JPH10507443A

JPH10507443A - 一酸化窒素の合成を刺激する方法及び製剤

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Publication number: JPH10507443A
Application number: JP8512652A
Authority: JP
Inventors: カエセマイアー，ダブリュー，エイチ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1995-10-05
Publication date: 1998-07-21
Also published as: EP0784429A1; MX9702527A; DK0784429T3; ES2236716T3; DE69533940T2; PT784429E; EP1552745B1; EP0784429A4; AU3889695A; DE69535734D1; WO1996010910A1; ATE388700T1; US5543430A; EP0784429B1; CA2201784A1; ATE287212T1; US5767160A; EP1552745A1; AU705002B2; CA2201784C

Abstract

(57)【要約】この発明は、血管収縮に関連する疾患の治療に用いるＬ−アルギニンと一酸化窒素シンターゼの作用物質（即ちニトログリセリン）との混合薬を含有する治療混合薬を開示し、これにより一酸化窒素シンターゼ（ｃＮＯＳ）の構成形態を刺激して固有一酸化窒素（ＮＯ）を生産することにより血管収縮を緩和する。Ｌ−アルギニンの独立の経路により生産された外因性ＮＯと比較すると、固有ＮＯは臨床の終端及び死亡率を減少する能力に関し優れた有益な効果を有する。

Description

【発明の詳細な説明】一酸化窒素の合成を刺激する方法及び製剤発明の背景この発明は、概括的に、非高血圧性の心血管・脳血管・腎血管（cardiocerebr orenovascular）の疾患のみならず、高血圧性の心血管・脳血管・腎血管の疾患の治療方法並びにこれらの疾患及びその症状の治療に使用できる画期的な製剤に関連し、この治療方法では、内因性生物学的一酸化窒素源（Ｌ−アルギニン）と一酸化窒素シンターゼ（Nitric Oxide Synthase，ＮＯＳ）の刺激薬（特にニトログリセリン）とを投与に先立って混合しニトログリセリン耐性の治療に役立つ混合薬が形成される。関連技術の説明ここ数十年、心血管の疾患の治療においてニトログリセリンは血管拡張剤（va sodilating agent）として人間に投与されている。ニトログリセリン又はグリセリルトリニトレート（glyceryl trinitrate）は有機硝酸エステルであり、患者に投与すると薬理学的活性を有する代謝産物の一酸化窒素（ＮＯ）に生物学的に変換される。例えば、ＮＯは、血管緊張低下（vasorelaxation）の結果発生するサイクリックグアニジン一リン酸塩（cyclic guanidine monophosphate，ｃＧＭＰ）を順に増加する血管平滑筋細胞中の可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化し（ウォールドマン［Waldman］他、１９８７年、「サイクリックＧＭＰの合成及び機能」、薬理学レビュー、３９、１６３）、最終的に血管拡張（vasodilation ）及び血圧低下の原因となる。しかしながら、ニトログリセリンの有益な効果に対して治療のためニトログリセリンを投与される受容者の耐性が急速に増大するため、ニトログリセリンの有効性は大幅に低下する。従って、投薬量を増加しても血管緊張低下又は血管拡張に殆ど又は何らの効果も生じないため、ニトログリセリン耐性の増大はニトログリセリン治療の価値を著しく制限する（ボゲルト，エム［Bogaert，M.］、１９９１年、「ニトロ血管拡張薬（nitrovasodilators）に対する耐性の臨床学的関連性」、心血管薬理学会誌［J．Cardiovas．Pharmaco l］、１７（追補３）、Ｓ３１３、及び、ウンガ，ピー［Unger，P.］他、１９９１年、「静脈内の硝酸塩の耐性」、心血管薬理学会誌、１７（追補３）、Ｓ３００）。ニトログリセリン耐性の正確な生体機構は知られていない。耐性の説明に関し以下の理論がある。ニトログリセリンの活性一酸化窒素への直接生体内変化に必要なスルフヒドリル（−ＳＨ）のプールは、過剰のニトログリセリン基質によって劣化する（ベスガールド，エス［Boesgaard，S.］他、１９９１年、「硝酸塩の耐性：ラットの生体（in vivo）内での長期ニトログリセリン注入におけるチオール追加の効果」、治療実験薬理学会誌［J．Pharmacol．Exp．Ther.］、２５８、８５１）。血管のグアニル酸シクラーゼの活性はニトログリセリンによって低下する（ヘンリー，ピー・ジェイ［Henry P．J.］他、１８９８年、「血管拡張薬としてのＳ−ニトロソチオール：一酸化窒素含有血管拡張薬に対する耐性との関連性」、薬理学会報［Br．J．Pharmacol］、９８、７５７）。また、ニトログリセリンに対する耐性に対し、ｃＧＭＰの劣化速度が増加しうる（アクセルソン，ケイ・エル［Axelsson，K．L.］他、１９８７年、「生化学的見地からの硝酸塩の耐性」、医薬、３３、６３）。また、近年、一酸化窒素は血管内皮のアルギニンからの通常の代謝産物として酵素的に形成され、内皮由来弛緩因子（endothelium-derived relaxing factor, ＥＤＲＦ）を形成する重要な構成要素を供給することが判明している。更に、マクロファージ及びニューロンは、それらの分子の死滅及び／又は細胞増殖抑制機能の構成要素として、基体内で一酸化窒素を生産することも判明している。更に最近では、ＮＯＳと呼ばれる種類の酵素がＬ−アルギニンから一酸化窒素を生成し、生成された一酸化窒素は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（guanylate cyclase）の緩和及び活性化に依存する内皮、中枢神経系及び末梢神経系の神経伝達及び活性化マクロファージ細胞毒性（Cytotoxicity）に影響することが立証されている（セサ，ウィリアム・シー［Sessa，William C.］、１９９４年、「タンパク質の一酸化窒素シンターゼ群」、レビュー、１３１〜１４３）。一酸化窒素シンターゼには、構成品種（ｃＮＯＳ）及び誘導品種（ｉＮＯＳ）を含む多数の明確な異性体（isoform）がある。構成品種（形態）は通常の内皮細胞、ニューロン及び他の組織内に存在する。内皮細胞（セル）中の構成品種による一酸化窒素の形成は、平常の血圧の規制に重要な役割を果たすと考えられる。一酸化窒素シンターゼの誘導品種（形態）は活性化マクロファージ中に存在し、例えば血管の平滑筋細胞において種々のサイトカイン（cytokines）及び／又は微生物生産物により誘導されることが判明している。敗血症（sepsis）又はサイトカインにより誘発される衝撃において、一酸化窒素シンターゼの誘導品種による一酸化窒素の過剰生産が生命をおびやかす低血圧に対し重要な役割を果たすと考えられる。前記のように、Ｌ−アルギニンの一酸化窒素への変換はＮＯＳによって酵素触媒作用を受け、結果的に副産物としてＬ−シトルリン（L-citrulline）を生ずる。前記の通り、先に内皮について説明したが、以下多数の細胞型についてＮＯＳ活性を説明する。脳、内皮及びマクロファージ異性体は、約５０％アミノ酸アイデンティティを有する生産物又は異なる遺伝子と考えられる。脳内ＮＯＳと内皮内ＮＯＳとは極めて類似した性質を有するが、主として脳内ＮＯＳが細胞質ゾル（cytosolic）である一方、内皮内酵素は大部分は膜付随性タンパク質である点で両者は相違する。脳及び内皮に存在する優れたシンターゼである一酸化窒素シンターゼ（ｃＮＯＳ）の構成品種は、機能的に基礎的条件下で活性を有し、更にレセプタに媒介される作用物質（agonists）又はカルシウムイオノホア（calcium ionophore）に応答して発生する細胞内のカルシウムの増加により刺激される。ｃＮＯＳは酵素の「生理学的」形態と考えられ、生物学的過程の多様な群において役割を果たす。試験管内（In vitro）での研究の結果、一酸化窒素シンターゼの活性は一酸化窒素自体による負フィードバック法で規制できることを示している。心血管・脳血管・腎血管の循環において、構成品種的に生産された一酸化窒素の主要なターゲットは、血管の平滑筋、心筋（ミオサイト）及び冠状血管の平滑筋に存在する可溶性グアニル酸シクラーゼである。通常の基質が存在する場合、一酸化窒素は一酸化窒素シンターゼにより優先的に生産される。しかしながら、Ｌ−アルギニンが存在しない場合、脳内一酸化窒素シンターゼはフリーラジカル、超酸化物及び過酸化水素を生成すると考えられる。この一酸化窒素シンターゼの性質は、神経毒性及び虚血等の病態生理学的条件の潜在的な主要関連性を有する。酵素の構成品種とは対照的に、誘導品種即ちカルシウム独立形態は初めにマクロファージで説明されるに過ぎなかった。現在では、多くの他の細胞型において一定の刺激に応答して一酸化窒素シンターゼが誘導されることが知られている。このため、通常、例えば心筋（myocardium）の細胞等のみならず血管の平滑筋細胞等は、一酸化窒素シンターゼの構成品種を示さず（レバイン，ビー［Levine， B.］他、１９９０年、「深刻な慢性心機能不全において高レベルで推移する腫瘍壊死因子（Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure）」、新英国医学会誌［N Engl J med.］、３２３、２３６〜２４１）、構成異性体（constitutive isoform）の考えられるレベルを示す。ｉＮＯＳが基礎的条件下で示す活性はごくわずかであるが、例えばリポポリサッカリド（lipopolysaccharide）及びあるサイトカイン等のファクタに反応する場合には一定時間にわたり活性を示す。酵素の誘導品種は構成品種に比べ極めて多量のＮＯを生産し、ｉＮＯＳによって生産された高濃度のＮＯは細胞に有毒であるため、誘導ＮＯＳは酵素の「病態生理学的（pathophysiological）」形態であると考えられる。ｉＮＯＳの誘導はグルココルチコイド（glucocorticoids）及びサイトカインにより阻止できる。ｉＮＯＳの転写後規制（posttranscriptio nal regulation）は殆ど知られていない。ＮＯの細胞毒性効果は、大部分がグアニル酸シクラーゼ及びサイクリックＧＭＰ形成から独立していると考えられる。領域内の研究の大部分は、Ｌ−アルギニンの種々の誘導品種（derivatives）を使用するｉＮＯＳ刺激の抑制薬に集中している。しかしながら、ｃＮＯＳの刺激及びニトログリセリン耐性に対するその効果に関しては殆ど研究されていない。現在まで、長期化するニトログリセリンの投与の有益な効果を維持するためにニトログリセリンの耐性又は抵抗の最低限を超える生理学的なＮＯ生産を刺激する効果的な方法がないので、ニトログリセリン耐性は健康管理社会を失望させ続けている。非高血圧性の心血管・脳血管・腎血管の疾患及び症状のみならず、高血圧性の心血管・脳血管・腎血管の疾患及び症状の効果的な治療方法がニトログリセリンの抵抗−耐性の最低限を克服するため技術的に必要とされる。発明の概要本明細書中の用語「患者（subject）」は、人間を含むあらゆる哺乳類を意味し、患者の生体内でアルギニンから一酸化窒素が形成される。ここで患者について使用する方法は、既存の条件での療法による治療のための使用と同様に疾患予防に対する使用も想定している。本明細書中で使用する用語「固有ＮＯ（native NO）」は、Ｌ−アルギニンの生体内変化又はＬ−アルギニン依存経路によって生産される一酸化窒素を意味する。本明細書中で使用する用語「終端（endpoint s）」は、心血管の疾患の治療過程で遭遇する臨床の出来事、即ち死（死亡率）を含む。この発明の目的は、ニトログリセリンに対する薬理学的耐性を治療することにある。この発明の他の目的は、Ｌ−アルギニンの内因性一酸化窒素又は「固有」一酸化窒素への生体内変化による疾患条件を予防、治療、抑制又は改善する方法を提供することにある。この発明の他の目的は、結合された動脈及び静脈拡張の効果を有する製剤を提供することにある。この発明の他の目的は、頻脈（tachycardia）を改善又は回避すると共に、虚血（ischemia）を予防又は治療することにある。この発明の他の目的は、「固有」一酸化窒素を生産するニトログリセリンの能力を増加又は最大化することにより、Ｌ−アルギニンとニトログリセリンとを予混合してニトログリセリン耐性を治療するための相乗効果を発揮させ、死亡率を含む臨床の終端を低減することにある。この発明の他の目的は、血液流が突然回復した患者における再灌流損傷（repe rfusion injury）を予防することにある。この発明の他の目的は、Ｌ−アルギニンの薬要求量及び薬量の過剰供給に対応する有害な結果を低減するため形成された結合薬又は混合薬を使用することにある。この発明の更なる目的は、高血圧症（hypertension）、高血圧性心臓病（hype rtensive heart disease）；アンギーナ（angina）、心筋梗塞（myocardial inf arction）及び突然死を含む冠状血管性心臓病（coronary heart disease）；広範囲の心血管の疾患（心不全、脈拍及び末梢血管の疾患）及び腎血管（renovascul ar）の虚血／高血圧症の治療のために、ニトログリセリンとＬ−アルギニンとの混合薬を提供することにある。この発明の前記及び他の目的は、以下説明する１又は２以上の実施の形態により達成される。この発明の一実施形態では、患者への投与に先立ち、治療に効果的な量のＬ− アルギニン及びｃＮＯＳ作用物質が混合される。この発明の他の実施形態では、投与に先立ち、生理学的に受容できるｐＨで治療に効果的な量のＬ−アルギニン及びニトログリセリンが結合される。他の実施形態は血管拡張又は血管緊張低下により患者の高血圧症を治療する方法であり、高血圧症の患者を選択する過程と、前記患者に静脈の拡張薬（venous dilator）と動脈の拡張薬（arterial dilator）との混合薬を含む反高血圧製剤を投与する過程と、患者の周期的な血圧を測定する過程と、望ましい血圧又は治療の効果が患者に現れるまで製剤の投与を継続する過程とを含む。高血圧症の患者の望ましい血圧は最終的には以下の範囲内である：収縮期（systolic）では、好ましくは９５〜１８０mmHgの範囲、より好ましくは１０５〜１６５mmHgの範囲、更に好ましくは１２０〜１４０mmHgの範囲；弛緩期（diastolic）では、好ましくは５５〜１１５mmHgの範囲、より好ましくは６５〜１００mmHgの範囲、更に好ましくは７０〜９０mmHgの範囲、そして最も好ましくは７５〜８５mmHgの範囲である。収縮期はいかなる場合も９５mmHg以下となってはならない。他の実施形態は血管拡張又は血管緊張低下により高血圧症でない患者の心血管の疾患を予防又は治療する方法であり、患者を選択する過程と、非内皮依存及び内皮依存一酸化窒素源を結合した静脈の拡張薬（即ちニトログリセリン）と、内皮依存一酸化窒素源である動脈の拡張薬（Ｌ−アルギニン）との混合薬を含む製剤を前記患者に投与する過程と、患者の周期的な血管緊張低下を測定する過程と、望ましい血管緊張低下の状態又は望ましい治療の効果が患者に現れるまで製剤の投与を継続する過程とを含む。血管緊張低下の望ましい状態は、例えば収縮期では約２０mmHg低下し、弛緩期では約１０mmHg低下する。収縮期はいかなる場合も９５mmHg以下となってはならない。更に他の実施形態は血管拡張により患者の高血圧症を治療する方法であり、高血圧症の患者を選択する過程と、前記患者にＬ−アルギニンとニトログリセリンとの混合薬を含む反高血圧製剤を投与する過程と、患者の周期的な血圧を測定する過程と、患者が望ましい血圧になるまで反高血圧製剤の投与を継続する過程とを含む。更に他の実施形態は患者のｃＮＯＳを刺激する方法であり、患者を選択する過程と、耐性を治療しかつ死亡率を含む終端を減少するため「固有」ＮＯ生産を最大化するよう前記患者にＬ−アルギニンとニトログリセリンとの混合薬を含む製剤を投与する過程とを含む。図面の簡単な説明図１Ａ及び図１Ｂは、Ｌ−アルギニン依存経路及び独立経路を示す一酸化窒素生産の概要図である。図２は、ラットの大動脈（rat aorta）に併用投与したＬ−アルギニン及びニトログリセリンのｃＮＯＳ刺激効果を示す棒グラフである。図３は、ラットの大動脈に併用投与したＬ−アルギニン及びＳＮＰのｃＮＯＳ刺激効果の欠如を示す棒グラフである。図４は、本明細書で説明する製剤投与の間の頻脈（tachycardia）の欠如を示す人間の薬量実験の結果である。好適な実施形態の詳細な説明投与に先立ちＬ−アルギニンをニトログリセリンと併用すると、単独でニトログリセリンを投与する場合の通常の抵抗又は耐性レベルを改善できることが判明した。ＮＯＳはニトログリセリンによって刺激され、ニトログリセリンをＬ−アルギニンと予め混合するとニトログリセリンとＬ−アルギニンとの間の複合又は統合製剤による有益な相乗効果を奏すると考えられる。過剰のＬ−アルギニンは、Ｌ−アルギニンの一酸化窒素への生体内変化において触媒作用を果たす刺激された一酸化窒素シンターゼのための付加的基質となる。過剰のＬ−アルギニンの存在下でのＮＯＳの刺激は、ＮＯ生産によって明らかに影響を受けるあらゆる疾患又は条件を予防、治療、抑制又は改善するために使用できる。そのような条件として、非高血圧性の心血管・脳血管・腎血管の疾患のみならず、高血圧性の心血管・脳血管・腎血管の疾患及び症状が含まれる。この混合薬は特に固有ＮＯ生産の必要な患者に役立つ。この混合薬は以下について有効に適用できる：（１）慢性の安定なアンギーナ；（２）不安定なアンギーナ；（３）急性心筋梗塞（Acute myocardial infarction）；（４）冬眠した心筋（Hibernating myocardium）；（５）気絶した心筋（Stunned myocardium）；（６）心筋梗塞後の心室の回復（ventricular remodeling）の限界及び後続の鬱血性心不全（congestive heart failure）の危険；（７）再発性心筋梗塞の予防（ Prophylaxis of recurrent myocardial infarction）；（８）心筋梗塞による突然死の防止；（９）血管痙攣性アンギーナ（Vasospastic angina）；（１０）前記１〜６に関連して収縮期に見られる鬱血性心不全；（１１）前記１〜１０及び後記１２〜１５に関連して弛緩期に見られる鬱血性心不全；（１２）前記１〜１１及び後記１５、１６に関連して見られる微小血管アンギーナ；（１３）前記１〜１２及び後記１５、１６に関連して見られる静かな虚血（Silent ischemia）；（１４）前記１〜１３及び後記１５に関連して見られる心室の異所性活性の低下（Reduction of ventricular ectopic activity）；（１５）高血圧性心臓病と連携しかつ冠状血管拡張薬の保有量を損なう虚血性心筋（ischemic myocardiu m）の前記１〜１４の状態のいずれか又は全て；（１６）高血圧症による危機、手術による高血圧（perioperative hypertension）、複雑でない一次性高血圧（ essential hypertension）及び二次性高血圧（secondary hypertension）の治療中の血圧制御；（１７）前記１５、１６に関連して見られる左心室肥大の回帰（ Regression of left ventricular hypertrophy）；（１８）前記１〜１７に見られる心外膜の冠状動脈のアテローム性硬化症（epicardial coronary atheroscle rosis）の予防及び／又は回帰；（１９）血管形成後の再狭窄（restenosis post angioplasty）の予防；（２０）前記１〜１９に関連した再灌流損傷に媒介されたフリーラジカルの予防及び／又は改善；（２１）冠状動脈のバイパスにより心臓麻痺（cardioplegic）を抑制する間又は他の心臓外科手術中の心筋損傷（myoc ardial injury）の予防における結合の使用、即ち心臓麻痺の解決策としての結合の使用；（２２）移植後の心筋症（Post transplant cardiomyopathy）；（２３）腎血管の虚血（Renovascular ischemia）；（２４）脳血管の虚血（Cerebro vascul ar ischemia）（一過性虚血発作（ＴＩＡ）及び脈拍）。図１Ａ及び図１Ｂは、発生細胞及び標的細胞の両者並びにそれらの相互関係においてニトロ血管拡張薬（nitrovasodilators）によって誘引された作用メカニズムの概要を示す。ニトログリセリン又はグリセリルトリニトレート（ＧＴＮ）の作用メカニズムはＬ−アルギニン依存及びＬ−アルギニン独立の両者であり、この連携はニトログリセリン耐性の改善及び治療並びに臨床の終端及び死亡率を低減に関し極めて大きな効果を奏することが判明している。発生細胞の種類は内皮細胞であるが、心内膜細胞（endocardial cell）又は冠状動脈の内皮細胞でもよい；標的細胞の対応型は血管の平滑筋細胞であるが、心筋細胞（ミオサイト）でもよい。血管の平滑筋細胞は主として静脈、動脈及び冠状動脈に存在する。以下、ニトロ血管拡張薬によって刺激された平滑筋及びミオサイトの弛緩に焦点を当てて説明するが、ここでは一酸化窒素シンターゼは一酸化窒素シンターゼの構成品種のｃＮＯＳ、発生細胞は内皮細胞、標的細胞は血管の平滑筋細胞である。これらの図は種々の作用サイト間の細胞の関連性を示すのではなく、それらの機能の関連性を示す。図１Ａでは、ＮＯ生産は種々の発生源及び機構から発生し、この点がイグナロ（Ignarro）（ルイス，ジェイ薬学博士［Louis J．PhD.］、１９９１年、「内皮由来の一酸化窒素及びニトロ血管拡張薬の薬理学」、西部医学会誌、５１〜５６）に詳述され、そのまま引用する。Ｌ−アルギニン独立又は非内皮依存経路において、一酸化窒素（ＮＯ）によるグアニル酸シクラーゼ（Guanylate Cyclase，ＧＣ）の活性化は使用したニトロ血管拡張薬のタイプに依存する。無機亜硝酸（ＮＯ₂ ^-）は帯電し、限られた量だけが細胞に浸透できるが、細胞内の亜硝酸はＮＯに変換できる。親油性有機硝酸エステル（Ｒ−ＯＨ）は、酸性チオール（Ｒ− ＳＨ）の簡単な反応によってＮＯに変換される。Ｓ−ニトロソチオール（S-Nitr osothiols，Ｒ−ＳＮＯ）は自発的に分解してＮＯを生産する不安定な中間体である。チオールがニトログリセリンの作用を強化しかつニトログリセリンに対するある程度の耐性へ転化するメカニズムの一つでは、チオール（Ｒ−ＳＨ）とニトログリセリン（ＧＴＮ）との直接反応により不安定な中間体のＳ−ニトロソチオール（Ｒ−ＳＮＯ）が形成されると考えられ、Ｓ−ニトロソチオールは前記の通り分解する（図１ＢではＲ−ＳＨ＋ＧＴＮ→ Ｒ−ＳＮＯを示さず）。外因性ＮＯの非酵素的形成は、例えばシステイン（cysteine）、ジチオトレイトール（dithiothre itol）、Ｎ−アセチルシステイン（N-acetylcysteine）、メルカプトコハク酸（ mercaptosuccinic acid）、チオサリチル酸（thiosalicylic acid）及びメチルチオサリチル酸（methylthiosalicylic acid）等のチオール源により行われると考えられる。例えばイソソルバイド二硝酸塩（isosorbide denitrate）、イソソルバイド５'一硝酸塩（isosorbide 5’mononitrate）等の硝酸塩もＮＯ生産に使用でき、これらは公知のＬ−アルギニン独立経路の市販の中間体である。ニトロ青酸塩（Nitroprusside，(ＣＮ)₅−ＦｅＮＯ）は分解してＮＯを形成し、チオール依存ではない。ＧＴＰはグアニジン三リン酸塩である；ＨＯＮＯは亜硝酸である；Meth．Blueはメチレンブルーである；Ｒ−ＯＮＯは有機亜硝酸エステルである；Ｒ−ＳＳ−Ｒはジスルフィドである。Ｌ−アルギニン独立経路において、グリセリルトリニトレート（ＧＴＮ）反応はＲ−ＯＮＯ₂により表され、ＮＯを生成するためスルフヒドリルを含む酵素等のチオールのプールを要すると考えられ、従来、細胞内のチオール欠如の結果としてニトログリセリンの薬理学的作用に対する耐性が発生すると考えられていた。しかしながら、外因性薬量に依存するチオールは逆にニトログリセリン耐性を発生させないため、これでは耐性を説明できないが（ファン，エイチ・エル［Fung H.L.］、１９８８年、「薬理学及び実験治療ジャーナル」、２４５、２,５２４〜３０）、ＮＯの独立ドナーとして有益な効果を発揮し、一酸化窒素の自発的な放出を容易にする（ムンツェル，ティー医学博士［Munzel T.，M.D.］他、１９９４年、「ニトログリセリン耐性は何故起こる？」、臨床心臓学［Clinical Cardiology］、２０、No.9、４０〜４７）。しかしながら、ここで初めてニトログリセリンに対する耐性は第二の経路を含んでもよいと仮定し、実際には、この「第二の経路」は第一の経路でもよい。この「第二の経路」は、図１Ｂに示すＬ−アルギニン依存経路又は内皮依存経路である。図１Ａに示すように、発生細胞はＢ内皮（Endothelium B，ＥＴ_B）レセプタ等の種々のレセプタ媒介作用物質を有することが知られている。即ち；アセチルコリン（Ａｃｈ）；Ｐ物質（ＳＰ）、ヒスタミン（Ｈ）；アルギニンバソプレッシン（ＡＶＰ）；ブラジキニン（ＢＫ）；アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）；プロスタグランジンＦ₂α（ＰＧＦ₂α）；オキシトシン（ＯＴ）；及びＮＯＳ生産を刺激するカルシウムイオノホア（Ａ２３１８７）である。しかしながらここまでは、ニトログリセリンが、ＮＯＳのための作用物質と、スルフヒドリル基媒介Ｌ−アルギニン独立経路のための改質薬物（pro-drug）との二重の役割を果たす点を考慮しなかった。従来は、ニトログリセリンはＬ−アルギニンの「固有」一酸化窒素への生体内変化に何ら効果がないと考えられていたが、現在では、Ｌ−アルギニンを伴うニトログリセリン、ニトログリセリン結合又は統合製剤（図１ＢのＧＴＮ結合）はｃＮＯＳに刺激的効果を及ぼすと考えられている。この詳細なメカニズムは詳しくは解明されていないが、投与に先立つニトログリセリンとＬ−アルギニンとの新規な結合が、処理されていないニトログリセリンの供給系統として働く新規な複合製剤の役目を果たすため、ｃＮＯＳ刺激に対し予想できない相乗効果を有することを理解できよう。一方、ｃＮＯＳの刺激は、Ｌ−アルギニンとの脱会合平衡状態にある結合又はニトログリセリンのための特徴的なレセプタサイトを有するｃＮＯＳの結果物でもよい。また、Ｌ−アルギニンが過剰に付加されるため、組み合わせて二つを投与することによりＬ−アルギニンのｃＮＯＳ過程のための適切な基質が提供される。Ｌ−アルギニンとニトログリセリンとの間では、二つが混合されたときに結合又は複合製剤が形成される。この、複合製剤をブルーカー（Bruker）３００MHz ＮＭＲを使用して測定した結果を表Ｉに示す。測定サンプルは以下の通り：濃縮標準としてサンプルＡ（０.５mlＤ₂Ｏ中にＬ−アルギニン１００mg）；濃縮混合物としてサンプルＢ（０.５mlＤ₂Ｏ中のＬ−アルギニン１００mgにニトロスタット（nitrostat）１錠を加えたもの）；希釈標準としてサンプルＣ（１.０mlＤ₂ Ｏ中にサンプルＡを１滴）；希釈混合物としてサンプルＤ（１.０mlＤ₂Ｏ中のＬ −アルギニン１３mgにニトロスタット３錠を加えたもの）。これらのサンプルを比較してコンピュータで重ね合わせ、結合が形成されたか否かを調べた。ニトログリセリンをＬ−アルギニンへ添加すると、Ｌ−アルギニンについて最も容易に測定できる信号であるδ１.９の多重項及びδ３.２の三重項の化学シフトが変化した。この変化を表Ｉに示す。ニトログリセリンの存在下でＬ−アルギニン中のプロトンの化学シフトの変化は、複数の物質から１つの複合体（又は錯体）が溶液中で形成されて２つの独立した物質とは異なる中間体が形成されることを明示している。更に、このことは化学シフトが濃度に依存しないとの事実により裏付けられる。このため、Ｌ−アルギニンとニトログリセリンとは溶液中では独立して作用しないと完全に結論づけられるが、むしろ幾分かはＬ−アルギニンのプロトンの化学的環境を変化させかつ高分解能ＮＭＲ分光学により検出できる結合の形成が含まれる。これにより、ニトログリセリン単独の投与で従来見られる抵抗−耐性限界を克服する特徴的な有効ＮＯ供給系統を説明することができる。しかしながら、有益な効果は単にＬ−アルギニン及びｃＮＯＳ刺激薬の同時投与から生じてもよい。また、Ｌ−アルギニンとニトログリセリンとの併用により動脈及び静脈の結合した拡張効果を生じてもよい。ニトログリセリンは主に静脈拡張薬（venodilato r）として単独で使用され、静脈内プールのため心拍数を急速に増加させる原因となる一方、Ｌ−アルギニンは主に動脈の拡張薬として単独で使用される。従って、二者の結合の結果、進行した心筋梗塞の虚血と反対に頻脈を発生する一方又は他方の傾向をつりあわせる調和した動脈及び静脈拡張薬効果が得られる。この点は、イヌによる研究における予備的データで示唆され、表ＩＩに示すデータに最も顕著である。表ＩＩのデータはＬ−アルギニンを毎分５cc投与した場合であり、ここでＬ−アルギニンは１０％Ｗ／Ｖ（ｇ／ml）で、ニトログリセリンは３.３８μg／kg／分で５分間にわたり静脈内（Intravenous，ＩＶ）に投与された。イヌは体重１３.６kgのビーグル犬であった。結合して投与する際、相対的濃度及び薬量は同一とした。ＢＰは血圧（収縮期／弛緩期、mmHg）である；ＭＡＰは平均動脈圧（mmHg）である；ＣＯは心拍出量（リットル／分）である；ＴＰＶＲは全末梢血管抵抗（dyn＊秒／cm³）；ΔＴＰＶＲは全末梢血管抵抗の変化（％）である；ＨＲは心拍数（bpm）である。ＣＯ即ち心拍出量における効果により以下のことを理解できよう；Ｌ−アルギニンの単独投与後の心拍出量の増加は主に動脈の拡張薬としてのＬ−アルギニンの効果による；ニトログリセリン単独の場合の心拍出量の減少は主に静脈の拡張効果による；一方、併用した場合は極めて調和した動脈及び静脈の拡張効果を発揮する（心拍出量の変化は僅か０.０４（＝１.６０−１.５６）である）。従って、頻脈への傾向がない（即ち、圧受容器活性（baroreceptor reflex activati on）の証拠がない）。この併用による有益な他のメカニズムは、ニトログリセリンを単独で使用した場合は、最近心臓発作を起こし血液流が突然回復した患者の再灌流損傷を制限する最小の利益のみであるという事実と関連する。バイパスポンプから離れた冠状動脈のバイパス操作後、血液流の再建を行っている患者にも、同様の現象が見られる。この形態の再灌流損傷は再灌流でのフリーラジカル生成により媒介されると考えられ、特にネコの場合の予備的データは、単独で投与したＬ−アルギニンがフリーラジカル生産を制限することを示す（ウェイリッチ，エイ・エス薬学博士［Weyrich，A.S.，PhD.］他、１９９２年、「ネコの心筋虚血後の再灌流損傷の改善におけるＬ−アルギニンの役割」、循環、８６：２７９〜２８８）。従って、この結合は、ニトログリセリン単独での使用と比べ再灌流損傷を制限する可能性がある。各々単独で使用する場合と比較した他の有効な結合使用法は、これまでにボランティアが研究したことによりＬ−アルギニン単独では薬要求量に関し弱い血管拡張薬であることが判明した事実と関連する（６００cc／時、ナカキ，ティー［ Nakaki T.］他の報告による、１９９０年、「Ｌ−アルギニンが誘発する高血圧症」、ランセット［The Lancet］、６９６）。複雑な鬱血性心不全の有無に関係なく不安定な冠状動脈の症候群及び心筋梗塞を有する患者にはＩＶ（Intravenos ）液が過剰投与される傾向がある。従って、ニトログリセリンをＬ−アルギニンと併用することによって、全Ｌ−アルギニン薬要求量と、これによる鬱血性心不全を進行させる危険を著しく抑制できる。またこれは、腎臓の機能を損ねかつ大量のＬ−アルギニンによるアシドーシス（acidosis）及び腎不全（renal failur e）の傾向がある患者にとって重要である。使用すべき基本的併用は、水に治療濃度のＬ−アルギニンとニトログリセリンとを含む混合薬である。どの製薬階級のＬ−アルギニンでも十分であるが、好ましくは２.５〜６０％Ｗ／Ｖ（ｇ／ml）、より好ましくは５〜４５％Ｗ／Ｖ（ｇ／ml）、更に好ましくは７.５〜３０％Ｗ／Ｖ（ｇ／ml）、更により好ましくは１０〜１５％Ｗ／Ｖ（ｇ／ml）、そして最も好ましくは１０％Ｗ／Ｖ（ｇ／ml）まで、それぞれＬ−アルギニンを希釈する。予想される一般的な薬量は無菌水（ sterile water）中にＬ−アルギニン３０ｇである（全体積３００cc）。Ｌ−アルギニンについて、最終的に［塩酸塩：塩基としてのＬ−アルギニン］は約１０：１から約２５：１、より好ましくは１５：１から２０：１、最も好ましくは１５：１と予想される。この例では、Ｌ−アルギニンの２８〜２９ｇは塩酸塩、１〜２ｇは塩基である。Ｌ−アルギニンと併用されるニトログリセリンは好ましくは患者の kg体重に依存する濃度であり、薬量時間は、好ましくは０.１μg／kg／分から約５μg／kg／分、より好ましくは０.２μg／kg／分から約４μg／kg／分、更に好ましくは０.５μg／kg／分から約３μg／kg／分、更により好ましくは０.７５μ g／kg／分から約２μg／kg／分、最も好ましくは約１μg／kg／分と予想される。従って、ＩＶ体積に依存して、投与時間及び投与したニトログリセリンの重量は、望ましい範囲（即ち１μg／kg／分）を得るのに十分な量だけ加えられる。皮膚通過システム（transdermal system）を使用する場合、ニトログリセリンの供給は好ましくは０.２mg／時から１mg／時、より好ましくは０.３mg／時から０ .８mg／時、更に好ましくは０.４mg／時から０.６mg／時を要する。梱包品はニトログリセリンと無菌水とを加えられるようにしたガラス瓶中にフリーズドライのＬ−アルギニンを含むことが予想され、例えばＬ−アルギニン３０ｇ及びニトログリセリン１〜９６０mgに無菌水を加えて全体積３００ccとなるよう希釈する。また、ニトログリセリン、Ｌ−アルギニン及び水を無菌のガラス瓶に加え、生理学的ｐＨに適合させることができる。水中の再形成（reconstitution）のｐＨは、生理学的に好ましくは約５〜８の範囲、より好ましくは６〜７.５の範囲、更に好ましくは７〜７.５の範囲、更により好ましくは約７.４であることを要し、溶液に投入された場合の延長状態期間中の細菌学的過剰成長（bacteriologic overgrowth）を避けると共に、ｐＨ５.６の限界を要する溶液中に存在する当面の問題を回避できる。ニトログリセリンの薬量は心拍数の比の結合効果に関する将来の研究により変化してもよい。また、本明細書の説明は静脈内（intravenous）の投与に焦点を絞っているが、頬内（buccal）、冠状動脈内（intracoronary）、筋肉内（intra muscular）、局所的（topical）、鼻腔内（intranasal）、直腸内（rectal）、舌下（sublingual）、口腔（oral）、皮下（subcutaneous）、又はパッチによる投与形態の単独又は組合せも本発明を利用できる。これらの併用可能性により、現在ニトログリセリン単独で使用する場合はパッチの形で行うように、パッチでのＬ −アルギニンとニトログリセリンとの結合が最も一般的な使用法である。パッチ技術の実施可能性は、トリディル（Tridil，商標名）へのＬ−アルギニンの溶解度試験により裏付けられる。溶解度試験は以下の要領で行った：水を加えず、Ｌ −アルギニン約１７０mgをトリディル（商標名）１.０mlに溶かす（ニトログリセリン５mg／ml）；Ｌ−アルギニン塩酸塩２５００mg、トリディル（商標名）１ .０ml及び脱イオン水２.８mlを３０℃で混合し、静かにかき混ぜた後外界温度（約２４℃）まで冷却すると、無色透明の混合物が得られた；Ｌ−アルギニン２５００mg、トリディル（商標名）１ml及び脱イオン水０.５mlを混ぜ合わせると、極めて厚いが流動性のあるスラリーが得られた。これらの結果は、Ｌ−アルギニンとトリディル（商標名）とが大幅な相互溶解性を有し、従って現在のパッチ投与技術でも簡単に行えることを示唆する。以下、前記の作用機構と心血管・脳血管・腎血管の疾患の治療とを説明する：例１先頃、一般に臨床上見られるようにニトロ青酸ナトリウム（sodium nitroprus side，ＳＮＰ）をニトログリセリンに添加する場合と同じ要領で水に溶かしたニトログリセリン及びＬ−アルギニンの共投与することによって、最低限のニトログリセリン効果を施されたイヌはさらに反応性が良くなることが発見された；しかしながら、ＳＮＰと比べて、ニトログリセリンと結合したＬ−アルギニンは極めて好ましい血液力学的効果を発揮した。ＳＮＰと比較すると、血管抵抗は５０％低下し、心拍出量は２倍となり、収縮性は増加した。このことから、直接的に一酸化窒素を生産することが知られるＳＮＰに対し、Ｌ−アルギニンとニトログリセリンとの結合はＥＤＲＦ（endothelium-derived relaxing factor，内皮由来弛緩因子）を生成するとの仮説が導かれた。ここでＥＤＲＦが一酸化窒素と同一か否かを議論するため、ＮＯと非同一のＥＤＲＦは血液力学的効果が相違するとの説明を仮定した。特別のＥＤＲＦを説明するため、一酸化窒素の改質薬物であることに加えてニトログリセリンがｃＮＯＳ活性に対する作用物質でもあり、イヌの場合のアルギニン割合限界は、特に、高血圧症、高脂血症（hyperlipidemia）、動脈硬化症（arteriosclerosis）等の、過剰投与されたＬ−アルギニンの受動的拡散におそらく優先される潜在的な割合限界を有する活性輸送プロセスと考えられる内皮細胞を含む疾患状態で発生するＬ−アルギニンにおける供給−需要の不整合により説明できると仮定した。よって、硝酸塩の抵抗及び耐性を治療するためのＬ−アルギニンとニトログリセリンとの合理的な結合が得られる。この仮説を検証するため、健康なラットの大動脈を水溶液中でＬ−アルギニンと結合したニトログリセリンに曝露する効果を調べ、この結果を水溶液中でＬ−アルギニンと結合したＳＮＰより得られた結果と比較した。Ｌ−アルギニンとニトログリセリンとの併用効果を図２に示す。臨床の手順は以下の通りである：動物の準備このニトログリセリンによる実験に８匹のＳＤラット（Sprague-Dawley rats ）を使用し、ＳＮＰによる実験に２匹を使用した。各ラットのから大動脈を摘出し、この大動脈を洗浄して５つのセグメントに切り分けた。セグメントはベースライン値のばらつきを最小にするため無作為に分配した。続いて、このセグメントを３７℃のアール塩溶液（Earl's Salt solution）中で培養した。処理手順ニトログリセリン群−５つのセグメントの内の１つは、内皮（基底活性）の完全な状態を検定する基準に用いるために除外した。他の４つには、それぞれＬ− アルギニン５０μmolを加えた。ホスホジエステラーゼ（phosphodiesterase）によるあらゆるｃＧＭＰ劣化を防止するため、３０分後、ＩＢＭＡＸ１ml（５０μ mol）を５つのセグメントに加えた（ＩＢＭＡＸはイソブチルメチルキサンチンである）。５つのセグメントは以下のように処理した：Ａ−基準−基底活性；ＢはＬ−アルギニン群であり、基底群にＬ−アルギニン５０μmolを加えた；Ｃはニトログリセリン群であり、Ｌ−アルギニン５０μmolにニトログリセリン５μm ol；Ｄはニトログリセリン＋Ｎ^G−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（N^G- nitro-L-arginine methyl ester，Ｌ−ＮＡＭＥ、公知のＮＯＳ機能の抑制薬）群であり、ニトログリセリン５μmol＋Ｌ−ＮＡＭＥ０.５μmol及びＬ−アルギニン５０ μmol；ＥはＬ−ＮＡＭＥ群であり、Ｌ−ＮＡＭＥ０.５μmol及びＬ−アルギニン５０μmolである。５０分後、各セグメントを取り出し、０.１規定の塩酸５００μl（マイクロリットル）中に入れた。これらを１時間放置し、その後液から取り出して重量を測定した。サイクリックＧＭＰの定量ｃＧＭＰ決定のため、細長片（セグメント）を取り出して重量測定した後の塩酸溶液４００μlをガマ流動管（gama flow tubes）内に移し、放射免疫測定（ra dioimmunoassay）によりサイクリックＧＭＰを決定した。データ解析Ａ．基準−基底。これは、可溶性グアニル酸シクラーゼ活性の残りのＮＯ源によって生成されたベースラインにおけるｃＧＭＰ活性を表す。即ちベースラインである。Ｂ．Ｌ−アルギニン群。これは、Ｌ−アルギニンとＥＤＲＦによって生成されたｃＧＭＰ活性を表す（内因性又は「固有」ＮＯ生産）。Ｃ．ニトログリセリン群（Ｌ−アルギニン＋ニトログリセリン）。このｃＧＭＰ活性は、Ｂ（Ｌ−アルギニン）とｃＮＯＳから誘導されたニトログリセリンとの合計及び一酸化窒素に加えてＬ−アルギニン独立経路によってニトログリセリンから生産されたＥＤＲＦを表す（改質薬物効果）。Ｄ．Ｌ−アルギニン群（Ｌ−アルギニン＋ニトログリセリン＋Ｌ−ＮＡＭＥ）。過剰のＬ−ＮＡＭＥは全発生源からＥＤＲＦより得られたＮＯＳを抑制するため、ニトログリセリンの酵素変換のみからのｃＧＭＰ活性を表す。Ｅ．Ｌ−アルギニン＋Ｌ−ＮＡＭＥ。可溶性グアニル酸シクラーゼ活性を活性化する非一酸化窒素源によるｃＧＭＰ活性を表し、これはｃＧＭＰの非ＮＯ活性（non NO activation）効果を除去するために全測定値から減算される（心房のナトリウム増加因子（atrial natriuretic factor）、他）。従って以下が明らかである：ニトログリセリンからの全ＮＯはＣ−Ｂである；ニトログリセリンのＮＯへの酵素劣化によるＮＯはＤ−Ｅに等しい；ニトログリセリンからのＥＤＲＦ（ＮＯＳ）刺激＝（Ｃ−Ｂ）−（Ｄ−Ｅ）である。ＳＮＰ群前記のように２匹のラットから成る第二の群について実験したが、この群では治療手順においてニトログリセリンをＳＮＰに代えたのみである。これらの結果を図３に示すが、図３のＡ'、Ｂ'及びＥ'は図２のＡ、Ｂ及びＥと完全に対応する。Ｃ'はＬ−アルギニン５０μmol＋ＳＮＰ１μmolに等しく、ＥＤＲＦ生産のＬ−アルギニン刺激からのｃＧＭＰ活性＋ＳＮＰによるあらゆるｃＮＯＳ活性＋非酵素的変換によるＳＮＰからのＮＯを表す。ＳＮＰがスルフヒドリル基を必要とするかは明らかでないが、非酵素的副産物としてＮＯ及びシアン化物を形成することが解る。Ｄ'はＳＮＰ + Ｌ−ＮＡＭＥであり、ＳＮＰのＮＯへの非酵素的変換のみにより生成したｃＧＭＰ活性を表す。即ち外因性又は「非固有」ＮＯである。ＳＮＰからの全ＮＯ＝Ｃ'−Ｂ'である；ＳＮＰからの非酵素的変換による全ＮＯ＝Ｄ'−Ｅ'である；ＮＯＳ活性によるＳＮＰからのＥＤＲＦ＝（Ｃ'−Ｂ' ）−（Ｄ'−Ｅ'）である。結果図２及び図３はこれらの結果をまとめた棒グラフであり、１００mgウェットティッシュ当たりのピコモル（picomols）で検出されたｃＧＭＰをそれぞれ表す。図２には示さないが、Ｌ−アルギニンが存在しない状態でニトログリセリンとＬ −ＮＡＭＥとを結合すると、ｃＧＭＰ生産に関し同様の結果が得られた。図２及び図３の両方において、「ＮＯＳ」と表示された棒は、全ＮＯからＬ−アルギニン独立経路により生産されたＮＯを引いて得られた「固有」ＮＯの量である。ニトログリセリン抵抗−耐性は１８８８年以来心臓専門医（cardiologists）及び薬理学者（pharmacologists）を失望させている（スチュアート，ディー・ディー［Stewart D.D.］、１８８８年、「ニトログリセリンに対する著しい耐性」、フィラデルフィア総合病院、１７２〜５）。これらの結果は図１Ａ及び図１Ｂについて概説した仮説を裏付け、ニトログリセリン耐性の機構を明らかにする。追加のニトログリセリン活性サイトは内皮細胞のｃＮＯＳと考えられる。耐性に至る条件下では、ｃＮＯＳ誘導におけるニトログリセリンの作用物質効果は、図１Ａ及び図１Ｂの活性Ｌ−アルギニン輸送ポンプ力学における割合限界に対する第二の内皮細胞でのＬ−アルギニンの劣化に至る。これは、膜摂取過程での供給と需要との不整合の状況を生じ、イヌの場合にアルギニンが割合を制限する理由となる。また、これはニトログリセリンの投与中に硝酸塩のない時間が必要となる理由でもある。内皮細胞は活性輸送によって不十分なＬ−アルギニンで充満しているため、これが必要であると考えられる。Ｌ−アルギニンをニトログリセリンに加えることによってＥＤＲＦが生成でき、プロセスにおいて、ニトログリセリン単独又はＳＮＰその他の外因性ＮＯのドナーとの結合による使用と比べて臨床及び死亡率の終端の大幅な減少が達成されると考えられる。動脈と比べて静脈が外因性ＮＯ（及び最も可能性の高い「固有」ＮＯ）に対し敏感であるとの事実より、バランスのよい動脈・静脈の拡張薬であるＳＮＰに対し、ニトログリセリンが低い薬量で主として静脈の拡張薬であることの理由が説明できる。３７μg／時のレベルで全ＥＤＲＦポテンシャルが実現され、ニトログリセリンによって生成された最後の一酸化窒素源としてＮＯの改質薬物変換が行われるため、３７μg／時のニトログリセリンが動脈性となることが説明できる。この改質薬物変換から生成された最後のＮＯ源は、ＳＮＰからのＮＯと同等で、同様の動脈に対する効果を生じる。ＥＤＲＦはＮＯと同一ではなく、おそらくＮＯの前駆体（Ｌ−ＯＨ−ＮＯ、半減期３〜５０秒）であろう。このことから、不安定なアンギーナ、急性心筋梗塞等の臨床の状況でニトログリセリンの代わりにＳＮＰを使用するのは誤りであることが説明できる（フラハーティ，ジェイ・ティー医学博士［Flaherty，J.T.， M.D.］、１９８３年、「急性心筋梗塞における静脈内でのニトログリセリンとニトロ青酸ナトリウムとの比較」、アメリカ医学会誌、５３〜６０）、ＥＤＲＦはより反虚血作用（anti-ischemic actios）を有し、かつ、ＳＮＰを使用してＥＤＲＦを生産できないため、死亡率に関しＳＮＰはニトログリセリンで潜在的に実現可能な利益まで到達できない。ニトログリセリンによるｃＮＯＳ刺激によって生産されたＥＤＲＦの他の有益な効果は、外因性ＮＯに対するフリーラジカルの捕集剤（scavenger）としての機能に関するＥＤＲＦの能力から得られる（ゼンボビッツ，エイ［Zembowicz A.］他、１９９１年、「一酸化窒素及び他の潜在的血管拡張薬は人工内皮細胞によりＮ^G−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニンから形成される」、アメリカ自然科学アカデミー薬理学会報［Pharmacology．Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA］、８８：１１１７２〜１１１７６）。再灌流損傷では、フリーラジカルの捕集剤（おそらくＥＤＲＦ）は、Ｌ−アルギニンとニトログリセリンとが偶然存在するが非固有ＮＯ源であるＳＮＰが存在しない場合に発生するフリーラジカルを吸収するため必要とされる。この点は、ＳＮＰとの中間体としてのＥＤＲＦが考えられないことから説明できる。割合制限過程がＬ−アルギニン基質を加えることにより克服されるまでに生産されたＥＤＲＦが全く又は殆ど存在しないため、耐性は確立され、ニトログリセリンの有益な効果は失われる。これは、最近心臓発作を起こし突然血液流が回復した患者の再灌流損傷を制限する有益な効果は、ニトログリセリンを単独で使用してもすぐに失われる事実と関連して、結合又は複合製剤から他の有効な機構を与える。バイパスポンプから離れた冠状動脈のバイパス操作後、血液流の再建を行っている患者にも、同様の現象が見られる。この形態の再灌流損傷は再灌流でのフリーラジカル生成により媒介されると考えられ、特にネコの場合の予備的データより、単独で投与したＬ−アルギニンがフリーラジカル生産を制限することが示されている。従って、この結合は、ニトログリセリン単独での使用と比べ再灌流損傷を制限すると考えられる。これらの結果は、ニトログリセリンを過剰のＬ−アルギニンと結合することにより、ニトログリセリン抵抗−耐性を治療する内皮細胞膜輸送ポンプの受動的拡散優先機構に利用できる新薬製剤の製造を示す。この製剤は、高血圧症、高血圧性心臓病、冠状動脈性心臓病（アンギーナ、心筋梗塞、突然死）、心血管の疾患（鬱血性心不全、脈拍、末梢血管の疾患）、脳血管の虚血（ＴＩＡ）及び腎血管の虚血を含めて適用できる。この複合物の他の潜在的な用途はラットの大動脈及びイヌの場合の結果として示したようにＥＤＲＦを独立に生産することであり、これは現在単独で行われるニトログリセリン投与における他の毒性又は不都合もなくニトログリセリンの耐性を治療することができる大きな価値を有する。投与方法は不変である。Ｌ−アルギニン−ニトログリセリン混合薬は選択的にｃＮＯＳを刺激し、ｉＮＯＳを誘導しないと思われる。これは以下により裏付けられる：１．ｉＮＯＳ誘導は、一般に回復不能の血管破裂及び死につながる。古典的な例は内毒素によるショックである。この点は本発明で見られなかった。２．ｉＮＯＳ誘導は、ｉＮＯＳ内皮細胞へのＬ−アルギニン輸送を増加する正フィードバック機構と関連する（リンド，ディー・エス医学博士［Lind，D.S. , M.D.］、１９９３年、「肺動脈の内皮細胞において内毒素はアルギニン輸送を刺激する」、外科、１１４；２；１９９〜２０５）。従って、Ｌ−アルギニン投与を追加することは、血管破裂の傾向を速めるだけである。３．ｉＮＯＳ誘導がベースラインに存在しない状態では、ニトログリセリン及びＬ−アルギニンの単独又は結合による投与は、回復不能の血管破裂には至らない。ニトログリセリン単独又は結合の両方は、それぞれの薬の投与を停止することが可能な薬量に従う低血圧を発生させる。第２項に関し、前記のｉＮＯＳ誘導の状態では、ニトログリセリン耐性の改善によって膜ポンプのニトログリセリンの逆効果となる、即ち活性Ｌ−アルギニン膜輸送における負フィードバック機構が生じると考えられる。これは耐性の改善に至る要因となりうる。第３項に関し、ｉＮＯＳ誘導は出血性及び心臓性の衝撃を含む全ての血管衝撃の共通の特徴となりうる。低心拍出量症候群（ボーダーラインの心臓性の衝撃）を伴う鬱血性心不全の進行状態は、同様にサイトカイン生産（腫瘍壊死因子（Tu mor Necrosis Factor））及びｉＮＯＳの誘導と関連しうる。現在、患者がベースラインの低血圧状態時に単独でニトログリセリンを投与する場合に用いられるように、このような状態においてニトログリセリンと結合したＬ−アルギニンの投与が将来的に必要となるであろう。１２.５mg／全体積２５０ccから１００mg／全体積２５０ccの１０％Ｌ−アルギニンの範囲にわたる広範囲のニトログリセリン濃度を使用して通常の人間のボランティアへの８時間投与を行い、その結果従来Ｌ−アルギニン又はニトログリセリンのいずれかを単独で使用した場合に報告されていた頻脈が発生しない極めて重要な事実が判明した。現在認可されている薬量の２.５倍Ｌ−アルギニンを添加すると（合計７５ｇ）、現在認可されているＬ−アルギニン製剤に存在する塩化水素（ＨＣｌ）からの代謝性アシドーシスが認められなかった。この研究につき以下まとめて示す。例２以下の研究は、Ｌ−アルギニンと組み合わせた静脈内のニトログリセリンの通常の人間のボランティアの薬量変化に関する。この研究の目的は、以下について静脈内の１０％Ｌ−アルギニン（水溶液）を有するニトログリセリンの結合投与を調べることにある：１．反射頻脈（圧受容器活性）。２．降圧薬活性（治療の効果）。３．代謝性妨害−代謝性アシドーシス。４．長期間の投与に伴う心電図の異常状態。この薬量変化研究の対象となった患者は、過去に疾患又は入院の経歴がなくかつ慢性の薬物治療も行っていない４７歳の正常血圧の白人男性であった。この研究に用いた材料は以下の通り：１．トリディル（商標名）の静脈用ニトログリセリン（５mg／cc）。２．１０％Ｌ−アルギニン水溶液（Ｒ−ジーン［R-Gene，商標名］−ＫＡＢＩ）。３．通常生理食塩水４．１５０cc真空密封無菌ビン５本５．薬及び食塩水の投与を交互に行うために３方向コックを有するアイバックポンプ（Ivac Pumps）２台。６．プロパック心臓モニタ（Propac cardiac monitor）１台。７．宇宙実験室２０００（Spacelabs 2000）の２４時間血圧モニタ１台。８．カーディオノスティックス・デュラル−ライト（Cardionostics Dural- Lite）のモデル＃２０１１ホルタレコーダ（holter recorder）１台。患者の準備として、前夜にペプシド（Pepcid）４０mg（ファモチジン−メルク［famotidine-MERCK］）及びベナドリル（benadryl）５０mgを予め投与した。実験の朝、ベナドリル５０mgを再度投与した。これは、Ｌ−アルギニンにより活性化されうるＨ₁及びＨ₂のレセプタを防止するためである。実験の朝、ベースラインＥＫＧは、血清化学（Serum Chemistries）及び完全血球算定（Complete Blood Count，ＣＢＣ）と共に得られた。続いて２４時間ホルタモニタ、推移する血圧のモニタ及びプロパックが取り付けられた。血圧モニタはプロパックに対して校正され、収縮期での約２０mmHg及び弛緩期での約１０ mmHgの血圧の不一致が左右の腕それぞれ認められた。次に、左の伏在静脈（saph enous vein）へ１８ゲージアンジオカス（18 gauge angiocath）によりＩＶを左足に設置した。食塩水を伴う最初の継続投与は、ＫＶＯ（keep vein open，静脈開放保持）割合で開始した。続いて、６つの急速薬量反応滴定を以後８時間実行し、１０％Ｌ−アルギニン中のニトログリセリン強度１／４（ビン＃１）、強度１／２（ビン＃２）及び全強度（ビン＃３）としてその結果を図４に示す。この後、Ｌ−アルギニンなしの水溶液で全強度のニトログリセリンを投与した（ビン＃４）。次に、１０％Ｌ−アルギニン中にニトログリセリンなしで純粋Ｌ−アルギニン１０％を投与した（ビン＃５）。最後に、１０％Ｌ−アルギニン中に２倍強度のニトログリセリンを含めて投与した（ビン＃６）。全強度のニトログリセリンとは、水中のＬ−アルギニン１０％又は水のみの全体積２５０ccにニトログリセリン５０mgとして定義した（ビン＃４）。各投与では、最初の割合は時間当たり２５ccとした。続いて、時間当たり５０ ccと投与量を２倍にした。これを５〜１０分ごと時間当たり５０ccずつ増加させ、全投与割合を時間当たり３００ccまで引き上げた。これらの投与中、前記のように投与の割合を増加する前にプロパックで２分ごとに血圧及び心拍数データを記録した。ビンを替える間は、時間当たり１００ccの通常生理食塩水に切り換えて投与した。各投与の最初に１０ccの「開放」割合で実行することにより前のビンに残った投与物から評価用１０ccの「デッドスペース」を取った。その後、前記のように、２５ccでの手順を再開した。最終の投与の後、再び血清化学（Serum Chemistries）、ＣＢＣ（完全血球算定）及びＥＫＧを得た。各投与において、収縮期及び弛緩期の右腕の血圧は平均化された。心拍数も同様に平均化された。これらの平均値は、２分ごとに得られる個々の値を読み取り、それらを合計し、投与期間で分割することによって得られた（投与間にビンを替えるときの測定は含まない）。この結果を図４にまとめた。図４において、ＳＢＰは収縮期血圧、ＤＢＰは弛緩期血圧、ＨＲは心拍数をそれぞれ意味する。図４で使用したＬ−アルギニンに対するニトログリセリンの比では、反射頻脈は少しも認められなかった。薬量による血圧の低下はニトログリセリン濃度に従う傾向があった。８時間にわたり投与された７５ｇの全薬量に対する長時間で投与されたＬ−アルギニンに対する二次的に進行する代謝性アシドーシスは認められなかった。不整脈は認められなかった。心電図の異常状態は認められなかった。このことは、結合したＬ−アルギニン／ニトログリセリンの投与は、Ｌ−アルギニン又はニトログリセリンのいずれかを単独で投与した場合に見られるものと反対の結果とならないことを明示している。以上の本発明の説明は、発明者により案出された現時点での発明の好適な実施形態である。しかしながら、前記本発明の説明は限定的に解釈されるべきではなく、本発明を実施する種々の均等なシステム及び方法が存在することを理解されたい。例えば、Ｌ−アルギニンは、例えばＲ−ジーン（R-Gene，商標名）、その他の製薬階級のＬ−アルギニンの発生源等の市販の入手可能な製品が利用でき、ニトログリセリンはニトログリセリン単独について業界で公知の種々の供給系統のものから利用できる。例えば：ニトロリンガル（Nitrolingual，商標名）スプレー（０.４mg／メートル薬量、プーランク・ローラー社［Poulenc Rorer］）等の舌エアロゾル（lingual aerosols）；ミニトラン（Minitran，商標名）（０. ６mg／時、スリーエム社）等の皮膚通過システム；ニトロ−ビッド（Nitro-Bid ，商標名）軟膏（２％、マリオン・メレル・ダウ社［Marion Merrell Dow］）等の局所軟膏（topical ointments）その他錠剤及びパッチ形（現在、デュポン社のトリディル（商標名）商用パッチ製品を使用）。このリストは全てを含まず、Ｌ−アルギニンとニトログリセリンとの併用に対する供給系統として容易に変更可能な種々のニトログリセリン供給系統の代表例を単に意味するにすぎない。必要な全ては、ニトログリセリンとＬ−アルギニンとの同時供給のための互換性のある系統である。このような供給系統及び商用品から始まる原料は本発明の範囲及び精神から排除されない。即ち、本発明の真の範囲は添付の請求の範囲により定まる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/195 ＡＢＲＡ６１Ｋ 31/195 ＡＢＲ 31/21 ＡＧＡ 31/21 ＡＧＡ 31/415 31/415 31/557 31/557 31/60 31/60 33/00 33/00 38/11 37/42 38/17 37/34 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．患者を選択する過程と、静脈の拡張薬と動脈の拡張薬とを混合する過程と、前記患者に前記混合薬を含む製剤を投与する過程と、患者について血管緊張低下の周期的な指示薬を得る過程と、血管緊張低下の望ましい状態が得られるまで製剤の投与を継続する過程とを含むことを特徴とする血管拡張又は血管緊張低下による患者の中の疾患条件の予防方法又は治療方法。２．静脈内に（intravenously）、頬内に（buccal）、冠状動脈内に（intra coronary）、筋肉内に（intramuscularly）、局所的に（topically）、鼻腔内に（intranasally）、直腸内に（rectally）、舌下に（sublingually）、口腔に（ orally）、皮下に（subcutaneously）、又はパッチにより製剤を投与する請求項１に記載の方法。３．前記動脈の拡張薬はＬ−アルギニンである請求項１に記載の方法。４．前記疾患は、高血圧症（hypertension）、高血圧性心臓病（hypertensi ve heart disease）、冠状動脈性心臓病（coronary heart disease）、心血管の疾患（cardiovascular disease）、脳血管の疾患（cerebrovascular disease）、及び腎血管の虚血（renovascular ischemia）である請求項１に記載の方法。５．前記静脈の拡張薬は外因性一酸化窒素源（exogenous source）である請求項３に記載の方法。６．前記外因性一酸化窒素源はニトログリセリンである請求項５に記載の方法。７．前記外因性一酸化窒素源は、ニトロ青酸ナトリウム（sodium nitroprus side）、硝酸エステル（nitrate esters）、亜硝酸イソアミル（isoamylynirite ）、SIN-1、システイン（cysteine）、ジチオトレイトール（dithiothreitol）、Ｎ−アセチルシステイン（N-acetylcysteine）、メルカプトコハク酸（mercap tosuccinic acid）、チオサリチル酸（thiosalicylic acid）及びメチルチオサリチル酸（methylthiosalicylic acid）から成る群より選択される請求項５に記載の方法。８．Ｌ−アルギニン及びニトログリセリンを治療濃度で投与する請求項６に記載の方法。９．Ｌ−アルギニンの治療濃度は７.５％から約３０％Ｗ／Ｖ（ｇ／ml）である請求項８に記載の方法。１０．Ｌ−アルギニンの治療濃度は１０％から約１５％Ｗ／Ｖ（ｇ／ml）である請求項８に記載の方法。１１．Ｌ−アルギニンの治療濃度は１０％Ｗ／Ｖ（ｇ／ml）である請求項８に記載の方法。１２．ニトログリセリンの治療濃度は約０.２μg／kg／分から約５μg／kg ／分である請求項８に記載の方法。１３．ニトログリセリンの治療濃度は約０.５μg／kg／分から約３μg／kg ／分である請求項８に記載の方法。１４．ニトログリセリンの治療濃度は約０.７５μg／kg／分から約２μg／k g／分である請求項８に記載の方法。１５．ニトログリセリンの治療濃度は約１μg／kg／分である請求項８に記載の方法。１６．ｐＨ６〜８.０の範囲内に保持する請求項８に記載の方法。１７．ｐＨ７〜７.４の範囲内に保持する請求項８に記載の方法。１８．Ｌ−アルギニンと一酸化窒素シンターゼの作用物質（agonist）との混合薬を含有することを特徴とする治療混合薬。１９．作用物質はニトログリセリンである請求項１８に記載の治療混合薬。２０．更に作用物質は、アセチルコリン（acetylcholine）、Ｐ物質（subst ance P）、ヒスタミン（Histamine）、アルギニンバソプレッシン（arginine va sopressin）、ブラジキニン（bradykinin）、アデノシン三リン酸（Adenosine T riphosphate）、プロスタグランジンＦ₂α（Prostaglandin F₂α）、オキシトシン（Oxytocin）、Ｂ内皮（Endothelium B）及びカルシウムイオノホアＡ２３１８７（calcium inophore A23187）から成る群より選択されるレセプタ媒介作用物質を含有する請求項１８に記載の治療混合薬。２１．Ｌ−アルギニンと一酸化窒素シンターゼの作用物質とを混合する過程と、一酸化窒素シンターゼレセプタサイトを有する患者に混合薬を投与する過程と、前記一酸化窒素シンターゼを望ましいレベルまで刺激する過程とを含むことを特徴とする一酸化窒素シンターゼを刺激して一酸化窒素を生産する方法。２２．前記Ｌ−アルギニンは前記作用物質に対して過剰である請求項２１に記載の方法。２３．作用物質はニトログリセリンである請求項２１に記載の方法。