たすことができるならば、該プライマーが鋳型の正確な配列を反映する必要がないことを意味する。概して、誤対合した塩基はプライマー配列中に導入されて、変更されたハイブリダイゼーション緊縮を与える。一般的には、しかしながら、プライマーは、非相補的ヌクレオチドが本明細書中前記のように予め決定されたプライマー末端に存在しうる限りでなければ、正確な相補性を有する。本発明をここで、以下の具体的な説明、実施例、表および図面を論及することによって例証するが、制限するものではない。Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接したＤＮＡにおける多形性の識別。Ｘｐ：Ｙｐテロメアの出発点に近い４８０ｂｐについての一本鎖立体配座多形（ＳＳＣＰ）分析（オリタ（Orita）ら、1989年、P.N.A.S.,86,276-2770）は、高水準の変異を示す（データは示されていない）。この変異の性状を決定するために、テロメアに隣接するＤＮＡの８５０ｂｐにわたるＰＣＲ生成物（ＴＳＫ８Ｃ〜ＴＳＫ８ＧおよびＴＳＫ８Ｅ〜ＴＳＫ８Ｂ、図１ａ）の直接配列分析に着手し、そして配列情報を３２人のコーカサス人（白人）および２１人のアフリカ人ＤＮＡから得た。配列には、テロメア反復配列（変異体ＧＡＧＧＧ反復によって規定される）の出発点に隣接する最初の塩基（−１）から番号を付ける。多形の位置は、８５０ｂｐ塩基配列中に分布している（図１、表１）。アフリカ人ＤＮＡの中で見出されただけであった１０ｂｐ挿入／欠失多形性の他に、コーカサス人ＤＮＡでは１３種類の多形性が識別され、アフリカ人ＤＮＡでは１６種類識別された（表１）。塩基置換多形性の頻度は、Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接した８５０ｂｐにわたって、コーカサス人では１／６５ｂｐおよびアフリカ人では１／５０ｂｐである。更に、若干のまれな変異位置が検出されたが、配列決定されたＤＮＡ中で１度だけ生じており、これらはこの部分の分析には包含されなかった。多形位置の検定。多形性のいくつかは制限酵素部位を生成するかまたは破壊するが、最初に、これらの部位の四つ、−４１４、−４２７、−６５２、−８４２を、プライマーＴＳＫ８Ｃ＋ＴＳＫ８Ｇ（図１ａ）を用いるゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅に続いて適当な酵素（それぞれ、Ｍｂｏｌ１、Ｔａｑ１、Ａｖａｌ１、Ｄｄｅｌ）の一つによる消化によって更に別の分析用に選択した。これらの多形部位のそれぞれが、試験されたコーカサス人（ｎ＝８０）、アフリカ人（ｎ＝２８）集団においてハーディ・ワインベルグ平衡にあることが分った（データは示されなかった）。意外にも、４か所全部の多形位置でホモ接合の多数の個体は、試験された無関係のコーカサス人の中で識別され、そして他のものは４か所全部の位置でヘテロ接合であった。したがって、ハプロタイプ分析は、多形位置−８４２での二つの対立遺伝子（ニュートン（Newton）ら、1989年、N.A.R.17,2503-2516）の一つの特異的増幅のためのＡＲＭＳＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ増幅に続いてＲＦＬＰ分析によって行われて、−４１４位、−４２７位および−６５２位を検定した。コーカサス人における４か所の多形位置のハプロタイプ分析は、可能な１６種類のハプロタイプの三つ（Ａ、ＢおよびＣ）だけを示した。ハプロタイプＡ、ＢおよびＣの頻度は、コーカサス人においてそれぞれ０．５１、０．４４および０．０５であり、それらはハーディ・ワインベルグ平衡にある（表２）。ハプロタイプＢおよびＣは−４２７位でのみ異なり、したがって、４か所の多形部位間にはほぼ完全な連鎖不平衡が存在する。日本人、アフリカ人、アフリカ・カリブ人およびカリティアナ（Karitiana）集団からのＤＮＡのＲＦＬＰおよびハプロタイプ分析もまた、４か所の多形部位について行われた。同３種類のハプロタイプは、日本人、アフリカ人およびアフリカ・カリブ人集団で識別されたが、ハプロタイプ頻度は異なり、試験された集団全部がハーディ・ワインベルグ平衡にある（表２）。カリティアナは南アメリカからの同系繁殖族であり、分析された２２個体の中でハプロタイプＢだけが識別された。したがって、ハプロタイプＢはカリティアナ族に固定されていると考えられる。ＲＦＬＰ検定は、Ｄｄｅｌ制限部位の存在または不存在に基く多形位置−１７６に対して確立された。試験された７９人のコーカサス人ＤＮＡの中で、ハプロタイプ（Ａ、ＢおよびＣ）に対してヘテロ接合のＤＮＡは全て、−１７６多形性でもヘテロ接合であったし、そしてＡまたはＢハプロタイプに対してホモ接合のＤＮＡは、ＧかまたはＴそれぞれについて−１７６でホモ接合であった（表１）。 −３０位に対するＡＲＭＳＰＣＲ検定が開発され（材料および方法を参照されたい）、そして分析は、コーカサス人の中で、ＢまたはＣハプロタイプの染色体はこの位置にＡを有し、そしてハプロタイプＡの染色体の大部分はこの位置にＴを有し、一つのハプロタイプＡ染色体だけがＡ−３０を有することを示した（表１を参照されたい）。−１７６および-３０多形性の分析中に、前に検出されなかった多形性が識別されたが、それはＴＳＫ８Ｂプライマーによる増幅効率を減少させた。配列分析（材料および方法を参照されたい）は、これがＴＳＫ８Ｂプライマーの３′末端から３ｂｐの−１３位での多形性によることを示した。ＡＲＭＳ検定がこの位置のために開発されており（材料および方法を参照されたい）、そしてまた、検定された７９人のコーカサス人ＤＮＡの中で、ハプロタイプＡに対してホモ接合のＤＮＡは全てこの位置にＴを有し、ＢまたはＣハプロタイプに対するＤＮＡは全てＡを有し、そしてヘテロ接合体は全て−１３位でヘテロ接合（Ｔ／Ａ）であった。したがって、コーカサス人では、コーカサス人で検定された多形位置にわたってほぼ完全な連鎖不平衡が存在する。ハプロタイプ間の配列ダイバージェンスの決定。意外にも、ほぼ完全な連鎖不平衡が、コーカサス人ＤＮＡのＸｐ／Ｙｐテロメアに隣接した７か所の多形部位（−１３、−３０、−１７６、−４１４、−４２７、−６５２および−８４２）間で識別され、そして同様に、ほぼ完全な連鎖不平衡が、アフリカ人、日本人およびアフリカ・カリブ人の４か所の多形部位にわたって実証された（−１７６、−１３および３０は試験されなかった）。介在多形部位もまた強い連鎖不平衡にあったかどうかを確認するために、ハプロタイプＡに対してホモ接合の３人のコーカサス人ＤＮＡおよびＢに対してホモ接合の３人のＤＮＡを配列決定した（図２）。配列決定された個体は全て介在多形位置に対してホモ接合であって、したがって、これらの部位もまた、コーカサス人ハプロタイプ（ＡまたはＢ）について完全な連鎖不平衡にありうる。配列決定されたコーカサス人ＤＮＡからの８５０ｂｐ中で識別された１３種類の多形性は、ＡおよびＢハプロタイプ間に１．６％配列ダイバージェンスを示す。この集団において最も一般的なハプロタイプであるハプロタイプＡおよびＣに対してホモ接合のアフリカ人ＤＮＡもまた配列決定された。配列決定された６種類のＤＮＡ中で、介在多形位置の大部分は、２種類のＤＮＡを除いてホモ接合であった（以下および表１を参照されたい）。アフリカ人ＤＮＡでは、５７ｂｐごとの多形位置並びにアフリカ人ハプロタイプＡおよびＣ間の最大１．８％までの配列ダイバージェンスを示す配列決定された８２０ｂｐ中に、１４種類の塩基置換多形性（−１３位または−３０位を含まない）および一つの１０ｂｐ挿入／欠失が存在する。配列決定されたアフリカ人ＤＮＡの一つは、ハプロタイプＣに対してホモ接合であったが、二つの介在位置（−５４４および−５４０）ではヘテロ接合であり、そしてハプロタイプＡに対してホモ接合の別のアフリカ人ＤＮＡもまた、多形位置−５４４および−５４０でヘテロ接合であった。更に別の配列分析（表１に含まれていない）は、ハプロタイプＡに対してホモ接合の、そして −５４４位および−５４０位それぞれにＧおよびＴを有する以外は介在多形位置全部でホモ接合の別のアフリカ人ＤＮＡを識別した。−５４４位および−５４０位にわたるアフリカ人ＡおよびＣハプロタイプ間の見掛上のスイッチは、ミニサテライト反復単位の二つの間の対立遺伝子間変換または対立遺伝子内交換として生じうる。アフリカ人ＤＮＡの介在多形位置を配列決定した後に識別された更に別のハプロタイプは、この集団中の不均一性は増加したが、多形部位にわたってなお強い連鎖不平衡が存在することを示唆する。ハプロタイプＡに対してホモ接合の３人のコーカサス人および３人のアフリカ人のＤＮＡの配列比較（−４１４位、−４２７位、−６５２位および−８４２位に基く）は、介在多形位置で若干の有意差を示した（表１）。介在多形位置が包含される場合、Ａハプロタイプはアフリカ人およびコーカサス人集団間で一致しないが、１８部位の内８か所で異なる。更に、配列分析によって二つの他の多形性が検出された。すなわち、−８２６位の一つ（Ｃ−＞Ｔ）は、Ａハプロタイプのアフリカ人染色体の被験者においてのみ生じ、そして−２１７位のもう一つ（Ｇ−＞Ｃ）は、コーカサス人Ａハプロタイプ染色体の被験者でのみ生じる。これらの−８２６および−２１７での追加の変異体は、最近になって生じたことがあり、アフリカ人およびコーカサス人集団それぞれに限定されない。塩基置換多形性の高頻度の近位限界の定義。Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接したＤＮＡの２ｋｂｐを包含するクローンＴ７Ａ１／４からの配列情報（ブラウン（Brown）ら、Cell（ケンブリッジ、マサチューセッツ），63,119-132）を用いて、テロメアから２．０および１．５ｋｂｐのプライマーを設計した。１７人のコーカサス人および１１人のアフリカ人のＤＮＡのＴＳＫ８ＪからＴＳＫ８Ｋまで３２０ｂｐのＰＣＲ生成物の直接配列分析は、両方の集団に共通のもう一つ別の多形位置（−１８８８、ＧまたはＡ）およびアフリカ人ＤＮＡだけの別の多形位置（−１８９７、ＧまたはＡ）を示した。この部分での塩基置換多形性の頻度は、コーカサス人およびアフリカ人におけるテロメアに隣接した８５０ｂｐと比較して減少しているが、その差は有意でない（二端確率試験を用いて、コーカサス人についてｐ＝０．２２４およびアフリカ人についてｐ＝０．１７６）。−１８８８多形性は、ＮｌａｌＶ制限部位の存在または不存在によって検出されうるが、コーカサス人、日本人、アフリカ人およびアフリカ・カリブ人集団においてハーディ・ワインベルグ平衡にあることが分った（表３（ａ））。−１８８８多形性と、隣接するハプロタイプＡ、ＢおよびＣとの間のハプロタイプ分析は、コーカサス人において研究されたが（表３（ｂ））、隣接するハプロタイプと−１８８８対立遺伝子との間の強いが不完全な連鎖不平衡並びにアフリカ人およびアフリカ・カリブ人における隣接するハプロタイプの頻度（表２（ｂ））は、これらの集団において隣接するハプロタイプと−１８８８多形性との間にはるかに弱い連鎖不平衡が存在することを示唆する。ほぼ完全な連鎖不平衡と組合わされた塩基置換多形性の極めて高い頻度は、テロメアに隣接したＰＡＲ１の先端に限定されると考えられる。ＰＣＲによるテロメア変異反復地図作成（ＴＶＲ−ＰＣＲ）。本発明者は、Ｘｐ／Ｙｐテロメアの近位１ｋｂにおける変異反復体の分布を検定するシステムを開発した。簡単にいうと、その方法は、（ＴＴＡＧＧＧ）反復プライマー（ＴＥＬＨ）かまたは（ＴＧＡＧＧＧ）変異反復プライマー（ＴＥＬＧ）を有するテロメア反復配列に隣接したＤＮＡに対してアニーリングする放射性標識された隣接するプライマーを用いるゲノムＤＮＡの増幅を包含する。末端標識された増幅生成物を変性ポリアクリルアミドゲル上で分割し且オートラジオグラフィーによって検出する。６ｂｐ反復単位に基くバンドのラダーが生じ、（ＴＧＡＧＧＧ）および非増幅「ヌル」反復体を含む（ＴＴＡＧＧＧ）反復体の散在パターンを見ることができる（図３（ａ））。最初に、ゲノム中の独特の配列ＤＮＡに対してアニーリングするプライマーＴＳＫ８Ｅを用いて、Ｘｐ／Ｙｐテロメアへの増幅を行った。しかしながら、その増幅生成物は、約４００ｂｐのテロメアフランキングＤＮＡを包含し且つポリアクリルアミドゲル上での分割に適当な寸法ではなかった。したがって、プライマーＴＳ−３０Ａを用いて、Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接したＳＩＮＥ中の−３０多形位置から増幅を行う。隣接するハプロタイプ（ＡＢまたはＡＣ）に対してヘテロ接合の個体において、ＴＳ−３０Ａプライマーは、ＢまたはＣハプロタイプからテロメアへと特異的に増幅する。ＴＥＬＧ（ＴＧＡＧＧＧ）およびＴＥＬＨ（ＴＴＡＧＧＧ）反復プライマーは、４個の反復体から成り且つテロメアの高Ｇ鎖に対してアニーリングする。これらのプライマーの３′塩基は、６ｂｐ反復単位（ＴＴ／ＧＡＧＧＧ）の第二位に誤対合し、表４を参照されたい。最適化されたＰＣＲ条件下において、ＴＥＬＧおよびＴＥＬＨは、テロメア配列中の反復単位の第二位の塩基がプライマーに対して相補的である場合に増幅を開始するだけである。図４は、−３０の隣接する多形位置でヘテロ接合の無関係の個体からのテロメアの対立遺伝子特異的増幅を示す。それぞれのラダーの最初の反復単位は（ＧＡＧＧＧ）であり、そしてそれは、ＴＥＬＧプライマーによって非効率的に増幅される。標準６％および拡張５％ポリアクリルアミド勾配ゲル上で試料を分割することにより、１００反復単位を分割してテロメア反復配列にすることが可能である。ＴＶＲ−ＰＣＲ分析は、−３０の隣接する多形性に対するヘテロ接合体であるＣＥＰＨパネルの親からのＤＮＡについて行われた。これまでに地図が作成された４１種類のＸｐ：Ｙｐテロメアの内、５種類は、完全に、Ｘｐ／Ｙｐテロメアの近位末端においてテロメア（ＴＴＡＧＧＧ）反復型から成るので、それらは一致する。残りの３６種類のテロメアは全て異なるが、地図のサブセットは類似性を示し且つフランキングＤＮＡ中にハプロタイプＣを有して、共通の祖先が示唆される（データは示されていない）。カリティアナＤＮＡは、隣接するハプロタイプＢに対して全てホモ接合であり（表２）、したがって、これらの個体における−３０位からのＸｐ／ＹｐテロメアのＴＶＲ−ＰＣＲ分析は、テロメアコードへと容易に解読されることができない二倍体コードを生じる。しかしながら、生じたパターンの検討は、検討された１４種類の二倍体コードの内１０種類が異なったことを示し、したがって、この同系繁殖族のテロメア地図には更に変異があるはずである（データは示されていない）。現在、テロメア地図のメンデル分離は、少なくとも一方の親が−３０位でＡまたはＴに対してヘテロ接合である場合に家系内で観察されうる。対立遺伝子特異的プライマーＴＳ−３０Ａは、−３０位にＡを有するいずれも染色体からもテロメア地図を生じる。したがって、半数体テロメア地図は、この位置でＡまたはＴに対してホモ接合である個体からそれぞれ生じる。その結果、−３０位にＡを有する染色体からのテロメア地図の分離は、一方の親がヘテロ接合である場合に家系内で起こりうる（図５ａ）。これらの突然変異現象の起原（生殖系列、体細胞または細胞培養中）はまだ確認されていない。ＴＶＲ−ＰＣＲ技術の改良。若干のテロメア地図の近位末端にある大きい間隙（図４ａ）は、更に別の種々の反復型の存在を反映し、そしてクローン化テロメアの配列分析（ロイル（Royl e）ら、Proc.Roy.Soc.Lond.B.,247,57-61．1992年）から、本発明者は、（ＴＣＡＧＧＧ）および（ＴＴＧＧＧＧ）反復体が共通していることを知っている。ヌル反復型のタンデム配列がテロメア地図中に存在する場合、データベース分析のためにテロメア地図のコードを作成するのは難しいことがありうる。したがって、更に別のテロメアおよび種々の反復プライマー（表４）を合成した。プライマーＴＥＬＷ、ＴＥＬＸおよびＴＥＬＹはいずれも、４個の反復単位から成り；前のように、３′塩基は、ＴＥＬＷ、ＴＥＬＸおよびＴＥＬＹが（ＴＴＡＧＧＧ）、（ＴＧＡＧＧＧ）および（ＴＣＡＧＧＧ）反復型に対してそれぞれアニーリングするように６ｂｐ反復単位の第二位に誤対合し；余分な反復は第二反復体の第二位に導入されて；そして本発明者の研究が、わずかの（ＴＡＡＧＧＧ）反復型しかテロメア反復配列中に存在しないことを示唆しているように、二つの５′反復体の第二位はＴである。これらのプライマーを用いる予備実験は、「３態」ＴＶＲ地図を作成しうることを示す（図６）。ヌル反復体の頻度は減少し、そして同一反復体のブロックとしてよりもむしろテロメア反復配列中に単独で存在する反復単位の増幅は大いに改良される。結果として、ここで、テロメア地図をコードし且つデータベースを作成することが可能である。ＴＳ−３０Ｔプライマーを用いるハプロタイプＡ対立遺伝子からの対立遺伝子特異的増幅は効率的ではなく、したがって、プライマー設計に対する修飾が行われた。ＴＶＲプライマーＴＡＧ−ＴＥＬＷ、ＴＡＧ−ＴＥＬＸおよびＴＡＧ−ＴＥＬＹはいずれも、４個の反復単位から成り；その３′塩基は、ＴＡＧ−ＴＥＬＷ、ＴＡＧ−ＴＥＬＸおよびＴＡＧ−ＴＥＬＹがＴＴＡＧＧＧ、ＴＧＡＧＧＧおよびＴＣＡＧＧＧ反復型に対してそれぞれアニーリングするように６ｂｐ反復単位の第二位に誤対合する。末端前反復中の対応する位置は、種々の反復型から同等の増幅を促すように多義的（ambiguous）にされた。本発明者の研究は、わずかのＴＡＡＧＧＧ反復型しかヒトテロメア反復配列中に存在しないことを示した。したがって、ＴＡＧ−ＴＥＬプライマーの５′末端でのＴＡＡＧＧＧに相補的な二つの反復体の存在は、該プライマーがＴＴＡＧＧＧ、ＴＧＡＧＧＧまたはＴＣＡＧＧＧ反復体に対して低下した効率によってアニーリングすることを可能にする。更に、２０ヌクレオチド非相補的尾部をそれぞれのＴＶＲプライマーの５ ′に加えたが、ＴＶＲ−ＰＣＲ反応は、増幅を駆動させる尾部−プライマーの添加を包含しないし且つタンデム反復生成物がこわれるのを妨げない。しかしながら、非相補的尾部の存在は、テロメア反復配列中のそれぞれの反復単位からの生成物の同等の増幅を促進することが見出され、そして均一な反復型のブロックの末端での更に別のバンドの発生を減少させた。図４ｂは、−３０の隣接する多形位置でヘテロ接合の無関係の個体からのテロメアの対立遺伝子特異的増幅を示す。ＴＶＲ−ＰＣＲ生成物は、それぞれの反復位置に対して３トラック（Ｔ、ＧまたはＣ）の内の一つで現れたバンドの６ｂｐラダーとして分割される。若干の反復体は、おそらくは更に別のテロメア反復配列変異の存在のために増幅することができないが；このような未知の反復体をＮ型反復体と称した。約１２０反復単位を変性ポリアクリルアミドゲル上で分割することができ、バンドのパターンは、データベース分析のためのＴ−、Ｇ−、Ｃ −およびＮ型反復体のテロメアコードに容易に変換することができる（図３および４を参照されたい）。Ｘｐ／Ｙｐテロメアのメンデル遺伝。Ｘｐ／Ｙｐテロメア地図のメンデル遺伝は家系内で実証されており、ＣＥＰＨ家系１４２３における父性テロメア地図の分離を図５で示す。この家系において、祖父（１４２３−１１）は−３０位でヘテロ接合（Ａ／Ｔ）であり、そしてテロメア地図（Ａ′と表示された）は、対立遺伝子特異的プライマーＴＳ−３０Ａを用いる増幅によって作成された。祖父（１４２３−１２）は−３０位でホモ接合（Ａ／Ａ）であり且つ二つのテロメア地図から二倍体パターンを生じ、おそらくは、多数のＮ型反復体がこのテロメアの近位末端に存在したために、ＡおよびＡ″テロメアは二倍体地図に対して数本のバンドしか与えなかった。父親（１４２３−０１）もまた、−３０位でホモ接合であり、それは父性Ａ′および母性Ａテロメア地図を受継いでおり、その母親で見られたのとは異なる二倍体パターンを生じた。その息子（１４２３−０３）で増幅された半数体テロメア地図は、祖父の場合のＡ′テロメア地図と一致したが、娘の半数体テロメア地図（Ａ）は、その父親および祖母の二倍体テロメアパターンの一部分と見ることができる。テロメア地図は、したがって、この家系においても他のＣＥＰＨの６家系（データは示されていない）においても、メンデル遺伝標識として分離する。ＰＡＲ１テロメアの近位末端での極端な可変性は、比較的高い de novo 突然変異率によって維持されるべきであるが、これまでに検討された７家系中では突然変異対立遺伝子が識別されなかった。テロメア可変性。テロメア地図は、−３０の隣接する多形性に対してヘテロ接合のＣＥＰＨ家系ＤＮＡの親からの６５種類の対立遺伝子について決定された(図6c)。隣接するハプロタイプＡと関連するテロメア地図の一つおよびハプロタイプＢと関連する９種類は、ほぼ完全にＴＴＡＧＧＧ反復体から成った。ハプロタイプＢ対立遺伝子の５種類は区別できなかったが、他のテロメアは全て異なっていて、地図が作成された６１種類のテロメアにおいて６５種類の異なった対立遺伝子構造が得られた。ハプロタイプＡ対立遺伝子は全て、少なくとも二つのＮ型反復体によって開始し、したがって、未知の配列の１２bpを包含した。隣接するハプロタイプＢおよびＣと関連のテロメアは全て、ハプロタイプＢテロメア１３２９１０２を除いて、Ｇ型反復体によって開始したが、それらは、Ａハプロタイプテロメアの大部分と同様に、二つのＮ型反復体によって開始した。テロメア中の種々の反復体は、クラスターを形成する強い性質を示し、例えば、ハプロタイプＡ対立遺伝子におけるＧ−およびＮ型反復体並びにハプロタイプＢ対立遺伝子におけるＣ型反復体の連続を生じた。いくつかの場合、高次反復構造の証拠、例えば、いくつかのハプロタイプＣ対立遺伝子においてＴＧＧ三反復モチーフの連続が存在した（４５０１で見られるように）。更に別のＴＶＲ−プライマーを用いるＴＶＲ−ＰＣＲは、ハプロタイプＡ対立遺伝子における多数のＮ型反復体がＴＴＧＧＧＧであったことを示した（データは示されていない）。時々、バンドのラダーの６bp周期性の変化が、例えば、ハプロタイプＡ１２０１および関連したテロメアで検出されており（図６）、配列分析は、他のＮ型反復体中に更に別のまだ特性決定されない変異が存在することを示した。明らかに、Ｘｐ／Ｙｐテロメアの近位末端での潜在的配列変異は、現在、ＴＶＲ−ＰＣＲによって検出されるよりも大きい。大部分の地図作成されたテロメアは様々であるが、それにもかかわらず、対立遺伝子サブセットが識別されており、それらは内部構造に関係していた（図６）。これらの同様の対立遺伝子サブセットは、通常、共通の隣接するハプロタイプに関与し、それらが極めて最近の共通祖先対立遺伝子から分岐したことが示唆される。最も明確に配列した対立遺伝子、例えば、ハプロタイプＣ対立遺伝子１４２３０２および１４２３０８の比較は、テロメア多様性をもたらす大部分の突然変異現象が、１個または数個の反復単位の局在性増加または損失に関与して、均一な反復型のブロックを生成することを示唆する。真実ならば、突然変異のこのパターンは、１個または数個の反復単位に関与する局所複製ずれ（slippage））現象によって支持されると考えられる。考察。ヒトゲノムの非コーディング領域における塩基置換多形性の頻度は、２３５塩基中約１個であるが（ニッカーソン（Nickerson）ら、1992年）、ＨＬＡ−ＤＱＡ遺伝子座（ギレンステン（Gyllensten）およびエーリッヒ（Erlich）、1988年）などの数か所の領域では、多形部位の頻度ははるかに高い。Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接した８５０ｂｐにおいて、本発明者は、平均頻度より高い塩基置換多形性を識別した（コーカサス人において６５ｂｐ中１個；アフリカ人において５０ｂｐ中１個）。しかしながら、８５０ｂｐ中では多形部位にわたってほぼ完全な連鎖不平衡が存在し、したがって、集団中では少数のハプロタイプしか存在しない。ヒトゲノムの非コーディング領域における二対立遺伝子多形性の他のクラスターの分析は、多数のハプロタイプを示したが、ＤＮＡ配列の短い伸長部分にわたって部分連鎖不平衡が識別された（ニッカーソンら、1992年）。同様に、ミニサテライトに隣接した多形性の若干のクラスターは、部分連鎖不平衡を示した（モンクトン（Monckton）ら、1993年）。部分連鎖不平衡は、偽常染色体ミニサテライト（ＤＸＹＳ１７）での対立遺伝子とＹ染色体との間で識別されたが（デコルテ（Decorte）ら、1994年）、雄性生殖系列中の偽常染色体部分にわたる組換えの勾配は、この関係を説明することができる。強い連鎖不平衡は、神経線維腫症１部分の３４０ｋｂｐにわたる７種類の遺伝子内多形性（ジョルデ）（Jorde）ら、1993年）にわたって、およびＹ染色体特異的配列と常染色体部分になる数百塩基の多形性（エリス（Ellis）ら、1990年）との間に識別された。概して、連鎖不平衡は、混合操作、遺伝的浮動、選択または組換えの抑制によって生じうることが認められるが、これらの作用のどれが、Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接した強い連鎖不平衡の成立に影響したかは明らかでない。進化の際の高等霊長類染色体の末端に高い配列転換が存在しており（ロイルら、1994年）、本発明者の予備研究は、チンパンジーおよびゴリラにおけるＸｐ／Ｙｐの末端の配列体制およびテロメアの位置が、ヒトと比較して異なることを示唆している。ヒトＸｐ／Ｙｐテロメアに隣接した配列は多数の塩基置換を蓄積しており、そのためハプロタイプが１．８％程度まで異なっており；これはその配列が古いことを示唆するが、それは、この部分にわたるほぼ完全な連鎖不平衡の存在を説明しない。一つの可能な説明は、ヒト祖先が、ミニサテライトおよびゲノム中のどこか他のＳＩＮＥを含む配列の分岐した重複を含んでいたことである。二つの遺伝子座間の変換および重複した遺伝子座の損失は、Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接した高度に分岐したハプロタイプを導入しうるし、そして引き続き、突然変異が、（−２１７位および−８２６位のものなどの）無関係のハプロタイプ系統を蓄積すると考えられる。しかしながら、隣接するハプロタイプに対してホモ接合のある限られた数のアフリカ人およびコーカサス人ＤＮＡからの本発明者の配列データは、それら二つの集団においてハプロタイプが異なることを示し、したがって、それらは速やかに分岐しうる。Ｘｐ／Ｙｐテロメア反復配列の出発点に対して多形部位のいくつかが極めて近いことは、ＰＣＲによるテロメア変異反復地図作成（ＴＶＲ−ＰＣＲ）の開発を促した。その技術は、ミニサテライト対立遺伝子地図を作成するのに開発された方法（ＭＶＲ−ＰＣＲ）（ジェフリーズら；1993年）と類似しているが、テロメアおよび変異反復プライマーは、非相補的尾部によって「標識」されていない。驚くべきことに、対立遺伝子特異的増幅は、反復プライマーが４６種類のテロメア全部でアニーリングすることができ且つ対立遺伝子特異的増幅に用いられる多形部位がＳＩＮＥ中にある場合、ＴＶＲ−ＰＣＲによって達成されうる。ＳＩＮＥのこの系列はゲノム中に推定２０，０００コピーを有するが（ラ・マンチャら；1989年）、コピー間の配列ダイバージェンスは、ゲノム中のＴＳ−３０Ａプライマーに可能なアニーリング部位の数を減少させることができる。更に、何等かの他のテロメアに近いＳＩＮＥのこの系列の他のコピーの起こりうる不存在は、Ｘｐ／Ｙｐテロメアから観察された特異的増幅を説明すると考えられる。ＴＶＲ−ＰＣＲは、テロメアにおける対立遺伝子多様性を探求するための新規な系である。コーカサス人のＸｐ／Ｙｐテロメアの近位末端で示された極端な対立遺伝子変異は、高い潜在性突然変異率を示唆するが、de novo 突然変異を、なお確認すべきである。近縁の対立遺伝子の比較は、テロメア反復配列の近位末端が、おそらくは、ずれと、新規な変異反復体を配列中に導入する不定期の塩基置換とによって進化するらしいことを示唆する。関連したテロメア地図および隣接するハプロタイプ間の強い関係もまた、ずれなどの対立遺伝子内過程と一致して、テロメアが半数体系統に沿って大きく進化していることを示唆する。地図が作成されたテロメアの大部分は、少なくとも生殖系列において、テロメアの末端上に（ＴＴＡＧＧＧ）反復体を付加する酵素テロメラーゼの活性によってテロメアの近位末端が混乱しないことを示した。しかしながら、種々の対立遺伝子間で交換が起こった証拠がいくつか存在する。例えば、隣接するハプロタイプＣと結合したテロメア地図１３４１１４は、これまでに地図が作成された他のハプロタイプＣ対立遺伝子に対するよりも、隣接するハプロタイプＢと結合したテロメア地図のサブセット（例えば、３５０２）と類似し；そしてハプロタイプＢと結合したテロメア地図１３４９０１は、他のハプロタイプＢ結合テロメアと類似しているが、１１回反復後のその地図は、隣接するハプロタイプＣとの結合において見出された４５０１のようなテロメア地図と更に似るようになる。このような交換が対立遺伝子内組換えによって生じるのか、またはミニサテライトで多様性を生じることが知られている変換様過程によって生じるのかは分らない。このような交換の根拠がなんであれ、このような交換が、存在する強い連鎖不平衡を破壊すると考えられるので、それらは、しばしば、テロメア隣接ＤＮＡ中の組換えに関与することができない。ＴＶＲ−ＰＣＲは、法的ＤＮＡ分析において有用でありうる、特に、短反復単位の散在パターンをなお決定しうる分解ＤＮＡに関するＤＮＡ類別システムである。ＴＶＲ−ＰＣＲは、蛍光標識された隣接するプライマーを用い且つ自動配列決定装置で類別する自動操作に適当でありうる。その技法はまた、例えば、老化細胞系におけるテロメアの体細胞転換の研究に応用されうるし、そしてそれは、主として、他のヒトテロメア、およびテロメアがＴＴＡＧＧＧまたは類似の反復体から成る他の種に対して開発されうると考えられる。実施例材料および方法：ゲノムＤＮＡＣＥＰＨ（Centre d′Etude du Polymorphisme Humain）家系ＤＮＡの親を構成する８０人の無関係の個体からのコーカサス人ＤＮＡリンパ芽球様ＤＮＡ。アフリカ人およびアフリカ・カリブ人ＤＮＡは、英国で集められた全血試料から抽出された。全血からの日本人ＤＮＡ試料は、Ｋ．タマキ（Tamaki）から寄贈され（ジェフリーズら、1991年）、そしてカリティアナＤＮＡ試料はＫ．キッド（Kidd）およびＦ．ブラック（Black）から寄贈された。プライマーこの論文で記載されたプライマーは、クルアケム（Cruachem）からの試薬を用いてアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）３８０ＢＤＮＡシンセサイザーで合成された。それぞれのプライマーの配列を、表４（ａ）および（ｂ）で示す。ＰＣＲ反応ＰＣＲ反応は全て、特に断らない限り、４５ｍＭトリス−ＨＣｌ（２２℃でｐＨ８．８）中１μＭの各プライマー、１１ｍＭ硫酸アンモニウム、４．５ｍＭＭｇＣｌ₂、６．７ｍＭ２−メルカプトエタノール、４．４μＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、ＢＳＡ１１３μｇ／ｍｌ、１ｍＭの各ｄＮＴＰおよびＴａｑポリメラーゼ（アドバンスド・バイオテクノロジー（Advanced Biotech nology））を含み（ジェフリーズら、1991年）、そしてパーキン・エルマー（Pe rkin Elmer）９６００熱循環器中で循環した。配列決定ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）を、２０μｌ容量中でプライマーＴＳＫ８ＧおよびＴＳＫ８ＣまたはＴＳＫ８ＥおよびＴＳＫ８ＢまたはＴＳＫ８ＪおよびＴＳＫ８Ｋによって増幅させ、そして反応を９６℃４０秒間、６５℃５０秒間、７０℃１分間で３２回循環させた。生成物を、電気泳動に続いて透析膜に対する電気溶出によって精製し、そして二本鎖配列決定をウィンシッブ（Winship）（ウィンシップ、1989年）の方法にしたがって行った。この方法により、全部で８０３塩基を配列決定した。隣接する−１３多形位置の識別ＴＳＫ８ＥおよびＴＥＬＧを用いるゲノムＤＮＡの増幅によるＰＣＲ生成物（約５００ｂｐ）を、上記のようにゲル精製し且つＴＳＫ８Ａプライマーを用いて配列決定した。ＢまたはＣハプロタイプの配列決定の前に、隣接するハプロタイプＡ／Ｂに対してヘテロ接合のＤＮＡからの対立遺伝子特異的増幅を、ＴＳＫ８Ｂ〜ＴＳＫ８Ｃを用いるゲノムＤＮＡの増幅により、９６℃２０秒間、７０℃２分２０秒間を３３回で達成された。対立遺伝子特異的増幅は、増幅生成物の一部分をＤｄｅｌによって消化することにより確証され；残りの生成物は、プライマーＴＳＫ８Ｂ、ＴＳＫ８Ｅ、ＴＳＫ８ＧまたはＴＳＫ８Ｃによって配列決定された。多形位置−４１４、−４２７、−６５２および−８４２のＲＦＬＰ分析ゲノムＤＮＡを、２０μｌ中においてプライマーＴＳＫ８ＧおよびＴＳＫ８Ｃによって増幅させた。５０回のＰＣＲ反応は、製造者の指示（Gibco-BRL）による１６μ ｌ反応中においておよび１ｍＭ三塩化スペルミジンの存在下において多形位置（表１を参照されたい）に適当な制限酵素によって完了するまで消化した。生成物を、２．２％メタフォア（Metaphor）（ＦＭＣ）アガロースゲル上で分割した。 −１７６位のＲＦＬＰ分析は、ＴＳＫ８ｅ（１μＭ）、ＴＳＫ８Ｂ（０．５μＭ）およびＴＳ−１３ＡＲ（０．５μＭ）の存在下におけるゲノムＤＮＡの増幅によって達成された。生成物をＤｄｅｌによって完了するまで消化し、そして生成物を４．５％メタフォアアガロースゲル上で分割した。−１８８８での多形性を、ＮｌａＩＶによる（ＴＳＫ８Ｊ＋ＴＳＫ８Ｋ）ＰＣＲ生成物の消化によって検定した。ハプロタイプ分析多形位置−８４２から：ＴＳＫ８Ｅおよび対立遺伝子特異的プライマーＴＳ−８４２Ｃを用いる１５μｌＰＣＲ増幅４μｌを、多形位置（ −４１４、−４２７および−６５２）に適当な酵素によって完了するまで消化し且つ上記のように分割した。−１７６位のＲＦＬＰ分析ＴＳＫ８ＥおよびＴＳＫ８Ｂによって増幅されたゲノムＤＮＡからのＰＣＲ生成物を、（上記のように）Ｄｄｅｌによって完了するまで消化した。後のＰＣＲ増幅は、プライマーＴＳＫ８ｅ（１μＭ）、ＴＳＫ８Ｂ（０．５μＭ）およびＴＳ−１３ＡＲ（０．５μＭ）の存在下で行って、これらの反応においてＡハプロタイプ対立遺伝子の表示されていない部分を補った。−１８８８位のＲＦＬＰ分析 −１８８８位は、ＴＳＫ８ＪおよびＴＳＫ８Ｋによって増幅されたＰＣＲ生成物を（上記のように）ＮｌａｌＶによって完了するまで消化することにより検定された。−１３および−３０多形性のＡＲＭＳ検定 −１３多形性は、ＴＳＫ８Ｂプライマーによる非効率的増幅のために、−１７６および−３０多形性の分析中に識別された。−１３多形性は、ＴＳＫ８Ｅと一緒に対立遺伝子特異的プライマーＴＳ１３ＡＲを用いて検定された。ＴＳ１３ＡＲの存在下でのＰＣＲ反応は、９６℃ ５０秒間、６６℃４０秒間、７２℃１分間で３２回循環した。生成物を１．５％ＨＧＴ（ＦＭＣ）アガロースゲル中で分割した。−３０多形性は、０．５μＭのＴＳＫ８ＢおよびＴＳ１３ＡＲプライマー両方と組合わせた１μＭの対立遺伝子特異的プライマーＴＳ−３０ＡまたはＴＳ−３０ＴＳの存在下のゲノムＤＮＡのＰＣＲ（１０μｌ）によって検定された。ＴＳ−３０Ａの存在下の反応を、９６ ℃１５秒間、６２．５℃４０秒間、７０℃３０秒間で３２回循環させた。生成物を４．５％メタフォア（ＦＭＣ）アガロースゲル上で分割した。二態テロメア変異反復地図作成対立遺伝子特異的プライマーＴＳ−１３Ａを、０．５μＭプライマー、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２単位、３７０ｋＢｑ（ｇ−³²Ｐ）ＡＴＰ（アマーシャム・インターナショナル（Amersham International））を含有する１０μｌ反応中において３７℃で２時間５′末端標識した。標識されたプライマー２μｌおよび０．１μＭのＴｅｌＨかまたはＴｅｌＧテロメア反復プライマーを含有する二つの１０μｌＰＣＲ反応を、９６℃２０秒間、６７℃４０秒間、７０℃２分間で１９回循環させた。生成物（６．５μｌ）を標準６％０．５〜２．５ｘＴＢＥ７．６７Ｍ尿素ポリアクリルアミドゲル（Sequi-gen，バイオラド（Biorad））および５％１ｘＴＢＥ７．６７Ｍ尿素ポリアクリルアミド拡張ゲル上の電気泳動によって分割し且つオートラジオグラフィーによって検出した。三態テロメア変異反復地図作成隣接するプライマーＴＳ−３０Ａを上記のように標識した。ゲノムＤＮＡ（１μｇ）を、製造者指示にしたがってＡｌｕ１およびＤｄｅ１によって１０μｌ反応中において３７℃で２時間消化した。これらの酵素はどちらも、ＴＳ−３０ＡプライマーおよびＸｐ／Ｙｐテロメア反復配列間を切断せず、したがって、この工程は、ＴＳ−３０Ａプライマーによってミスプライミングされた生成物の低水準「バックグラウンド」を排除した。消化されたＤＮＡ（１００ｎｇ）は、標識された隣接するプライマーおよびプライマーＴｅｌＷかまたはＴｅｌＸ若しくはＴｅｌＹを用いるＰＣＲ反応（二態地図作成用と同様）で用いられた。ＴｅｌＷによる反応を、９６℃２０秒間、６７℃４０秒間、７０℃２分間で２０回循環させ；ＴｅｌＸおよびＴｅｌＹによる反応を、９６ ℃２０秒間、６８℃４０秒間および７０℃２分間で１９０回循環させた。生成物を二態地図作成用と同様に分割し且つ検出した。更に、対立遺伝子規格プライマーＴＳ−３０ＡまたはＴＳ−３０Ｔを、０．５ μＭプライマー、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２単位、３７０ｋＢｑ（ｇ³²Ｐ）ＡＴＰ（アマーシャム・インターナショナル）を含有する１０μｌ反応中において３７℃で一晩中５′末端標識した。テロメア地図作成用に選択されたゲノムＤＮＡ（１μ ｇ）を、Ａｌｕ１およびＤｄｅ１によって１０μｌ反応中において３７℃で２時間消化した。これらの酵素は、ＴＳ−３０Ａ／Ｔプライミング部位およびＸｐ／Ｙｐテロメア反復配列間を切断せず、ＴＳ−３０ＡまたはＴＳ−３０Ｔによるミスプライミングからの生成物の低水準「バックグラウンド」を排除するのに用いられた。消化されたＤＮＡ（１００ｎｇ）は、標識されたプライマー２μｌおよび０．４μＭのＴＡＧ−ＴＥＬＷまたはＴＡＧ−ＴＥＬＸまたはＴＡＧ−ＴＥＬＹテロメア反復プライマーを含有する三つのＰＣＲ（１０μｌ）それぞれで用いられた。ＴＡＧ−ＴＥＬＷおよびＴＡＧ−ＴＥＬＹの存在下の反応を、９６℃２０秒間、６８℃４０秒間および７０℃２分間で１９回循環させ、そしてＴＡＧ− ＴＥＬＸの存在下の反応を、９６℃２０秒間、６７．５℃４０秒間、７０℃２分間で１９回循環させた。生成物（６．５μｌ）を７．６７Ｍ尿素を含有する６％変性ポリアクリルアミド０．５〜２．５ｘＴＢＥ緩衝液勾配ゲル中の電気泳動によって分割した。１０ｘＴＢＥは、ｐＨ８．３の０．９Ｍトリス−ホウ酸中０．０２ＭＥＤＴＡを含み、１ｘＴＢＥおよび７．６７Ｍ尿素を含有する５％ポリアクリルアミド拡張ゲルを用いてより長い生成物を分割した。生成物はオートラジオグラフィーによって検出された。表１Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接したＤＮＡにおける多形性。多形性位置にはテロメア（表の右側）から番号を付し、そして広範囲に分析された多形部位の検定を以下に示す。表の上２行は、コーカサス人およびアフリカ人ＤＮＡにおける多形位置（５’＞３’＞テロメア）にある塩基を示す。表の下の最初の欄は、−４１４位、−４２７位、−６５２位および−８４２位の分析によって決定されたハプロタイプを示す。全ての多形性にわたる完全なハプロタイプは、ハプロタイプＡに対してホモ接合の３種類のＤＮＡ；およびＣＥＰＨパネルからのハプロタイプＢに対する３種類；隣接するハプロタイプＡに対してホモ接合の３種類のアフリカ人ＤＮＡおよび隣接するハプロタイプＣに対する３種類の配列分析から得られた。ハプロタイプは集団中で極めて強い連鎖不平衡にあると考えられるが、コーカサス人およびアフリカ人集団のＡハプロタイプ間には多数の相違がある。表２（ａ）Ｘｐ：Ｙｐ偽常染色体テロメア結合部分で多形性−４１４、−４２７、−６５２および−８４２から形成されたハプロタイプ。脚注：４つの多形位置の検定に基くハプロタイプは、試験された集団においてハーディ・ワインベルグ平衡にある（データは示されていない）。表２（ｂ）Ｘｐ／Ｙｐ偽常染色体テロメア結合部分および−１８８８ＮｌａｌＶ多形性におけるハプロタイプの頻度。ハプロタイプＡ、ＢおよびＣは、４つの多形位置（−８４２、−６５２、−４２７および−４１５）の分析によって決定された。３種類のハプロタイプおよび− １８８８多形性の頻度はそれぞれの集団について示されており；それぞれの多形性は、試験された集団においてハーディ・ワインベルグ平衡にあり（データは示されていない）；ｎはそれぞれの集団について試験された個体数である。表３（ａ）脚注：−１８８８多形性は、試験された集団全てにおいてハーディ・ワインベルグ平衡にあり、そして予備データは、それが、試験された集団においてテロメアに隣接したハプロタイプ全部について完全な連鎖不平衡にないことを示唆する。表３（ｂ）コーカサス人におけるＸｐ／Ｙｐテロメアおよび−１８８８多形位置の隣接するハプロタイプ間の連鎖不平衡全ての対立遺伝子組合わせについての不平衡係数Ｄを示す。Ｄｕｖ＝Ｐｕｖ− Ｐｕｑｖ、ここにおいて、ＰｕｖはハプロタイプＡｕＢｖの頻度であり；Ｐｖは、最初の遺伝子座での対立遺伝子Ａｖの頻度であり、そしてｑｖは、第二の遺伝子座での対立遺伝子Ｂｖの頻度である。Ｄは−０．２５〜＋０．２５でありうる。Ｄ値は、カイ二乗統計を用いるランダム関連からの有意偏差について試験された。^* ｐ，０．０５，^***ｐ＜０.００１。ゼロからのＤ値の有意偏差についての全部の試験において全体ｇ²＝３７．２４で且つ二つの自由度ｐ＜０．０１。連鎖不平衡係数はまた、遺伝子頻度の標準化後にｒ値に変換されており、ｒは−１〜＋１でありうる。表４（ａ）および（ｂ）プライマー配列。制限部位（下線）を含有するプライマーＴＳＫ８Ｃ、ＴＳＫ８ＥおよびＴＳＫ８Ｇの非相補的５′尾部（太字）を示す。テロメア地図作成用プライマーＴｅｌＨ、ＴｅｌＧ、ＴｅｌＷ、ＴｅｌＹの反復単位は、配列の下に角括弧でくくられている。図１（ａ）Ｘｐ／Ｙｐ偽常染色体部分のテロメア結合。非相補的５′尾部を含むプライマー）。Ｂ．テロメア（ＧＡＧＧＧ）の最初の反復に隣接した最初の塩基（−１）から番号を付した、Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接したＤＮＡの配列。ミニサテライトの配列は大文字として、そしてＳＩＮＥはイタリック体で示されている。多形位置は、配列（−１３〜−８４２）の上に番号が付され、多形部位の塩基（太字）が示されている。ＲＦＬＰを生成する部位の制限酵素を示し、そして若干のアフリカ人ＤＮＡで欠失した１０ｂｐに下線を施している。ＰＣＲプライマーの位置を配列の上（一致）または下（相補的）に示し、プライマーの末端の＊は、非相補的５′プライマー尾部を示す（表４を参照されたい）。図１（ｂ）Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接したＤＮＡのためのプライマー配列。図２コーカサス人ＤＮＡ中で見出された配列多形性。隣接するハプロタイプＡに対してホモ接合の３種類のＣＥＰＨ親ＤＮＡ（０２０１、１７０１および２３０１）および隣接するハプロタイプＢに対してホモ接合の３種類のＣＥＰＨ親ＤＮＡ（２１０１、２１０２および２８０１）のプライマーＴＳＫ８Ｂからの配列を示す。−１４６位および−１７６位において、ハプロタイプＡに対してホモ接合のＤＮＡは塩基Ｃを有し、そしてＣおよびハプロタイプＢに対してホモ接合のＤＮは、それぞれ塩基ＴおよびＡを有する。この図で更に示された−１４５位および −１４７位は、コーカサス人では多形ではない（表１を参照されたい）。全試料のＡ−、Ｃ−、Ｇ−およびＴ−トラックは、多形性の識別を促すために互いに隣接して実験された。図３（ａ）テロメア地図の作成を示す図。対立遺伝子特異的増幅は、隣接するハプロタイプ（ＡＢまたはＡＣ）に対してヘテロ接合の個体において、ハプロタイプＢまたはＣの対立遺伝子の増幅のための放射性標識されたプライマーＴＳ−３０Ａを用いアクリルアミドゲル上で、６ｂｐ反復長さに基くバンドのラダーに分割される。二つのトラックは、Ｔ（ＴＴＡＧＧＧ）およびＧ（ＴＧＡＧＧＧ）、Ｎ（ヌル）図３（ｂ）テロメア地図作成の主要物。対立遺伝子特異的増幅は、隣接するハプロタイプ（ＡＢまたはＡＣ）に対してヘテロ接合の個体において、ハプロタイプＡまたはハプロタイプＢおよびＣ対立遺伝子それぞれの増幅のための放射性標識されたプライマーＴＳ−３０ＴまたはＴＳ−３０Ａを用いて−３０多形位置から達成され反応で達成される。生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル上で、６ｂｐ反復単位長さに基くバンドのラダーに分割される。三つのトラックは、Ｔ，ＴＴＡＧＧＧ、Ｇ，ＴＧＡＧＧＧ、Ｃ，ＴＣＡＧＧＧおよびＮ，未知の反復型のテロメアコ図４（ａ）無関係の個体からの９種類の対立遺伝子からのテロメア反復地図を示すオートラジオグラム。１対の隣接したＴおよびＧトラックは半数体テロメア地図を表し、６ｂｐ間隔でバンドが一つのトラック中に存在するかまたはどこにも存在しない。Ｔ（ＴＴＡＧＧＧ）、Ｇ（ＴＧＡＧＧＧ）およびヌル（バンドは存在しない）反復体の分布は、オートラジオグラムから読取ることができる。Ｘｐ／Ｙｐテロメア（ＧＡＧＧＧＧ）の最初の反復はＧ型として読取られ、そして標準および拡張ゲルからの情報を組合わせることにより、約１００反復単位が分割されうる。矢印は標準（左側）および拡張（右側）ゲル間の重複を示し、目盛りはテロメア反復体の数を示す。図４（ｂ）ＴＶＲ−ＰＣＲによるテロメア反復地図の実施例。Ｔ、Ｇ、Ｃの３トラックの各組は、示された７人の無関係のＣＥＰＨ個体からの単一テロメア地図である。テロメアはＴＳ−３０Ａプライマーを用いて増幅されており、したがって、隣接するハプロタイプＢまたはＣと結合している。バンドは、ほぼ６ｂｐ間隔で一つのトラック中に存在するかまたは全く存在しない。Ｔ，ＴＴＡＧＧＧ、Ｇ，ＴＧＡＧＧＧ、Ｃ，ＴＣＣＡＧＧＧおよびＮ（未知）反復体の分布は、オートラジオグラムから読取ることができる。示されたテロメアの最初の反復は、ＴＡＧ−ＴＥＬＸによって増幅されて、Ｇトラック中の９９ｂｐの生成物を与える。目盛りはテロメア反復体の数を示す。図５（ａ）ＣＥＰＨ家系１４２３中のテロメア地図の分離。祖父母（ＦＦ＝１１、ＦＭ＝１２、ＭＦ＝１３、ＭＭ＝１４）はいずれも−３０位でヘテロ接合であり、そして対立遺伝子特異的プライマー（ＴＳ−３０Ａ）による増幅は、−３０位でＡを有する染色体から半数体テロメア地図を生じる。明らかに、−３０位で同様にヘテロ接合である母親（Ｍ＝０２）のテロメア地図は、その母親（ＭＭ＝１４）から受継がれたが、父親（Ｆ＝０１）は−３０位でホモ接合であり、しかもその父親（Ｆ＝１１）および母親（ＦＭ＝１２）で見出されたテロメア地図の複合体である二倍体テロメア地図を有する。しかしながら、ＦＭのテロメア地図は、該父親またはそのいずれの子によっても受継がれなかったヌル反復体（矢印で示された）中に更に別の（ＴＧＡＧＧＧ）反復を含む。子（０４、０７および１０）は、 −３０位でホモ接合であるので、二倍体コードが見られ、そして子（０３、０６、０８および０９）は−３０位でヘテロ接合であり、そしてそれらの母親かまたは父親からのＴＳ−３０Ａプライマーによって増幅されうるテロメア地図を受継いでいた。−３０位に存在する塩基を示し、そして試料は、図４の場合と同様にＴ（ＴＴＡＧＧＧ）およびＧ（ＴＧＡＧＧＧ）トラックとして充填された。図５（ｂ）家系中のテロメアの分離。テロメア地図は、ＣＥＰＨ１４２３家系からの祖父（ＦＦ＝１１）、祖母（ＦＭ＝１２）、父親（Ｆ＝０１）、息子（Ｓ＝０３）および娘（Ｄ＝０８）から、隣接するプライマーＴＳ−３０Ａを用いて作成された。祖父は−３０位でヘテロ接合（ＡＴ）であり、半数体テロメア地図（Ａ′）を生じた。祖母は−３０位でホモ接合（ＡＡ）であり、したがって、ＡおよびＡ″ と表示されたテロメアの組合わせ地図から二倍体テロメアパターンを生じた。父親もまた−３０位でホモ接合であり、そしてその両親のＡ′およびＡテロメアから二倍体テロメアパターンを生じた。二人の子は、両者とも−３０位ヘテロ接合であり、息子はその父親からＡ′テロメアを受継いだが、娘はＡテロメア地図を受継いだ。それぞれのテロメアは、ＴＴＡＧＧＧ、ＴＧＡＧＧＧおよびＴＣＡＧＧＧ反復型それぞれの分布について三つのトラック（Ｔ、ＧおよびＣ）から推論される。図６三態テロメア変異反復地図およびコード。（ａ）隣接する−３０位でいずれもヘテロ接合の５種類のＣＥＰＨＤＮＡ（６６０２、１７０２、３５０２、３７０１および６６０１）からのテロメア地図を、標識された隣接するプライマーＴＳ−３０Ａと、Ｔ（ＴＴＡＧＧＧ）またはＧ（ＴＧＡＧＧＧ）またはＣ（ＴＣＡＧＧＧ）反復型それぞれから開始するＴｅｌＷかまたはＴｅｌＸかまたはＴｅｌＹとの間の増幅によって作成した。反応は、変性ポリアクリルアミドゲル上において、隣接したトラックで標識されたＴ、Ｇ、Ｃに分割された。右側の目盛りは反復単位数を示す。（ｂ）図６Ａで示された三態テロメア変異反復地図を、データベース分析用にコード化した。各ＤＮＡ試料について、３トラックの一つでのバンドの存在を、Ｔ、ＧまたはＣ反復型として記録する。時々、ＴおよびＣトラックで同じ位置にバンドが現れるが、その場合、それはＴ型反復単位として記録される。どのトラックにもバンドが存在しないことは、Ｎまたはヌル反復型として記録された。三態ＴＶＲ−ＰＣＲ技法にはまだ若干の欠点があり、例えば、ラダー中の各位置の単一バンドの代わりに二重線が存在すること；ＴｅｌＸ（ＴＧＡＧＧＧ）プライマーが最初の１０〜１５反復に対して非特異的バックグラウンドを生じ、そしてそれは、テロメアコードが読取られた場合に無視され；一つの型を有する反復単位のブロックの末端のバンドは、他よりも暗くなりがちであった。（ｃ）近位Ｘｐ／Ｙｐテロメア配列の超可変性。−３０の隣接する多形性でヘテロ接合の示されたＣＥＰＨ個体から得られた単一対立遺伝子テロメア地図を、Ｔ（ＴＴＡＧＧＧ）、Ｇ（ＴＧＡＧＧＧ）、Ｃ（ＴＣＡＧＧＧ）およびＮ（未知）反復型の分布に対してコード化した。Ｇ−、Ｃ−およびＮ型反復を、それぞれ赤、緑および黒で示す。種々の散在パターンの可視化を助けるために、Ｔ型反復体を青色バーとして示す。６５種類のテロメアから得られたテロメア地図を、それらの隣接するハプロタイプにしたがって分類した。ハプロタイプＡ対立遺伝子は、−３０位にヌクレオチドＴを有し、そしてＴＳ−３０Ｔプライマーによって増幅されたが、ハプロタイプＢおよびＣは−３０位にヌクレオチドＡを有し、そしてＴＳ−３０Ａプライマーによって増幅された。ハプロタイプＢおよびＣテロメアの内の一つを除く全てが、Ｇ型反復によって開始する。ハプロタイプＡテロメアの開始点の未知の配列は、二つのＮ型反復体で表される。ダッシュ（′）は、いくつかのテロメア地図の６ｂｐ周期性の僅かな変化を示すのに入れられた。表１Ｘｐ／Ｙｐテロメアに隣接したＤＮＡにおける多形性。多形性位置にはテロメア（表の右側）から番号を付し、そして広範囲に分析された多形部位の検定を以下に示す。表の上２行は、コーカサス人およびアフリカ人ＤＮＡにおける多形位置（５′->３′->テロメア）にある塩基を示す。表の下の最初の欄は、−４１４位、−４２７位、−６５２位および−８４２位の分析によって決定されたハプロタイプを示す。全ての多形性にわたる完全なハプロタイプは、ハプロタイプＡに対してホモ接合の３種類のＤＮＡ；およびＣＥＰＨパネルからのハプロタイプＢに対する３種類；隣接するハプロタイプＡに対してホモ接合の３種類のアフリカ人ＤＮＡおよび隣接するハプロタイプＣに対する３種類の配列分析から得られた。ハプロタイプは集団中で極めて強い連鎖不平衡にあると考えられるが、コーカサス人およびアフリカ人集団のＡハプロタイプ間には多数の相違がある。表２脚注：４つの多形位置の検定に基くハプロタイプは、試験された集団においてハーディ・ワインベルグ平衡にある（データは示されていない）。表３脚注：−１８８８多形性は、試験された集団全てにおいてハーディ・ワインベルグ平衡にあり、そして予備データは、それが、試験された集団においてテロメアに隣接したハプロタイプ全部について完全な連鎖不平衡にないことを示唆する。表４プライマー配列。制限部位（下線）を含有するプライマーＴＳＫ８Ｃ、ＴＳＫ８ＥおよびＴＳＫ８Ｇの非相補的５′尾部（太字）を示す。テロメア地図作成用プライマーＴｅｌＨ、ＴｅｌＧ、ＴｅｌＷ、ＴｅｌＸ、ＴｅｌＹの反復単位は、配列の下に角括弧でくくられている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＧＢ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ジェフリーズ，アレック・ジョンイギリス国レスターシャーエルイー２６エフエイ，レスター，アスキス・ブールヴァード 14

Claims

【特許請求の範囲】１．ゲノムＤＮＡの試験試料を特性決定する方法であって、該試験試料と型特異的プライマーとを接触させて、テロメア反復配列中で一つの型の内部反復単位を選択的に開始させ、そして該型特異的プライマーを適当なヌクレオシド三リン酸およびそれらの重合剤の存在下で伸長させて、その型の内部反復単位から少なくともテロメア反復配列の末端まで伸長した増幅生成物セットを生じることを含む上記方法。２．２種類またはそれ以上の型特異的プライマーを用いて、種々の任意の標識を有する種々の増幅生成物セットを生じる請求項１に記載の方法。３．１種類または複数の増幅生成物セットが、テロメア反復配列に隣接する部分まで伸長し、そしてその隣接する遺伝子座に対してハイブリッド形成し且つ適当なヌクレオシド三リン酸およびそれらの重合剤の存在下で伸長して１種類または複数の増幅生成物セットを増幅する場合により標識された共通プライマーの鋳型として作用する請求項１または請求項２に記載の方法。４．型特異的プライマーおよび共通プライマー伸長の工程をポリメラーゼ連鎖反応で繰り返す請求項３に記載の方法。５．隣接する遺伝子座が多形であり且つ共通プライマーが対立遺伝子特異的プライマーである請求項３〜４のいずれか１項に記載の方法。６．テロメア内部反復単位の２種類またはそれ以上の型を分析する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．１種類または複数の型特異的プライマーおよび／または共通プライマーが、１種類または複数の尾部特異的プライマーの１種類または複数の尾部配列を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．１種類または複数の型特異的および／または共通プライマーが、蛍光性によって末端標識されている請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。９．テロメア反復配列が、Ｘｐ／Ｙｐ偽常染色体部分（ＰＡＲ１）に含まれている請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。１０．隣接する遺伝子座がミニサテライト部分に含まれている請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。１１．隣接する遺伝子座が、短い散在反復要素（ＳＩＮＥ）中に含まれている請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。１２．ゲノムＤＮＡの試験試料を特性決定する方法であって、該試験試料と対立遺伝子特異的プライマーとを接触させて、適当なヌクレオシド三リン酸および重合剤の存在下においてＸｐ／Ｙｐ偽常染色体部分（ＰＡＲ１）テロメア反復配列の２０キロベース中の１個またはそれ以上の多形遺伝子座で選択的に開始させ、そして１種類または複数のプライマー伸長生成物の存在または不存在に関して対立遺伝子変異体を検出することを含む上記方法。１３．一つの対立遺伝子特異的プライマーのプライマー伸長生成物が、ポリメラーゼ連鎖反応において種々の多形遺伝子座のための対立遺伝子特異的プライマーの鋳型として作用しうる請求項１２に記載の方法。１４．Ｘｐ／Ｙｐ偽常染色体部分（ＰＡＲ１）テロメア反復配列の末端から決定される−１３位、−３０位、−７３位、−１４５位、−１４６位、−１４７位、−１７６位、−２９７位、−２９８位、−３３３位、−３３８位、−３６３位から−３７３位までの欠失、−４１４位、−４１５位、−４２７位、−５４０位、−５５４位、−６５２位、−８４２位から選択される１種類またはそれ以上の多形性の分析を含む請求項１２または請求項１３に記載の方法。１５．共通プライマーが、請求項１４に記載の−１３、−３０および−１７６多形性の一つに対する対立遺伝子特異的プライマーである請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。１６．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法によって作成された個々の試料コード。１７．請求項１６に記載の個々の試料コードの多重性を含むデータベース。１８．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法で用いるためのプライマーであって、の内の一つによって特異的に識別可能な遺伝子座に対してハイブリッド形成する上記プライマー。１９．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法で用いるための対立遺伝子プライマーであって、の内の一つによって特異的に識別可能な遺伝子座に対してハイブリッド形成する上記プライマー。２０．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法で用いるための型特異的プライマーであって、の内の一つによって特異的に識別可能な遺伝子座に対してハイブリッド形成する上記プライマー。２１．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法で用いるための１種類またはそれ以上の型特異的プライマー、および／または対立遺伝子特異的および／または共通プライマーを含む試験キット。２２．遺伝したまたは後天性の疾患の検出のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。２３．遺伝したまたは後天性の疾患に対する素因の検出のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。２４．癌を含めた異常な細胞分裂および／または増殖の診断における、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。２５．個体の識別または家族関係の決定のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。２６．テロメアに隣接するＤＮＡ配列からのヒト染色体のテロメア地図作成のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。２７．テロメアに隣接するＤＮＡ配列からのＴＴＡＧＧＧおよび変異テロメア反復型を有する非ヒト生物のテロメア地図作成のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。