JPH10507367A

JPH10507367A - 抗ウイルス剤による赤血球溶液の処理

Info

Publication number: JPH10507367A
Application number: JP8516189A
Authority: JP
Inventors: クック，デビッド; ウォロウィッツ，スーザン; ニーロ，アイリーン
Original assignee: セラスコーポレーション
Priority date: 1994-11-14
Filing date: 1995-11-08
Publication date: 1998-07-21
Anticipated expiration: 2015-11-08
Also published as: US6171777B1; US20020182581A1; EP0804074A4; EP0804074A1; US5691132A; EP0804074B1; DE69533942T2; ATE287210T1; AU712034B2; US5559250A; CA2203885C; AU4151396A; WO1996014737A1; DE69533942D1; US6410219B1; CA2203885A1; JP3145124B2; US6143490A

Abstract

(57)【要約】物質中の病原体を処理するための方法および組成物を記載する。臨床実験室で処理する前にヒト体液を除染する方法、およびin vivoで使用する前に血液製品を除染する方法を含む。本技法により、試験結果を損なうことなしに大量のヒト血清が処理される。生物学的物質を光除染するための新規な化合物もまた考案されており、これらの化合物は、血清分析対象物の妨害をすることがないという点で臨床試験に適合する。

Description

【発明の詳細な説明】抗ウイルス剤による赤血球溶液の処理発明の属する技術分野本発明は、新規化合物と、in vitroまたはin vivoでの使用を目的とする生体物質中の病原体のin vitroでの不活性化方法、特に、臨床検査または輸血前の赤血球を含む溶液中の病原体の不活性化方法に関するものである。発明の背景他の生体物質と同様に、血液製品中における病原体の存在は、この物質のレシピエントのみならず、医療従事者にとっても重大な健康上の問題として認識されている。医療従事者に関しては、病院の患者をモニターする日常的な作業としてヒトの体液（血液、尿、脊髄液など）を採取して検査することにより、多量のヒト体液を取り扱う。典型的には、瀉血士は、病院のそれぞれの患者から毎日少なくとも管に一本の血液を採取する。運搬、分配および検査の過程において、臨床作業従事者は各サンプル管を取り扱い、その際にその内容物に接触する可能性がある。このように、感染性である可能性のあるヒトの体液の集中的な取り扱いは、どうしても健康上の危険を伴うものである。労働安全衛生局(OSHA)は、毎年500万人以上の病院検査室の従業員をはじめとする医療従事者が、職場で血液による病原体への感染にさらされていると推定している。圧倒的多数の感染の原因となっている病原体はB型肝炎ウイルス(HBV)である。防疫センター(CDC)は、医療従事者の間で毎年1万2千件のHBV感染があると推定している。これらのケースの中で、5 00件以上が入院を必要とし、これらの患者のうち約250人が死亡している（劇症肝炎、肝硬変または肝臓がんによる）。「健康管理および公共安全労働者に対するHIVおよびHBVの予防および伝染のガイドライン」(CDC，1989年２月)を参照されたい。ほとんどのフルタイムの検査室従業員が、勤続中に少なくとも一度は肝炎にかかる。実際、すべての医療従事者の三分の一近くにおいて、以前にHBVに感染したことを示す血清学的証拠が示されている。上記の文献。後天性免疫不全症候群(AIDS)の認識後は、臨床検査室では更なる予防措置が講じられている。たとえば、サンプルを遠心分離した後に血清からの細胞の分離を維持するために手作業でプラスチックの挿入物を入れる代わりに、最近では血液を採取する際に空の管に入っている“ゲル”が利用される。管を遠心すると、細胞がゲルの下に行き、血清は上に残る。この方法により、あまりサンプルに触れることなく分離を維持することができるが、この方法は分析のときに技術者の取扱い回数を減らすものではない。不幸なことに、感染性のウイルスは液体中または乾燥状態のいずれにおいても、場合によっては高温にしても、長期間にわたって残存し得る。Resnick et al.，JAMA 255:1887(1986)。手袋や防護メガネのような予防策は問題の完全な解決とはならない。検査室や臨床での事故は、典型的には、体のより大きな部分への接触を伴い、病気は皮膚や粘膜を通して伝染し得る。Morbidity and Mortality Weekly Report 36:285(1 987)。職場における血液による病原体への感染に対するより適切な解決法が依然として必要とされていることは明らかである。このような解決法は、広い範囲の病原体に対する保護として作用するものでなくてはならない。さらに、解決のための手法は、検査室や血液銀行での作業を不当に妨害するものであってはならない。もう一つの重大な問題は、in vivoで使用する血液供給物の汚染である。血液供給の安全性は、輸血による病原体の伝染により脅かされ続けている。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)および後天性免疫不全症候群(AIDS)により引き起こされる脅威は現在広く喧伝されているが、血液により感染する他の数多くのウイルス性病原体は、さらに大きな問題となっている。R.Y.Dodd，「1990 年代の輸血医学」(A merican Assoc．Blood Banks 1990)(S.J.Nance，編)中の記載を参照されたい。たとえば、合衆国においては、何千件ものケースを調べた結果、毎年、複数回輸血を受けたレシピエントの10パーセント近くが肝炎をおこしていると推定されている。ボランティアのドナーから輸血のレシピエントのために集められた全血は、普通、その成分：赤血球、血小板、および血漿に分離される。これらの各フラクションは個別に貯蔵され、さまざまな特異的な状態や病状を治療するために用いられる。赤血球成分は、主に、外傷、慢性貧血、および、手術後の出血を含む、手術による失血（特に心臓および肝臓手術）の治療に用いられる。D.M.Surgenor ら,T ransfusion 32:458(1992)。合衆国だけで毎年約400万人のレシピエントに約1200 万ユニットの赤血球が輸血されている。E.L.Wallace ら，Transfusion 33:139(1 993)。血液供給の安全性は、輸血前に病原体について血液を検査するだけでは確実とはいえない。ほとんどの検査は、ドナーになりそうな人において病原体に対する抗体の検出を行うことによる。現在では、「セロネガティブ」な血液ドナー、すなわち、病原体に対して検出可能な抗体を有さないドナーによっても感染性病原体が伝染され得ることが文献により明らかにされている。たとえば、あらかじめ検査してHIV-1ウイルスに対する抗体が陰性であった血液のレシピエントにおける13例の輸血関連AIDSが防疫センター(CDC)に報告されている。書き誤りやその他の間違いによっても、患者は汚染されたり、不正確に試験されたり、または誤ったラベルを付けた血液に接触する可能性がある。通常の手順で採取した全血は成分に分けられるので、一つの悪いユニットにより何人かの被害者が出ることが問題を複雑にしている。血液銀行において間違いは珍しいことではない。1990年の開始以来、29,586件の血液銀行による間違いと事故がFDAに報告されている。「我々の血液はどの程度安全か」、U.S.News and World Repor t，1994年６月27日、68-78頁。血液センターにより誤って供給された血液の回収は、血液製品が輸血されてから数カ月または数年経ってからおこなわれることが多いため、一般的に効果的でない。血液製品を介した病気の伝染を排除するための別のアプローチとして、輸血用製品中の病原体を不活性化する手段の開発がおこなわれてきた。これらの技術のいくつかとしては、加熱[J.Hilfenhous ら，J．Biol．Std．70:589(1987)]、溶媒/界面活性剤処理[B.Horowitz ら，Transfusion 25:516(1985)]、ガンマ線照射 [G.Moroff ら，Transfusion 26:453(1986)]、またはUV単独照射[K.N.Proudouzら，Blood 70:589(1987)]などがあり、赤血球の機能の維持とは完全に適合しないものである。病原体を不活性化するもう一つの手段はメチレンブルーの使用である。S.J.Wa gnerらは、メチレンブルーを赤血球溶液の殺ウイルス剤として試した。S.J.Wagn er ら，Transfusion 33:30(1993)。赤血球をメチレンブルーとともに光処理すると、ATPの減少、イオン透過性の亢進、および自己免疫グロブリン(IgG)の赤血球表面への結合が起こることがわかった。処理の結果として、赤血球膜にかなりの全体的な(かつ望ましくない)修飾が生じたことが推測された。また別のアプローチとして、ウイルス性病原体を宿す可能性のあるリンパ球の赤血球製品への混入をなくす方法がある。フィルターおよび凍結/融解の両方の方法による白血球涸渇が試みられた。S.M.Bruisten ら，Transfusion 30:833(1 990)。しかしながら、この方法では完全なリンパ球の除去は達成できない。さらに、白血球涸渇は無細胞ウイルスには効果がない。このように、このアプローチは血液を完全に安全にするには十分とは言えない。最後に、血液を使わずに血液の代用品を使う方法がある。ヘモグロビン溶液、パーフルオロカーボンエマルジョンおよびベシクル-カプセル化ヘモグロビンは、皆候補として提案されたものである。残念ながら、これらはすべて、一般的な代用品としては不適当であった。R.M.Winslw「血液の安全性：最近の挑戦」(S.J .Nance 編)(AABB 1992)(pp.151-167)中の記載を参照されたい。要するに、赤血球溶液中のウイルス性病原体を不活性化する手段が必要である。この方法は、血液製品または輸血レシピエントに害を及ぼすことなく効果的なものでなくてはならない。発明の概要本発明は、新規化合物、および、in vitroまたはin vivoでの使用を目的とする生体物質中の病原体のin vitroでの不活性化方法、特に、臨床検査または輸血の前に赤血球を含む溶液中の病原体の不活性化方法に関する。本発明においては、病原性ウイルスを含めて核酸含有微生物による汚染を処理するために、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を選択的に使用する。本発明のメカニズムを提示することを意図するものではないが、これらの化合物はアルキル化剤である。本発明は、生物学的組成物の病原体による汚染を除去する以下の工程を含む方法を意図するものである。すなわち、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を病原体の混入が疑われる生物学的組成物に加えて、上記の化合物が上記の病原体のすべてを実質的に不活性化するのに十分な最終濃度となるように混合物を作る工程と、上記の生物学的組成物に重大な損傷を与えることなく上記の混合物をインキュベートする工程とからなる方法である。一つの態様において、最終濃度が1μg/ml〜250μg/mlの間になるように生物学的組成物に化合物を加える。別の態様においては、混合物を１分から48時間にわたってインキュベートする。本発明の一つの態様においては、化合物を生物学的組成物に加え、この化合物は、デキストロース、塩化ナトリウム、マンニトール、アデニンおよびH₂O との混合物中にある。本発明は生物学的組成物は血液製品からなることを意図する。本発明はまた、 c)上記の血液製品の哺乳類への輸注という付加的な工程をも含む。一つの態様によれば、輸注される血液製品は、赤血球、または特に赤血球濃縮物からなる。本発明は、ウイルス性および細菌性病原体の両方の不活性化を意図するものである。本発明によるこの方法のための一つの化合物は、N1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンである。しかし、本発明は、一つ以上の上記化合物を生物学的組成物に加えてもよいことを意図する。さらに、本発明は、c)上記の混合物をインキュベートした後、上記の化合物を吸収性物質を用いて上記の生物学的組成物から除く工程を含むものである。特に、本発明は、血液製品中の病原体を不活性化するための以下の工程を含む方法を意図するものである。すなわち、a)核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を病原体の混入が疑われる赤血球を含む血液製品に加えて、上記の化合物が上記の病原体のすべてを実質的に不活性化するのに十分な最終濃度となるように混合物を作製する工程と、b)上記の混合物を１分〜48時間にわたって、上記の赤血球に重大な損傷を与えることなくインキュベートする工程とを含む方法である。核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物の最終濃度が 1μg/ml〜250μg/mlの間となるように、血液製品にこの化合物を加える。ある付加的成分として、本発明は、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を血液製品に加える際に、この化合物が、デキストロース、塩化ナトリウム、マンニトール、アデニンおよびH₂Oとの混合物中にあることを意図する。もう一つの態様においては、この方法はさらに、c)上記の血液製品の哺乳類へ輸注する工程を含む。本発明は、この方法によりウイルス性および細菌性病原体の両方を不活性化することを意図するものである。さらに、この方法により血液製品を除染することを意図するものである。N1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ- 2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンをはじめとする、さまざまな化合物がこの方法に使用される。さらに、一つ以上の上記の化合物を上記の血液製品に加えてもよい。本発明は、c)上記の混合物をインキュベートした後、吸収性物質を用いて上記の化合物を上記の生物学的組成物から除去する工程という付加的な工程を含むものである。さらに別の態様においては、本発明は、以下に記載する順番で各工程を含む、 in vitroでの臨床検査に用いるための臨床サンプル中の病原体を不活性化する方法を意図するものである。すなわち、a）i）N1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6 -クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミン、および、ii）病原体で汚染される恐れのある、in vitroでの臨床検査に用いるための臨床サンプルを、任意の順で提供する工程と、b)核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を上記の臨床サンプルに加えて混合物を作製する工程、c)上記の混合物を１分〜48時間にわたってインキュベートする工程、および、d)上記の臨床サンプル中の臨床化学分析対象物のレベルを測定する工程からなる方法である。この方法において意図されている一つの化合物は、N1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N 4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンであり、N1,N1 -ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンを、上記の臨床サンプルに重大な損傷を与えることなく上記の病原体のすべてを実質的に不活性化するのに十分な濃度になるように加えることが好ましい。さらに、N1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンを、上記の臨床サンプルに加える際には、N1,N 1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンは、デキストロース、塩化ナトリウム、マンニトール、アデニンおよびH₂Oを含む混合物中にあってもよい。本発明は、特に上記の臨床サンプルが赤血球を含み、不活性化される病原体が細菌性病原体またはウイルス性病原体のどちらかからなるものであるということを意図する。一つの態様によれば、上記の臨床サンプル中の臨床化学分析対象物のレベルの測定は、上記の臨床サンプルが有意な損傷を受けることなくおこなわれる。さらに別の態様では、本発明は5-[N,N-ビス(2-クロロエチル)アミノ]メチル-8 -メトキシプソラレンを含む物質の組成物であることを意図する。図面の説明図１は、さまざまな濃度のキナクリンマスタードのAdsolまたはジメチルスルホキシド(DMSO)溶液で処理したR17の力価の減少を示すグラフである。水平な点線は用いたアッセイの検出限界を表す。図２は、ヘマトクリットの関数で表した、キニクリンマスタードによるR17の不活性化を示すグラフである。図３は、キニクリンマスタードの不活性化のキネティクスを示すグラフである。図４は、キニクリンマスタードのAdsol中でのインキュベーション時間の関数で表されたR17の力価の減少を表すグラフである。図５は、Adsol、赤血球またはAmberlite XAD-16^TMのいずれかの存在下でインキュベートした場合の、時間の関数で表されたR17不活性化能の減少を示すグラフである。図６は、さまざまな濃度のキニクリンマスタードの細胞外カリウムレベルに対する効果を示すグラフである。図７は、さまざまな濃度のキニクリンマスタードで処理したR17の力価の減少を示すグラフである。水平な点線は用いたアッセイの検出限界を表す。図８は、赤血球中で、Amberlite XAD-16^TMを存在させて、または存在させずにインキュベートした後に、TA 1537株を用いたエイムス試験により測定したキニクリンマスタードの活性を示すグラフである。図９は、キニクリンマスタードをさまざまな濃度で使用したときの細菌株、St aphylococcus Epidermis の不活性化を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明は、全般的には、新規化合物、および、in vitroまたはin vivoでの使用を目的とする生体物質中の病原体のin vitroでの不活性化方法、特に、臨床検査または輸血前の赤血球を含む溶液における病原体の不活性化方法に関する。本発明によれば、病原性のウイルスおよび細菌を含めて、核酸を有する微生物による汚染を処理するために、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を選択的に使用する。 I．本発明の化合物従来、光活性化した化合物を用いる赤血球の除染法には、ヘモグロビンが化合物の活性化に必要な波長の光を吸収することに起因する問題があった。このため、たとえ以前の方法が他の媒体中で病原体を不活性化するはずのものであっても、それらの方法は赤血球の存在下では効果を示さない。これに対して、本発明は、赤血球濃縮物［ヘマトクリットが1%〜60%の範囲またはそれ以上］の中でさえも効果的に病原体を不活性化することができる滅菌方法を意図するものである。本発明は、光に曝すことを必要とせずに病原体を不活性化する化合物で赤血球溶液を処理することを意図するものである。輸液用液体における不活性化に対して、本発明は二つの利点がある。第一は、光が必要ないので、不活性化にあまり複雑な技術を必要としない点である。第二は、除染化合物が短時間で完全に反応する点である。処理は、使用する化合物によって、数分から数時間で完了する。核酸と反応しない物質または別の生体分子と反応しない物質は加水分解され、輸液中に化合物が残らない。本発明の作用について特定のメカニズムを限定することを目的とするものではないが、本発明の化合物には共通して二つの性質がある。第一の性質はこれらの化合物は共有結合によらずに核酸に結合する点である。第二の性質は、これらが少なくとも一つのマスタード基を有することである。 A．非共有結合核酸結合基核酸に結合する化合物は、核酸に親和性を有し、共有結合によらずに結合することのできる基であるとここで定義される「核酸結合リガンド」を有する。核酸に結合するいくつかの方式がある。以下に記載する方式のいずれか、それらの組み合わせ、または他の方式により結合する化合物は、核酸結合リガンドであるとみなされる。本発明は以下の化合物に限定されるものではないが、核酸結合リガンドの例としては次のようなものがある：a)インターカレート剤、たとえば、アクリジン、アクリドン、プロフラビン、アクリフラビン、アクチノマイシン、アントラシクリノン、β−ロードマイシンA、ダウナマイシン、チアキサンテノン、ミラシルD、アントラマイシン、マイトマイシン、エキノマイシン、キノマイシン、トリオスチン、ジアクリジン、エリプチセン（二量体、三量体および類似物を含む）、ノルフィリンA、フルオレンおよびフルオレノン、フルオレノジアミン、キナクリン、ベンズアクリジン、フェナジン、フェナントラジン、フェノチアジン、クロロプロマジン、フェノキサジン、ベンゾチアゾール、キサンテンおよびチオキサンテン、アントラキノン、アントラピラゾール、ベンゾチオピラノインドール、3,4-ベンズピレン、ベンゾピレンジオールエポキシド、1-ピレニルオキシラン、ベンズアントラセン-5,6-オキシド、ベンゾジピロン、ベンゾチアゾール、キノロン、クロロキン、キニン、フェニルキノリン、カルボキシアミド、ソラレンおよびイソソラレンのようなフロクマリン、フロクマリンのエチジウム塩、プロピジウム、コラリン、エリプチシンカチオンおよび誘導体、多環系炭化水素およびそのオキシラン誘導体、およびエキニマイシン；b)マイナーグルーブ結合体、たとえば、ジスタマイシン、マイトマイシン、ネトロプシン、他のレキシトロプシン、Hoechst 33258および他のHoechst色素、DAPI(4',6'-ジアミジン-2-フェニルインドール)、ベレニルおよびトリアリールメタン色素；c)メジャーグルーブ結合体、たとえば、アフラトキシン；d)静電気により結合する分子（リン酸骨格結合体）、たとえば、スペルミン、スペルミジンおよび他のポリアミン；e)三重らせん形成、D-ループ形成および一本鎖のターゲットへの直接の塩基対のような配列特異的相互作用により結合する核酸または類似物。特定のメカニズムに限定するものではないが、核酸結合リガンドは、核酸と非共有結合的に相互作用することにより、分子に核酸を標的とさせる（または、導く）ためのキャリアー（または、アンカー）として機能すると考えられる。 B．マスタード基本発明の化合物が共通して有する二番目の特性は、これらが少なくとも一つのマスタード基を有することである。ここでは、「マスタード基」とは、モノまたはビスハロエチルアミン基、およびモノハロエチルスルフィド基を有するものと定義される。本発明は、マスタードに厳密に限定されるわけではない。マスタードはアジリジニウム錯体またはアジリジン錯体およびこれらの錯体のイオウ類似体のような反応性中間体を形成することができると考えられている。本発明には、エポキシドのような、マスタードと均等な働きをする官能基も含まれる。特定のメカニズムに限定するものではないが、マスタード基を有する化合物は核酸と反応して共有結合型錯体を形成し、核酸の複製を阻害することが知られている。これらは典型的には固体であって、求核試薬を含む媒体に溶解すると数分または数時間以内に完全に反応する。いくつかの例を下に示す。ナイトロジェンマスタードは、核酸結合リガンドとマスタード基とを有する化合物のクラスに属するもので、これについては文献に詳しく記載されている。たとえば、Gravatt，G.L.,ら，“DNA特異的アルキル化剤。4．4-アニリノキノリンを基本骨格とするマイナーグルーブ特異的アニリンマスタード”，J．Med．Chem ．34:1552(1991); Cummings，J．ら，“誘導体化を用いた高速液体クロマトグラフィーによる血漿中の反応性ナイトロジェンマスタード抗がん剤の定量”，Anal ．Chem．63:1514(1991)を参照されたい。これらは核酸の強力なアルキル化剤として知られており、この作用のため、これらは抗腫瘍剤として広く研究されてきた。いくつかのものは臨床において実用化の途が見いだされている（たとえば、アニリンマスタード、クロラムブシル、メルファラン）。ナイトロジェンマスタードの一つのクラスとして、アニリンマスタードがある。これらの化合物は少なくとも一つのハロエチルアミノアニリン基を有しており、このハロエチル基は一つまたは二つ置換されている。ビス（ハロエチル）アミノアニリン基の例を下に示した（Rは他の基に結合する箇所である）。特別なアニリンマスタード基としては、アクリジンと結合したアニリンマスタードがあり(Gravatt，et al.，J．Med．Chem．34:1552)、ここでは、Rは連結基で（たとえば、O、CH₂、S、COHN、またはCOが挙げられるが、他の連結基でもよい）、マスタード基を第二の構成要素であるアクリジン基に連結している。例としてアニリンマスタードに結合する9-アミノアクリジンを下に示す（ここで、Xは連結基である）。本発明は核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する特定の化合物、N1,N1- ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミン二塩酸塩（「キニクリンマスタード」）が赤血球に対する抗ウイルス剤として有用であることを示す。キニクリンマスタードは市販されている（Aldr ich，MilWaukee，WIより、構造を下に示すようなキニクリンマスタード二塩酸塩水和物として）。 II．除染される物質本発明は、新規化合物、および、核酸結合リガンドとマスタード基とを有する化合物の新規な利用法である血液、血液製品および他の生物学的組成物中のウイルスおよび細菌の不活性化に関するものである。限定的なリストではないが、本発明には以下の生物学的組成物が含まれ、一般的に「サンプル」と呼ばれる。血液および血液成分の典型的な組成物としては、全血、濃縮された赤血球、血小板、血漿（新鮮または新鮮凍結血漿）、および血液または血液成分に由来するタンパク質がある。血液成分はまた血漿タンパク質成分を含む。血液成分はまた、抗血友病因子(AHF、第VIII因子)；第IX因子および第IX因子錯体(第II因子、第VII 、第IXおよび第X 因子)；フィブリノーゲン、第XIII因子、プロトロンビンおよびトロンビン(第II因子および第IIa 因子)；免疫グロブリン(たとえば、IgA、Ig D、IgE、IgGおよびIgMおよびそれらのフラグメント、たとえばFab、F(ab')₂、およびFc)；破傷風およびＢ型肝炎に対して使われる高度免疫グロブリン；クリオプレシピテート；アルブミン；インターフェロン；リンホカイン；および伝達因子を包含する。本発明はまた、血液および血液製品の一部として、人工血液または人工血液製品をも含む。本発明に含まれる他の生物学的組成物としては、ワクチン、組換えDNA生産タンパク質、オリゴペプチドリガンド等がある。生物学的組成物はさらに、血液および血液成分以外の臨床サンプル、たとえば、尿、痰、便、脊髄液、および臨床検査のために哺乳類から分離される他の物質を含む。 III．病原体の不活性化本発明は、血液製品を、その血液製品を使用する前に核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物で処理して、混入した病原体の核酸配列を不活性化することを意図するものである。 A．不活性化一般ここでは「不活性化」という用語は、病原体ユニットの核酸を変化させて病原体ユニットの複製を不可能にすることと定義される。これは、サンプル中に存在するすべての病原体ユニットが複製不可能にされる「全体的不活性化」、または、存在するほとんどの病原体ユニットが複製不可能にされる「実質的不活性化」と区別される。化合物の「不活性化効率」は、その化合物が所定の化合物濃度または放射線の照射用量において達成できる不活性化のレベルとして定義される。たとえば、100μMの仮想の化合物Ｘが5logのHIVウイルスを不活性化し、同一の実験条件で同一濃度の化合物Ｙが1logのウイルスのみを不活性化した場合、化合物Ｘは化合物Ｙよりもよい「不活性化効率」を有するはずである。ある「不活性化」の方法が「全体的不活性化」を達成できるかできないかを評価するためには、一つの特定の例を考察するのが有用である。培養物のアリコートを新しい培養プレートに移して増殖させたときに、一定時間後に検出されなければ、細菌培養物は不活性化されたという。シグナルが検出可能であるためには、生きているバクテリアの最小数をプレートにアプライしなければならない。最適な検出法を用いると、この最小数は１細菌細胞である。次に適した検出法を用いると、シグナルを観察するためには、適用される細菌細胞の最小数は、１よりもはるかに大きくなる。検出法により、それより下では「不活性化法」が完全に効果的であるように見える（そしてそれよりも上では「不活性化」は実際に部分的にしか効果的でない）「閾値」が決定される。 B．潜在的な病原体の不活性化核酸に対する不活性化法の感度の限界を決定する際に、検出法と閾値と同様のことが考えられる。ここでも「不活性化」は病原体ユニットが複製不可能にされることを意味する。 in vivoまたはin vitroで、ヒトによって使用される物質のための不活性化法の場合には、検出法は理論的にはこの物質にさらされた結果としての病気への感染のレベルの測定に採用し得る。それより下では不活性化法が完全であるという閾値は、今度は物質と接触したためにおこる病気を予防するのに十分な不活性化のレベルとして採用される。この実用的なシナリオでは、本発明の方法が「全体的不活性化」という結果を生じることは必要不可欠ではないと考えられる。生存部分が病気を引き起こすには不十分である限り、「実質的不活性化」で十分であるといえる。このように、残存病原体のいかなる生存部分も病気を引き起こすには不十分である場合、「実質的にすべて」の病原体が不活性化されている。本発明の不活性化法は病原体の核酸を実質的に不活性化させる。一つの実施態様において、この不活性化法により、血液製品中の病原体の核酸が実質的に不活性化される。本発明の化合物が病原体を不活性化する方法を限定することを意図するものではないが、不活性化は病原体の核酸の一部がアルキル化された結果であると思われている。さらに、本発明の不活性化法を核酸の性質により限定することを意図とするものではないが、この不活性化法は、すべての形態の核酸(DNA、mRNA、等 )を実質的に不活性化するものと予想される。核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を核酸を修飾するために使用した場合、病原体の核酸（DNA、mRNA、等のいずれか）とその化合物との相互作用により、病原体の複製が好適に妨害されるので、ヒトが処理された病原体に接触しても感染はおこらない。「合成媒体」は、ここでは水性の人工血液または血液製品貯蔵媒体であると定義される。一つの実施態様において、本発明は、リン酸緩衝生理食塩水からなる合成媒体中の血液製品の不活性化を意図する。本方法は、血液中に存在する核酸ベースの病原体を単一の手順により不活性化する。このように、本方法は、細菌、原生動物およびウイルスを除去する潜在能力を有する。これは、本発明を不活性化される病原体の数または性質により限定するものではない。しかしながら、重要なことには、本発明の処理はHIVウイルスの複製を遮断することが見いだされている。AIDSが世界的に流行する前に効果的な除染法が利用可能であったならば、輸血関連HIV感染はおこらなかったであろう。核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物に基づく除染は、関与する病原体に関係なく、血液供給からすべての感染性病原体を除去する可能性を有する。 C．病原体の不活性化のための化合物の選択化合物が本発明の除染法に有用であるかどうかを決定するためには、1)化合物の病原体を不活性化する能力、および、2)その処理後の変異原性の二つの重要な性質を考慮しなければならない。化合物の病原体を不活性化する能力はいくつかの方法により決定できる。一つの技術は、試験化合物の核酸への結合を定量するアッセイである、バクテリオファージスクリーニングを実施することである。このタイプのスクリーニングであるR17スクリーニングについて、下に実施例として詳しく記載した。R17スクリーニングにより不活性化作用を示す場合には、その化合物のウイルスを不活性化する能力を直接テストすることが有用である。直接ウイルスの不活性化スクリーニングを行う一つの方法について、下に無細胞HI Vについての実施例として詳しく記載した。 R17バクテリオファージスクリーニングは他の多くのウイルスに対する化合物の効果並びに、HIV不活性化効果を予測するものと思われている。R17は、不活性化するのが非常に困難な病原体と考えられているので選択された。これは、小さい、一本鎖RNAファージである。本発明を実施する手段を限定することを意図とするものではないが、核酸の断片が短いほど、化合物にとって標的が小さくなるので、不活性化が困難になると考えられている。そこで、R17を不活性化するような条件下では多くのウイルスおよび細菌も不活性化されることが期待される。無細胞HIVスクリーニングは、R17によるテストの結果陽性であった化合物が実際に他のウイルスを不活性化するために効果的に作用することを肯定することによってR17スクリーニングを補う。そこで、化合物がR17スクリーニングで活性を示した場合には、この化合物について次にウイルスの不活性化スクリーニングテストをおこなう。本発明の方法において使用する化合物を試験する上で重要な第二の性質は、処理後の変異原性である。最も広く使われている変異原物質/発ガン物質スクリーニングアッセイは、エイムス試験である。このアッセイはD．M．MaronとB．N．A mesによりMutation Research，113:173(1983)に記載されており、特定のスクリーニングについては下に実施例として詳しく記載した。エイムス試験では、増殖がヒスチジン要求性であり通常のDNA修復酵素を欠損している Salmonella typhi murium のいくつかのユニークな株を利用する。細菌をヒスチジン非要求性にする正常な突然変異の頻度（すなわち、自発的な復帰変異体の頻度）は低い。この試験は、処理後に存在するあらゆる残存化学物質がこの復帰変異体の頻度に与える影響を評価するものである。いくつかの物質はそれ自体は変異原性はないが、代謝作用によって変異原に変換されるので、被験化合物を寒天プレート上で肝臓抽出物とともに菌と混合すると、この肝臓抽出物は、動物における代謝と擬似した作用をする。対照プレートには菌と抽出物のみを植える。混合物をインキュベートする。細菌の増殖は（少しでもあれば）コロニーを数えて調べる。エイムス試験が陽性の場合には、化合物を含むプレート上にあるコロニーの数が対応する対照プレート上のコロニー数を有意に上回る。既知の発ガン物質をこのようにエイムス試験によりスクリーニングすると、約 90パーセントが陽性となる。既知の発ガン性のない物質を同様に試験すると、約 90パーセントが陰性となる。ある化合物(X)について、本発明に使用する除染化合物としての可能性を下記の表１に示す方法で評価することができる。Ｘはまず、ステップIで評価される。Ｘを赤血球の存在下、4〜320μMの間のいくつかの異なる濃度で、下記の実施例で説明する方法により、R17アッセイにてスクリーニングする。化合物がR17スクリーニングのいずれかの濃度で1logのR17の不活性化(log kill)よりも大きい不活性化作用を示す場合には、次いでその化合物を下に実施例として説明するように、ステップIIの無細胞HIVアッセイでスクリーニングする。その化合物が無細胞HIVアッセイにおいて1logのHIVの不活性化(log kill)よりも大きい不活性化作用を示した場合には、その化合物は、臨床試験用サンプル中の病原体の不活性化のために有用な薬剤である。その化合物についてin vivoで使用するための生体物質の除染について評価したい場合には、次にステップIIIにすすむ。本発明の方法により除染された生体物質を、除染後に残ったどの化合物に変異原性があるかを決定するためにエイムス試験によりスクリーニングする。最後に、残った物質がエイムス試験で有意な変異原性を示さない場合には、化合物はin vivoで使用するための製品中の病原体を不活性化するための有用な薬剤であると認定される。この指示に従えば、どの化合物が本発明の方法での使用に適しているかを決定することができる。 D．不活性化のための化合物の送達および除去本発明は、いくつかの異なる剤形と投与経路を意図し、それによってここに記載された化合物は不活性化法の中で送達され、所望により除去することができる。この節は単に例証するものであり、発明を化合物で処理するためのいかなる方法または剤形に限定することを目的とするものではない。本発明の化合物は、血液製品を除染する目的に応じて、いくつかの剤形で、また、さまざまな時間に不活性化法に導入され得る。たとえば、この化合物は、水、生理食塩水、合成媒体または他のさまざまな媒体に溶かした水性の溶液として導入することができる。あるいは、化合物はアジュバントを用いてまたは用いずに乾燥製剤として提供することができる。さらに、化合物は単独で導入してもよく、またはいくつかの異なる化合物の「カクテル」あるいは混合物の形で導入してもよい。好ましい実施態様においては、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物は、250μM未満の濃度で使用する。この化合物は血液または血液製品と直接混合することもできるし、生体適合性の液体［たとえば、Adsol（その成分は下記の実験の節に記載する）または有機溶媒（たとえば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール）］を用いて、溶液または懸濁液として調製した後に血液と混合してもよい。新規化合物もまた不活性化プロセスにおいて異なる時点で提供することができる。たとえば、血液バッグのような反応容器に、製造時に化合物を導入してもよい。あるいは、この物質を反応容器に入れた後に化合物を加えて滅菌してもよい。 1．臨床サンプルの除染臨床サンプルとは、臨床検査のために哺乳類から分離したすべての物質であると定義され、たとえば、これらに限定されるものではないが、血液および血液成分、尿、痰、便、骨髄、および脊髄液が含まれる。血清の分析対象物は、ここでは臨床化学検査で測定される臨床サンプル中に見いだされる成分であると定義される。血清の分析対象物の例としては、これらに限定されるものではないが、グルコース、血液尿素窒素、クレアチニン、血液尿素窒素/クレアチニン比、ナトリウム、カリウム、塩素、マグネシウム、カルシウム、無機のリン、総タンパク質、アルブミン、総グロブリン、アルブミン/グロブリン比、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸トランスフェラーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、尿酸、鉄、トリグリセリド、およびコレステロールが挙げられる。臨床サンプルの除染においては、目的は、感染性病原体が臨床検査室の従業員に感染しないようにサンプルを除染することである。サンプルはレシピエントに輸注されないので、残存化合物をサンプルから除去することはほとんど考慮されない。このため洗浄技術は不要かもしれない。本発明では、サンプルを患者から採取する前に化合物を臨床サンプルの試験管の中に入れておいてもよいし、採取後に加えてもよい。化合物がサンプルと接触した後、望ましくはサンプルを完全に混合し、次いでインキュベートする。その後、感染性の病気の蔓延の心配なしに、サンプルを所望の臨床化学検査の項目についてスクリーニングすることができる。 2．輸注のための血液製品の除染除染のための化合物は、血液の採血前または後に血液バッグに加えることにより、分画の前に全血に導入してもよい。あるいは、血液の分画後にそれぞれの画分を除染するために化合物を加えてもよい。輸注用の製品においては、製品を処理した後、輸注の前に、残存化合物または反応により生成した化学物質を除去することが望ましい場合がある。本発明は、光の照射後、輸注前の血液製品からの化合物の除去または「洗浄」を意図する。一つの態様において、残存化合物または生成した化学物質を吸着材を用いて除去する。本発明で使用される吸着材の例としては、これらに限定されるものではないが、活性炭（ポリマーでコートされていないものまたはコートされたもの）、シリカ、逆相シリカ、高分子吸着剤および修飾された高分子吸着剤が挙げられる。本発明は、吸着材を輸注用血液製品に導入するためにいくつかの方法を意図する。吸着剤を血液製品に直接混合した後、濾過により除去してもよい。あるいは、血液製品を吸着材を含むフィルターに通すことも可能である。 3．ワクチンおよび他の生物学的組成物の除染ワクチンおよび血液に由来しない生物学的組成物、たとえば、組換えDNA生産タンパク質およびオリゴペプチドリガンドもまた、本発明の方法を用いて除染できる。組換えDNA生産タンパク質は、宿主生物体の中で大量に生産されることが多い。除染化合物の導入を増幅の前に行うと、宿主生物体が増殖するにつれて化合物が生物体中に取り込まれる。あるいは、製品の生産後、哺乳類への導入前に、この化合物を加えてもよい。輸注用血液製品の場合と同様に、ここでも使用前の化合物の除去が望ましい場合がある。上で述べた方法は、ワクチンおよび他の生物学的組成物の場合にも同様に適用される。 V．処理される物質の生化学的特性の保持 in vivoで用いられる血液製品を処理する際、処理のプロセスまたは使用した化合物により処理される物質のin vivoでの活性が変化しないかどうかを考慮しなければならない。たとえば、赤血球の輸注は、大量に失血した患者に対する、よく確立された有効な治療である。しかしながら、使用した不活性化処理により赤血球のin vivoでの生存が著しく減少する場合には、この治療には実用的な価値がない。本発明の化合物は、血液および血液製品の生化学的特質の保持に適合する温度で反応を行うことができるので、不活性化方法に有用である。しかし、すべての病原体不活性化法で除染される物質の生物学的活性を有意に低下させることなく不活性化がおこなわれるわけではない。以前から知られている不活性化のための化合物およびプロトコルでは、血液製品が光照射の間に生成した酸素ラジカルにより損傷を受けることを防止するために、光への曝露とそれに続く曝露前および曝露中の反応物から酸素分子の除去が必要であった。L.Lin ら，Blood 74:517(1989); Wiesehahn へのUS 特許第No.4,727,027号を参照されたい。本発明は、光を使わずに、酸素の存在下で、調製された製品の活性を損うことなく血液製品の除染に使用することを可能にする。さらに、本発明の方法によれば酸素分子の濃度を減少させる必要がない。本発明によれば、本発明の方法により除染した血液製品が、その特定の血液製品の機能について公知のアッセイ法で、正常に機能している血液製品と同様の試験結果を示した場合には、血液製品のin vivoの活性は損われていないかまたは有意な低下を受けていないということを含む。本発明の方法により除染された臨床サンプルが、通常の臨床化学検査において、未処理のサンプルと同様の検査結果を示した場合には、臨床サンプルの活性は損われていないかまたは有意な低下を受けていない。これに対して、血液製品または臨床サンプルは、血液製品が調製された目的のために機能しなくなった時には、「有意な損傷」を受けたとみなされる。たとえば、赤血球に関しては、本発明の方法により処理してから９日間保存した赤血球と、処理せずに９日間保存したサンプルで、赤血球のAMPレベル、IgG結合、および細胞外カリウムレベルが実質的に同じならば、in vivoの活性は損われていないかまたは有意な低下を受けていない。同様に、臨床サンプルも、一つ以上の通常の臨床化学検査において、処理されたサンプルが処理されていないサンプルと実質的に同じ検査結果を示すなら、有意な損傷を受けていない。「実質的に同じ」とは、処理されたサンプルの値が、未処理の対照が示す値の変化よりも10%以上大きい変化を示さないことを意味する。赤血球の場合には、この比較を処理後９日間保存した後に行う。 VI．ワクチンの調製ウイルスワクチンの製造もまた本発明の方法に含まれる。本発明には、ヒトのウイルスおよびイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒツジウイルスのような動物ウイルスを含むさまざまな種類のウイルスに対するワクチンの製造が含まれる。本発明の方法は、外被のあるウイルス、および外被のないウイルスの双方を含む、二本鎖DNAウイルス、一本鎖DNAウイルス、二本鎖RNAウイルスおよび一本鎖RNAウイルスの不活性化に適している。本発明による、ウイルスに感染し得る哺乳類の宿主に接種するためのワクチンの製造法は、感染した宿主から分離したウイルスの培養物を、適当な哺乳類細胞培養中で培養増殖させる工程と、不活性化されたウイルス粒子の抗原性が実質的に保持される条件で、少なくとも一つの種ウイルスを、ウイルスが感染しない程度に不活性化するのに十分な時間にわたって、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物にさらす工程と、上記の不活性化されたウイルスを適当なアジュバントと組み合わせる工程とを備える。不活性化されたウイルスはワクチンとしての使用のために様々な方法で製剤化される。ウイルスの濃度は不活性化の前に決定されるが、一般的に10⁶〜10⁹プラーク形成単位(pfu)/mlで、総用量が少なくとも用量あたり10⁵プラーク形成単位( pfu/用量)、通常は少なくとも10⁶pfu/用量、好ましくは少なくとも10⁷pfu/用量となるようにする。総用量は普通は約10⁹pfu/用量またはその付辺で、さらに普通には約10⁸pfu/用量である。ワクチンは細胞を含んでもよいし細胞を含まなくてもよい。ワクチンは、イオン化水、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水等のような生理学的に受容できる不活性な媒体を用いてもよいし、生理学的に受容できる免疫アジュバント、たとえば、これらに限定されるものではないが、ミネラルオイル、植物油、無機塩およびムラミルジペプチドのような免疫賦活剤と組み合わせて投与してもよい。ワクチンは、皮下、筋肉内、腹腔内、経口、または鼻腔内から投与ができる。通常、総用量が約0.5ml〜8mlの範囲になる場合には、特定の部位に対する特定の用量は約0.1ml〜4mlの範囲となる。注射の回数とその時間間隔は、非常に多様性に富むが、通常１、２または３週間の間隔で１から３回の注射を行うと効果的である。実施例下記実施例は、本発明の好ましい態様および側面を説明するためのもであり、本発明の範囲を限定するもまではない。下記の実施例の開示では、以下の略号を使用する。すなわち、eq（当量）；M （モル／リットル）；μM（マイクロモル／リットル）；N（規定）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；gm（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；l（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；Ｑ（キナクリン）；ＱＭ（キナクリンマスタード）；ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）；Ｈｔｃ（ヘマトクリット）；ＲＢＣ（赤血球）；ＬＢ（ルリア培地）；Ｎ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）；ＢＵＮ（血液尿素窒素）；Creat（クレアチニン）；phos acid（リン酸）；al k（アルカリホスファターゼ）；ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）；ＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）；ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）；ＧＧＴ（グルタミン酸トランスフェラーゼ）；ｃｆｕ（培養形成単位）；ｐｆｕ（プラーク形成単位）；ＤＭＥＭ（ダルベッコの改良イーグル培地）；ＦＢＳ（ウシ胎児血清）；ＰＲＢＣ（濃縮赤血球）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ｒｐｍ（回転／分）；ＴＣ（組織培養）；ＮＨＳＰ（正常なヒト血清プール）；ＬＳＭ（リンパ球分離培地）；ＮＣＳ（新生子ウシ血清）；ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）である。下記実施例で使用したAdsolは、Baxter Heathcare Corp（Deerfield，IL）から市販されているが、次の混合物：１リットルの蒸留水中の 22 g のグルコース、９g のＮａＣｌ、7.5gのマンニトールおよび 0.27 g のアデニンを滅菌濾過することにより調製した。下記実施例のいくつかでは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。ＰＣＲは、クローニングまたは精製を行うことなくゲノムＤＮＡの混合物における標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法である。K.B．Mullis ら、米国特許第 4,683,195および 4,683,202（本明細書中に参考として組み入れる。）を参照。標的配列を増幅するこの方法は、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に大過剰の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを導入した後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で正確な順序の熱サイクルを行うことから成る。２種類のプライマーは、二本鎖の標的配列の各々の鎖に相補的である。増幅を行うために、混合物を変性させ、次いで、プライマーを標的分子内の相補的配列にアニーリングさせる。アニーリングの後、プライマーはポリメラーゼによって伸長し、新しい一組の相補鎖を形成する。変性、プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによる伸長の工程は、所望の標的配列の増幅部分の濃度を高くするために、何回も繰り返すことができる（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長から一つの「サイクル」が構成され、多数の「サイクル」が存在し得る。）。所望の標的配列の増幅部分の長さは、プライマーの互いの相対的位置によって決定され、従って、この長さは、調節可能なパラメーターである。工程を繰り返すという観点から、その方法は、発明者によって、「ポリメラーゼ連鎖反応」と呼ばれる。実施例１本実施例では、Adsol またはＤＭＳＯで調製したキニクリンマスタード（ＱＭ）溶液のＲ１７不活性化活性を測定する。バクテリオファージＲ１７は、約 1.2 x 10⁶ダルトンの一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、他の多くの標的と比較して不活性化しにくい。一般的には、L．Linら、Blood 74:517（1989）参照。Ｒ１７系の利点は、不活性化が実験室で容易に測定できるということである。不活性化を測定するためのアッセイでは、ファージが不活性化の後に細菌を感染し、その増殖を阻害する能力を測定する。ファージは、Hrf 3000細菌において増殖させた（Ｒ１７および Hrf 3000 は、ＡＴＣＣ（Washington，D.C.）から入手した。）。最初に、Ｒ１７ストックウイルスを Adsolで 1:20 に希釈した（ＬＢ培養基において10.9 logs/ml）（Ｒ１７−Adsol）。次いで、Ｒ１７−Adsol混合物における 30 % のヘマトクリット（Ｈｔｃ）赤血球濃縮物を、赤血球（ＲＢＣ）を全血から沈降させ、3.5ml のＲＢＣペレットを 7.0ml のＲ１７−Adsol に再懸濁することにより調製した。この調製および以下の実験において、Ｈｔｃは、F800型 Sysmex 細胞計数器（Toa Medical Electronics，Kobe，Japan）で測定した。次いで、サンプルの1 mlアリコート 10 個を滅菌チューブに移した。 Aldrich，Inc.，Milwaukee，WIから市販されているＱＭの約 2 mg を２本のチューブの各々に秤量した。次いで、サンプルを各々、ＤＭＳＯまたは Adsolに溶解して、最終濃度を 0.4 mg/mlにした。Adsol 中のＱＭは、この濃度では懸濁物であって、溶液ではない。次いで、ＱＭ懸濁物をＲ１７−Adsol サンプルに添加して、サンプルチューブ中のＱＭの最終濃度を 2.5、5.0 、10または 20 μg/mlとした。ＱＭは、これらの濃度で完全に可溶化した。正の対照サンプルも調製した。この場合は、50μl の AdsolまたはＤＭＳＯをＲ１７−Adsol サンプルに添加した。サンプルは、室温で少なくとも１時間放置した。次いで、サンプルをＲ１７ファージアッセイによって滴定した。滅菌した 13 mlの希釈チューブをＬＢ培養基によって調製した。それらの希釈物を調製するために、ファージ溶液の 0.1 ml アリコートを培地 0.4 ml の最初の希釈チューブに添加した。次いで、この溶液 0.02 mlを第二のチューブの 0.5mlの培地に添加した（1:25）。第二溶液は次いで、残りのチューブに順次（1:25）入れて希釈した。各希釈サンプルに、一夜培養した 0.05 mlの Hrf 3000 細菌および 3 ml の溶融ＬＢトップアガーを添加した。混合材料をＬＢ培養基プレートに注いだ。トップアガーが固まった後、プレートを 37 ℃で一夜インキュベートした。翌朝、プラークを計数し、処理後に残ったファージの力価を、希釈因子に基づいて計算した。結果を下記表２および図１に示す。そのデータから明らかなように、ＱＭ濃度が 2.5μg/mlと低くても、Ｒ１７の不活性化には有効である。10μg/ml以上の濃度では、完全な不活性化がこのアッセイの検出限界まで達成される。実施例２本実施例の目的は、ＲＢＣの存在が本発明の化合物および方法によるＲ１７の不活性化にあまり影響を及ぼさないことを示すことである。２種類の化合物、ＱＭおよび化合物１（合成は下記実施例１７に記載する）を試験した。ＱＭの場合の方法は次の通りであった。まず、約 60 % ＨｔｃＲＢＣ濃縮物を Adsolでの希釈により調製した。そのサンプルを滅菌チューブに入れて再度 Adsolで希釈し、最終Htc が 2 %、6 % 、20 %または 60 % であるＲＢＣ濃縮物を得た(各チューブの最終体積 5 ml)。次に、Ｒ１７ストック（ＬＢ中に11.3 logs/ml）を Adsolで 1:10 に希釈した（Ｒ１７−Adsol）。このストックを各チューブに添加して（0.5 ml）、1 ml中の最終Ｈｔｃを約 1% 、3 % 、10 %または 30 % にした。正の対照サンプルは、ＲＢＣを使用しないで、0.5 mlのＲ１７−Adsol を 0.5 ml の Adsolと混合することにより調製した。ＱＭ（3.4 mg）をＨ₂Ｏに溶解して、最終濃度を 0.1 mg/m lとした。次いで、ＱＭ溶液の10μl アリコートを各Ｒ１７サンプルに添加し、サンプルを約２時間インキュベートした。負の対照は、ＱＭによる処理を行わなかった。サンプルは次いで、上記実施例１に記載したように、Ｒ１７ファージアッセイで滴定した。結果を表３および図２に示す。データから明らかなように、ＱＭは、試験したＨｔｃ全てにおいてＲ１７を不活性化させる。新規化合物１の不活性化能を試験するために、別の実験を行った。Ｒ１７（ストック力価は 11.9 log であった。）の1:1000 希釈物を 25 mlの濃縮赤血球において調製した。５本のチューブの各々に、このＲ１７−濃縮赤血球溶液 5 ml を添加した。次いで化合物１を、生理的食塩水に溶解して、最終濃度を 3 mg/ml とした。溶液中の化合物を次のように４本のチューブに添加した。第一のチューブは対照チューブであり、生理的食塩水のみを入れた。第二のチューブは 10 μ g/mlの化合物１／生理的食塩水を入れた。第三のチューブは、30μg/mlの化合物１／生理的食塩水を入れた。第四のチューブは、100 μg/mlの化合物１／生理的食塩水を入れた。最後のチューブは、300 μg/mlの化合物１／生理的食塩水を入れた。それらのチューブは、混合した後、4℃で一夜インキュベートした。それらの結果は、Ｒ１７不活性化活性を示した。30μg/ml以上の濃度は、最初の力価が 10 log であったＲ１７を約 4 log不活性化させた。実施例３本実施例では、ＱＭによるＲ１７不活性化の速度論を記載する。不活性化の速度論を測定するために、反応性ＱＭは、特定の時間でのＲ１７不活性化に関する信頼し得る測定値が中間時点で得られるように、反応性を低下させなければならない。ここでは、二つの方法を組み合わせて反応を弱めた。第一は、ＮＡＣをサンプルに添加して、過剰のＱＭと反応させた。第二は、サンプルをＬＢ培地で急激に希釈し、サンプル中の有効なＱＭ濃度を低下させた。下記に記載した対照実験は、この二つの方法が、残留ＱＭを効果的に弱め、反応速度論の有効な測定を可能にすることを示している。サンプルは、以下の方法で調製した。Ｒ１７の Adsolにおける希釈物（1:20）を、0.15 ml のファージ（11.3 logs/ml）＋ 2.85 mlの Adsolで調製した。滅菌濾過した 0.1 MのＮＡＣ 1アリコートを解凍して、ＱＭのＲ１７との反応を弱めるために使用した。次いで、適当な体積のＬＢを含む、ファージの標準的希釈物のチューブを調製した。適切な時点でサンプルを入れる、消去因子（ＮＡＣおよび／またはＬＢによる希釈）を含む一組のチューブ（消去チューブと言う）を調製した。システイン（ 44μｌアリコート）を消去チューブ＃１〜１２に添加した。ＱＭ（1.5 mg）を Adsol（25.0 ml）に溶解して、最終濃度を 0.1 mg/mlとした。次いで、ＱＭ溶液を Adsolに入れて 100X に希釈した（50μl のＱＭ溶液＋ 4.95ml の Adsol）。最終濃度は 1μg/mlであった。表４に、各対照および実験サンプルをどのように処理したかを記載する。対照は、まず、ファージのアリコート（100 μl）を消去チューブ９〜１３に入れた後、直ちに 1μg/mlのＱＭ 100μl を消去チューブ９および１０に添加し、200 μl の Adsolを消去チューブ１１および１２に添加することにより処理した。消去チューブ１３には Adsol（250 μl）を添加した。次いで、サンプル９および１１はＬＢ培養基に入れて希釈し、ファージアッセイを行った。次に、実験サンプルを処理した。ファージ（1.0 ml）を取り出して 15 mlの滅菌チューブに入れた。ＱＭ（1.0 ml、1.0 μg/ml）を添加した。この混合物を、０、２、４、８、16、32、64および 128分後に消去チューブ１〜８に入れた（20 0 μl アリコート）。サンプルを混合し、直ちにＬＢ培養基に入れて希釈し、ファージアッセイを行った。最後に、サンプル１０、１２および１３をＬＢ培養基に入れて希釈し、ファージアッセイを行った。結果を表５および図３に示す。ＮＡＣのみではＲ１７は不活性化しないが（サンプル＃１１および＃１２をサンプル＃１３と比較）、ＱＭの前にＮＡＣを添加すると、ＱＭ不活性化に対してかなり保護されたが、完全ではなかった（サンプル＃７および＃１０を比較）。ＮＡＣと希釈を組み合わせると、ＱＭ活性のほとんど完全な消去が得られた（サンプル＃１および＃１３を比較）。Ｒ１７のＱＭ不活性化は２時間以内に完了した。実施例４本実施例は、薬物を Adsol中でプレインキュベートしたときのＱＭ活性の低下を測定する。マスタードは、熱的に許容される経路によって反応すると考えられる。マスタードは、水性溶液中で加水分解することができる。この実験は、特定の水性溶液、Adsol 中でＱＭ抗ウイルス活性の低下が測定されるように計画した。先の結果から、ＱＭ抗ウイルス活性は、薬物を Adsol中でプレインキュベートすると、急速には低下しないことが分かった（結果は示さない。）。それらの実験における問題は、光依存性不活性化の可能性であった。なぜならば、室内の光を遮蔽するために特に努力を払うことなくサンプルのＬＢでの希釈が行われ、また、アクリジンは、光力学的効果によって不活性化することが知られているからである。この実験は、Ｒ１７不活性化が光によって媒介される効果によるという可能性を排除するために、室内の光レベルが実験の間ずっと注意深く制御される条件下で繰り返した。また、室内の光に慎重にさらしたサンプルにおける光の影響を調べ、親化合物である、下記構造：のキニクリンによる不活性化を調べるために、別の対照を加えた。下記手順を、遮光した、生物安全キャビネット中で行った。Ｒ１７ファージ（ 10.9 logs/ml）を Adsolで 10 倍に希釈した（1.0 mlのＲ１７ストック＋9.0 ml の Adsol）。1 mlの希釈ファージを 1.5 ml の滅菌チューブに移した。0.1 mg/m l のＱＭ溶液を、3.4 mgのＱＭ（フード中で秤量）を 34 mlのＨ₂Ｏで溶解することにより調製した。得られた溶液をホイルで包んで遮光した。次いで、0、10 、40、60、120 または 240分のプレインキュベーションの後、10μl のＱＭをチューブに添加した。サンプルを再びホイルで包んで、露光を防止した。光対照に対しては、時間0 で10μl のＱＭを 1.0 ml のファージに添加し、そのサンプルはホイルで包まなかった。キニクリンのＤＭＳＯ溶液 1 mg/mlを別の対照として調製した。この 1μl を二つのサンプルの各々に添加した。次いで、一つのサンプルはホイルに包んでインキュベートし（サンプルＱ）、一つはホイルなしでインキュベートした（サンプルＱ＋光）。全てのサンプルを、ＱＭの最後の添加後、２時間15分インキュベートした。時間０のサンプルの全インキュベーションは、６時間15分であった。下記の処理を、室内の光を極く少なくして行った（光源は、一つの閉じた出入り口であった）。細菌は、暗所で希釈し、プレーティングした。正の光対照に対しては、サンプルを、希釈中は室内の光にさらし、次いで、プレーティング中は薄暗い光条件に移した。結果を図４および表６に示す。これらの結果から、本実験条件下では、ＱＭまたはキニクリンによる光に依存した不活性化はなかったことが明らかである。さらに、ＱＭ活性は、Adsol 中で４時間プレインキュベートした後も弱まらなかった。実施例５ＱＭ活性は、上記実施例４で示したように、Adsol 中で４時間プレインキュベートした後も弱まらなかった。本実施例の目的は、ＱＭが、赤血球の存在下でのプレインキュベーションにより、より急速に不活性化するかどうかを測定することである。本実施例はまた、マスタード基を含む化合物の除去における洗浄技術の有効性を確立するために、吸着物質による赤血球溶液からのＱＭの除去の速度論をも調べる。最初に、ファージ希釈液を調製した。Ｒ１７（11.3 log/ml ストック）を Ads olで 1:10 に希釈した（0.7 mlのファージ＋6.3 mlの Adsol）。希釈ファージ（ 0.5 ml）を 1〜15のラベルを付けた 1.5 ml の滅菌チューブ 15 本に入れた。各チューブの処理を表７に示す。次に、ＱＭ溶液を調製した。約 20 mlの濃縮赤血球（ＰＲＢＣ）を 50 mlの円錐チューブに入れて、1600 rpmで９分間遠心した。遠心後のペレットの体積は 1 7 mlであった。約 3 mg のＱＭを生物安全キャビネット中で、秤量紙により秤量した（実際の重量は 4.5 mg であった）。次いで、サンプルを 50 mlの円錐チューブに移した。そのサンプルを Adsolに溶解して、0.1 mg/ml の濃度にした（Ad sol の実際の体積は 45 mlであった）。次に、赤血球ペレットを 17 mlのＱＭ溶液で 1:1に希釈した。チューブの中身を、数回上下逆さにすることにより穏やかに混合した。これを、以後、ＱＭ−ＲＢＣ溶液とする。 Amberlite XAD 16^TM（Sigma，St．Louis，MOから市販されている吸着剤）を秤量し（0.452 g）、15 ml の円錐チューブに移した。ＱＭ−ＲＢＣ溶液（9 ml）のアリコートを 0.5 gの XAD 16 を含む 15 mlのチューブに移し、上下逆さにすることにより穏やかに混合した。これを、以後、ＱＭ−ＸＡＤ溶液とする。ＱＭ溶液を等量の Adsol（各 1 ml）で希釈した。これを、以後、ＱＭ−Adsol 溶液とする。各時点で、ＱＭ−ＲＢＣ、ＱＭ−ＸＡＤおよびＱＭ−Adsol から 0.1 ml を 1 .5mlのエッペンドルフチューブに取り出した。それらのチューブの中身をマイクロ遠心管に入れて全速で 10 秒間遠心し、細胞および樹脂をペレット化した。次いで、ＱＭを含む 5μl の水相を、ファージを含む適当なチューブに移した。ＱＭを含むファージを次いで、上記表７で特定した時間、暗所でインキュベートした。240 分のサンプルは、ＱＭ添加の後、少なくとも２時間インキュベートした。最後に希釈を行い、ファージをプレーティングした。結果を下記表８および図５に示す。ＱＭ抗−ウイルス活性は、赤血球とともに４時間プレインキュベートすると除去された。吸着洗浄剤である Amberlite XAD -16^TMも、１時間以内に血液からＱＭを除去した。これらの結果は、赤血球の存在下でのインキュベーションもしくは吸着樹脂による処理のいずれか、または二つの処理の組み合わせは、不活性化後に残留ＱＭを迅速に除去するのに十分であることを示唆するものである。実施例６本実施例の目的は、本発明方法によるアヒルＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）の不活性化を測定することである。ＤＨＢＶは、ヒトＢ型肝炎ウイルスのモデルとして選択した。二つのウイルスは設計が類似しているからである。Ganem，D．およびVarmus，H．「Ｂ型肝炎ウイルスの分子生物学」，Ann．Rev．Biochem．56:6 51(1987)参照。感染したアヒル肝細胞を次のように準備した。アヒル肝細胞を約１週齢のアヒルの子の肝臓から単離した。アヒルの子は、プレスクリーニングして、ＤＨＢＶ陰性であると判定された。アヒルの子を各々麻酔した後、門脈から 0.5mlのヘパリンナトリウムを注入した。次に、各々のアヒルの子に、200 mlの 1X MEM／アールＢＳＳ＋ 2 ml のＨＥＰＥＳ緩衝液＋ 2 ml の 1 %ＥＧＴＡ（1 X MEM 溶液）を含む 75 mlの溶液を灌流した。次いで、アヒルの子に、30 mg の Collagena se A（Boehringer-Mannheim Biochem.，Indianapolis，INから市販）＋ 200 ml の Ham's F-12 ／ＤＭＥＭ培地を含む濾過滅菌溶液を 20 分間灌流した。この時点で肝臓を取り出し、細かいマッシュ状に切り刻み、50 ml の Ham's F -12 ／ＤＭＥＭを含む 125 ml のビンに入れた。5 mgのＤＮアーゼＩおよび25ml の Ham's F-12 ／ＤＭＥＭを含む約 10 mlの溶液を肝臓懸濁物に添加した。その懸濁物を 200 rpmで 10 分間遠心した。次いで、懸濁物をガーゼパッドによって漉し、125 ml のビンをＤＮアーゼＩ溶液の残りの 15 mlで洗浄し、洗浄液も肝臓懸濁物中に漉した。細胞懸濁物を等分して 50 mlの２本の遠心管に入れ、50 x gで２分間ペレット化した。ペレットを、培地 199／アールＢＳＳ、5 % の子ウシ血清を含む 10 mlの溶液に再懸濁してペレット化した。この工程をさらに２回繰り返した。３回ペレット化したものを 10 mlのプレーティング培地に再懸濁した。別に 10 mlのプレーティング培地を各チューブに添加した。肝細胞懸濁物を 70 ミクロンの細胞漉し器により 50 ml遠心管に濾過した。細胞懸濁物のアリコート（約0.5 ml）を、2 mlのプレーティング培地を含むペトリ皿に移して、各ペトリ皿につき、約 6〜8 x 10⁶個の生きた細胞に相当する集密度とした。37℃で２時間インキュベートした後、培地をＬ−１５培地（Gibco，G rand Island，NY から市販）（0.9 g/l のガラクトース、0.55 g/lのピルビン酸ナトリウムを含む）／ＤＭＳＯに変えた。培地を 24 時間で再び変え、その後は 48 時間ごとに変えた。細胞は、５〜７日間培養増殖させた。次に、ウイルスの不活性化を行った。ＤＨＢＶストックウイルスを 37 ℃で 1 5 分間、オーブン中で解凍した。次いで、ウイルスをマイクロ遠心管中、1400 r pm、室温で５分間遠心し、上清を新しいチューブに移して、チューブの底の物質を除去した。遠心および移動を繰り返し、サンプルを氷上に置いた。約 7 ml の全血を酸クエン酸塩デキストロース抗凝固剤を含むチューブに取り出した。細胞を 1600 rpm で９分間沈降させて、赤血球を濃縮した。血漿を取り出し、同量（2.9 ml）の Adsolで置き換えた。ウイルス 0.25 mlを 2.25 mlの赤血球で希釈し、混合物を攪拌して 10^-1の希釈物を作った。希釈したウイルスは次いで、次のように滅菌チューブに入れてアリコートを作った。すなわち、50μl は未処理サンプルとし、1.8 μl は 40 μ g/mlのＱＭでの処理用とし、0.5 mlは 10 μg/mlのＱＭでの処理用とした。次いで、1 mg/ml のＱＭ溶液を、3.2 mgのＱＭを 3.2 ml の滅菌ｄｄＨ₂Ｏに溶解することにより調製した。ＱＭ溶液のアリコートを、次のように、ウイルスを含むチューブに添加した。すなわち、72μl のＱＭを 1.8 ml のサンプルに添加して、ＱＭの最終濃度を 40 μg/mlとし、5 μl のＱＭを 0.5 ml のサンプルに添加して、ＱＭの最終濃度を 10 μg/mlとした。これらサンプルを室温で４時間インキュベートした。インキュベートした後、赤血球をマイクロ遠心管で沈降させた。血漿／Adsol 上清を除去した。各サンプルの希釈物を、100 μl のウイルスを 0.9 ml のＰＢＳ／10 %ＮＣＳ（ＰＢＳは 10 mM、ｐＨ 7.4 であった）で順次希釈することにより調製した。未処理の対照（サンプル＃１）は、10-⁷に希釈した。処理サンプル（＃２および＃３）は、10^-4に希釈した。次いで、肝臓懸濁物を含むプレートを、表９に記載の計画に従って接種した。プレートは、約 100μl のウイルスを接種したものを２つ作り（下記参照）、1 、10または 15 日間培養した。次いで、サンプルをＰＣＲおよびスロットブロットハイブリダイゼーションにより分析して、ウイルスＤＮＡの有無を確認した。スロットブロットハイブリダイゼーションは、組織培養サンプルからＤＮＡを採取した後、サンプル全てに対して行った。ＰＣＲ分析は、選択したサンプルに対して行った。サンプルを、標識用のプラスミド pD1.5G ＤＮＡと同様に、3MのＮａＯＨで変性させた。次いで、サンプルをＮＨ₄ＯＡｃで中和させた。400 μl の 1M ＮＨ₄ＯＡｃを、各サンプルのアリコートと同様に、フィルターを取り付けた VWR Scientific，Greenbelt，MOから市販されている Mini Fold II スロットブロット装置の各ウェルに添加した。全てのサンプルがフィルターを通過するまで装置を真空にした。次いで、フィルターを焼いて脱水した。次に、フィルターを、250 mlの 20 X ＳＳＣ（175.3 g のＮａＣｌ、88.2 gのクエン酸ナトリウム／800 mlのＨ₂Ｏ）、50 ml の50 X デンハルト溶液（5 g の Ficoll（Si gma，St．Louis，MO製）、5 gのポリビニルビロリドンおよび 5 gのウシ血清アルブミン／500 mlのＨ₂Ｏ）、20 ml の h mg/ml変性サケ精子ＤＮＡ、180 mlのＨ₂Ｏ、500 mlのホルムアミドおよび 10 mlの 10 % ドデシル硫酸ナトリウム水溶液の混合物中でプレハイブリダイズした。プローブは次のように調製した。すなわち、3 μl の pD1.5G(67 ng /μl)および 5 ml の 15 ng /μl ランダム6量体オリゴヌクレオチドを加熱し、再び冷却した後、4 μl の 5 X標識緩衝液、2 μl のｄＧＡＴ混合物（各 5 mM のｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ／ＴＥ）、1 μl のクレノウおよび 5 μl の［a³²Ｐ］ｄＣＴＰを添加してインキュベートした。25 mM のＥＤＴＡを添加することにより反応を停止した。次いで、ハイブリダイゼーション溶液 1 ml につき 5 x 10⁵ 個／分のプローブをフィルターに添加し、一夜ハイブリダイズさせた。フィルターを取り出し、ストリンジェンシーの低い洗浄溶液（50 ml の 20 X ＳＳＣ、940 mlのＨ₂Ｏおよび 10 mlの 10 % ＳＤＳ）を添加してフィルターを覆い、振とうしながら洗浄した。これを２回繰り返し、最後は、ストリンジェンシーの高い溶液（5 mlの 20 X ＳＳＣ、990 ml のＨ₂Ｏおよび 10 mlの 10 % ＳＤＳ）を代わりに添加した。次いで、適切な照射を得るためにフィルターをフィルムにさらした後、フィルムの正のハイブリダイゼーションを記録した。子ウシ胸腺ＤＮＡを含む負の対照サンプルも実験した。表１０には、ＰＣＲおよびスロットブロットハイブリダイゼーションのデータをまとめる。（ＮＰは、そのサンプルに対してＰＣＲを「行わなかった」ことを意味する。＋の印は、ＤＨＢＶの核酸がＰＣＲで増幅したことを意味する。−の印は、増幅しなかったことを意味する。）表１０を参照すると、ウイルス力価は、プレート＃９に対するＰＣＲ陽性シグナルに対して 6 logs/mlであった。10μg/mlの用量のＱＭは、プレート＃６０および＃６１に対するＰＣＲ陽性シグナルに対して 4 logs/mlを不活性化させた。 40μg/mlの用量のＱＭは、試験した全サンプルのＰＣＲシグナルおよびスロットブロットシグナルがない場合に対して＞6 logsのＤＨＢＶ／mlを不活性化させた。実施例７この実施例の目的は、QMによる無細胞HIVの不活性化を測定することである。R 17アッセイの場合と同じように、QMの少量のアリコートを貯蔵HIV-1へ添加した。貯蔵QM溶液は、この化合物3.4mgを組織培養培地（DMEM/15%FBS）に溶解し、QM の最終濃度を0.6mg/mlにすることにより調製した。QMは、この濃度において溶液ではなくコロイド状懸濁液であったが、これを実験に使用した。貯蔵HIV（10^4.2 プラーク形成単位/ml）をDMEM/15%FBSに入れた。QM溶液を貯蔵HIV-1のアリコートに添加して、最終全サンプル容積を0.5mlにするとともに、次のQM最終濃度：3 μg/ml、10μg/ml、または30μg/mlにした。これら0.5mlの試験アリコートを、2 4ウェルポリスチレン組織培養プレート中に置いた。二つの対照、すなわちHIV-1 ストックだけを含有するもの、およびQMを含有するがHIV-1ストックを含有しないものを調製した。すべてのサンプルを室温で1時間インキュベートし、次に-70 ℃で保存し、その後、マイクロタイタープラークアッセイにより感染力を定量した。本発明の化合物で処理したサンプル中での残存HIV感染力を測定するためのアリコートを取り出して培養した。残存HIV感染力は、MT-2感染力アッセイを使用して定量した。（Hanson，C.V., Crowford-Miksza，L．および Sheppard，H.W.，J．Clin．Micro 28:2030(1990) に既に記載されている）。アッセイ培地は、1mlあたり200μgのストレプトマイシン、200Uのペニシリン、50μgのゲンタマイシン、および1μgのアムホテリシンBを含有する85%DMEM（高グルコース濃度を有す）、15%FBS並びに1mlあたり2μ gのポリブレン（ミズーリ州セントルイスにあるSigma Chemical Co.）であった。不活性化処理を施した試験サンプルおよび対照サンプルを希釈して、50%アッセイ培地および50%正常ヒトプール血漿とした。サンプルは、96ウェルプレート（ニューヨーク州コーニングにあるCorning Glass Works）中で連続的に希釈した。これらのプレートを5%CO₂雰囲気下、37℃において1から18時間インキュベートした。MT-2細胞（0.025ml）［メリーランド州ロックヴィルにある国立衛生研究所 AIDS Research and Reference Reagent Programから入手できる（カタログ番号237）クローンα-4］を各ウェルに添加して、濃度を1ウェルあたり細胞数80 ,000とした。5%CO₂中で37℃において更に1時間インキュベーションを行った後、予め38.5℃に加温された、1.6%SeaPlaqueアガロース（メイン州ロックランドにあるFMC Bioproducts）を含有するアッセイ培地0.075mlを、各ウェルに添加した。このプレートを数分間37℃に保ち、数枚のプレートを重ねてプレートキャリアに入れ、600×gで20分間遠心分離した。遠心分離中、アガロース層がゲル化する前に細胞単層が形成された。5%CO₂中で37℃において6日間プレートをインキュベートし、50μg/mlヨウ化プロピジウム（propidium）（Sigma Chemical Co. ）のリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）溶液0.05mlを各ウェルに添加することによって染色した。24から48時間後、これらのプレートを8,000μW/cm² 304nm UV光ボックス（ウィスコンシン州ニューバーリンにあるFotodyne，Inc.）上に置くことによって、桃色／橙黄色蛍光染色されたマイクロプラークを可視化した。立体顕微鏡を用いて、20×から25×の倍率でプラーク数を調べた。結果を上の表11に示す。30μg/mlの濃度において、QMは使用したプラークアッセイの検出レベルまで完全に無細胞HIVを不活性化できた。実施例８最後の実施例では、QMが無細胞HIVを不活性化できることを示した。HIVはまたは、ある種の細胞内に見出すことができる。この実施例では、いろいろな濃度において、QMが細胞関連型のHIVを不活性化する能力を調べる。慢性的にHIV IIIBに感染したH9細胞を使用した。（H9/HTLV-III-B NIH 1983年カタログ番号400）。これらの細胞の培養物は、2mMのL-グルタミン、200単位/ml のペニシリン、200μg/mlのストレプトマイシン、および9%の胎仔ウシ血清（ニューヨーク州パーチェスにあるIntergen Company）を追加した高グルコースのダルベッコ（Dulbecco）改良イーグル（Eagle）培地中に保存した。保存中、培養物を週一回分離して、濃度を3×10⁵から4×10⁵個の細胞/mlとした。分離後約4日してから、必要に応じて8.8%重炭酸ナトリウムを添加した。不活性化処理のために、これらの細胞を分離3日後に使用した。これらの細胞を400 gで10分間、それらの培養培地から遠心分離して、上清を捨て、細胞をおよそ8mlの85%DMEM+15%FB Sに再懸濁させて濃度を2×10⁶個の細胞/mlにした。感染した細胞の懸濁液のアリコート（1ml）を、QMなしの対照用およびQM実験サンプル用として15ml管に入れた。この15ml管へQMの貯蔵溶液（1mg/mlの無菌ddH₂O溶液）を加えて希釈し、アリコートが適切に0、3、10、30、100、または150μg/mlのいずれかの最終濃度となるようにした。これらのサンプルを周期的によく混合しながら2時間インキュベートし、次に-80℃に保存し、その後マイクロタイタープラークアッセイにより分析した。保存したサンプルを37℃で解凍し、次に、Hanson，C.V.，Crowforf-Miksza，L .およびSheppard，H.W.，J．Clin．Micro 28:2030(1990)の記載内容、および前述の実施例7の記載内容に次の変更を行って、HIVマイクロタイタープラークアッセイにより滴定した。サンプルを、連続的に96ウェルプレート（ニューヨーク州コーニングにあるCorning Glass Works）中で直接希釈した。5%CO₂雰囲気中で37 ℃において1から18時間インキュベートした。MT-2細胞（0.025mL）［メリーランド州ロックヴィルにある国立衛生研究所 AIDS Research and Reference Reagent Programから入手できる（カタログ番号237）クローンα-4］を各ウェルに添加して、1ウェルあたり細胞数80,000の濃度にした。5%CO₂中で37℃において更に1 時間インキュベーションを行った後、予め38.5℃に加温した、1.6%SeaPlaqueアガロース（メイン州ロックランドにあるFMC Bioproducts）を含有するアッセイ培地0.075mLを、各ウェルに添加した。このプレートを数分間37℃に保ち、数枚のプレートを重ねてプレートキャリアに入れ、600×gで20分間遠心分離した。遠心分離中、アガロース層がゲル化する前に細胞の単層が形成された。5%CO₂中で3 7℃において6日間プレートをインキュベートし、50μg/mLヨウ化プロピジウム（ Sigma Chemical Co.）のリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）溶液0.05mLを各ウェルに添加することによって染色した。24から48時間後、これらのプレートを8,00 0μW/cm² 304nm UV光ボックス（ウィスコンシン州ニューバーリンにあるFotodyn e，Inc.）上に置くことによって、桃色／橙黄色蛍光染色されたマイクロプラークを可視化した。立体顕微鏡を用いて、20×および25×の間の倍率でプラーク数を調べた。結果を表12に示す。この実施例から、QMが非常に低濃度においてさえ、例えば10μg/ml以下でさえ、細胞関連HIVを不活性化することは明らかである。実施例９この実施例では、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する二つの化合物、すなわちQMおよびN-(2-クロロエチル)-N-エチル-N'-(6-クロロ-2-メトキシ-9- アクリジニル)-1,3-プロパンジアミン二塩酸塩（"ICR-170"）（ペンシルヴェニア州ウォリントンにあるPolysciences Incから市販されている）が、赤血球の存在下で無細胞HIVおよび細胞関連HIVの両方を不活性化する能力を示す。無細胞HIVの不活性化に対しては、15mlのPRBCを5mlのアドソール（Adsol）と混合して最終容積を20mlとした。その後、10個の2mlアリコートを15ml入り円錐管に添加した。次に、これら二つの化合物をいろいろな投与量でこれらの管に添加した。これらの化合物の貯蔵溶液はいずれも生理食塩水に溶解した1mg/ml溶液であり、4℃で保存した。ICR-170はこの濃度の溶液であった。二つの試験化合物の次の量：20、40、80、または160μlをPRBC入りの管へ添加し、試験化合物の最終濃度を10、20、40、または80μg/mlにした。これらの化合物を添加した後、30分ごとに混合しながら暗所で室温において10 0分間、サンプルをインキュベートした。続いて2500rpmで5分間遠心することによって赤血球をペレット化させた。上清を除去し、NHSPを添加してサンプルに15 %NHSPが含まれるようにした。サンプルは-80℃で保存した。細胞関連HIVの不活性化も、次の点を除いて同様な方法で行った。慢性的にHIV IIIBに感染したH9細胞を使用した。（H9/HTLV-III-B NIH 1983年カタログ番号4 00）。これらの細胞の培養物は、2mMのL-グルタミン、200ユニット/mLのペニシリン、200μg/mlのストレプトマイシン、および9%の胎仔ウシ血清（ニューヨーク州パーチェスにあるIntergen Company）を追加した高グルコースDMEM中に保存した。保存中、培養物を週一回分離して、濃度を3×10⁵から4×10⁵個の細胞/ml とし、分離後約4日してから、必要に応じて3.3%重炭酸ナトリウムを添加した。不活性化処理のために、これらの細胞を分離3日後に使用した。このストックのサンプル中の細胞の数は、ノイバウアー（Neubauer）式血球計算板（ミズーリ州グリーンベルトにあるVWR Scientificから市販されている）を用いて算定し、細胞数1.07×10⁶個/mlであることが分かった。アリコート（18.7ml、細胞数20×10⁶ 個）をペレット化し、5mlのアドソール中に懸濁させた。次に、この細胞懸濁液5mlを15mlのPRBCに添加した。このサンプルを分割して、無細胞サンプルに対して上述したように化合物を添加した。サンプルを100分間インキュベートし、続いてNHSPとRPMI-1640（カリフォルニア州サンタアナにあるIrvine Scientific から市販されている）との1:1混合物3mlを添加した。次に、各サンプルをリンパ球分離培地（LSM）（ノースカロライナ州ダラムにあるOrganon Teknika Corpから市販されている）6mlの入った15ml管に入れ、これらの管を1500rpmで30分間遠心した。別の層として分離したH9細胞をもう一つの管に取り出して、10mlのDMEM と混合し、2000rpmで5分間遠心した。このペレットを1mlの85%DMEM+15%FBS中に再懸濁させ、次に2ml入りサルステッド（sarstedt）管へ移した。サンプルは、同様に-80℃で保存した。無細胞HIVに対して実施例8で、また細胞関連HIVに対して実施例9で記述したようにマイクロタイタープラークアッセイを用いてサンプルの力価を測定した。結果を以下の表13A（無細胞）および13B（細胞関連）に示す。実施例10 上記の実施例では、QMが例外的な病原体不活性化活性を有することを確認した。臨床試験または輸注のための血液製品を除染する薬を選択する際、使用する方法および化合物が血液製品の機能に及ぼす影響を考慮することも重要である。この実施例では、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する二つの化合物、すなわちQMおよびクロラムブシル（chlorambucil）が、カリウムの漏出および赤血球表面へのIgGの結合によって測定される赤血球の機能に及ぼす短期的影響を調べる。クロラムブシルの構造を以下に示す。この実施例では更に、核酸結合リガンドおよびマスタード基の両方を有する化合物（QM）、ならびにマスタード基だけを有し核酸結合リガンドを持たない化合物（クロラムブシル）の赤血球中でのR17不活性化活性を比較する。全血（20ml）を50ml入り円錐管に移し、1600rpmで9分間遠心処理した。血漿を除去した（9ml）。次にR17ファージの10.9 logs/mlストックを、アドソールで1: 20に希釈した（24.4mlのアドソール + 1.28mlのR17）。次にペレット化された赤血球を25.6mlのアドソール/R17混合物で再懸濁させて30%Htcにした。アリコート（各3ml）を氷上の9個の管に移した。各マスタードをアドソールに添加した。ウィスコンシン州ミルウォーキーにあるAldrich Inc.から市販されているクロラムブシル（5.8mg）を1.93mlのアドソール + 5.85μlの3M NaOHに添加した（不溶解物質が残存していたが、実験では添加前に攪拌することにより懸濁液として使用した）。QM（2.9mg）を0.967mlのアドソールに添加した（ここでも物質は懸濁液の状態であった）。直ちに、以下の表14に示した容量のマスタードを血液に添加し、反転させて混合した。細胞外カリウム量は、処理後約1時間してから、Ciba Corning 614 K⁺/Na⁺アナライザー（マサチューセッツ州メドフィールドにあるCiba Corning Diagnostics Corpから市販されている）を使用して測定した。残りのサンプルは、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、R17アッセイ用として0.2mlの各サンプルを取り出し、マイクロフュージ（microfuge）で1分間遠心した。次に上清を取り出してファージアッセイを行った。残りのサンプルのカリウム量を測定し、これらのサンプルを4℃で保存した。カリウム測定は、1週間または著しい差異が観測されるまで毎日繰り返した。細胞外カリウムデータを表15および図6に示す。サンプル中のIgG結合は、直接抗グロブリン試験用Baxterユニバル（Unival）抗ヒトグロブリン抗IgGおよび抗ヒトグロブリン試験の品質管理用Baxterクームス（Coombs）コントロール細胞（両方ともイリノイ州ディアフィールドにあるBaxter Healthcare Corporationから入手できる）を使用して測定した。FACScan^TM（カリフォルニア州マウンテンヴューにあるBecton Dickinson）により測定されたIgG結合の結果を表15および16に示す。 R17は、すべてのQM濃度において完全に不活性化された（≧8.4 logs/ml）。しかしながら、クロラムブシルに対しては300μg/mlの濃度まで不活性化はほとんどまたはまったく観測されなかった（≦0.4 logs）。クロラムブシルはカリウム漏出または赤血球のIgG結合を変化させなかった。Q Mは顕著な抗ウイルス活性を示し、この実験の条件下では赤血球の機能のわずかな変化を誘起したにすぎなかった。顕著な赤血球の損傷は、R17を不活性化するのに必要な量よりも多くの量を使用したときに検出されたにすぎない。実施例11 実施例10では、カリウム漏出および表面IgG結合が無視できる条件下で、QMが赤血球中でR17を不活性化できることを示した。この実施例は、いろいろな量のQ Mで処理した後の赤血球の機能をより広範に調べることによって、こうした観測結果を確証するようにデザインされている。具体的には、この実施例では、QM処理が血液銀行と非常に類似した条件下で保存した後の赤血球の機能に及ぼす影響を調べる。およそ1日を経た濃縮赤血球単位を、サクラメント（Sacramento）血液センターから入手した。この赤血球を再分散し、およそ200mlを無菌容器へ移した。R17 （0.2ml）のLB溶液を添加し、サンプルを混合した。次に、この単位を6〜30mlのアリコートに分割し、氷上の無菌円錐型遠心分離管に入れた。残りの濃縮赤血球は4℃においてバッグ中で保存した。 QM（3.2mg）を氷冷アドソール（1.6ml）と混合して2.0mg/mlの懸濁液を作製した。このQM懸濁液のアリコートを表17に示すように赤血球へ添加した。このサンプルを穏やかに反転させて十分に混合し、Fenwalトランスファーパック（イリノイ州のBaxter/Fenwal）に移して4℃で保存した。次のような細胞の機能の測定を行った。1)Ciba Corning 614 K+/Na+アナライザー（マサチューセッツ州のCiba Corningから市販されている）を使用して、一週間は毎日、その後は毎週、カリウム量を測定した。2)処理後第一日目、その後は毎週、アデノシン-5'-三リン酸（ATP）および2,3-ジホスホグリセリン酸（2,3 -DPG）を測定した。ATPはミズーリ州Sigma手順No.366-UVに準じて測定したが、引用によりこの手順は本明細書中に含まれるものとする。2,3-DPGは、ミズーリ州セントルイスにあるSigmaから市販されている2,3-DPGキットを使用して測定した。3)赤血球表面へのIgG結合は、イリノイ州ディアフィールドにあるBaxter He althcare Corporationから市販されている直接抗グロブリン試験用Baxterユニバル抗ヒトグロブリン抗IgGおよび抗ヒトグロブリン試験の品質管理用Baxterクームスコントロール細胞を使用して、1日後および1週間後に測定した。Ｒ１７不活性化の結果は図７に示す。赤血球機能の結果は表１８Ａ−１８Ｄに示す。濃縮赤血球中で有効なR17不活性化条件下において、カリウム漏出、ATP含有量または2,3-DPG含有量に及ぼす顕著な影響はなく、RBCに対するIgG結合に及ぼす影響もわずかにあるにすぎない。実施例12 この実施例では、変異原性に対する周知のアッセイであるエイムス（Ames）試験でQMが変異原性を有するかを評定する。マスタードは病原体の不活性化に対すて有効な化合物であることは明らかであるが、これらはまた潜在的な変異原でもある。この実施例では、QMで処理した血液が、特にインキュベーション期間の後で顕著な変異誘発作用を示さないことを明らかにする。従って、本発明の化合物は例外的な病原体不活性化効率を有するが、変異原性は最小限に抑えられる。この実施例では、エイムスアッセイを使用してQMの変異原性を試験した。変異原性は、四つの条件下で試験した。すなわちQMを水中で一晩インキュベートし、赤血球にQMを添加して、直ちに平板培養した場合；QMを赤血球に添加して、4℃ で一晩インキュベートし、次に平板培養した場合；およびQMを赤血球に添加して、4℃で4時間インキュベートし、次にアンバーライト（Amberlite）XAD-16^TMと混合して、一晩インキュベートした後、平板培養した場合である。最初に、赤血球へのQMの溶解度を測定した。10mg/mlのQMを赤血球中へ加えて1 0倍および100倍に希釈し、溶解度を調べた。1.0mg/mlの溶液を得るために、10mg /mlのQM溶液20μlを50%Htc赤血球180μlと混合した。このストックには一定の粒子が含まれていた。次に、3.0mg/mlのQM溶液20μlと50%Htc赤血球180μlとを混合するとによって0.3mg/mlの濃度を試験した。3mg/mlストックを用いると明らかに溶液から沈殿を生じた。最後に、20μlの1.0mg/mlストックを180μlの濃縮赤血球と混合した。この1.0mg/mlストックの外観は透明であった。3mg/mlストックを最大濃度に選んだため、この実験では赤血球中で0.3mg/mlおよび30μg/プレートが濃度の上限である。これら三つの試験混合物の調製は次のように行った。QMをDMSOに溶解した10mg /ml溶液を1.0mg/mlに希釈した（60μgのQM溶液を0.54mlのDMSOに添加した）。50 %Htc赤血球溶液は、1600rpmで9分間、10mlの濃縮赤血球単位を遠心処理することによって調製した。上清を除去して細胞ペレットを同容量のアドソール中に再懸濁させた。次に、モデルF800Sysmex細胞数カウンター（日本の神戸市にあるToa Medical Electronics）を用いてHtcを確認した。その後、RBC溶液の13個の0.9ml アリコートを試験管に入れた。QMの四つの異なる貯蔵溶液を調製したが、それはこの化合物が3mg/mlほどの低濃度で溶液から沈殿するからである。1.0mg/ml溶液を次のように希釈することによって、いろいろな濃度の貯蔵溶液を調製した。すなわち、150μlの1.0mg/ml QM溶液＋350μlのDMSOから0.3mg/ml溶液を；40μlの 1.0mg/ml QM溶液＋360μlのDMSOから0.1mg/ml溶液を；15μlの1.0mg/ml QM溶液＋485μlのDMSOから0.03mg/ml溶液を調製した。最初の管へ100μlのDMSOを添加し、この管を4℃の振とう機（ミズーリ州グリーンベルトにあるVWR Scientific から市販されているOrbital振とう機を25rpmで）に載せて一晩インキュベートした。管2〜5も同様に一晩振とうさせ、次に、エイムスの菌株へ添加する直前に各 QM溶液の100μlアリコートを管に入れて希釈した。管6〜9へは、100μlの各QM溶液を添加した。次に、これらの管を振とう機に載せて4℃で一晩インキュベートした。最後に、管10〜13へも100μlの各QM溶液を添加し、次にこれらの管を振とう機に載せて4時間インキュベートした。続いて、0.1gの高分子吸着材アンバーライトXAD 16^TM（ミズーリ州セントルイスにあるSigmaから市販されている）を管10〜13のそれぞれに添加して、一晩インキュベーションを継続した。各管の最終含有量および使用したQM貯蔵溶液を以下の表19に列挙する。別の実験において、QM水溶液のサンプルを次のように調製した。サンプル管にラベルを貼って、それぞれに0.5mlのリン酸緩衝液を添加した。次に、これらの管のうちの五つに、QMの貯蔵溶液（1mg/ml）のいろいろな希釈液を添加した。10 0μg/プレートに対しては、1.4mlの貯蔵溶液を；30μg/プレートに対しては、0. 42mlのストック＋0.98mlのH₂Oを；10μg/プレートに対しては、0.14mlのストック＋1.26mlのH₂Oを；３μg/プレートに対しては、0.042mlのストック＋1.358ml のH₂Oを；１μg/プレートに対しては、0.014mlのストック＋1.386mlのH₂Oを添加した。H₂Oだけを使用して対照も調製した。 MaronおよびAmesによって詳細に記述されたサルモネラ変異原性試験で使用される手順に厳密に従った。Maron，D.M.およびB.N．Ames，Mutation Research 11 3: 173(1983)。各手順の簡単な説明を本明細書中に記す。検定菌株TA97a、TA98 、TA100、TA102、TA1537、およびTA1538は、Ames博士から入手した。TA97a、TA 98、TA1537およびTA1538は、フレームシフト検定菌株である。TA100およびTA102 は、塩基置換検定菌株である。入手後すぐに、各菌株を種々の条件下で培養し、菌株に特異的な遺伝子型を確認した。この研究で使用した標準サルモネラ菌株の増殖にはヒスチジンが必要であるが、それは各検定菌株がヒスチジンオペロン中に異なるタイプの変異を含むからである。ヒスチジン変異の他に、これらの検定菌株には、以下に示す他の変異が含まれており、これにより菌株が変異原を検出する能力は増大する。ヒスチジン依存性：各菌株を、最初にビオチンだけを補足した最小グルコースプレート上に、次にビオチンおよびヒスチジンを補足した最小グルコースプレート上に線条接種することよってヒスチジンの必要性を試験した。すべての菌株がヒスチジン／ビオチン補足プレート上でだけ増殖したことから、ヒスチジンの必要性が確認された。 rfa変異：バクテリアの表面を覆うリポ多糖バリアの部分的な損失を引き起こす変異は、検定菌株をコーティングした線条栄養寒天プレートをクリスタルバイオレットと接触させることによって確認した。最初に、100μlの各培養物を、2m Lの溶融した最小限のトップ層寒天に添加して栄養寒天プレート上へ注いだ。次に、クリスタルバイオレットで飽和させた無菌濾紙ディスクを、各プレートの中央に置いた。37℃で16時間インキュベーションを行った後、プレートを計数し、ディスクの周りにバクテリアが増殖しない透明ゾーンが存在することから、rfa 変異を確認した。 uvrB変異：この研究で使用した三つの菌株には、欠陥UV修復系（TA97a、TA98 、TA100、TA1537およびTA1538）が含まれる。この特性は、菌株を栄養寒天プレート上に線条接種し、プレートの半分にカバーをかけて、プレートの露出面を殺菌灯で照射することによって試験した。インキュベーションの後、UV照射を受けないプレート面にだけ増殖が見られた。 R-因子：検定菌株（TA97a、TA98、TA100、およびTA102）には、変異原に対する感受性を増大させるpKM101プラスミドが含まれている。このプラスミドはまた、バクテリアにアンピシリン耐性を付与する。このことは、アンピシリンの存在下で菌株を増殖させることによって確認した。 pAQ1：菌株TA102にはまた、変異原に対する感受性を更に増大させるpAQ1プラスミドが含まれる。このプラスミドはまた、テトラサイクリン耐性をコードする。このプラスミドの存在を確かめるために、ヒスチジン、ビオチン、およびテトラサイクリンを含有する最小グルコースプレート上にTA102を線条接種した。このプレートを37℃で16時間インキュベートした。この菌株が正常な増殖を示したことから、pAQ1プラスミドの存在が示唆された。遺伝子型試験に使用したのと同じ培養株を再び培養し、アリコートを制御条件下で凍結させた。培養株の遺伝子型を再び試験して、凍結保存株を調製する操作に対する遺伝子型の忠実度を確認した。菌株を用いて行った最初の試験は、菌株のそれぞれに対して自然復帰変異の範囲を測定するものである。各変異原性実験について、検定菌株のヒスチジン非依存への自然復帰変異を測定し、プレート一つあたりの自然復帰変異体の数で表した。これはバックグラウンド対照として機能した。各検定菌株に好適な診断用変異原（TA98に対しては5mg/プレートのアミノフルオレン；TA100に対しては1.5mg /プレートのアジ化ナトリウム；TA1537に対しては9-アミノアクリジン）を使用して、検定菌株ごとに正の変異誘発対照を含めた。すべての実験に対して、プレインキュベーション処理を施した。この処理で、各検定菌株のうちの一つのバイアルを解凍し、菌株ごとに20μLの培養株および6 mLのOxoid栄養ブイヨン#2が入った管を用意した。この溶液を、37℃で10時間振とうさせた。プレインキュベーション処理において、試験溶液の評価に使用した検定菌株ごとに、0.1mLの一晩培養株を13本の無菌試験管のそれぞれに添加した。この試験管のそれぞれに、管1〜13からの0.1mLの試験溶液を添加した。このことを、QMの水溶液だけを含有するサンプルについても行った。この後、pH7.4の0 .2Mリン酸ナトリウム緩衝液0.5mLを添加した。この0.7mLの混合液を攪拌し、次に37℃で20分間振とうさせながらプレインキュベートした。振とう後、ヒスチジンおよびビオチンを補足した2mLの溶融トップ層寒天を、この0.7mLの混合液に添加し、直ちに最小グルコース寒天プレート（基剤寒天の容積は20mL）上に注いだ。トップ層寒天を30分かけて固化し、次にプレートを反転させて37℃で44時間インキュベートした。インキュベーションの後、各プレート上の復帰変異体コロニーの数を調べた。結果を図8に示す。赤血球中および水中でインキュベーションなしのエイムス試験ではQMが正のレスポンスを記録したが、赤血球中で一晩インキュベーションを行うと、吸着材を使用してインキュベーションを行ったときと同じように復帰変異体の量が顕著に減少した。活性炭吸着材ヘモソーバ（Hemosorba）（日本の東京都にあるAsahi Medical Corpから市販されている）を使用して並行実験を行った。結果は示さないが、アンバーライトXAD16^TMを使用したときの結果と同様であった。実施例13 前述したように、臨床サンプルの除染方法が、サンプルの除染をする一方、臨床試験自体の結果に顕著な影響を及ぼさないならば、そうした方法が最も有用であろう。この実施例では、本発明の方法によって処理したサンプルと未処理のサンプルとに関する通常の血液化学パネルの結果を比較する。 QMおよびICR-170の溶液（2mg/ml）を生理食塩水を用いて準備した。QMはほとんど完全に溶解したが、ICR-170は懸濁液の状態であった。次に、ヒト全血を取り出し、10mlアリコートを8本の管に入れる。QMまたはICR-170の100、200、または400μlのアリコートを、これらの管のうちの6本に添加して、化合物の最終濃度を20、40、または80μl/mlのいずれかにした。生理食塩水の100または400μl のアリコートを、残りの2本の管に添加して、対照サンプルを調製した。その後、サンプルを30分間凝固させ、続いて1000rpmで20分間遠心分離機にかけた。次に、分離した血清を、ラベルを貼ったプラスチック管へ移し、24種の通常の臨床化学試験用パネルに入れて試験した。結果を以下の表20に示す。QMおよびICR-170は両方とも、24種の臨床化学試験用パネルのいずれの結果に対しても顕著な影響を示さなかった。乳酸デヒドロゲナーゼおよびGGTは、高濃度のICR-170を含有するサンプルで小さな低下を示した。明らかに、本発明の方法は、血液サンプルの臨床試験を著しく妨害することはない。実施例14 この実施例では、本発明の方法を使用した、生物学的組成のバクテリア病原体の不活性化について述べる。次の実験を行って、本発明の方法を使用してバクテリア病原体を不活性化できることを裏づけた。この実施例では、本発明の除染方法を適用して表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）を不活性化した。可動性穿刺針（motility stab）から3mlのLBブイヨンに接種することによって、この生物体を一晩培養した。これを35℃に保ち、その1.0mlを使用して15ml入り円錐管に入った9mlのLBブイヨンに接種した。サンプル（1ml）を採取して、OD 600の読みを調べた。管へ5mlのLBブイヨンを添加した。次に10⁸ cfu/ml の表皮ブドウ球菌50μlを添加した。このサンプルのアリコート（それぞれ1ml）を5本の管に入れた。これらを、0、3、10、30、または100μg/mlのQMのいずれかで処理した。QMをddH₂Oに溶かした2mg/mlストックを次の量で添加して、所望の濃度：0μl、1.5μl、5μl、15μl、50μlに調整した。これらのサンプルを氷上で3 時間インキュベートした。インキュベーションの後、寒天の入った100mmのペトリ皿上へ、LBブイヨンによる一連の10倍希釈液0.1mlを線条接種することによってバクテリアを定量した。35℃で24時間インキュベーションを行った後、コロニーの数を調べて、1mlを基準にバクテリア濃度を計算した。図９に示した結果から、QMが>10μg/mlのときは、このアッセイの検出レベルまで表皮ブドウ球菌を不活性化することが分かる。実施例15 除染された血液製品にin vivo治療としての価値を持たせる場合、除染処理後に、血液製品はある効力を保持していなければならない。赤血球の特定のサンプルの効力を確認する一つの方法は、哺乳動物へ輸注したときに、こうした赤血球が正常な赤血球よりもかなり速くレシピエントの体によって浄化されることはないことを確かめることである。この実施例では、本発明に従って核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物で濃縮された赤血球を処理し、マウスに輸注して、輸注後の生存を追跡した。抗凝固剤（クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸、プロスタグランジンE1およびテオフィリンを含む）を使用して8匹のBalb/cマウスから血液を抜き取り全量を12mlとした（8mlの全血および4mlの抗凝固剤）。等容量のアドソールを添加し、このサンプルを2000rpmで5分間遠心分離した。上清を取り出し、「洗浄された溶液」として保存した。赤血球ペレットは、アドソールに再懸濁させて50%Htc溶液にした。三つの1.5mlアリコートを、14ml入り丸底ポリプロピレン管へ移した。次に、QMおよびICR-170の二つの化合物の1mg/ml溶液を、生理食塩水を用いて調製した。化合物は次のように三つのポリプロピレン管に添加した。すなわち、管1には処理を施さず（120μlの生理食塩水を添加した）；管2には1mg/mlのQM溶液120μlを加えて最終濃度を80μg/mlとし；管3には1mg/mlのICR-170溶液120μl を加えて最終濃度を80μg/mlとした。この後、サンプルを4℃で2時間インキュベートした。細胞を三回洗浄し、毎回、各管に6mlのアドソールを添加して、1800rpmで5分間、サンプルを遠心した。最終洗浄の後、ペレットをアドソール緩衝液に再懸濁させて濃度を4×10⁶個の細胞／μlにした。50μlの各サンプルを取り出して未染色対照とした。次に、残りの細胞をPKH26染色液で染色した。1mMのPKH26ストックから120μl を取り出して8mlの希釈剤Aで希釈し、15.7μMのPKH26の実験用溶液を調製した。この溶液は使用するまで暗所で保存した。各2mlの細胞に、2mlのPKH26染色液を添加した。サンプルを穏やかに混合し、暗所において室温で5分間インキュベートした。2.5分後、細胞を再混合した。更に5分間インキュベーションを行った後、2倍容量の保存「洗浄された溶液」を添加して染色反応を停止させた。細胞を1 800rpmで5分間遠心分離してペレットとし、上清を除去した。次に、前と同じように細胞をアドソール緩衝液て3回洗浄した。最終洗浄の後、アドソールを用いてサンプルの容積を1mlに戻した。この時点で、各サンプルのアリコートを取り出して陽性染色対照サンプルとし、Sysmex機で計数した。サンプル1〜3のそれぞれに由来する標識細胞0.2mlを、尾静脈注射によりSwiss Websterマウスへ輸注した。次にマウスの体重を測定し、血液容量を計算した。血液容量は、gm単位の動物の体重×0.06として計算した。その後、1時間、24時間、第一週の間にさらに2回また3週間の間に毎週一回、ヘパリン−EDTAでコーティングしたキャピラリーを使用して後眼窩静脈穿刺によりマウスから採血した。眼採血サンプルは等張液に入れてから分析にかけた。 FACScan^TMを用い、FL2（赤色蛍光チャネル）において前方および側方散乱リニアモードゲートを使用して、赤血球集団のゲート通過を行いながらサンプルを分析した。合計100,000回の赤血球のゲート通過イベントにおける標識細胞の割合を測定した。結果を表21に示す。この結果によると、処理とは無関係に、処理細胞は未処理対照細胞と同じようにin vivoで生存した。 PKH26で標識した後、RBCのかなりの溶血が検出された。従って、回収率は標識方法による影響を受ける可能性がある。別の標識方法も使用したが、それについて述べる。活性化ビオチンエステルをBalb/cマウスの尾静脈から注射してin viv oで赤血球を標識した（各マウスに、２日間連続して0.1mgを注射する「少量投与処理」または3日間連続して0.3mgのビオチンを与える「大量投与処理」のいずれかの処理を施した）。処理後、蛍光タグ付けされたストレプトアビジンを有する低用量および高用量投与処理細胞は、FACScan分析による検出で明確に識別可能であった。低用量および高用量処理細胞は、上述したように80μg/mlのQMまたは ICR-170で独立に処理した。処理後、細胞を洗浄し、差別的に標識がなされた未処理細胞と混合した。次に3匹のマウスに輸注した。すなわち、1匹には未処理低用量投与および未処理高用量のRBCを与え、もう1匹にはQM処理低用量および未処理高用量RBCを与え、更にもう1匹にはICR-170処理低用量および未処理高用量RBC を与えた。上述したように採血した。結果を表22に示す。明らかに、処理細胞の回収率は未処理細胞のものと非常に類似している。実施例16 この実施例では、本発明の化合物である5-[N,N-ビス(2-クロロエチル)アミノ] メチル-8-メトキシソラレン塩酸塩（本文中では「化合物１」と記す）の合成について述べる。工程1：5-ブロモメチル-8-メトキシソラレンの合成 2.69g（12.3mmol）の8-メトキシソラレン（ウィスコンシン州ミルウォーキーにあるAldrichから市販されている）を135mLの氷酢酸に溶解した溶液へ、11mLのブロモメチルメチルエーテルを添加した。この溶液を攪拌し、次に3日間室温で放置して、その間に白色固体を沈殿させた。この混合物を氷浴中で冷却して濾過した。この濾液に、更に2.75g（12.7mmol）の8-メトキシシラレンおよび5mLのBr CH₂OCH₃を添加した。再び3日間静置した後、生成物単離を繰り返した。濾過ケークを冷氷酢酸で洗浄し、空気乾燥を行い、最後に真空乾燥を行って淡黄色固体として全収量6.3g（81%）の5-ブロモメチル-8-メトキシソラレンを得た。NMR（CDC_l3 ）：4.33(S,3H)、4.88(s,2H)、6.52(d,J=10Hz,1H)、6.95(d,J=2Hz,1H)、7.77( d,J=2Hz,1H)、8.11(d,J=10Hz,1H)。工程2：5-[N,N-ビス-(2-ヒドロキシエチル)アミノ]メチル-8-メトキシソラレンの合成 5-ブロモメチル-8-メトキシソラレン（0.50g 、1.6mmol、上記の工程1で得たもの）およびジエタノールアミン（2.56mL、27mmol）を、23mLの無水エタノール中で混合し、10時間還流した。この溶液を濃縮し、次に、その残渣にCHCl₃（65m L）を添加した。有機層を30mL、30mLおよび10mLの水で順に洗浄し、水性溶液を合わせてCHCl₃で逆抽出した。次に、有機溶液を合わせ、三回抽出したが、毎回、7mLの1.2N HClを使用した。酸溶液を合わせ、10%NaOH水溶液を用いてpH5〜6とし、生成した濁った溶液を4回洗浄したが、毎回、20mLのCHCl₃を使用した。この最終有機溶液を2×20mLのブラインですすぎ、脱水し（Na₂SO₄）、濃縮して0.43g （79%）のアミンジオール、すなわち融点121〜122℃；NMR（CDCl₃)：2.71(t,J=5 Hz,4H)、3.61(t,J=5Hz,4H)、4.09(s,2H)、4.29(s,3H)、6.41(d,J=10Hz,1H)、7.0 0(d, J=2Hz,1H)、7.70(d,J=2Hz,1H)、8.38(d,J=10Hz,1H)の5-[N,N-ビス-(2-ヒドロキシエチル)アミノ]メチル-8-メトキシソラレンを得た。工程3：5-[N,N-ビス(2-クロロエチル)アミノ]メチル-8-メトキシソラレン塩酸塩 5-[N,N-ビス-(2-ヒドロキシエチル)アミノ]メチル-8-メトキシソラレン（0.03 0g、0.090mmol）を、1mlの塩化チオニルに溶解させた。これを小さい針状の通気口を設けたセラムキャップ（serum cap）で上を覆い、３日間攪拌した。反応混合物をストリッピングし、粗製固体をイソプロパノール中で再結晶させて、融点 158〜162℃の灰白色固体として5-[N,N-ビス(2-クロロエチル)アミノ]メチル-8- メトキシソラレン塩酸塩（0.012g、32.4%）を得た。¹HNMR(CD₃OD)：3.40(t,J=6H z,4H)、3.86(t,J=6Hz,4H)、4.33(s,3H)、4.70(s,2H)、6.52(d,J=10Hz,1H)、7.28 (d,J=2Hz,1H)、8.03(d,J=2Hz,1H)、8.48(d,J=10Hz,1H)。化学シフトには、存在する痕跡量の酸の影響が敏感に現れた。上記の塩の一部を、塩化メチレンおよびNaHCO₃水溶液の間で分配させた。有機層を重炭酸塩水溶液で再び洗浄し、ブラインで脱水し、次に無水Na₂SO₄で脱水し、エバポレートして質量スペクトル（EI、m/e）：371(3)、369(4)、230(16)、22 9(100)、214(5)、201(5)、186(10)（日本の京都府にあるShimadzu Corporation から市販されている15mカラムのRtx-5を備えたShimadzu QP5000 GC/MSにより測定）の中性アミンを得た。実施例17 この実施例では、本発明の方法によって赤血球を処理する意図された実施態様について述べる。血液銀行で現在使用される標準的な血液製品分離方法は、次の通りである。すなわち、三つのバッグを可撓性チューブにより一体化して血液移送セット（例えば、イリノイ州ディアフィールドにあるBaxterなどから市販されている）を作製する。第一のバッグに血液を入れた後、セット全体を遠心分離（例えば、DupontのSorvall^TMスウィングバケット遠心分離機など）にかけ、第一のバッグ中に濃縮された赤血球および血小板に富んだ血漿を得る。血漿はチューブを介して（例えば、血漿圧搾用のFenwall^TM装置を使用して）第一のバッグからしぼり出して第二のバッグへ移す。次に、濃縮された赤血球が入った第一のバッグを切り離す。本発明の除染方法を特に赤血球に応用する実施態様において、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を、赤血球に導入して（例えば、第一のバッグにこの化合物を入れてから血液を注入するか、または遠心分離の後で第一のバッグに入れてもよい）、インキュベートする。インキュベーションの後、吸着剤（例えば、活性炭またはアンバーライト樹脂などの市販材料）を使用してこの化合物を除去することが可能である。赤血球が入ったバッグへ吸着剤を直接導入してもよいし、または吸着剤が入った洗浄装置に赤血球を通してもよい。インキュベーション、洗浄、およびそれに続くいかなる貯蔵も、市販の貯蔵バッグを用いて行うことが可能である。上記のことから、本発明が、貯蔵およびin vivoでの使用を目的とする血液製品の除染方法を提供することは自明であろう。本発明は、詳述した操作そのもの、すなわち記載および説明された化合物、組成、方法、または手順そのものに限定されるものではなく、修正および均等な置換ができることは、当業者には自明であることを理解すべきである。記載されたすべての特許は、引用により本明細書中に含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ０７Ｄ 219/14 Ｃ０７Ｄ 493/04 １０６Ｃ 493/04 １０６Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者ニーロ，アイリーンアメリカ合衆国 94539 カリフォルニア州，フレモント，カーペンターコート 2361

Claims

【特許請求の範囲】１．a) 核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を、病原体が含まれる恐れのある生物学的組成物へ添加し、その際、該化合物が、該病原体のすべてを実質的に不活性化するのに十分な最終濃度に達する工程と、 b) 前記生物学的組成物に実質的な損傷を与えることなしに、前記混合物をインキュベートする工程と、を備える、生物学的組成物中の病原体を除染する方法。２．前記化合物を前記生物学的組成物へ添加して、前記化合物の最終濃度を1 μg/ml〜250μg/mlの間とする請求項1記載の方法。３．前記混合物を1分〜48時間の間インキュベートする請求項1記載の方法。４．前記化合物を前記生物学的組成物へ添加するとき、前記化合物はデキストロース、塩化ナトリウム、マンニトール、アデニンおよびH₂Oを含有する混合物に含まれている請求項1記載の方法。５．前記生物学的組成物が血液製品を含む請求項1記載の方法。６．更に、c) 前記血液製品を哺乳動物に輸注する工程を含む請求項5記載の方法。７．前記血液製品が赤血球を含む請求項5記載の方法。８．前記血液製品が赤血球濃縮物を含む請求項5記載の方法。９．前記病原体がウイルス病原体を含む請求項1記載の方法。 10．前記病原体が細菌病原体を含む請求項1記載の方法。 11．前記化合物がN1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9- アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンである請求項1記載の方法。 12．２以上の前記化合物を前記生物学的組成物へ添加する請求項1記載の方法。 13．更に、c) 前記混合物をインキュベートした後、吸着剤を用いて前記生物学的組成物から前記化合物を除去する工程を備える請求項1記載の方法。 14．a) 核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を、病原体が含まれる恐れのある赤血球含有血液製品へ添加して混合物を作製し、その際、該化合物が、該病原体のすべてを実質的に不活性化するのに十分な最終濃度に達する工程と、 b) 前記赤血球に実質的な損傷を与えることなしに、前記混合物を1分〜48時間の間インキュベートする工程と、を備える、血液製品中の病原体を不活性化する方法。 15．前記化合物を前記血液製品に添加して、核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物の最終濃度を1μg/ml〜250μg/mlの間にする請求項14記載の方法。 16．核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する前記化合物を前記血液製品に添加するとき、前記化合物はデキストロース、塩化ナトリウム、マンニトール、アデニンおよびH₂Oを含有する混合物に含まれる請求項14記載の方法。 17．更に、c) 前記血液製品を哺乳動物に輸注する工程を備える請求項14記載の方法。 18．前記病原体がウイルス病原体を含む請求項14記載の方法。 19．前記病原体が細菌病原体を含む請求項14記載の方法。 20．請求項14記載の方法によって除染された血液製品。 21．前記化合物がN1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9- アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンである請求項14記載の方法。 22．２以上の前記化合物を前記血液製品に添加する請求項14記載の方法。 23．更に、c) 前記混合物をインキュベートした後、吸着剤を用いて前記生物学的組成物から前記化合物を除去する工程を備える請求項14記載の方法。 24． in vitro臨床試験を目的とする臨床サンプル中の病原体を不活性化する方法であって、以下の各工程、 a) i) N1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミン、およびii) 病原体に汚染される恐れのある、in vit ro臨床試験を目的とする臨床サンプルを任意の順で供給する工程と、 b) 核酸結合リガンドおよびマスタード基を有する化合物を前記臨床サンプルに添加して混合物を作製する工程と、 c) 前記混合物を1分および48時間の間でインキュベートする工程と、 d) 前記臨床サンプル中の臨床化学分析対象物のレベルを測定する工程と、を上記の順序で含む前記方法。 25．前記化合物がN1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9- アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンである請求項24記載の方法。 26． N1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンを添加して、前記臨床サンプルに有意な損傷を与えることなしに前記病原体のすべてを実質的に不活性化するのに十分なN1,N1-ビス(2 -クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンの濃度に到達させる請求項25記載の方法。 27． N1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル )-1,4-ペンタンジアミンを前記臨床サンプルに添加するとき、N1,N1-ビス(2-クロロエチル)-N4-(6-クロロ-2-メトキシ-9-アクリジニル)-1,4-ペンタンジアミンはデキストロース、塩化ナトリウム、マンニトール、アデニンおよびH₂Oを含有する混合物に含まれている請求項24記載の方法。 28．前記臨床サンプルが赤血球を含む請求項24記載の方法。 29．前記病原体がウイルス病原体を含む請求項24記載の方法。 30．前記病原体が細菌病原体を含む請求項24記載の方法。 31．前記臨床サンプルに有意な損傷を与えることなしに工程d)を実施する請求項24記載の方法。 32． 5-[N,N-ビス(2-クロロエチル)アミノ]メチル-8-メトキシソラレンを含む物質の組成物。