JPH10507632A

JPH10507632A - 母体からの胎児血液の濃縮

Info

Publication number: JPH10507632A
Application number: JP8511058A
Authority: JP
Inventors: ブッシュ，ユルゲン; ラトブルフ，アンドレアス; ミルテニー，ステファン; ホルツ，イルゲン
Original assignee: ミルテニーバイオテック，インコーポレイティド
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 1998-07-28
Also published as: AU691040B2; AU3593595A; WO1996009409A1; EP0778899A4; CA2200294A1; EP0778899A1

Abstract

(57)【要約】母体の末梢血試料から胎児細胞を調製する方法が提供される。母体血液試料から単核細胞の懸濁物を調製する。次に、成人細胞上に存在するマーカーに特異的な磁気的に結合した抗体を加え、次に磁界の存在下で細胞をカラムに結合させて、該試料から母体の細胞を欠乏させる。欠乏画分から、胎児赤血球を磁性細胞ソーター解析（MACS）を用いて濃縮する。次にこれらの有核赤血球を、胎児遺伝子物質の供給源として使用し、常法（例えば、in situハイブリダイゼーション、中期スプレッドおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのプローブ）により染色体異常もしくは遺伝子異常の存在、またはＹ遺伝子の存在について解析する。

Description

【発明の詳細な説明】母体からの胎児血液の濃縮導入技術分野本発明の分野は出生前診断である。背景出生前の遺伝子検査は近年急速に進展している。DNA遺伝子配列の情報によりどのようなタンパク質または遺伝子が既知の病気に対応するかが明らかになってきた。鎌形赤血球貧血、筋ジストロフィー、テイ・サックス病、ハンチントン病、およびダウン症候群のような先天性疾患は、特異的な遺伝子突然変異または染色体異常まで突き止められている。現在では多くの例で、分子生物学的手法を用いて出生前に、胎児が染色体の欠陥または遺伝子の欠陥を有するか否かを測定することができる。現在の分子診断の方法では、生育している胎児の細胞のDNA試料を必要とする。どの起源の胎児細胞も、解析に充分なDNAを提供できなければならない。現在使用されている方法は、いずれも胎児に対して何らかのリスクを持っている。羊水穿刺や絨毛膜絨毛の採取は医学的に認められているが、侵襲的であり、統計的に有意な確率で感染または流産を引き起こす。胎児の遺伝子材料として母体血液中の胎児の細胞を使用する可能性に関心が持たれている。これまでに母体血液中に３つの有核胎児細胞が見いだされている（胎盤栄養膜、胎児赤芽細胞、および胎児リンパ球）。母体の全血液中に胎児細胞が観察される頻度は、10^-4 〜10^-8の間であり、これはPCRにより胎児の対立遺伝子（alles）を検出するにはあまりにも低すぎる。 CD71（トランスフェリン受容体）、合胞体栄養細胞成分、多型性HLAクラス１抗原およびCD71／抗グリコホリンＡを用いる蛍光活性化細胞ソーター解析（FACS ）を使用して、母体血液から胎児細胞を濃縮することが、何人かの研究者により記載されている。しかし、FACSは技術的に難しいため、日常的に医学診断使用することができなかった。FACSソーター解析は時間とコストがかかる方法である。 FACSソーター解析は、大量の細胞を分類したり、多種類の細胞を同時に分類することは難しいという欠点を有する。抗体に結合した磁性微粒子を用いて特異的な型の細胞を選択することにより、細胞ソーター解析を行う別のアプローチか記載されている。磁性細胞ソーター解析（MACS）は、母体血液中のCD71⁺細胞を選択するのに使用されているが、ポリメラーゼチェイン反応により胎児の特異的DNAを検出するには濃縮のレベルが不充分である。３つの密度勾配を工程を加えてこの方法を改良することにより、濃縮された細胞画分中の胎児のトリソミーを検出できることが報告されているが、密度勾配の安定性の技術が難しいため、この方法で得られる細胞集団の純度は悪かった。胎児細胞を母体血液から分離し多種類の（かつおそらくは大量の）試料を実験室で処理できる改良されたMACS方法は、出生前診断の分野で大きな利益となるであろう。関連文献母体血液を用いる出生前診断の総説は、Chueh and Golbus（1990）Seminars i n Perinatology 14: 471-482に記載されている。母体細胞から胎児細胞を精製するために蛍光活性化細胞ソーター解析を用いることは、Price，（1990）Am．J．Obst．Gynecol．65: 1731-1737；および Yeaohら、（1991），Prenatal Diagnosis 11: 117-123に記載されている。母体末梢血中に胎児の有核細胞が存在することとその頻度は、Hamadaら、（1993）Hu m．Genet．91: 427-432に記載されている。 DNA配列検出のために多くの方法が発表されている。例えば、Trask（1991）Tr ends in Genetics 7: 149-154; Wileyら、（1984）In Vitro 20: 937-941; Loら、（1991）Nuclec Acid Research 19: 3561-3567; Erlichら、（1991）Eur．J． Immunogenetics 18: 33-55; Kasaiら、（1980）Forensic Sci．35: 1196-1200; およびBudowleら、（1991）Am．J．Hum．Genet．48: 137-144を参照。有核赤血球を濃縮する方法は、Bhatら、（1993）J．Immunol．Methods 158: 2 77-280; Bianchiら、（1993）Prenat．Diagnosis 13: 293-300;およびHolgreve （1992）Am．J．Obstet．Gynecol．166: 1350-1355に記載されている。高勾配磁性細胞ソーター解析は、Miltenyiら（1990）Cytometry 11: 231-238 に記載されている。出生前診断への磁性細胞ソーター解析の応用は、Velascoら、（1992）AJRI 30: 194-201; およびSmith（1993）J．Med．Genet．30: 1051-1 056に記載されている。発明の要約胎児DNA配列と染色体の特徴を非侵襲的方法により検出する方法および組成物が提供される。末梢血を母親から、好ましくは生育している胎児から離れた部位で採取する。２工程高勾配磁性細胞分離法（２重MACS）を用いて、母体血液の単核細胞から胎児の有核細胞を濃縮する。成人リンパ様細胞または骨髄細胞上に存在するマーカーへの特異的結合により、母親の細胞を欠乏させる。別の工程で、 MACSにより胎児の細胞を濃縮する。次にこれらの有核赤血球を、胎児遺伝子物質の供給源として使用し、常法(in situハイブリダイゼーション、中期スプレッド（metaphase spreads）およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのプローブ）により染色体または遺伝子の特徴の存在について解析する。図面の簡単な説明図１Ａと１Ｂは、DNAの供給源として、母親の末梢血単核細胞；母体血液からのCD45^-／CD14^-、CD45⁺／CD14⁺、およびCD45^-／CD14^-／CD71⁺で２重MACSを行なった分類した細胞；および父親の血液からの末梢血単核細胞を用いて、市販のHL A-DQ A1タイピングキットで解析した、HLA-DQ A1遺伝子座のPCR解析結果を示す。図２ＢのDNAを、記載されているようにPCRプレ増幅を行なった。図２は、DNAの供給源として、末梢血単核細胞；母体血液からCD45^-／CD14^-、C D45⁺／CD14⁺、およびCD45^-／CD14^-／CD71⁺で２重MACSを行なった分類した細胞；および父親の血液と子の血液からの末梢血単核細胞を用いた、S1S80遺伝子座のP CR解析結果を示す。具体的な態様の説明胎児DNA配列と染色体の特徴の出生前検出のための方法および組成物が提供される。末梢血を母親から採取する。次に母体血液から有核細胞を調製する。高勾配磁性細胞分離法（２重MACS）、または高密度および低密度磁性分離法の組合せを使用して、母体細胞の欠乏と胎児細胞の濃縮の組合せ工程により、胎児の赤血球を母体細胞から濃縮する。血液細胞の懸濁物を細胞表面抗原に特異的な超常磁性粒子で標識し、次に磁性カラムに結合させて分類する。２つの厳密系（two-stringency system）を使用する場合は、２重MACS法が最も有効であり、この方法では、欠乏工程が効率に標識細胞を捕捉し、濃縮工程は標識細胞を低率に捕捉する。分類された胎児細胞は遺伝子物質の供給源として使用して、これを解析して胎児の性別、または他の遺伝的特徴を測定する。胎児細胞を濃縮するための高勾配磁性細胞ソーター解析（MACS）の使用は、今日使用されているフローサイトメトリー法と比較すると、特に臨床の現場でいくつかの利点を有する。本方法の試薬および装置は安価であり、容易に使用および維持できる。複数のカラムを準備することにより、多くの試料が同時に処理できる。大量の数の試料の処理を簡便をするために自動化システムを使用することができる。母体の循環流中に非常に低頻度で存在する胎児細胞は、比較的大量の母体血液試料を必要とし、これはフローサイトメトリーで分類することは容易ではない。母親は、少なくとも妊娠６週（ｇ．ｗ．）、通常少なくとも約８週またはそれ以後である。一般に母親は、妊娠約８〜20週であるが、必要であればこれ以後でも解析は可能である。母体血液試料は任意の部位から採取される（静脈穿刺が便利である）。試料を通常少なくとも約20ml採取し、より一般的には少なくとも約 40ml採取し、約500mlという多量を採取することもあり、より一般的には約250ml を超えない。血液は常法（例えば、EDTA、ヘパリンまたはクエン酸−ブドウ糖溶液の添加により凝固を防ぐ）により処理される。試料から有核細胞調製物を作成する。成人の赤血球から有核細胞を分離する任意の方法が使用できる。フィコール−ペーク（Ficoll-Paque）密度勾配またはエルトリエーションの使用は、文献に充分記載されている。あるいは、成人赤血球を選択的に溶解する溶液（例えば、塩化アンモニウムカリウム、シュウ酸アンモニウムなど）に、血液細胞を再懸濁する。有核末梢血細胞（NPBC）の試料から選択的に母体細胞を欠乏させる。超常磁性粒子に結合した欠乏試薬を、成人の造血細胞上に存在するが胎児の赤血球には少ししか存在しないかまたは欠損している細胞表面抗原に結合させる。特に有用な欠乏試薬は、細胞表面抗原に対する抗体である。全抗体または断片（例えば、Ｆ ab，Ｆ（ab′）２、軽鎖または重鎖断片）を使用してもよい。このような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でもよく、一般的に市販されているかまたは、当該分野で公知の方法で容易に産生できる。欠乏に使用される抗体は、低レベルの非特異的染色を有するが、一般的に抗原に対して少なくとも100 μＭの親和性を有する。広範囲の型の血液細胞を欠乏させるために、欠乏試薬のカクテルを用いる。一般に、少なくとも約95％の成人有核血液細胞は、カクテル欠乏試薬により結合され、より一般的には少なくとも約99％が、そして好ましくは少なくとも約99.5％の細胞が結合される。欠乏のための好適な抗原には、リンパ様細胞で発現されているCD45；単球上に存在するCD14；前駆細胞上に発現されているCD34、および主に顆粒球上に存在するCD15がある。他の有用な表面抗原には、CD11，CD44，CD46 ，CD48，CD43，CD49d，CD３，CD19，CD56，CD７、およびCD５がある。好適な態様では、CD14，CD45および随時CD34に特異的な抗体のカクテルが使用される。カクテル調製物にとって他の有用なマーカーの組合せは、CD43とCD19；CD３，CD19 ，CD56およびCD15；CD７とCD19；およびCD43とCD５がある。欠乏試薬抗体は、米国特許第4,452,773号および4,230,685号に記載のように、超常磁性粒子に結合される。微粒子は通常、直径が約100nm未満であり、通常直径が約10nmより大きい。結合の正確な方法は、本発明の実施に決定的に重要ではなく、多くの別法が当該分野で公知である。同時係属特許出願第08／252,112号（参考のため本明細書に引用される）に記載のように、抗体は直接粒子に結合される。いくつかの方法により間接結合させることができる。欠乏試薬抗体は、高親和性結合系の１つのメンバー（例えば、ビオチン）に結合され、粒子は他のメンバー（例えば、アビジン）に結合される。欠乏抗体の種特異的エピトープを認識する第２工程の抗体を使用することもできる（例えば、抗−マウス免疫グロブリン、抗−ラット免疫グロブリンなど）。間接結合法により、種々の欠乏抗体とともに単一の磁性結合抗体種を使用することが可能である。１つの好適な方法は、同時係属特許出願第08／252,112号に記載の超常磁性粒子に結合したハプテン特異的第２工程抗体を使用する。ハプテン特異的抗体は、ハプテンに対して通常少なくとも約100μＭの親和性を有する。欠乏抗体は、適当なハプテンに結合される。適当なハプテンには、ジゴキシン、ジコキシゲニン、FITC、ジニトロフェニル、ニトロフェニルなどがある。抗体へのハプテンの結合法は当該分野で公知である。本方法に必ずしも必要ではないが、蛍光色素（例えば、フィコエリスリン、FI TC、ローダミン、テキサスレッド、アロフィコシアニンなど）で欠乏抗体を標識することは有用である。蛍光色素標識物は、欠乏および濃縮工程後に細胞組成物を顕微鏡的にまたはフローサイトメトリーで追跡するために使用することができる。蛍光標識は、磁性粒子と同じ間接結合系を使用することが便利である。例えば、ジゴキシゲニン結合欠乏抗体のカクテルを、磁性粒子に結合した抗−ジゴキシゲニン抗体と一緒にして、次に抗−ハプテン抗体に対する蛍光色素結合抗体で標識する。欠乏試薬抗体は、NPBCの懸濁物に添加され、利用可能な細胞表面抗原に結合するのに充分な時間インキュベートされる。インキュベートは、通常少なくとも約５分間、かつ通常約30分間未満行われる。磁性分離の効率が抗体の不足により制限されないように、反応混合物中には充分な濃度の抗体が存在することが好ましい。適当な濃度は、力価測定により決定される。細胞が分離される媒体は、細胞の生存活性を維持する任意の媒体でよい。好適な媒体は、0.1〜0.5％のBSAを含有するリン酸緩衝化生理食塩水である。種々の媒体は市販されており、細胞の性質に従って使用することができる。これらには、ダルベッコー改変イーグル培地（dMEM）、ハンクス基本塩溶液（HBSS）、ダルベッコーリン酸緩衝化生理食塩水（dPBS）、RPMI、イスコベ（Iscove's）培地、５mMの EDTAを含有するPBSなどに、しばしば胎児牛血清、BSA，HSAなどを捕捉したものがある。第２工程磁性結合抗体が使用される時、細胞懸濁物は、上記の媒体中で洗浄および再懸濁した後、第２工程抗体でインキュベートされる。あるいは、第２工程抗体は、直接反応混合物中に加えられる。直接結合した欠乏抗体が使用される時、細胞懸濁物は、次の工程に直接使用されるか、または媒体中で洗浄され再懸濁される。磁性標識した細胞の懸濁物は、WO90／07380（参考のため本明細書に引用される）に記載のようにカラムまたはチャンバーに適用される。このマトリックスは、最密充填された強磁性粒子、スチールウール、ワイアー、磁性に応答する微粒子などよりなっていてよい。マトリックスは、強磁性物質（例えば、鉄、スチールなど）よりなり、細胞と金属との接触を防ぐために不透過性コーティングによりコーティングしてもよい。マトリックスは、分離チャンバー内で充分な磁界勾配を形成して、磁性標識した細胞が有効的に保持されることを可能にするように、充分な表面積を有するべきである。ある分離に必要な容量は、経験的に決定され、細胞の大きさ、細胞表面上の抗原の密度、細胞数、抗体親和性などにより変化する。最終的細胞調製物の純度を最高にするために、２つの厳密系が使用され、ここで欠乏工程では効率に標識細胞が捕捉され、濃縮工程では標識細胞は低率に捕捉される。これにより、標識細胞が第１の分離工程から第２の工程に持ち越される確率が低下する。欠乏カラムの厳密性とは、磁界の存在下で少なくとも約95％の標識細胞がカラムに保持され、通常標識細胞の少なくとも約99％が保持され、好ましくは少なくとも約99.9％が保持されるものである。強磁性カラムの構造、マトリックス組成物、磁界強度、サイズおよび流速が、カラムに保持される標識細胞の割合を決定するであろう。厳密性を向上させる要因には、カラムサイズと長さの増加、流速の低下、より細かいマトリックス組成である。欠乏工程には、微粒子を有する繊維のカラムマトリックスが好ましい。結合細胞と非結合細胞の解析により、厳密性の経験的な測定が行われる。標識細胞は磁界の存在下で、一般的に少なくとも約100mT、より一般的には約5 00mT、一般的に約２Ｔ以下、さらに一般的には約１Ｔ以下で、マトリックスに結合される。磁界の供給源は、永久磁石または電気磁石でもよい。溶出液中に含有される非結合細胞は、溶出液がカラムを通過する時採取される。より純度を上げるために、非結合細胞を磁性カラムにもう一度通過させてもよい。非結合細胞は、濃縮工程で使用して、胎児有核細胞を選択する。超常磁性粒子に結合した濃縮試薬は、胎児細胞上に存在する細胞表面抗原に結合する。トランスフェリン受容体、CD71、または胎児細胞（特に胎児肝由来の赤血球）上に存在する他の細胞表面マーカーに特異的な試薬の使用が、特に興味深い。超常磁性粒子に直接結合した抗体が好適である。CD71は成人および胎児活性化細胞上に存在し、胎児赤血球上に高レベルで発現される。成人造血前駆細胞上のCD71の発現の混入は、欠乏試薬カクテル中にCD34を使用することにより、避けることができる。他の興味深いマーカーはグリコホリンＡであり、これは成人赤血球と胎児赤血球の両方に発現されている。成人の赤血球は脱核しているため、成人の赤血球が混入しているからといってグリコホリンＡが使用できないことはない。しかし、成人の赤血球を認識する試薬を欠乏工程に含有させるように注意しなければならない。濃縮試薬、超常磁性粒子、カラムおよび緩衝液は、欠乏試薬で記載したように調製されるが、濃縮カラムの厳密性は除去カラムの厳密性より低いであろう。濃縮カラムの厳密性は、磁界の存在下で少なくとも約50％の標識細胞がカラムに保持され、一般的には少なくとも約80％の標識細胞が保持され、一般的には95％以下が保持されるものである。濃縮工程には、球形のカラムマトリックスが好ましい。細胞は磁性マトリックスに結合される。最初の結合後、マトリックスを任意の適当な生理学的緩衝液で洗浄して、非結合細胞を除去する。非結合細胞を廃棄する。結合細胞は、磁界を解除して放出させ、適当な緩衝液中に溶出する。細胞の生存活性を維持する適当な媒体中で細胞を集める。種々の媒体が市販されており、細胞の性質に応じて使用することができ、それらには、dMEM，HBSS，dPBS，RPMI ，PBS-EDTA，PBS、イスコベ(Iscove's)培地などに、しばしば胎児牛血清、BSA， HSAなどを捕捉したものがある。多くの場合で、分離操作は、欠乏工程を最初に行い、次に濃縮工程を行う。濃縮工程を最初に行う場合は、濃縮細胞から磁性標識物を除去するために、濃縮の後に追加の工程が必要である。これは、任意の適当な方法により行われる。濃縮された細胞集団は、デキストラナーゼの溶液でインキュベートされる（ここで、デキストラナーゼは、標識細胞から実質的にすべての微粒子を除去するのに充分な濃度で存在する）。通常、反応は少なくとも約１時間で完了するであろう。次に欠乏工程を、デキストラナーゼで処理した細胞について既に記載したように行う。あるいは、濃縮工程を最初に行い、欠乏工程は微粒子の代わりに大きな磁性粒子を使用するように変更してもよい。そのような磁性粒子の使用は、既に記載されており、試薬は市販されている。濃縮された細胞集団は、欠乏抗体カクテルに結合した約５〜10μｍの高度に磁性のポリマー粒子とともにインキュベートされる。次に細胞の混合物を、磁界の近くに置く。ポリマー粒子に結合した実質的にすべての細胞は、約１分後に磁石に結合し、約５分以内に結合する。非結合細胞はデカントして解析に使用する。欠乏工程と濃縮工程が終了後、細胞を適宜使用する。細胞を採取する方法は、行う解析の型に依存する。精製したDNA試料が必要な操作では、常法に従って細胞を溶解させる。文献に多くの適当な方法が記載されている。解析が全染色体について行われる場合は、細胞は常法に従って適当に調製される。１つの好適な態様において、細胞はフィルターに固定化され、次に適当な蛍光色素が結合した試薬でin situで標識される。遺伝子解析法の選択は、本発明にとって決定的に重要ではない。胎児細胞、DN Aまたは染色体を必要とする任意の従来法の解析が使用できる。例として、特異的DNA配列の検出のためのポリメラーゼチェイン反応、染色体数のための蛍光 in situハイブリダイゼーション、染色体相補体の検出のための中期スプレッド、およびＹ染色体の存在の検出のためのキニクリンマスタードの使用がある。母体の循環流中の胎児細胞の絶対数は少なく、従ってポリメラーゼ連鎖反応（ PCR）を使用する方法は特に興味深い。細胞試料からDNAを単離し、特異的プライマーを使用してDNAの領域を増幅するためにPCRを使用する。増幅されたDNAを次に、特異的対立遺伝子の存在について解析する。解析ではサイズに従ってDNAを分画して、断片長多型を測定するか、またはハイブリダイゼーション法を用いて特異的配列の有無を測定する。ほとんどの場合に、特異的または非特異的プライマーを使用する前増幅工程（PEP）が用いられる。バルクPCR（ここでは、多くの細胞のDNAが単一の反応で増幅される）は、胎児中の父親の対立遺伝子（例えば、Ｙ染色体）の存在を測定するか、または母親と父親の対立遺伝子が区別できる遺伝子を測定するのに特に有用である。胎児細胞と混入している母体細胞を区別するためには遺伝子解析を行うことが有効である。これは、DNAモザイク検出により行われる。単離した単一細胞をPCR により、通常前増幅工程と組合せて増幅する。DNAを増幅し、目的の配列の有無および、父親由来のマーカーについて解析する。父親に割り当てることができる任意の多型が使用できる。特に興味深いのは、主要組織適合遺伝子複合体（例えば、HLA-A，HLA-B，HLA-DP，HLA-DQおよびHLA-DR）、マイクロサテライト（micr osatellite）繰り返し多型（例えば、D9S52，APOC2，D19S49，D1S80，D8S320，S E33など）、タンパク質配列の多型などである。母親のパターンと異なる試料のみを記録し、こうして混入している母体細胞を排除する。 DNAモザイク検出の変法はまた、FISHと組合せて使用される。目的の配列に特異的な蛍光色素標識プローブ以外に、父親由来のマーカー、または胎児特異的マーカー（例えば、ヘモグロビンＦ）のための第２の蛍光色素を有するプローブが添加される。母親のパターンと異なる細胞のみを記録する。本方法により解析される症状には、脆Ｘ（fragile X）；染色体21，18，12，1 3，ＸおよびＹのトリソミー；および他の染色体異常；胎児Ｙ染色体の存在；およびテイ・サックス病、筋ジストロフィー、嚢胞性繊維症、血友病、およびヘモグロビン異常症（例えば、鎌形赤血球貧血、サラセミア）などがある。臨床検査室のニーズに対応するために、本方法を実施するために必要な試薬と装置を有するキットが提供される。そのようなキットは、欠乏工程のための：ハプテン結合マーカー特異的抗体（例えば、抗−CD34、抗−CD45、抗−CD14など）；超常磁性粒子に結合した抗−ハプテン抗体；および高厳密性選択に適したカラムを含んでよい。濃縮工程のために含有される成分には、超常磁性結合したマーカー特異的抗体（例えば、抗−CD71、抗−グリコホリンＡなど）；および低厳密性選択に適したカラムがある。必要な場合は、大きな磁性ビーズを含有してもよい。成人赤血球の溶解、細胞染色および細胞の採取などのための緩衝液が含まれると便利である。１つのカラムのみが用いられるが、複数のカラムが同時に使用されることも予想され、そのような目的のために、自動または手動操作のための装置が提供されてもよい。遺伝子解析のための試薬（特に、PCR増幅のためのプライマー、FISHのための染色試薬および細胞固定化のためのフィルター）も含まれて良い。以下の例は例示のためであり、決して本発明を限定するものではない。実験母体血液からの胎児赤血球の２重MACS濃縮材料と方法末梢血からの単核細胞の単離妊娠女性とその夫達の腕の静脈から20mlの血液を採取して、５％EDTAを加えた。母体細胞の単核細胞と有核赤血球を、フィコール− ペーク(Ficoll-Paque)(ファルマシア(Pharmacia)、ウプサラ、スエーデン)密度勾配遠心分離(600ｇで20分、20℃)により単離した。細胞をPBS(リン酸緩衝化生理食塩水： 137mM塩化ナトリウム、２mM塩化カリウム、８mMリン酸二ナトリウム、1.5mMリン酸二水素カリウム、pH7.4)で２回洗浄した。免疫蛍光と磁性標識前記のように調製した２×１０⁷の末梢血単核細胞（PBMC）を、0.01％アジ化ナトリウムと１％ウシ血清アルブミンを含有する150μｌPBS(PBS／BSA／NaN₃)中に再懸濁し、PBS／BSA中のストック液から１：４希釈したフィコエリスリン結合マウス抗−ヒトCD45モノクローナル抗体（KC56 IgG1 コールター、クレフェルド (Krefeld)、KRG）200μｌで染色し、氷上で10分間インキュベートし、PBS／BSA ／NaN₃で１回洗浄し、30μｌ MACSラット抗マウスIgG1−結合超常磁性マイクロビーズと30μｌ抗−CD14−結合マイクロビーズ（ミルテニイ・バイオテック（Mi ltenyi Biotec）、Gergisch Gladbach，FRG）を含有する150μｌのPBS／BSA／Na N₃で、４℃で15分間標識した。ある実験では、ジゴキシゲニン結合マウス抗−ヒトCD45モノクローナル抗体とジゴキシゲニン結合抗−CD14抗体を、抗−ジゴキシゲニン結合超常磁性粒子とともに使用した。標識細胞をPBSで１回洗浄し、MACS −A2カラムに加えた（ミルテニイ・バイオテック(Miltenyi Biotec)）。最初のMACSソーター解析で陰性の画分を、PBS／BSA／NaN₃中の170μｌのフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合マウス抗−ヒトCD71モノクローナル抗体（12μｇ／ml；LO 1.1，IgG２ａ、ベクトン・ディッキンソン（Becton Dick inson）、サンホセ（San Jose）、カリホルニア州、米国）で氷上で10分間再度染色した。細胞を洗浄し、前記のように60μｌのPBS／BSA／NaN₃中の30μｌのMACSラット抗マウスIgG２ａ＋ｂ−結合超常磁性マイクロビーズ（ミルテニイ・バイオテック(Miltenyi Biotec)）で標識した。次に細胞を洗浄し、MACSでソーター解析した。超常磁性粒子に結合したCD71は、ミルテニイ・バイオテック（ Miltenyi Biotec）から購入した。MACS による細胞ソーター解析 CD45とCD14を発現する細胞の欠乏を目的とする最初のMACSのために、標識細胞をＡ２カラムにかけ、基本的にMiltenyiら（前述）に記載のようにソーター解析した。最適の欠乏のために、MACSカラムの出口で26Ｇの針を用いて、流速を約0. 4ml／分に維持した。次に細胞を１mlの緩衝液で洗浄した。CD45^-／CD14^-細胞の比率の低いCD71⁺細胞の単離を目的とする２回目のMACSのために、MiniMACSカラムを使用した。細胞をCD71結合マイクロビーズで標識した。陰性細胞を、約0.35 ml／分の流速でカラムから１mlの容量で洗い去った。次にカラムを0.5mlの緩衝液で４回洗浄した。最後に磁石の外のカラムからCD45^-／CD71⁺細胞をPBS／BSA／ NaN₃ １mlに溶出した。欠乏工程および濃縮工程でMACSカラムにのせる直前および直後に生細胞の数をノイバウアー計算板により使用直前に評価した。死滅細胞は、トリパンブルー染色で排除した。フローサイトメトリーすべてのソーター解析工程は、FACScanフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、サンホセ（San Jose）、カリホルニア州、米国）を用いて、５変数３色サイトメトリー解析により解析した。試料当たり10 ,000イベントを記録し、FACScan研究ソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、サンホセ（San Jose）、カリホルニア州、米国）を用いて解析した。生細胞を、死滅細胞を特異的に染色するヨウ化プロピジウムを用いて、分散と相対的ヨウ化プロピジウム対フィコエリスリン染色により、ゲートを開いた（図１ＡとＢ、Weichelら、1992）。濃縮と欠乏の因子は以下のように計算した：濃縮因子＝１／除去因子＝（元の試料中の陰性の％／元の試料中の陽性の％）× （陽性画分中の陽性％／陽性画分中の陰性％）および回収率＝（陽性画分中の標的細胞の絶対数）／（元の画分中の標的細胞の絶対数）DNA の抽出とPCR DNAを、アルカリ溶解を用いて標準的方法で抽出した。DNA濃度は、紫外線光度計で280nmで定量した(Beckman UV分光光度計SE550)。製造業者の説明書に従って、Ampli-TypeHLA-DQaキット（シータス(Cetus)、エメリビル（Emeryville）、カリホルニア州）、かつパーキン・エルマー・サーモサイクラー(パーキン・エルマー（Perkin-Elmer）、ウエーバーリンゲン(Ueberl ingen)、FRG)を用いて、HLA-DQ A1遺伝子タイピングを行なった。特異的HLA-DQ A1増幅の前に、ある場合にはZhang（前述）により記載されたプライマー伸長前増幅（PEP）のための非特異的プライマーを使用して、DNAを前増幅した。 DIS80遺伝子座からの配列のPCR増幅は以下のプライマーを用いて行なった： D1S80 PCRのサイクリング条件は以下の通りである：ホットスタート後94℃で変性１分、67℃でアニーリング１分、72℃で伸長１分、30サイクル。PCR産物を、不連続未変性ポリアクリルアミドゲル（濃縮用ゲル：3.5％Ｔ，2.7％Ｃ、分離ゲル：７％Ｔ，４％Ｃ）で分離した。DN A断片を銀染色で検出した。対立遺伝子はサイズが異なり、D1S80タイピングキット(パーキン・エルマー(Perkin-Elmer))の「対立遺伝子ラダー（allelic ladder ）」を用いて分類した。HLA-DQ A1とD1S80 PCRが特異的対立遺伝子を検出する能力を測定するために、１つのヘテロ接合性ドナーからのDNAを、別のヘテロ接合性ドナーからのDNAに力価測定した。両方のドナーは、１つの対立遺伝子を共有した。我々は、この力価をソーター解析したCD45^-／CD71⁺細胞からのDNAの力価と比較した。PCRシグナルが得られなくなる相対的濃度、すなわち感度の限界を、父親の対立遺伝子についてシグナルが得られなくなるCD45^-／CD71⁺細胞からの DNAの濃度と比較した。この時点で対立遺伝子混合物中の特異的対立遺伝子の既知の頻度は、このDNAの希釈の父親の対立遺伝子の頻度と等しいと見なした。結果 MACS によるCD45^-／CD71⁺細胞の精製 11人の妊娠女性（妊娠12週〜25週）の末梢血20mlから、単核細胞を得た。CD45⁺ およびある場合にはCD14⁺細胞を、磁気蛍光的に標識し（散乱に基づき、７１〜９２％の細胞についてゲートを開いた）、そしてMACSカラムで欠乏させた。陰性画分は0.6〜２％の染色細胞を含有した。この画分をCD71について再度磁気的に染色し、第２のMACSを行なった。溶出した画分は、62〜87％のCD71⁺細胞を含有した。両方のMACS染色は、約30分間が必要であった。表１は、２つの分離の結果を示す。フィコールで分離したPBMCからの単純なMA CS CD71⁺濃縮を、同じ試料の２重MACS CD45^-／CD14^-／CD71⁺濃縮と比較した。、CD45／CD14細胞を欠乏後にCD71⁺細胞集団（1.2％）を10倍濃縮（10.2％）し、さらに２重MACS操作によりCD71⁺濃縮を行って32.1倍濃縮し、最終的に全体で301 倍（78.5％）濃縮した。MACS操作の直接のCD71⁺濃縮による濃縮率は、わずかに3 3倍（28.9％）であった。すべての11の分離において、CD45⁺／CD14⁺細胞を72〜92％から0.6％〜2.0％に欠乏させた（除去率 242〜977、平均780）。第２のMACSで、残りのCD45^-／CD14^- 細胞を再度、溶出する細胞の中で1.9％〜4.8％に濃縮した。第１のMACSでCD45／ CD14細胞を欠乏させてCD45^-／CD71⁺細胞を0.5〜2.1％から1.4％〜10.2％に濃縮した(濃縮率2.8〜9.4、平均3.9)。第２のMACSで、残りのCD45^ー／CD71⁺細胞を62 ％〜87％に濃縮した（濃縮率31〜465、平均130）。すなわち、CD45^-／CD71⁺細胞の全体の濃縮率は、300〜820の間で平均500であった。回収率は、38％〜55％であった。ソーター解析した細胞をフローサイトメトリーで解析し、これらから遺伝子解析のためにDNAを調製した。HLA-DO A1 とD1S80多型のPCR解析ソーター解析していない母体単核細胞とソーター解析した母体単核細胞、父親の細胞、およびある場合には新生児の細胞中のDNAを、特異的HLA-DQ対立遺伝子、D1S80断片長多型の検出のためにPCRで解析した。図１に示す実験において（妊娠の１２週）、父親から遺伝した対立遺伝子（対立遺伝子２）をCD45^-／CD14^-／ CD71⁺細胞中に存在したが、ソーター解析していないPBMC，CD45^-／CD14^-またはC D45⁺／CD14⁺画分中には存在しなかった。一部のDNAを、Zhangら、（1993）P.N.A .S．89: 5847-5851に記載のようにプライマー伸長前増幅法(PEP)により前増幅した。妊娠13週目の女性から採取した別の試料において、PEP前増幅とHLA-DO A1遺伝子タイピングの後にのみ、胎児細胞中に父親の対立遺伝子を検出した。 D1S80 PCRで、父親の対立遺伝子はCD45^-／CD14^-／CD71⁺画分中にのみ検出されたが、ソーター解析していないPBMC、またはソーター解析したCD45⁺／CD14⁺細胞中では検出されなかった（図２）。出産後、子の遺伝子型を確認した。解析した11症例のうち７例で、母体血液からの胎児細胞中に父親の対立遺伝子が検出された。HLA-DO A1遺伝子タイピングについて、検出の成功率は11のうち６であった（表２）。１つの試料では、母親と父親はHLA-DO A1対立遺伝子(1.2) を共有し、母親と胎児の間に対立遺伝子の差は証明されなかった。胎児が父親からの共有対立遺伝子を遺伝したかどうかは不明である。 D1S80遺伝子タイピングについて、１つの試料では母親と父親はD1S80対立遺伝子（Ｔ22）を共有し、胎児の対立遺伝子の検出は不可能であった。D1S80多型について、11試料中の３つに胎児対立遺伝子が検出された。これらの試料において、胎児のDQ A1対立遺伝子も検出された。11試料中３つでは、母体細胞のDNAから D1S80 PCR産物は観察されなかった。母体血液中の胎児CD45^-／CD71⁺細胞の頻度 HLA-DO A1とD1S80のPCRによる母体血液中の胎児細胞の相対頻度を、CD45^-／CD 71⁺細胞の力価を、父親の遺伝子型を示す細胞から母親の遺伝子型を示す細胞への力価と比較して推定した。D1S80 PCRは、20の母親の対立遺伝子中１つの父親の対立遺伝子の検出限界で、特異的対立遺伝子長多型を検出することができた。 HLA-DO A1 PCRは、過剰の他の異なる対立遺伝子の存在下で特定の対立遺伝子の検出について高感度を有していた。感度は１／100（PEPなし）〜１／200（PEP有り）であった。２重MACSにより母体血液から濃縮されたCD45^-／CD71⁺細胞について、PCRによる父親の遺伝子の検出限界までのDNAの力価測定は、父親の対立遺伝子対母親の対立遺伝子の１／20〜１／200の相対頻度と一致した。20mlの母体血液のソーター解析したCD45^-／CD71⁺細胞から得られるDNAの平均量は、光学測定で175ngであった。我々は、20mlの母体血液から単離した細胞から0.9〜8.75ngの胎児DNAを得て、これは20mlの母体血液中の130〜1300のCD45^-／CD71⁺細胞に対応する。これは、MACソーター解析の前の、PBMC中の母体細胞の中の胎児細胞の頻度の10^-5〜1 0^-6に対応する。上記結果より、本発明は、母体血液から胎児の有核赤血球を分離するための簡便で迅速な方法を提供することは明らかである。本方法は非侵襲的であり、羊水穿刺や絨毛膜絨毛の採取に伴う感染や流産の危険性がない。操作の容易性、試料の数やサイズをスケールアップすることができることは、既存法と比較して大きな利点である。本明細書で引用したすべての文献や特許出願は、各文献や特許出願が参考のために具体的に個々に引用されているように、参考のため本明細書に引用される。前述のように本発明を例示のためかつ理解を容易にするためにある程度詳細に説明したが、添付の請求の範囲の本質や範囲を逸脱することなく、当業者はこれらの変更や修正が可能であることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ 33/543 ５４１ 33/543 ５４１Ａ 33/553 33/553 33/577 33/577 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ミルテニー，ステファンドイツ連邦共和国，デー−51429 ベルギッシュグラドバッハ，モイツフェルト 60アー (72)発明者ホルツ，イルゲンドイツ連邦共和国，デー−53117 ボン, クレメンツ−ホフバウアーシュトラーセ 37

Claims

【特許請求の範囲】１．胎児の遺伝子の特徴を測定するための非侵襲的出生前試験方法であって、（１）妊娠した母親の血液試料から有核細胞の懸濁物を調製し；成人の造血細胞より発現されるが胎児の赤血球には存在しない少なくとも１つの細胞表面抗原に特異的な磁気的に結合した抗体を、該単核細胞懸濁物に加えて；磁界の存在下で単核細胞の該懸濁物を強磁性マトリックス中を通過させて；そして該強磁性マトリックスに結合しない細胞を集めて欠乏細胞試料を得る、ことを含んでなる工程により、妊娠した母親の血液試料から成人造血細胞を欠乏させて；（２）胎児の赤血球により発現される細胞表面抗原に特異的な磁気的に結合した抗体を、該欠乏細胞の懸濁物に加えて；磁界の存在下で単核細胞の該懸濁物を強磁性マトリックス中を通過させて；非結合細胞の該マトリックスを洗浄し；そして実質的に該磁界の非存在下で該マトリックスから該胎児赤血球を溶出させて、濃縮した細胞試料を得る、ことを含んでなる工程により、該欠乏細胞試料中の胎児赤血球を濃縮し；（３）該濃縮細胞試料の遺伝子物質を、該胎児の遺伝子の特徴について解析する；ことを特徴とする、上記方法。２．成人の造血細胞により発現される少なくとも１つの細胞表面抗原は、CD45，CD14，CD44，CD46，CD48，CD34、およびCD11よりなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。３．該胎児の赤血球により発現される細胞表面抗原は、CD71およびグリコホリンＡよりなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。４．請求の範囲第１項に記載の方法であって、遺伝子物質の解析は：該濃縮した細胞試料からDNAを調製し；ポリメラーゼ連鎖反応により該DNAの特異的領域を増幅し；該増幅したDNA中の父親の配列の存在を測定する、工程を含んでなる、上記方法。５．父親の配列はＹ染色体上に存在する、請求の範囲第４項に記載の方法。６．胎児の遺伝子の特徴を測定するための非侵襲的出生前試験方法であって、（１）妊娠した母親の血液試料から単核細胞の懸濁物を調製し； CD71およびCD14に特異的な磁気的に結合した抗体のカクテルを、該単核細胞懸濁物に加えて；磁界の存在下で単核細胞の該懸濁物を強磁性マトリックス中を通過させて；そして該強磁性マトリックスに結合しない細胞を集めて欠乏細胞試料を得る、ことを含んでなる工程により、妊娠した母親の血液試料から成人造血細胞を欠乏させて；（２）CD71に特異的な磁気的に結合した抗体を、該欠乏細胞試料に加えて；磁界の存在下で単核細胞の該懸濁物を強磁性マトリックス中を通過させて；非結合細胞のマトリックスを洗浄し；そして実質的に該磁界の非存在下で該マトリックスから該胎児赤血球を溶出させて、濃縮した細胞試料を得る、ことを含んでなる工程により、該欠乏細胞試料中の胎児赤血球を濃縮し；（３）該濃縮細胞試料からDNAを調製し；（４）ポリメラーゼチェイン反応により該DNAの特異的領域を増幅し；該増幅したDNA中の父親の配列の存在を測定することを特徴とする、上記方法。７．非侵襲的出生前遺伝子検査のためのキットであって、強磁性マトリックスの２つのカラム； CD45とCD14に特異的な磁気的に結合した抗体のカクテル； CD71に特異的な磁気的に結合した抗体、を含んでなる、上記キット。