JPH10507442A

JPH10507442A - 薬剤代謝物の製造および予測への合成メタロポルフィリンの使用

Info

Publication number: JPH10507442A
Application number: JP8509745A
Authority: JP
Inventors: コルグヘイド，ムクンド・エス; ドルフイン，デイビツド・エイチ; ヒル，デイビツド・アール; ヒノ，フミオ; リー，エレイン・シー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1994-09-15
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 1998-07-21
Also published as: EP0781261A2; WO1996008455A3; US5760216A; CA2195873A1; WO1996008455A2

Abstract

(57)【要約】非常に多額の費用を要する医薬品開発プロセスのできるだけ早期に、できるだけ簡便に、医薬品の考えられる毒性および／またはその他の生物学的活性を有する代謝物について調べるために、そのような医薬品の代謝物を系統的かつ有効に合成・同定する方法であって、医薬品の各サンプルが合成メタロポルフィリン（ＳＭＰ）、ＳＭＰ酸化補助剤および溶媒の異なった組み合わせと反応するように、所定の条件下、好適な溶媒の存在下に、一連の合成メタロポルフィリンと合成メタロポルフィリン酸化補助剤の組み合わせに医薬品のサンプルを加え；得られた酸化生成物の分離・単離を行い；適切な動物モデル実験によって予め同定してある酸化生成物から代謝物の同定を行い；上記の方法によって多量に製造された実際の代謝物について毒理学的試験、病理学的試験、組織病理学的試験、機序試験または遺伝毒性試験を行って、有毒な、および／またはその他の代謝的に活性な有益もしくは有害な個々の代謝物を同定することを包含する方法。

Description

【発明の詳細な説明】薬剤代謝物の製造および予測への合成メタロポルフィリンの使用発明の属する技術分野合成メタロポルフィリン（synthetic metalloporphyrin：ＳＭＰ）化合物は、生物システム(biological system)における酸化触媒のモデルとして役立つ。生体代謝物の予測に有用な医薬化合物の酸化生成物は、合成メタロポルフィリン触媒、ＳＭＰ酸化補助剤（co-oxidizing reagent）および溶媒の特定の組み合わせのものと医薬化合物を反応させ、次にそのような酸化生成物の分離・同定を行うことで、系統的かつ効果的に製造することができ、次にその酸化生成物についての毒理学、病理学、組織病理学、機序(mechanistic)または遺伝毒性(genotoxic) の試験を行って、元の医薬化合物の代謝物の毒性その他の生物学的性質を求めることができる。発明の背景ヒトその他の動物において、ほとんどの医薬品が肝臓で代謝される。多くの薬剤代謝物は、主としてヘムを含有する酵素およびシトクロムを含有する酵素によって触媒される酸化機序によって生成する。そのうち、シトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼが、ほとんどの生体酸化での触媒の主体である（参照：Cytochrome P-450: Structure ，Mechanism and Biochemistry, P.R.Ortiz de Montellano ，ed.，PlenumPress，NY，1986）。医薬化合物が体内で受ける代謝プロセスは、特定用途におけるその化合物の効力（実際には、活性化合物自体を生じる場合がある）、化合物がどのような副作用を有し得るか、そしてそれの代謝物の毒性もしくは望ましくない生物学的活性の有無に対してかなり寄与するものである。これらの因子は、特定の医薬化合物の成否を左右する主要因子であり、代謝プロセスは重要であることから、過去３０年間にわたり酸化的代謝プロセスの機序研究に膨大な研究努力が払われてきた。医薬品候補剤の将来に対する薬剤代謝物の重要性を理解している薬理研究者は、そのような化合物の同定・単離を試みてきた。該研究者らはこれまで、多額の経費を要する医薬品開発プロセスにおいてできるだけ早期にこれらの代謝物を十分な量で得て、それら化合物に関してさらに毒性試験および薬理試験を行おうことを試みてきた。しかしながら、薬剤代謝の研究における生物システムの使用には、いくつかの問題が伴う。特に、動物およびin vitroの両方の代謝試験では、産生される代謝物は非常に少量であるため、それら代謝物の同定が困難である。これらの代謝物は一般に、同定するためには単離する必要があり、どの代謝物を調べるべきかを前もって薬理研究者が知ることはない。さらに、動物実験の場合、これらの代謝試験用にかなりの数の動物が必要であることから、実施に多額の費用を要することが知られており、同定できた場合でも、さらに試験を行うのに代謝物を容易かっ有効に合成することができない場合があり、特に試験を行うのに比較的多量の代謝物が必要である場合にはそうである。最近、研究者らは、シトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼ触媒の模擬物として合成メタロポルフィリンを利用する生体酸化のモデル系について調べるようになってきた。この新規な分野の文献についての総説は限られた数しか発表されておらず、キシーらの報告（Xie and Dolphin，″Biological Oxidations w ith Heme Proteins″，in Metalloporphyrins Catalyzed Oxidations，F.Montan ari and L.Casella，eds.，Kluwer Academic Publishers，The Netherlands，19 94，pp.269-306）およびモンタナリらの報告（Montanari et al.，Rev.Heteroat .Chem.，6 : 94-141(1992)）などがある。最初に調べられたＳＭＰは不安定であることが認められたが、合成メタロポルフィリン分子中に追加の原子を導入することで、分子の安定性が改善し、触媒反応の代謝回転(turnover)が上昇した。ドルフィン（Dolphin）らの研究では、メソ−テトラアリールポルフィリンのアリール基およびβ−ピロール位にハロゲン原子を付加することで、中間体のオキソ−ポルフィリン錯体がより電子欠乏状態となり、しかも立体的により保護された状態となることから、より有効な酸化触媒を行うことが示されている（例えば、上記のXie and Dolphin の報告参照）。しかしながら、これらハロゲン化合成メタロポルフィリンを用いるモデル研究には、これら触媒化合物自体を容易に入手できないという障害があった。これらの触媒は市販されていないことから、通常は研究者の実験室で製造しなければならない。合成メタロポルフィリンの合成に現在使用される方法の例として代表的なものが、ドルフィンらの特許（Dolphin et al.，１９９０年１月９日発行の米国特許４８９２９４１号）；トレイラーらの報告（Traylor et al.，Inorg.Chem ., 26 : 1338-1339(1987)）；ロチャ・ゴンサルベスらの報告（Rocha Gonsalves et al.，Tetrahedron Lett,, 32 : 1355-1358(1991)）；ホフマンらの報告（Ho ffmann et al.，Tetrahedron Lett.，31: 1991-1994(1990)）；およびウィジェセカラらの報告（Wijesekera et al.，Ange w,Chem.,Int.Ed.Engl., 29 : 1028-1030(1990)）に記載されている。しかしながら現時点では、医薬品の酸化的代謝の研究に関して、合成メタロポルフィリンの他の用途はほとんど報告されていない。各種シトクロムＰ４５０モデル系を用いてリドカイン酸化について研究し、それによってリドカインの公知の一次代謝物の一部を製造したキャリアら（Carrier et al.，Bull.Soc.Chim.Fr .，130.，405-416(1993)）は、反応条件とメタロポルフィリン自体を変えることによって、酸化生成物の量を変えることができるか、場合によっては全く異なった生成物を得ることができることを提言している。（対照的に、本発明の新規方法を適用することによって、残りの公知代謝物とさらには、継続して試験を行う上で生じ得る別の代謝物と考えられているいくつかの別の酸化生成物も製造された。）マツモトら (Matsumoto et al.,Drug．Metab．Disp., 19：768-780(1991))は、非常に狭い研究で、シトクロムＰ４５０モデルのメタロポルフィリンによるピペリジン環系の酸化を調べている。さらに、ヒルら（D,R.Hill et al.，Tetrahe dron Letters、原稿作成中）によって、エリスロマイシンの新規な酸化生成物が得られている。ただし、その生成物は、エリスロマイシンの生体代謝物ではない。従って本発明の目的は、薬理研究者に対して、医薬品候補剤の代謝物を系統的かつ有効に製造・同定する方法を提供して、多額の費用を要する医薬品開発プロセスのできるだけ早期にこれらの代謝物が許容できない毒性プロフィールを有するか否か、および／またはそれらの代謝物が持つ生物学的活性が望ましいものであるか望ましくないものであるかを決定できるようにすることにあった。本発明はさらに、医薬候補剤の酸化生成物を製造・同定する方法を提供して、その候補剤から、動物実験や生物実験を行う前に医薬品の代謝物を確認できるようにすることをも目的とするものであった。本発明のさらに別の目的は、医薬候補剤の酸化生成物（その生成物は、生物試験によって代謝物であることが確認されている場合がある）を、発見プロセスの早い段階で、代謝物についての毒理学的試験およびさらなる生物学的試験を行うことができるだけの量で多量に製造する合成方法を提供することにあった。本発明のさらに別の目的は、医薬候補剤の開発に必要な動物実験の量を低減する許容できる方途を提供することにもあった。発明の概要本願は、非常に多額の費用を要する医薬品開発プロセスのできるだけ早期に、できるだけ簡便に、医薬品の考えられる毒性および／またはその他の生物学的に活性を有する代謝物について調べるために、そのような医薬品の代謝物を系統的かつ有効に合成・同定する方法を記載し、該方法は、医薬品の各サンプルが合成メタロポルフィリン（ＳＭＰ）、ＳＭＰ酸化補助剤および溶媒の異なった組み合わせと反応するように、所定の条件下、好適な溶媒の存在下に、一連の合成メタロポルフィリンと合成メタロポルフィリン酸化補助剤の組み合わせに医薬品のサンプルを加え；得られた酸化生成物の分離・単離を行い；適切な動物モデル実験によって予め同定してある酸化生成物から代謝物の同定を行い；上記の方法によって多量に製造された実際の代謝物について毒理学的試験、病理学的試験、組織病理学的試験、機序試験または遺伝毒性試験を行って、有毒な、および／またはその他の代謝的に活性な有益もしくは有害な個々の代謝物を確認することを包含する。発明の詳細な説明本発明は、医薬候補化合物の酸化生成物の系統的製造方法に関し、該方法は、医薬化合物の各サンプルが合成メタロポルフィリン、ＳＭＰ酸化補助剤および溶媒の異なった組み合わせと反応するように、例えば塩化メチレン、アセトニトリル、アセトニトリル／水、メタノール／水、それらの緩衝水溶液等の好適な溶媒の存在下に、２４時間以下の期間にわたり、０℃から溶媒の還流温度までの温度にて、以下に定義される合成メタロポルフィリンの群のいずれかと以下に定義されるＳＭＰ酸化補助剤の群のいずれかとの一連の組み合わせと医薬候補化合物とを反応させ；得られた各酸化生成物を、ガス、液／液または固／液クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどによって分離・単離することを包含する。その酸化生成物は次に、ＮＭＲ、ＭＳ、ＩＲまたはＵＶ分光法などの分析手段によって同定することができる。次にこれらの酸化生成物を薬理研究者に提供し、薬理研究者はそれを適切な動物モデルを用いる試験で元の医薬候補化合物の実際の代謝物を確認するための予測物質として用いる。そして次に、実際の代謝物について（これらの個々の代謝物製造に対して至適化された上記方法による方法によって多量に製造されたもの）各種生物学的試験を行って、非常に多額の経費を要する医薬品開発プロセスのできるだけ早期にこれら代謝物の毒性および／またはその他の望ましいもしくは望ましくない生物学的活性を確認する。本明細書で使用される「合成メタロポルフィリン」という用語は、下記の構造（１）［式中、ＰＦＰはペルフルオロフェニルを表し、Ｍは鉄、マンガン、クロム、ルテニウム、コバルト、銅およびニッケルからなる群から選択される。］；構造（２）［式中、ＸはＣｌ、Ｂｒ、ＮＯ₂、ＣＮまたはスルホナートであり、Ｍは上記の通りである。］；あるいは構造（３）［式中、ＸおよびＭは上記の通りである。］を有するポルフィリン化合物を指す。本明細書で使用する合成メタロポルフィリンの略称としては、上記式（１）の化合物でＭが鉄のものについてペルフルオロテトラフェニルＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン；上記式（１）の化合物でＭがマンガンのものについてペルフルオロテトラフェニルＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン；上記式（２）の化合物でＸがＢｒでＭが鉄のものについてオクタクロロ−オクタブロモＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン；上記式（２）の化合物でＸがＢｒでＭがマンガンのものについてオクタクロロ− オクタブロモＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン；上記式（２）の化合物でＸがＣｌでＭが鉄のものについてオクタクロロ−オクタクロロＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン；上記式（２）の化合物でＸがＣｌでＭがマンガンのものについてオクタクロロ− オクタクロロＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン；上記式（３）の化合物でＸがＢｒでＭが鉄のものについてオクタクロロ−オクタブロモテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン；上記式（３）の化合物でＸがＢｒでＭがマンガンのものについてオクタクロロ−オクタブロモテトラスルホナートＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン；上記式（２）の化合物でＸがＣｌでＭが鉄のものについてオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン；上記式（２）の化合物でＸがＣｌでＭがマンガンのものについてオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＭｎ（ＩＩ）ポルフィリンなどがある。本発明での使用に好適な他の合成メタロポルフィリンは、電子吸引基および立体保護基による置換、例えばニトロ、シアノまたはスルホナートなどによる上記式（２）もしくは（３）の化合物のフェニル環および／またはポルフィリン環上の塩素原子の置換、あるいはカルボキシル基による上記式（２）もしくは（３）の化合物のスルホナート基の置換の結果として、有効な触媒活性を有し得るものである。一般に、これらの合成メタロポルフィリンは非常に反応性が高く、強力な酸化条件下で急速には分解せず、高い代謝回転数で触媒的酸化を行うことができる。本発明での使用が考えられる好ましい合成メタロポルフィリンは、上記式（２）または（３）を有する化合物の群から選択される化合物である。本発明での使用により好ましい合成メタロポルフィリンは、Ｍが鉄またはマンガンである式（２）または（３）の化合物であり、オクタクロロ−オクタブロモＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタブロモＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタクロロＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタクロロＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタブロモテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタブロモテトラスルホナートＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリンおよびオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＭｎ（ＩＩ）ポルフィリンを含む群から選択されるものである。合成メタロポルフィリンは、公知の方法（上記の発明の背景の項に引用の参考文献を参照）によって製造することができ、その場合、メソ−テトラキス（２，６−ジハロフェニル）−ポルフィリナート−亜鉛（ＩＩ）（「ハロ」は、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素である）などの好適な含亜鉛メタロポルフィリンを、いくつかの活性ハロゲン化剤のうちの一つと反応させ、次に所望の活性金属イオンで亜鉛原子を除去・置換する。それらはさらに、ポルフィリン環がハロゲン化された合成メタロポルフィリン製造の改良法によって製造することができ、その場合、ハロゲン化剤は、メタノール、エタノールなどの好適な極性溶媒中の、Ｃｌ₂またはＢｒ₂などの遊離ハロゲンとすることができ、反応を比較的低温で行って、所望の生成物を高収率で得るようにすることができる。そのような合成メタロポルフィリンは、より好ましくは、メソ−テトラキス（２，６−ジクロロフェニル）−ポルフィリナート−亜鉛（ＩＩ）を、０℃から室温までの温度で、メタノール、エタノールなどの好適な極性溶媒中、例えばＣｌ₂ またはＢｒ₂などの遊離ハロゲンと反応させ、次に所望の活性金属イオンで亜鉛原子を除去・置換することで製造することができる。合成メタロポルフィリンは、吸着、共有結合またはイオン結合で支持材料に付着させることができ、例えば、珪藻土に吸着させることができる。そのような吸着調製物を懸濁液の形であるいは固定化フォーマットとして（例：カラムにて）利用することができる。本願で使用する「ＳＭＰ酸化補助剤」という用語は、合成メタロポルフィリンとの使用に好適な酸化剤を指し、例えば、ヨードソベンゼン、次亜塩素酸ナトリウム、モノ過硫酸カリウム(potassium monopersulfate)、オゾンおよび過酸化物、例えば過酸化水素、ｍ−クロロ過安息香酸、クメンヒドロペルオキシドもしくはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドなどがある。好ましいＳＭＰ酸化補助剤としては、ヨードソベンゼン、次亜塩素酸ナトリウム、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドおよびモノ過硫酸カリウムからなる群から選択されるものである。酸化補助剤は好ましくは、少量ずつ徐々に反応混合物に加え、３時間後に新たな酸化剤を加えるようにする。上記の反応を行う溶媒としては、合成メタロポルフィリンおよび／または酸化補助剤と好ましくない相互作用を行わないもので、当業者には公知のいかなる溶媒であってもよい。溶媒を選択して、医薬化合物や合成メタロポルフィリンの溶解度を好ましいものとするか、あるいは生成物の回収および精製を容易にすることができる。好ましい溶媒としては、ＣＨ₂Ｃｌ₂、ＣＨ₃ＣＮ、Ｈ₂Ｏ中の２０％メタノール、Ｈ₂Ｏ中の２０％ＣＨ₃ＣＮ、または各種ｐＨレベルに緩衝された水溶液を含む群から選択されるものである。本方法の好ましい実施態様においては、合成メタロポルフィリンは、オクタクロロ−オクタブロモＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタブロモＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリンおよびオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＭｎ（ＩＩ）ポルフィリンを含む群から選択され；ＳＭＰ酸化補助剤は、ヨードソベンゼン、次亜塩素酸ナトリウム、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドおよびモノ過硫酸カリウムを含む群から選択され；溶媒は、ＣＨ₂Ｃｌ₂、Ｈ₂ Ｏ中の２０％ＣＨ₃ＣＮおよび緩衝水溶液を含む群から選択される。医薬化合物、合成メタロポルフィリン、ＳＭＰ酸化補助剤および溶媒の混合および反応は、ロボット装置などの適切な自動化手段を用いたりあるいはそれを用いずに、同時もしくは順次に行うことができる。メタロポルフィリン試薬および酸化剤の「キット」を作成して、この新規方法を簡便に使用できるようにすることもでき、それは本発明の範囲に含まれるものと考えられる。簡易かつ迅速な繰り返し実験によって反応条件を至適化して、最大数および／または最大量の代謝物または１以上の所望の代謝物を生成するような溶媒、メタロポルフィリン、酸化剤および反応条件の適切な組み合わせを確認することも本発明に含まれることは理解しておくべき点である。これにより必然的に、結果として大量化した至適方法を得て、１以上の所望の代謝物を多量に製造できるようにすることができる。上記の方法によって製造される酸化生成物が実際に試験対象の医薬品の代謝物であることを確認するのに使用するための「適切な動物モデル」には、特定の医薬品カテゴリについてヒトに類似の代謝プロセスを有する動物種を決定する上で薬理研究者には公知の方法によって確認されるものなどがある。本発明の方法は、例えば、臨床病理学的、組織病理学的、機序的もしくは遺伝毒性のプロトコルが関与する急性、亜慢性(sub-chronic)もしくは慢性試験などの毒性試験において、あるいは医薬候補剤の生物学的活性を求めたり、その有毒なもしくは代謝的に活性な代謝物を確認する上で使用される他のスクリーニングもしくはプロトコルにおいて、該方法によって製造される酸化生成物の検査と併用することができる。反応図式本願の反応の酸化生成物を、以下の図式に図示してある。図式１には、アミノピリンとその酸化生成物を図示してある。図式２には、４−アセチルアミノアンチピリン（ＡＰ−１０）の酸化を示してある。図式３には、３−ヒドロキシメチルアミノピリン（ＡＰ−５）の酸化生成物を図示してある。図式４には、リドカインとその酸化生成物を示してある。図式５には、ジメチルアニリンとその酸化生成物を示してある。図式６には、オクタクロロ−オクタハロＺｎ（ＩＩ）ポルフィリンの製造を図示してあり、その図式においては、左側のオクタクロロポルフィリンをメタノール中で塩素分子または臭素分子と反応させて、右側のオクタクロロ−オクタハロポルフィリンを得る。図式７には、ＡＢＴ−４１８の酸化生成物を示してある。図式８には、オダピパム（odapipam ）の酸化生成物を示してある。以下の実施例は本発明の特定の実施態様を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１アミノピリン代謝物遊離塩基のアミノピリン（アルドリッチ(Aldrich)）から、エーテル中ＨＣｌで処理することで、アミノピリン塩酸塩を製造した。アミノピリン６７８ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）を含むオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン（６．２ｍｇ、３．９μｍｏｌ）のＨ₂Ｏ：ＣＨ₃ＣＮ＝８０：２０（５０ｍＬ）溶液に、室温で撹拌しながら、ヨードソベンゼン（１６５０ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ；ザルツマンらの方法（Saltzman et al.，Org.Synth,, 43 : 60-61(1963)）に従って合成）を３０分ごとに少量ずつ加えた。酸化剤を最後に加えてから２時間後、溶液を５０℃で減圧下に蒸発させた。残留物をＮａ₂ ＣＯ₃水溶液２０ｍＬに溶かし、溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した（５０ｍＬで３回）。有機層をＮａ₂ＣＯ₃で脱水し、減圧下に蒸発させた。残留物について、溶離液をメタノール：塩化メチレン＝１：２５とするシリカゲルでのクロマトグラフィーを行った。溶出液から、７つの酸化生成物が得られた（図式２参照）：２，３−ジメチル−４−モノメチルアミノ− １−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−１）、４−アミノ−２，３− ジメチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−２）、４−ホルミルアミノ−２，３−ジメチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ −３）、２，３−ジメチル−４−ヒドロキシアミノ−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−４）、４−ジメチルアミノ−３−ヒドロキシメチル−２ −メチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−５）、４−ジメチルアミノ−２，３−ジメチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン−４− Ｎ−オキシド（ＡＰ−６）、ならびに４−ジメチル−２，３−ジメチル−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−７）、４−ホルミルアミノ−２−メチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−８）および４−ホルミルアミノ−３−ヒドロキシメチル−２−メチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−９）。これら生成物の収率は、以下の表１の実施例１の欄に示した通りである。ＡＰ −４、ＡＰ−７、ＡＰ−８およびＡＰ−９の化合物は新規な代謝物であるが、それ以外の化合物は、肝臓ミクロソームまたは精製シトクロムＰ−４５０によるアミノピリン酸化の公知の代謝物である。実施例２ｐＨ１でのアミノピリン酸化の別法アミノピリン２８ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を含むオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン（１ｍｇ、０．６μｍｏｌ）のアセトニトリル：ｐＨ１Ｈ₂Ｏ（０．２ＮＨＣｌで調節）＝１：４（２ｍＬ）溶液に、室温で撹拌しながら、ヨードソベンゼン（６６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を３０分かけて少量ずつ加えた。溶液を減圧下に蒸発させた。残留物を飽和Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液に溶かし、生成物を塩化メチレン１ｍＬで３回抽出した。有機層について溶離液を塩化メチレンとするシリカゲルでのクロマトグラフィーを行った。溶媒を減圧下に蒸発させ、残留物について塩化メチレン：ヘキサンから結晶化を行った。化合物ＡＰ−５を主要代謝物として得て（２２．７ｍｇ、収率７８％）、それが量的に確認された唯一の生成物であった。実施例３有機溶媒中でのアミノピリン酸化の別法遊離塩基のアミノピリン（アルドリッチ）から、エーテル中ＨＣｌで処理することで、アミノピリン塩酸塩を製造した。アミノピリン塩酸塩３０ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）を含むオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン（１ｍｇ、０．６μｍｏｌ）のメタノール：ＣＨ₃ＣＮ＝１：２０（２ｍＬ）溶液に、室温で撹拌しながら、ヨードソベンゼン（６６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を３０分かけて少量ずつ加えた。酸化剤を最後に加えてから１０分間反応液を攪拌し、その溶液を減圧下に蒸発させた。残留物について、溶離液を塩化メチレン：ヘキサン＝５：１とするアルミナでのクロマトグラフィーを行ったところ、化合物ＡＰ−７が収率１６％で単離された。実施例４４−アミノ−２，３−ジメチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−２）の２，３−ジメチル−４−ヒドロキシアミノ−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−３）への選択的酸化ｐＨ７のリン酸緩衝液４ｍＬに、４−アミノアンチピリン（０．１２ｍｍｏｌ、アルドリッチ）およびオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン（０．６μｍｏｌ）とを溶かし、冷却して０℃とした。これに、ヨードソベンゼン（６６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を少量ずつ１０分間かけて加えた。反応液を４時間攪拌し、塩化メチレン２ｍＬで３回抽出し、Ｎａ₂ＣＯ₃で脱水した。有機層について、塩化メチレンを溶離液とするシリカゲルでのクロマトグラフィーを行って、２，３−ジメチル−４−ヒドロキシアミノ−１−フェニル −３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ−３）を収率３０％で得た。実施例５４−アセチルアミノアンチピリン（ＡＰ−８）の選択的酸化４−アセチルアミノアンチピリン（１２０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）およびオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン（１５ｍｇ、０．９５μｍｏｌ）の溶液を５℃に維持し、それにクメンヒドロペルオキシド（１５０ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、混合物を室温で３時間経過させた。Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液で混合物を弱塩基性とし、生成物を塩化メチレン５ｍＬで３回抽出した。有機抽出層をＮａ₂ＣＯ₃で脱水し、減圧下に蒸発させた。残留物について、塩化メチレン：ヘキサン＝１：１を溶離液とする塩基性アルミナでのクロマトグラフィーを行った。カラムから溶出する最後の生成物帯を含む分画を集め、減圧下に蒸発させた。残留物について塩化メチレン：ヘキサンから結晶化を行って、化合物ＡＰ−９（図式３を参照）を収率３２％で得た。実施例６３−ヒドロキシメチルアミノピリン（ＡＰ−５）の選択的酸化上記実施例２の手順に従い、そのアミノピリンを４−ジメチルアミノ−３−ヒドロキシメチル−２−メチル−１−フェニル−３−ピラゾリン−５−オン（ＡＰ −５）に代えた。５℃で２時間反応させた後、混合物を０．１ＮＮａＯＨで中和した。生成物を塩化メチレン５ｍＬで３回抽出した。有機抽出層をＮａ₂ＣＯ₃ で脱水し、減圧下に蒸発させた。残留物について、塩化メチレンを溶離液とする中性アルミナでのクロマトグラフィーを行って、３−ホルミル誘導体（ＡＰ−１０、図式４）を収率４５％で得た。実施例７リドカインの酸化オクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン６ｍｇ（３．８μｍｏｌ）およびリドカイン７１４（３ｍｍｏｌ、アルドリッチ）をアセトニトリル：ｐＨ７のリン酸緩衝液＝１：２の液に溶かした。この溶液に、ヨードソベンゼン１．７ｇ（８ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温で４時間攪拌した。溶液を塩化メチレン５ｍＬで３回抽出した。有機抽出層をＭｇＳＯ₄で脱水し、減圧下に蒸発させた。残留物について、塩化メチレン：ヘキサン＝１：１を溶離液とする中性アルミナでのクロマトグラフィーを行った。６個の代謝物が得られた（図式５参照）：ω−（エチルアミノ）−２，６−ジメチルアセトアニリド（Ｌ−１）３４％、 ω−アミノ−２，６−ジメチルアセトアニリド（Ｌ−２）６％、ω−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシメチル−６−メチルアセトアニリド（Ｌ−３）４％およびリドカインＮ−オキシド（Ｌ−４）１５％、ならびに少量の環状代謝物、１−エチル−２−メチル−３−（２，６−ジメチルフェニル）イミダゾリン−４−オン（Ｌ−８）２％および２−メチル−３−（２，６−ジメチルフェニル）−イミダゾリン−４−オン（Ｌ−９）３％。実施例８有機溶媒中でのリドカインの酸化リドカインＨＣｌ（０．１５ｍｍｏｌ）およびオクタクロロ −オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン（０．５μｍｏｌ）のメタノール：アセトニトリル＝１：２０溶液（２ｍＬ）に、０℃で３０分かけてヨードソベンゼン（０．３ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。５時間後、溶液を２０℃で減圧下に蒸発させた。残留物について、ベンゼンを溶離液とする中性アルミナでのクロマトグラフィーを行った。主要生成物としてＬ−１およびＬ−２を得て、少量生成物としてＬ−８を得た。リドカインの代謝物であることがこれまで報告されていなかった化合物には、３−ヒドロキシ−ω−ジエチルアミノ− ２，６−ジメチルアセトアニリド（Ｌ−５）１３％ならびに４−ヒドロキシ−ω −ジエチルアミノ−２，６−ジメチルアセトアニリド（Ｌ−６）２％、２−ヒドロキシメチル−ω−ジエチルアミノ−２，６−ジメチルアセトアニリド（Ｌ−７）２％と少量のＬ−４およびＬ−９（いずれも既知化合物）などがある。実施例９２，６−ジメチルアニリンの酸化上記実施例８のリドカインを２，６−ジメチルアニリン（Ｌ−７、図式６参照）に代えて、実施例８を繰り返した。単離された酸化生成物は、２，６−ジメチルフェニルヒドロキシアミン（Ｌ−７）１２％、４−ヒドロキシ−２，６−ジメチルアニリン（Ｌ−８）５％および２，６− ジメチルベンゾキノン（Ｌ−９）２％であった。実施例１０オクタクロロ−オクタブロモポルフィリナート−鉄（ＩＩＩ）の製造１０ａ．オクタクロロポルフィリナート−亜鉛（ＩＩ）還流冷却器および乾燥管を取り付けた１リットルの三頸フラスコ中で、２，６ −ジクロロベンズアルデヒド（１００ｇ、０．５７ｍｏｌ）、無水酢酸亜鉛（３０ｇ）および２，６−ルチジン（３００ｍＬ）を加熱した。温度が１００℃に達した時点で、ピロール（４０ｍＬ、０．５７ｍｏｌ）を１０分以内で滴下し、反応混合物を１６時間還流した。溶媒を減圧下に除去し、残留物をトルエン（４００ｍＬ）を用いて磨砕した。メタノール（１００ｍＬ）を加え、混合物を１６時間５℃に保った。沈殿物を濾過によって回収し、クロロホルム５００ｍＬに溶かし、それにトリフルオロ酢酸５０ｍＬを加えた。混合物を窒素下に室温で１６時間攪拌した。水（２５０ｍＬ）を加え、混合物を１０分間激しく攪拌した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ₃および水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水した。ｐ−クロラニル１０ｇを加え、混合物をＮ₂下に２時間還流した。混合物を１６時間室温に保持し、再度加熱還流し、アルミナのカラムに通して不純物を除去した。溶液を濃縮して容量２００ｍＬとし、メタノール２００ｍＬを加えた。クロロホルムを減圧下に溶媒から除去し、得られた懸濁液を濾過した。そのポルフィリン（２７ｇ）をＤＭＦ５００ｍＬに溶かし、固体の酢酸亜鉛を加え、混合物を３０分間還流した。得られた沈殿物を回収し、水およびメタノールで洗浄し、脱水して、標題化合物７．２６ｇを紫色固体として得た。ＵＶ／ｖｉｓ吸収（ＣＨ₂Ｃｌ₂）、ｎｍ（相対強度）：６２７．０（０．９１）、５８４．５（１．７１）、５５０．０（１２．０８）、５１３．０（１．８２）、４８６．５（１．４９）、４２０．０（１００．０）、３９９．０（２３．１）。ＭＳｍ／ｚ：１５８５（Ｍ＋Ｈ）⁺。１０ｂ．オクタクロロポルフィリナート−亜鉛（ＩＩ）の別の大規模製造還流冷却器および乾燥管を取り付けた１２リットルの四頸フラスコ中、２，６ −ジクロロベンズアルデヒド（７５０ｇ、４．２９ｍｏｌ）、無水酢酸亜鉛（５８０ｇ）および２，６−ルチジン（５．０リットル）を加熱した。温度が９０〜１００℃に達した時点で、ピロール（６００ｍＬ、４．２９ｍｏｌ）を１０分以内でゆっくり加え、反応混合物を１８時間還流した。溶媒を減圧下に除去し、残留物をトルエン（６リットル）を用いて磨砕した。メタノール（５００ｍＬ）を加え、混合物を１６時間５℃に保持した。沈殿物を濾過によって回収し、メタノールで洗浄し、減圧乾燥した。乾燥化合物を熱クロロホルム６リットル中に懸濁し、メタノール６．０リットルを加えた。溶媒を減圧下にゆっくり蒸発させてクロロホルムを除去し、得られた紫色沈殿物を濾過によって回収し、メタノール、水およびペンタンで洗浄し、減圧乾燥して、標題化合物３５７ｇを得た。この粗生成物のサンプル３０ｇをクロロホルム１．５リットルに溶かし、トリフルオロ酢酸１５０ｍＬをゆっくり加えた。混合物をＮ₂下に室温で１６時間攪拌した。水（１．５リットル）を加え、混合物を１０分間激しく攪拌した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ₃および水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄ で脱水し、丸底フラスコに移し、ｐ−クロラニル３０ｇを加え、混合物をＮ₂下に３時間還流した。その熱溶液をアルミナのカラムに通し、カラムは熱クロロホルムで洗浄した。溶液を濃縮して容量２００ｍＬとし、メタノール２００ｍＬを加えた。クロロホルムを減圧下に除去し、得られた懸濁液を濾過して、ポルフィリン７．９８ｇを得た。そのポルフィリンをＤＭＦ７５０ｍＬに溶かし、固体の酢酸亜鉛（２０ｇ）を加え、混合物を２時間還流した。溶液を冷却し、ＤＭＦ５５０ｍＬを減圧下に留去し、水２００ｍＬを加えた。得られた沈殿物を回収し、水およびメタノールで洗浄し、乾燥して、標題化合物９．１３ｇを紫色固体として得た。１０ｃ．オクタクロロ−オクタブロモポルフィリナート−亜鉛（ＩＩ）オクタクロロ亜鉛ポルフィリン化合物（上記の段階１１ａまたは１１ｂから）のサンプル０．５ｇ（０．５２５ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍＬに溶かし、臭素（０．２７ｍＬ、５．２５ｍｍｏｌ）で処理した。得られた混合物を１時間加熱還流した。混合物を乾燥させ、残留物について、ＣＨＣｌ₃を溶離液とするアルミナ（中性、ブロックマン（Brockmann）１型）でのクロマトグラフィーを行った。暗緑色の生成物帯を集め、溶媒を減圧下に除去して、標題化合物を緑色固体として得た（０．３３２ｇ、３９％）。ＵＶ／ｖｉｓ吸収（ＣＨ₂Ｃｌ₂）、ｎｍ（相対強度）：５９４（７．４９）、４６２（１００）、３７１（１４．１５）。１０ｄ．オクタクロロ−オクタブロモポルフィリナート−鉄（ＩＩＩ）コバヤシらの方法（Kobayashi et al.，Bull.Chem.Soc.Japan, 48 : 3137(197 5)）により、段階１１ｃの化合物をヘミンメタロポルフィリンに変換した。実施例１１オクタクロロ−オクタブロモポルフィリネート−鉄（ＩＩＩ）の別途製造１１ａ．オクタクロロ−オクタブロモポルフィリナート−亜鉛（ＩＩ）メソ−テトラキス−（２，６−ジクロロフェニル）ポルフィリナート−亜鉛（ＩＩ）のサンプル（段階１０ａまたは１０ｂからのもの、０．５ｇ、０．５２５ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍＬに溶かし、臭素（０．２７ｍＬ、５．２５ｍｍｏｌ）で処理した。得られた混合物を室温で１．５時間攪拌し、１６時間４℃に保持した。沈殿物を濾過によって回収し、少量のメタノールで洗浄して、標題生成物０．２６８ｇ（収率６５％）を得た。ＵＶ−ｖｉｓ吸収（ＣＨ₂Ｃｌ₂）、ｎｍ（相対強度）：５９４（７．０）、４６３（１００）、３６８．５（１１．５）。ＭＳＭ／Ｚ（ｍ＋Ｈ）⁺：１５８５。１１ｂ．オクタクロロ−オクタブロモポルフィリナート−鉄（ＩＩＩ）コバヤシらの方法（Kobayashi et al.，Bull.Chem.Soc.Japan, 48 : 3137(197 5)）により、段階１１ａからの化合物をヘミンメタロポルフィリンに変換した。実施例１２オクタクロロ−オクタクロロポルフィリネート−鉄（ＩＩＩ）の製造１２ａ．オクタクロロ−オクタクロロポルフィリナート−亜鉛（ＩＩ）メソ−テトラキス−（２，６−ジクロロフェニル）ポルフィリナート−亜鉛（ＩＩ）のサンプル（段階１０ａまたは１０ｂからのもの、０．２５０ｇ、０．２６２ｍｍｏｌ）をメタノール５０ｍＬに懸濁させ、混合物を氷浴で冷却して０℃ とした。温度が５℃以下に保たれるような速度で混合物に塩素ガスを吹き込んだ。１５〜２０分後、反応混合物の色が紫から緑に変わり、出発物質はもはや存在しなかった。溶媒および未反応の塩素を減圧下に除去して、紫色固体を得た（０．２８３ｇ、収率８８％）。ＵＶ−ｖｉｓ吸収（ＣＨ₂Ｃｌ₂）、ｎｍ（相対強度）：４３６．０（１００）、４８５．０（５０）、５２３．０（９．５）、５７５．０（９．５）、６２５．０（９．３）。ＭＳＭ／Ｚ（相対強度）：１３３８（２５）、１３０５（４５）、１２６６（５０）、１２３０（１００）、１１９５（６０）、１１６０（５５）。１２ｂ．オクタクロロ−オクタクロロポルフィリナート−鉄（ＩＩＩ）コバヤシらの方法（Kobayashi et al.，Bull.Chem.Soc.Japan, 48 : 3137(197 5)）により、段階１２ａからの化合物をヘミンメタロポルフィリンに変換した。実施例１３有機溶媒中でのＡＢＴ−４１８の酸化ＡＢＴ−４１８（０．５０６ｍｇ）を塩化メチレン１０ｍＬに溶かし、オクタクロロ−オクタブロモＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン（０．５μｍｏｌ）を加えた。混合物を激しく攪拌し、ヨードソベンゼン０．５１１ｍｇを少量ずつ加えた。５時間後、溶液を２０℃で減圧下に蒸発させ、残留物を塩化メチレン１０ｍＬに再度溶かした。溶液をＨＰＬＣで分析し、代謝物の既知サンプルと比較して生成物を同定した（参照：サリバン（Sullivan）らの報告（原稿作成中））。実施例１４水系でのＡＢＴ−４１８の酸化ＡＢＴ−４１８（０．４９８ｇ）をアセトニトリル：水＝４：１溶液１０ｍＬに溶かした。この溶液に、オクタクロロ−オクタブロモ−テトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン８ｍｇと、次に次亜塩素酸ナトリウム水溶液２ｍＬを加えた。反応液を８時間攪拌した後、層分離した。各層をＨＰＬＣで調べて、代謝物の既知サンプルと比較して生成物を同定した。実施例１５オダピパムの酸化オダピパム（１０μｍｏｌ）を塩化メチレン１ｍＬに溶かし、ペンタフルオロＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン１μｍｏｌおよびヨードソベンゼン４０μｍｏｌを加えた。反応が完結した後、生成物をＨＰＬＣによって分離し、質量分光法(mas s spectroscopy)によって同定した（参照：オーボイルらの報告（O′Boyle et al. ，Pharmac.Therap., 43 : 1,（1989）））。実施例１６アミノピリンの系統的酸化それぞれアミノピリン５０ｍｇが入ったフラスコ２７個を準備し、そのフラスコに、下記の表４ａ〜４ｃに従って、溶媒、合成メタロポルフィリンおよび酸化剤を入れた（下記の略称参照）。内容物を室温で４時間混和し、溶媒を減圧下に除去した。残留物を塩化メチレンに取り、生成物をＨＰＬＣ、質量分光法、ＮＭＲ分光法および元素分析によって同定した。以下の表４ａ〜４ｃで使用の略称：Ａ＝塩化メチレン；Ｂ＝水中の２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル；Ｃ＝ｐＨ６のリン酸緩衝液；Ｄ＝オクタクロロ−オクタブロモＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン；Ｅ＝オクタクロロ−オクタブロモＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン；Ｆ＝オクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン；Ｇ＝オクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン；Ｈ＝ヨードソベンゼン；Ｉ＝次亜塩素酸ナトリウム；Ｊ＝ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド；およびＫ＝モノ過硫酸カリウム。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ドルフイン，デイビツド・エイチカナダ国、ブリテイツシユ・コロンビア・ブイ・６・アール・２・アール・２、バンクーバー、ウエスト・トウエルフス・アベニユー・4464 (72)発明者ヒル，デイビツド・アールアメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガーニー、ジヨージ・コート・5312、アパートメント・イー (72)発明者ヒノ，フミオ東京都世田谷区野沢１−35−23 (72)発明者リー，エレイン・シーアメリカ合衆国、イリノイ・60090、ホイーリング、ブルツクベイル・ドライブ・ 755−ビー

Claims

【特許請求の範囲】１．医薬候補化合物の酸化生成物の系統的製造方法であって、医薬化合物の各サンプルが合成メタロポルフィリン、ＳＭＰ酸化補助剤および溶媒の異なった組み合わせと反応するように、好適な溶媒の存在下に、２４時間以下の期間にわたり、０℃から溶媒の還流温度までの温度にて、選択された合成メタロポルフィリンと選択されたＳＭＰ酸化補助剤との一連の組み合わせと前記医薬候補化合物のサンプルとを反応させ、次に、得られた酸化生成物を分離および単離することを包含する方法。２．前記の選択された合成メタロポルフィリンが、オクタクロロ−オクタブロモＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタブロモＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタクロロＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタクロロＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタブロモテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタブロモテトラスルホナートＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−テトラニトロＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−テトラニトロＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタシアノＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリンおよびオクタクロロ −オクタシアノＭｎ（ＩＩ）ポルフィリンからなる群からのものである請求項１に記載の方法。３．前記の選択されたＳＭＰ酸化補助剤が、ヨードソベンゼン、次亜塩素酸ナトリウム、モノ過硫酸カリウム、オゾン、過酸化水素、ｍ−クロロ過安息香酸、クメンヒドロペルオキシドおよびｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドからなる群からのものである請求項１に記載の方法。４．前記溶媒が、ＣＨ₂Ｃｌ₂、ＣＨ₃ＣＮ、Ｈ₂Ｏ中の２０％メタノール、Ｈ₂ Ｏ中の２０％ＣＨ₃ＣＮおよびそれらの緩衝水溶液からなる群から選択されるものである請求項１に記載の方法。５．合成メタロポルフィリンが、オクタクロロ−オクタブロモＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタブロモＭｎ（ＩＩ）ポルフィリン、オクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＦｅ（ＩＩＩ）ポルフィリンおよびオクタクロロ−オクタクロロテトラスルホナートＭｎ（ＩＩ）ポルフィリンからなる群から選択され；ＳＭＰ酸化補助剤が、ヨードソベンゼン、次亜塩素酸ナトリウム、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドおよびモノ過硫酸カリウムからなる群から選択され；溶媒が、ＣＨ₂Ｃｌ₂、Ｈ₂Ｏ中の２０％ＣＨ₃ＣＮおよびそれらの緩衝水溶液からなる群から選択される請求項１に記載の方法。６．医薬品代謝物の製造、同定およびさらなる試験の方法において、請求項１に記載の方法に従って医薬品の酸化生成物を系統的に製造する段階；次に該酸化生成物を規準として用いて適切な動物モデル試験における前記代謝物を同定する段階；それらの代謝物を毒理学的試験、病理学的試験、組織病理学的試験、機序試験または遺伝毒性試験でさらにテストして、前記医薬品の有毒な、又はその他の生物学的に活性な代謝物を同定する段階を包含する方法。