JPH10507645A

JPH10507645A - Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼの不溶性凝集物をリフォールディングするための方法

Info

Publication number: JPH10507645A
Application number: JP8534172A
Authority: JP
Inventors: ラタラマナサン，; ミッチェルウェンデル，
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1995-05-12
Filing date: 1996-05-09
Publication date: 1998-07-28
Anticipated expiration: 2016-05-09
Also published as: AU5854196A; MX9708680A; JP3045778B2; US5714371A; CA2220729C; EP0871652A1; WO1996035709A1; CA2220729A1

Abstract

(57)【要約】 HCVプロテアーゼの不溶性凝集物を、可溶化およびリフォールディングするための方法。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼの不溶性凝集物をリフォールディングするための方法発明の背景Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）は、全世界の非Ａ非Ｂ型（NANB）肝炎、慢性肝臓疾患、および肝細胞ガン（HCC）の主な病原体であると考えられる。ウイルス感染は、米国における90％を超える輸血関連の肝炎の原因であり、そして40歳を超える成人における優勢な型の肝炎である。ほぼ全ての感染は、慢性肝炎をもたらし、そしてほぼ20％は肝硬変を発症する。ウイルス粒子は、効率的なインビトロ複製系が無いため、および感染した肝臓組織または血液には非常に微量のHCV粒子しか存在しないために同定されていない。しかし、ウイルスゲノムの分子クローン化が、感染したチンパンジーの血清からメッセンジャーRNA（mRNA）を単離し、次いで組換え方法論を用いてクローン化することにより達成された。［Grakoui A.らJ.Virol．67: 1385-1395(1993) ］。現在、HCVは、約9400ヌクレオチドを含む正鎖RNAゲノムを含むことが知られている。この構成は、フラビウイルスおよびペスチウイルスの構成と同様である。HCVのゲノムは、フラビウイルスおよびペスチウイルスのゲノムと同様に、約3 000アミノ酸の単一の大きなポリタンパク質をコードする。このポリタンパク質は、感染した細胞においてタンパク質分解を受けて成熟ウイルスタンパク質を形成する。ウイルスポリタンパク質の無細胞翻訳および細胞培養発現の研究は、HCVポリタンパク質が、細胞およびウイルスのプロテアーゼによりプロセシングされて推定の構造タンパク質および非構造（NS）タンパク質を産生することを確立した。少なくとも９の成熟ウイルスタンパク質は、特異的なタンパク質分解によりポリタンパク質から産生される。切断産物の順番および名称は、以下の通りである： NH₂-Ｃ-E1-E2-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH（図１）。３つのアミノ末端の推定構造タンパク質であるＣ（キャプシド）、E1，およびE2（２つのエンベロープ糖タンパク質）は、宿主の小胞体（ER）のシグナルペプチダーゼにより切断されると考えられる。宿主の酵素はまた、NS2のアミノ末端の生成を担う。非構造タンパク質のタンパク質分解プロセシングは、ウイルスのポリタンパク質内に含まれるウイルスプロテアーゼであるNS2-3およびNS3により行われる。NS2-3プロテアーゼは、NS2とNS3との間の切断を触媒する。これはメタロプロテアーゼであり、そしてNS2およびNS3のプロテアーゼドメインの両方を必要とする。NS3プロテアーゼは、ポリタンパク質の非構造部分の基質の残りの切断を触媒する。NS 3タンパク質は、631アミノ酸残基を含み、そして２つの酵素ドメイン（アミノ酸残基１〜181内に含まれるプロテアーゼドメインおよび残りのタンパク質内に含まれるヘリカーゼATPaseドメイン）を含む。70kD NS3タンパク質が、感染した細胞において、さらに切断されてプロテアーゼドメインをヘリカーゼドメインから分離するか否かについては知られていないが、細胞培養発現研究において切断は観察されていない。 NS3プロテアーゼは、セリンクラスの酵素のメンバーである。これは、触媒トライアッド（triad）としてHis，Asp、およびSerを含み、Serは活性部位の残基である。Ser残基の変異は、基質NS3/4A、NS4A/4B、NS4B/5A、およびNS5A/5Bの切断をなくす。NS3とNS4Aとの間の切断は分子内である一方、NS4A/4B、4B/5A、5A/ 5B部位での切断はトランスで生じる。哺乳動物細胞における種々の形態のHCV NSポリタンパク質の一過性の発現を用いる実験は、これらの全ての切断の効率的なプロセシングのためにはNS3セリンプロテアーゼが必要であるが、十分ではないことを確立した。フラビウイルスと同様に、HCV NS3プロテアーゼはまた、これらの切断反応のいくつかを触媒するためにコファクターを必要とする。セリンプロテアーゼNS3に加えて、NS4Aタンパク質は、4B/5A部位での基質の切断に絶対的に必要とされ、そして5A/5B間、およびおそらく4A/4B間の基質の切断効率を増加させる。 HCV NS3プロテアーゼは、HCV複製に必要とされる非構造HCVタンパク質を切断するので、NS3プロテアーゼは、HCVウイルスに対する治療剤の開発のターゲットであり得る。HCV NS3タンパク質をコードする遺伝子は、米国特許第5,371,017号に開示されるようにクローン化されたが、しかし、可溶性の活性な形態ではなかった。HCVプロテアーゼが治療剤を発見するためのスクリーニングにおいてターゲットとして有用である場合、プロテアーゼは可溶性の活性な形態で産生されなければならない。従って、可溶性で活性な形態のHCVプロテアーゼが必要とされている。HCVプロテアーゼは、このプロテアーゼのインヒビターを検出するために、そして構造的研究のために、高スループットのスクリーニングに用いられ得る。本発明者らは、NS3プロテアーゼの触媒ドメインをクローン化し、そして天然のタンパク質および融合タンパク質としてE.coliおよび酵母において発現させた。融合タグを用いて、精製および細胞膜周辺腔への分泌を容易にした。これらの全ての構築物は、不溶性形態のみのNS3タンパク質の発現をもたらした。細菌を異なる培地および温度で増殖させること、異なる株のE.coliにおいて発現させることを含む種々の試みは、可溶性のNS3の発現を生じることができなかった。従って、潜在的な治療剤を試験するためのスクリーニングにおいて使用され得る、可溶性で活性な形態のHCVプロテアーゼが必要とされている。発明の要旨本発明は、細菌により産生された不溶性のHCVプロテアーゼ凝集物から、可溶性でタンパク質分解的に活性な、リフォールディングされたHCVプロテアーゼを産生するプロセスを提供することにより、この必要性を満たす。不溶性のHCV NS 3プロテアーゼの凝集物は、この凝集物を産生する細菌から抽出される。次いで、プロテアーゼの凝集物は、変性試薬を含有する緩衝液中で可溶化される。次いで、可溶化されたプロテアーゼは、還元剤を含有する緩衝液中におかれる。この緩衝液は、酸性pHを有する。次いで、変性試薬は、緩衝液を酸性pHに維持する条件下で緩衝液から除去される。次いで、プロテアーゼを含有する緩衝液のpHを、約７〜８のpHまで段階的な様式で上昇させ、適切にリフォールディングした可溶性の活性なNS3プロテアーゼを産生させる。本発明の好ましい実施態様において、不溶性のプロテアーゼを、細菌のホモジネーションまたは超音波処理によって、まず細菌から抽出する。次いで、細菌を含有する凝集物を、塩酸グアニジン（GuHCl）の５Ｍ溶液中で可溶化する。次いで、NS3プロテアーゼを、例えば、溶液をSEPHACRYL S-300サイズ排除ゲルクロマトグラフィーにアプライすることによるような、サイズ排除クロマトグラフィーにより高分子量の凝集物から精製する。NS3プロテアーゼを含有する画分を回収し、そしてGuHClの５Ｍ溶液を含む溶液を、ジチオスレイトールおよびラウリルマルトシドを含有するリフォールディング緩衝液中で約0.1Ｍ GuHClまで希釈する。次いで、希釈された溶液を逆相クロマトグラフィーカラムにアプライし、そしてNS3プロテアーゼを含有するプールを回収する。次いで、プロテアーゼ画分のpHを約7.4〜7.8まで段階的な様式で上昇させて、適切にリフォールディングした可溶性で活性なNS3プロテアーゼを産生する。発明の詳細な説明引用される全ての参考文献の教示は、本明細書中にその全体が参考として援用される。 NS3プロテアーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列を、配列番号１に示す。本発明の前に、NS3プロテアーゼは、抽出および精製に十分な量で可溶性形態で生成され得なかった。本発明は、細菌で産生された可溶性HCVプロテアーゼを可溶化し、そしてリフォールディングするための方法を提供する。本発明によれば、配列番号１および配列番号４に示す配列を有する可溶性HCV NS3プロテアーゼが産生され得る。NS3プロテアーゼはまた、ニッケル（Ni²⁺）でコーティングした樹脂におけるタンパク質の精製に用いるために、そのアミノ酸末端に融合されたヒスチジンタグを有し得る。配列番号５を参照のこと。プロテアーゼは、E．coliのような細菌における不溶性の凝集物（すなわち、封入体）として産生される。不溶性HCV NS3プロテアーゼは、最初に、細菌の均質化または超音波処理により、細菌から抽出される。次いで、細菌を含有する凝集物を、可溶化剤で可溶化する。適切な可溶化剤は、塩酸グアニジン（GuHCl）、尿素、およびグルトチオシアネートである。好ましくは、可溶化剤は、５MのGuHCl溶液である。次いで、好ましい実施態様において、可溶化したNS3プロテアーゼを、サイズ排除クロマトグラフィーにより（例えば、SEPHACRYL S-300サイズ排除ゲルカラムにこの溶液をアプライすることにより）、高分子量凝集物から精製する。可溶化剤中のNS 3プロテアーゼを含有する画分を、還元剤を含有するリフォールディング緩衝液中に希釈する。適切な還元剤の例は、ジチオスレイトール（DTT）、ジチオエリトリトール（DET）、およびβ-メルカプトエタノールである。好ましいリフォールディング緩衝液は、約10％のDTTを含有する。リフォールディング緩衝液はまた、好ましくは、非イオン性界面活性剤を含有する。非イオン性界面活性剤の例は、ラウリルマルトシド、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、TRITON X-100 ト）(CHAPS)、およびオクチルグルコシドである。好ましくは、プロテアーゼの不溶性凝集物は、５M GuHCl中で可溶化される。サイズ排除ゲルカラムからの精製した画分をプールし、そして10％ジチオスレイトールおよび0.1％ラウリルマルトシドを含有するリフォールディング緩衝液中の約0.1M GuHClに希釈する。次いで、希釈した溶液を逆相クロマトグラフィーカラムにアプライし、そしてNS3 プロテアーゼを含有するプールを回収する。次いで、プロテアーゼ画分のpHを段階的な様式で、約７〜８に、好ましくは、7.4〜7.8に上昇させ、正確にリフォールディングされた可溶性の活性なNS3プロテアーゼを生成する。本発明のNS3プロテアーゼをコードするDNAは、既知の核酸配列［Ratnerら、Nu cleic Acids Res．13:5007(1985)］、およびMatteucciら［J Am．Chem．Soc．10 3:3185(1981)］のホスホルアミダイト固体支持法、またはYooら［J．Bilol．Che m．764:17078(1989)］の方法のような標準的な方法を用いる化学的合成によって調製され得る。Glick，Bernard R.およびPasternak，Molecular Biotechnology :55-63頁（ASM Press，Washington D.C．1994）も参照のこと。プロテアーゼをコードする遺伝子はまた、Grakoui，A.，Wychowski，C.，Lin，C.，Feinstone， S．M.およびRice，C．M.，Ｃ型肝炎ウイルスポリタンパク質切断産物の発現および同定、J．Virol 67:1385-1395(1993)に開示されたプラスミドを用いて得ることができる。さらに、HCVプロテアーゼをコードする核酸を、（HCVウイルスに感染した患者から）単離し、増幅し、そしてクローン化し得る。さらに、HCVゲノムは、PCT WO 89/04669に開示されており、そしてAmerican Type Culture Colle ction（(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD）からATCC受託番号40 394のもとで入手可能である。もちろん、遺伝コードの縮重のため、本明細書中で規定されるような成熟ヒト HCVプロテアーゼをコードし得る多くの機能的に等価な核酸配列が存在する。化学的合成、改変されたプライマーを用いるPCR、および部位特異的変異誘発のような公知の方法を用いて容易に調製され得るこのような機能的に等価な配列は、本発明の範囲内にある。本明細書中に用いられる用語「形質転換された細菌」は、遺伝子操作されて哺乳動物タンパク質を産生する細菌を意味する。このような遺伝子操作は、通常、細菌中への発現ベクターの導入を必要とする。発現ベクターは、細菌ゲノム中の遺伝子に相関した自律的複製およびタンパク質発現が可能である。細菌発現の構築は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が公知であるか、さもなければ利用可能であるならば、当該分野で周知である。例えば、DeBoer、米国特許第4,551,433号は、細菌発現ベクターにおいて使用するためのプロモーターを開示する；Goeddelら、米国特許第4,601,980号、およびRiggs、米国特許第4,431 ,739号は、E．coli発現系による哺乳動物タンパク質の産生を開示する；そしてR iggs、前出、Ferrettiら、Proc．Natl．Acad．Sci．83:599(1986)、Sproatら、N ucleic Acids Research 13:2959(1985)、およびMullenbachら、J．Biol．Chem 2 61:719(1986)は、細菌における発現のための合成遺伝子を構築する方法を開示する。多くの細菌発現ベクターが市販されており、そしてAmerican Type Culture Collection(ATCC)，Rockville，Marylandから入手可能である。ベクターへのヒトHCVプロテアーゼをコードするDNAの挿入は、DNAおよびベクターの両方の末端が同じ制限部位を含む場合、容易に達成される。そうでない場合は、DNAおよび/またはベクターの末端を、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生成された１本鎖DNA突出を削り取る（digest back）ことによって改変し、平滑末端を生成するか、または適切なDNAポリメラーゼを用いて１本鎖末端をフィルインすることによって同じ結果を達成することが必要であり得る。あるいは、所望の任意の部位は、末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することによって作製され得る。このようなリンカーは、所望の制限部位を規定する特定のオリゴヌクレオチド配列を含み得る。切断されたベクターおよびDNAフラグメントはまた、必要な場合、ホモポリマーテーリングによって改変され得る。多くのE．coli適合性発現ベクターを用いて、本発明の可溶性HCV NS3プロテアーゼを産生し得る。これらのベクターとしては、細菌性プロモーターまたはバクテリオファージプロモーター（例えば、Tac、Lac、Trp、Lac UV5、1P_r、および1 P_Lプロモーター）を含むベクターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、選択されるベクターは、HCVプロテアーゼ発現速度の調節を可能にする発現制御配列を有する。その上、HCVプロテアーゼ産生は調節されて、宿主細胞に対する毒性を示し得る過剰産生を回避し得る。最も好ましいのは、５’から３ ’に（上流から下流に）Tacプロモーター、Iac I^qリプレッサー遺伝子、および成熟ヒトHCVプロテアーゼをコードするDNAを含むベクターである。本発明の使用のために選択されるベクターはまた、分泌リーダー（例えば、ompAまたはプロテインＡのリーダー）を、これらのリーダーが翻訳後プロセシングの間に切断されて成熟HCVプロテアーゼを産生するか、またはリーダーが切断されない場合、このリーダーがプロテアーゼの酵素活性を干渉しない限り、コードし得る。融合ペプチドは、代表的には、組換え核酸法または合成ポリペプチド法のいずれかによって作製される。核酸操作および発現のための技術は、一般に、例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）第１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory；およびAusubelら（編）（1993）Curr ent Protocols in Molecular Biology，Greene and Wiley，NYに記載される。ポリペプチドの合成のための技術は、例えば、Merrifield（1963）J．Amer．Chem ．Soc．85:2149-2156；Merrifield（1986）Science 232:341-347；およびStewar tら(1984)、「Solid Phase Peptide Synthesis」（第２版）、Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.；およびAthertonら（1989）Solid Phase Peptide Synthesi s: A Practical Approach，IRL Press，Oxford；およびGrant（1992）Synthetic Peptides: A User's Guide，W．H．Freeman，NYに記載される。 NS4Aコファクター（配列番号６、７、および８）のようなより小さなペプチド、ならびに基質である5A/5B（配列番号５）および4B/5A（配列番号９）は、適切な方法（例えば、排他的（exclusive）固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合、または古典的溶液合成）によって合成され得る。ポリペプチドは、好ましくは、Merrifield，J．Am．Chem．Soc．85:2149(1963)によって記載されるような固相ペプチド合成によって調製される。合成は、αアミノ末端が保護されているアミノ酸を用いて行われる。不安定な側鎖を有する三官能性アミノ酸もまた、適切な基で保護されて、ポリペプチドの組み立ての間に、所望されない化学反応が生じるのを防止する。αアミノ保護基は選択的に除去され、アミノ末端で起こるその後の反応を可能にする。αアミノ保護基の除去のための条件は、側鎖保護基を除去しない。 αアミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成の分野で有用であることが公知の基である。この中には、アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、アリール型保護基（例えば、ビオチニル）、芳香族ウレタン型保護基［例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、置換ベンジルオキシカルボニル、および9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）］、脂肪族ウレタン保護基［例えば、t-ブチルオキシカルボニル（tBoc）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］、およびアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が含まれる。好ましい保護基は、tBoc およびFmocであり、従って、ペプチドは、それぞれtBocおよびFmoc化学によって合成されると言われる。選択される側鎖保護基は、カップリングの間インタクトなままでなければならず、かつアミノ末端保護基の脱保護の間、またはカップリング条件の間に除去されてはならない。側鎖保護基はまた、合成の完了に際して、完成したポリペプチドを変化させない反応条件を用いて、除去可能でなければならない。tBoc化学において、三官能アミノ酸のための側鎖保護基は、主としてベンジルに基づく。Fm oc化学において、これらは主としてt-ブチルまたはトリチルに基づく。 tBoc化学において、好ましい側鎖保護基は、Argについてはトシル、Aspについてはシクロヘキシル、Cysについては4-メチルベンジル（およびアセトアミドメチル）、Glu．SerおよびThrについてはベンジル、Hisについてはベンジルオキシメチル（およびジニトロフェニル）、Lysについては2-C1-ベンジルオキシカルボニル、Trpについてはホルミル、およびTyrについては2-ブロモベンジルである。 Fmoc化学において、好ましい側鎖保護基は、Argについては2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル(Pmc)または2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル(Pbf)、Asn，Cys、Gln、およびHisについてはトリチル、As p、Glu、Ser，Thr、およびTyrについてはtert.ブチル、LysおよびTrpについては tBocである。ホスホペプチドの合成のために、リン酸基の直接取り込みまたは組み立て後の取り込みのいずれかが使用される。直接取り込みストラテジーにおいて、Ser、T hr、またはTyrにおけるリン酸基は、Fmoc化学においてメチル、ベンジル、もしくはtert.ブチルにより、またはtBoc化学においてメチル、ベンジル、もしくはフェニルによって保護され得る。リン酸保護を伴わないホスホチロシンの直接取り込みはまた、Fmoc化学において使用され得る。組み立て後取り込みストラテジーにおいて、Ser，Thr、またはTyrの保護されていない水酸基は、ジ-tert.ブチル、ジベンジル-、またはジメチル-N,N'-ジイソプロピルホスホルアミジトを用いて固相に誘導体化され、次いでtert.ブチルヒドロパーオキシドにより酸化された。固相合成は、通常、αアミノ保護された（側鎖保護された）アミノ酸を適切な固体支持体にカップリングすることにより、カルボキシル末端から行われる。エステル結合は、クロロメチル樹脂、クロロトリチル樹脂、またはヒドロキシメチル樹脂に連結されると形成され、そして得られたポリペプチドはＣ末端に遊離のカルボキシル基を有する。あるいは、ベンズヒドリルアミン樹脂またはp-メチルベンズヒドリルアミン樹脂のようなアミド樹脂(tBOC化学用）ならびにRinkアミド樹脂またはPAL樹脂（Fmoc化学用）が使用される場合、アミド結合が形成され、そして得られたポリペプチドはＣ末端でカルボキシアミド基を有する。これらの樹脂は、ポリスチレンもしくはポリエチレンベースまたはポリエチレングリコールグラフト化、ハンドルまたはリンカーの存在または非存在、第１アミノ酸連結の存在または非存在のいずれでも市販され、そしてそれらの調製はStewartら( 1984)、「Solid Phase Peptide Synthesis」（第２版）、Pierce Chemical Co., Rockford,IL.;およびBayerおよびRapp(1986)Chem.Pept.Prot.3,3;およびAtherto nら（1989）Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach,IRL Press ,Oxfordにより記載されている。必要であれば、側鎖およびαアミノ基が保護されたＣ末端アミノ酸は、種々の活性化薬剤（ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIPCDI)およびカルボニルジイミダゾール(CDI)を含む）を用いてヒドロキシルメチル樹脂に連結される。そのセシウムテトラメチルアンモニウム塩形態において、またはトリエチルアミン(TEA)またはジイソプロピルエチルアミン(DIEA)の存在において直接クロロメチル樹脂またはクロロトリチル樹脂に連結され得る。アミド樹脂に対する第１のアミノ酸連結は、カップリング反応間のアミド結合形成と同じである。樹脂支持体への連結の後に、α-アミノ保護基は、保護化学(例えば、tBoc、Fm oc)に依存して種々の試薬を用いて除去される。Fmoc除去の程度は、300〜320nm で、または電導度セルによりモニターされ得る。αアミノ保護基の除去後、残存する保護アミノ酸は、所望の配列を得るために必要とされる順番で順次カップリングされる。カップリング反応のために種々の活性化薬剤が使用され得る。これらの活性化薬剤としては、DCC、DIPCDI、2-クロロ-1,3-ジメチルイミジウムヘキサフルオロホスフェート(CIP)、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-(ジエチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)およびそのピロリジンアナログ(PyBOP)、ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBroP)、0-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)およびそのテトラフルオロボレートアナログ(TBTU)またはそのピロリジンアナログ(HBPyU)、0-(7-アザベンゾトリアゾール -1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU) およびそのテトラフルオロボレートアナログ(TATU)またはピロリジンアナログ(H APyU)が挙げられる。カップリング反応に使用される最も一般的な触媒添加剤としては、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)、3-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(HODhbt)、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt) 、および1-ヒドロキシ-7-アザベンゼゾトリアゾール(HOAt)が挙げられる。それぞれ保護されたアミノ酸は、過剰（＞2.0等量）で使用され、そしてカップリングは、通常、Ｎ-メチルピロリドン(NMP)あるいはDMF、CH₂Cl₂またはそれらの混合物において行われる。カップリング反応の完了の程度は、各段階で（例えば、Kaiserら、Anal.Biochem.34:595(1970)に記載のニンヒドリン反応により）モニターされ得る。不完全なカップリングが見出される場合、カップリング反応は延長され、繰り返され、そしてカオトロピック塩が添加され得る。カップリング反応は、市販の装置（例えば、ABIモデル430A、431Aおよび433Aペプチド合成機）を用いて自動的に行われ得る。所望のペプチドの完全な組み立て後、ペプチド樹脂は、適切なスカベンジャー（scavenger）を有する試薬を用いて切断される。Fmocペプチドは通常切断され、そしてスカベンジャー（例えば、H₂O、エタンエジチオール、フェノール、およびチオアニゾール）を有するTFAにより脱保護される。tBOCペプチドは通常切断され、そして１〜２時間、-5℃から０℃で液体HFを用いて脱保護される。これは樹脂からポリペプチドを切断し、そして側鎖保護基の大部分を除去する。スカベンジャー（例えば、アニゾール、ジメチルスルフィド、およびp-チオクレゾール）は、通常液体HFと共に使用され、切断の間形成されるカチオンがポリペプチドに存在するアミノ酸残基をアルキル化およびアシル化するのを防止する。Trp のホルミル基およびHisのジニトロフェニル基は、それぞれHF切断の前にDMF中のピペリジンおよびチオフェノールにより除去されることを必要とする。Cysのアセトアミドメチル基は、酢酸水銀(II)、あるいは同時にシステインからシスチンに酸化するヨウ素、トリフルオロ酢酸タリウム(III)またはテトラフルオロボレート銀により除去され得る。tBocペプチド切断および脱保護に使用される他の強酸としては、トリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)およびトリメチルシリルトリフルオロアセテート(TMSOTf)が挙げられる。以下の実施例は、本発明を例示するために挙げられるが、これらに限定されない。実施例１ HCV NS3 プロテアーゼの産生Ａ．プラスミド構築。いくつかのプラスミドを、HCVプロテアーゼをE.Coliで発現するために、標準的な組換えDNA技術(Sambrook,FritschおよびManiatis)を用いて設計および構築した（図２〜７）。全てのHCVの特定の配列は、親プラスミドpBRTM/HCV 1-3011 に由来した(Grakouiら、1993)。プロテアーゼのＮ末端183アミノ酸バージョンを発現するために、停止コドンを、合成オリゴヌクレオチドを用いてHCVゲノムに挿入した（図３）。Ｎ末端246アミノ酸残基を発現するために設計されたプラスミドを、Ｃ末端の天然のNcoI制限部位により作製した。 i)プラスミドpBJ1015の構築（図２）完全なHCVゲノムを含むプラスミドpBRTM/HCV 1-3011(Grakoui Aら、J.Virol.6 7:1385-1395)を、制限酵素ScaIおよびHpaIで消化し、そして7138bp(塩基対)DNA フラグメントを単離し、そしてpSP72(Promega)のSmaI部位にクローン化してプラスミドpRJ201を作製した。プラスミドpRJ201をMscIで消化して2106bpのMscIフラグメントを単離し、そしてプラスミドpBD7のSmaI部位にクローン化した。得られたプラスミドpMBM48をKasIおよびNcoIで消化し、そしてクレノウポリメラーゼでの平滑末端化後、734bpのDNAフラグメントを単離してNcoI消化したクレノウポリメラーゼ処理したpTrcHIS B配列発現プラスミド(Invitrogen)にクローン化した。この連結により、HCV配列の５’末端部位にNcoI部位および３’末端部位にNsi I部位が再生された。次いで、プラスミドpTHB HCV NS3をNcoIおよびNsiIで消化し、そしてクレノウポリメラーゼおよびT4 DNAポリメラーゼで処理し、平滑末端化した738bpのDNAフラグメントを生成した。このフラグメントを単離し、そして AspI切断、クレノウポリメラーゼ処理した発現プラスミドpQE30(HIV)にクローン化した。得られたプラスミドpBJ 1015は、HCV NS3(246アミノ酸)プロテアーゼを発現する。 (ii)アミノ酸183の後ろに停止コドンを有するプラスミドpTS 56-9の構築（図３）プラスミドpTHB HCV NS3をNcoIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理し、次いでBstYIで消化した；そしてHCV配列を含むDNAフラグメントを単離し、そしてS maIおよびBglII消化したpSP72にクローン化した。次いで、得られたプラスミドp TS 49-27をBglIIおよびHpaIで消化し、そして２本鎖オリゴヌクレオチド： GA TCA CCG GTC TAG ATCT T GGC CAG ATC TAGA（配列番号３）を連結し、pTS56-9を作製した。従って、停止コドンは、NS3タンパク質のプロテアーゼ触媒ドメインをコードするDNAの末端に直接配置された。これは、HCVプロテアーゼがNS3タンパク質のヘリカーセドメインから独立して発現されることを可能にした。 (iii)プラスミド pT5 His HIV-NS3の構築（図４）プラスミドpTS56-9をBglIIで消化し、そして５’末端をフィルインするためにクレノウポリメラーゼで処理した。次いで、プラスミドをNgoMIで消化し、そしてNS3配列を含む平滑末端化BglII/NgoMIフラグメントを単離し、そしてSglI、クレノウ処理NgmMI切断、およびSalIクレノウ処理したpBJ 1015に連結した。得られたプラスミドをpT5His HIV 183と名付ける。実施例２不溶性HCV NS3プロテアーゼのリフォールディング本実施例は、HCV NS3プロテアーゼのリフォールディングの新規のプロセスを記載する。HCV NS3プロテアーゼはE．coli封入体ペレット由来の可溶化のモチーフを有さない。この手順を用いて、活性アッセイおよび構造研究のために精製された酵素を生成し得る。 E.coli 封入体ペレット由来のHis-HIV 183の抽出および精製 HisHIV183のプラスミドを有するE.coli細胞を用いて、市販供給源により推奨される方法に従って、E.coli M15[pREP]株(Qiagen)（これはIacリプレッサーを過剰発現する）の培養物を形質転換した。組換えプラスミドを有するM15[pREP] 細菌を、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを補充した20- 10-5ブロス中で一晩増殖させた。培養物をO.D.600が0.1になるように希釈し、次いでO.D.600が0.6〜0.8になるまで37℃で増殖させた後、１mMの最終濃度になるようにIPTGを添加した。誘導の２〜３時間後、細胞をペレット化することにより回収し、細胞ペレットを100mM Tris(pH 7.5)で洗浄し、そして遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを、ペレットの各gm湿重量あたり10mlの0.1M Tris- HCl、５mM EDTA(pH 8.0)(緩衝液Ａ)中に再懸濁した。Dounceホモジナイザーを用いてペレットをホモジナイズし、そして再懸濁した。懸濁液を20,000×gで30分間、４℃で遠心分離することにより明澄化した。このペレットを以下の５つの緩衝液で連続的に洗浄した。１．緩衝液Ａ２．1.0M塩化ナトリウム(NaCl)含有緩衝液Ａ３．1.0％Triton X-100含有緩衝液Ａ４．緩衝液Ａ５．1.0MグアニジンHCl(GuHCl)含有緩衝液Ａ洗浄したペレットを５M GuHCl、１％βメルカプトエタノールを含有する緩衝液Ａ（ペレットgm湿重量あたり３ml）で、Dounceホモジナイザーを用いて可溶化し、100,000×gで30分間、４℃で遠心分離した。高分子量凝集物からの変性HisH IV183の精製を、SEPHACRYL S-300ゲル濾過カラム上でのサイズ排除により達成した。特に、5.0M GuHClのE.coli抽出物の８mlサンプルを、流速1.0ml/分で、160ml Pharmacia S-300カラム(1.6×100 cm)にアプライした。カラム緩衝液は、5.0M G uHCl、0.1M Tris-HCl(pH 8.0)、および5.0mM EDTAを含んでいた。画分サイズは5 .0mlであった。適切な画分を、SDS-PAGEの結果ならびにProBlotへ転写されたタンパク質のＮ末端配列分析に基づいてプールした。HCV- プロテアーゼの界面活性剤に補助されるリフォールディングタンパク質を43mm Amicon YM10膜を用いて限外濾過することにより、５M GuHC l、0.1M Tris-HCl(pH 8.0)、１.0mM EDTA、1.0％βメルカプトエタノール中で1. 0mg/mlまで濃縮した。次いで、これを50倍希釈してリフォールディング緩衝液(1 0 0 mM リン酸ナトリウム(pH 8.0)、10mM DTT、0.1%ラウリルマルトシド)中で0.1M GuHClとし、そして混合物を氷上で少なくとも１時間インキュベートした。リフォールディング緩衝液中の500μgのタンパク質を含有する25mlのサンプルを、Pr o-RPC HR 3/5逆相クロマトグラフィーカラムにアプライした。アプライしたサンプルは、25mlのリフォールディング緩衝液中に500μgのタンパク質を含んでいた。次いでカラムに、99.9％H₂O＋0.1％トリフルロ酢酸(TFA)を含む溶液Ｂをアプライした。10ml容量の溶液Ｃ（10％H₂O、90％アセトニトリル(AcN)＋0.1% TFA）を、流速0.5ml/分および0.5mlの画分サイズで溶液Ｂ中に０〜60％グラジエントでカラムにアプライした。この画分を、A214;2.0吸収ユニットフルスケール(AUF S)でモニターした。タンパク質（ピーク１に対応する）を含有する画分を段階的な透析による再生のためにプールした。この画分をまず0.1％TFAを含有する25％グリセロール中で、一晩４℃で透析した。これらのプールした画分は、0.1％TFA濃度、40％アセトニトリル濃度、および１より小さいpHを有した。次いで、画分を、0.01％TFAを含有する25％グリセロール中で４℃で一晩透析してpHを約２に上げた；次いで0. 001％TFA含有25％グリセロール中で３時間透析してpHを約３に上げた；次いで50 mM NaPO₄(pH 6.0)、10mM DTT含有25％グリセロール中で３時間、４℃で透析して pHを約６に上げた。次いで、このタンパク質を50mM NaPO₄(pH 7.0)、0.15M NaCl 、10mM DTTを含有する25％グリセロール中で3.0時間、４℃で透析し；次いで最後に50mM NaPO₄(pH 7.8)、0.3M NaCl、10mM DTT、0.2％Tween 20を含有する25％グリセロール中で透析した。この結果、約7.4〜7.8のpHを有する溶液中で、精製された、リフォールディングされた、可溶性の、活性HCV NS3プロテアーゼが生じた。タンパク質の遠UV円偏光二色性(CD)分析を用いて、酸変性状態から中性pHにおける折りたたみ状態までのリフォールディングをモニターした。タンパク質回復をUVスキャンおよびSDS-PAGE分析によりモニターした。結果： His-HIV183 の界面活性剤に補助されるリフォールディング HisHIV183をE.coli封入体ペレットから定量的に抽出した。抽出の様々な段階におけるSDS-PAGE分析は、連続的な洗浄が、混入しているタンパク質の有意の量を除去するために必須であるということを示す。HisHIV183を、５M GuHClの存在下で洗浄した封入体ペレットから抽出した。５M GuHCl抽出物をSEPHACRYL S-300 カラムにアプライし、そして適切な画分をSDS-PAGE分析に基づいてプールした。最初の10個の残基のアミノ酸配列を確認した。リフォールディングは、DTT、ラウリルマルトシド、およびグリセロールの存在下で、４℃で、非常に低いタンパク質の濃度において行った。希釈したタンパク質をPro-RPC逆相カラムで濃縮した。２つのピークをUVおよびタンパク質プロフィールに基づいて得た。ピーク１のみが段階的透析後に可溶性タンパク質を生じた。遠UV CDスペクトル分析を用いて、酸性pHでの変性状態から中性pHでの折りたたみ状態へのリフォールディングをモニターした。pH 7.4において、タンパク質は有意な量の２次構造（βシートタンパク質の構造と一致する）を示すことが見出された。低pHでは、CDスペクトルは、タンパク質が200nmで最小モル楕円率を有する完全なランダムコイルであることを示した。220nmの肩の値に対する2 00nmのこの最小値の比は約４：１である。この比は２次構造形成が中性pHで起こる場合に減少した。透析の各段階でのUVスキャンは、タンパク質回収率がpH7.0まででは90％より大きく、そしてタンパク質凝集物に起因する光散乱効果が存在しなかったことを示した。SDS-PAGE分析はまた、リフォールディングの間、pH 7.0までではタンパク質の損失がないということを示した。タンパク質の沈殿が、透析の最後の段階で生じ、そして可溶性タンパク質を遠心分離により明澄化した。全体のタンパク質回収率は約10％であった。リフォールディングされたタンパク質は、4Aペプチドの存在下でインビトロ翻訳された5A/5B基質を用いるトランス-切断アッセイにおいて活性であることが見出された。実施例３インビトロ翻訳アッセイによるNS3プロテアーゼ活性の分析トランスでHCV NS3プロテアーゼ活性を検出するために、本発明者らは、無細胞翻訳系において、NS5A/5B切断部位を含む40kDタンパク質を発現させ、そしてこれをこの酵素の基質として使用した。基質タンパク質は、HCV NS3プロテアーゼによる切断の際に、見かけの分子量が12.5kD(NS 5A')および27kD(NS 5B')である２つのタンパク質生成物を生成する。基質5A/5BをコードするプラスミドpTS102を、EcoR Iを用いる消化により線状化し、そしてT7 RNAポリメラーゼを使用してインビトロで転写した。RNAを、製造者(Promega)のプロトコルに従い、ウサギ網状赤血球溶解物において、³⁵Ｓメチオニンの存在下で翻訳させてHCV特異的タンパク質を産生した。10mM Tris(pH 7.5)、１mM DTT、0.5mM EDTA、および10％グリセロールを含む20μlの総反応混合物中に、２〜８μlの³⁵Ｓメチオニン標識された翻訳5A/5B基質を配置した。10 μlのHCV NS3プロテアーゼ(配列番号２)を、ほぼ等モル量(２μM)のカルボキシ末端33merコファクターNS4A(配列番号７)とともに、可溶化緩衝液(50mM リン酸N a(pH 7.8)、0.3M NaCl、0.2％ Tween 20、10mM DTTまたはBME、10％グリセロール)中に添加することによって反応を開始し、そしてこの反応物を30℃で約１時間インキュベートした。等容量の２×Laemmliサンプル緩衝液(Enprotech Inc.) を添加し、そして100℃で３分間加熱することによって反応を停止した。反応生成物を、SDS PAGE電気泳動により分離し、ゲルを固定し、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーにかけた。このアッセイは、用量反応性の様式で5A/5B基質を切断し、期待される切断生成物：5A(12.5kD)および5B(27kD)(SDS PAGE分析により示されるように)を生成し得た。5A/5B基質からの切断された5Aおよび5Bポリペプチドの生成は、可溶性で活性のリフォールディングされたHCVプロテアーゼが、確かに、本発明のプロセスにより生成されたことの証拠である。実施例４触媒ドメインHis-HIV 183の界面活性剤に補助されるリフォールディング HCVプロテアーゼ触媒ドメインは、E.coliにおいて高濃度で、封入体ペレットとして発現されており、そしてリフォールディング研究を容易にする。His-HIVN S3183は、６残基のポリヒスチジンタグ、27残基のHIVプロテアーゼ切断配列、および183アミノ酸のセリンプロテアーゼドメインを含む。His-HIVNS3 183を、実施例２の手順に従い５M GuHCLを用いて抽出した。5.0M GuHCl E.coli抽出物のサンプルを、４ml/分の流速で、500mlのPharmacia S-300カラム(5.0×100cm)にアプライした。カラム緩衝液は実施例２で使用した緩衝液と同じであった。約100m gの高度に精製されたタンパク質を、リフォールディング研究のために得た。タンパク質(1.0mg/ml)を含む画分を回収し、そして緩衝液Ａ(100mMリン酸ナトリウム(pH 7.8)、25％グリセロール、0.1％ラウリルマルトシド、および10mM DT T)中で50倍に希釈し、そして直ぐにPOROS 20R1逆相カラムにアプライした。主要なピークおよびショルダーを、0.1％TFA中の０〜60％アセトニトリルグラジエントを用いて溶出した。ショルダーではなく、主要なピークのみが、段階的な透析手順を使用して活性なプロテアーゼを生じた。タンパク質(ピーク１に対応)を含む画分を、段階的な透析による再生用にプールした。この画分をまず、25％グリセロール中の0.1％TFAにおいて、４℃にて一晩透析した。これらのプールした画分は、0.1％TFA、40％アセトニトリルの濃度、および１未満のpHを有した。次いで、画分を、25％グリセロール中の0.01％TF Aにおいて、pHを約２まで上昇させて４℃にて一晩透析し、次いで25％グリセロール中の0.001％TFAにおいて、pHを約３まで上昇させて3.0時間透析し、次いで2 5％グリセロール中の50mM NaPO₄(pH6.0)、10mM DTTにおいて、pHを約６まで上昇させて４℃にて3時間透析した。次いで、タンパク質を、25％グリセロール中の5 0mM NaPO₄(pH7.0)、0.15M NaCl、10mM DTTにおいて、４℃にて3.0時間透析し、次いで最後に25％グリセロール中の50mM NaPO₄(pH7.8)、0.3M NaCl、10mM DTTにおいて透析した。これにより、約7.4〜7.8のpHを有する溶液中に得られる、精製された、リフォールディングされた、可溶性で活性なHCV NS3プロテアーゼを生じた。これにより、収率約27％で活性プロテアーゼ(純度＞95％)を得た。リフォールディングされたタンパク質は、短縮型5A-5B基質を使用するインビトロ翻訳アッセイにおいて、NS4Aペプチド(33mer)の存在下で活性であることを見出した。３つの小規模なリフォールディング実験(1.0＆10.0および20mg)により、再現可能な収率(30％)で活性な可溶性プロテアーゼが得られた。本発明者らは、逆相カラムでの負荷実験を行い、リフォールディングされたタンパク質の回収率を改善した。2.5mg規模のリフォールディングにより、27％の回収率で活性なプロテアーゼを得た。１リットルの発酵物(fermentation)由来のHCVプロテアーゼのリフォールディングは、４〜５mgの活性なタンパク質を生じると推定された。本発明者らは、SPAアッセイにおいて、リフォールディングされたHCVプロテアーゼの活性に対するNS4Aペプチドの増強活性を研究した。この酵素の速度論は、 HPLCアッセイにおいて非標識ペプチドを用いて決定されている（表）。 NS3 631 の予備的な、界面活性剤に補助されるリフォールディング完全長HCVプロテアーゼNS3 631を、E.coli封入体ペレットから抽出し、Sephac ryl S-300クロマトグラフィーを使用して精製した。40ミリグラムの高度に精製されたNS3 631を、６リットルの発酵物から得た。このタンパク質は、還元条件下でSDS-PAGEにおいてダブレット(doublet)として移動した。２つの免疫反応性バンドのＮ末端配列決定により、タンパク質の大多数がブロックされたＮ末端を有することが示された。この不均一性の生化学的基礎は不明である。HisHIV183 について記載された改変された界面活性剤に補助されるリフォールディングスキームを用いて、少量の可溶性タンパク質を得た。0.5M塩酸アルギニンをリフォールディング緩衝液に含ませることによって、手順を改変した。リフォールディングされたタンパク質は、短縮型5A-5Bを基質として使用するインビトロ翻訳アッセイにおいて、NS4Aペプチドの存在下で活性を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．細菌により産生された不溶性のHCVプロテアーゼ凝集物から、可溶性でタンパク質分解性が活性な、リフォールディングされたHCVプロテアーゼを産生するためのプロセスであって： (a)HCV NS3プロテアーゼの不溶性凝集物を、該凝集物を産生する細菌から抽出する工程； (b)プロテアーゼの該凝集物を、変性試薬を含有する緩衝物中で可溶化する工程； (c)工程(b)からの可溶化プロテアーゼを、還元剤を含有する緩衝液中に配置する工程であって、該緩衝液が酸性pHを有する工程； (d)該緩衝液が酸性pHを維持する条件下で、該緩衝液中から該変性試薬を除去する工程；および (e)プロテアーゼを含有する緩衝液のpHを、段階的な様式で約７〜８のpHまで上昇させて、適切にリフォールディングした可溶性で活性なNS3プロテアーゼを産生する工程、を包含する、プロセス。２．前記変性試薬が、塩酸グアニジン（GuHCl）である、請求項１に記載のプロセス。３．前記GuHClの溶液が、約５Ｍの濃度でGuHClを含有する、請求項２に記載のプロセス。４．前記還元剤が、ジチオスレイトールまたはβ-メルカプトエタノールである、請求項１に記載のプロセス。５．前記還元剤を含有する前記緩衝液が、非イオン性界面活性剤も含有する、請求項１に記載のプロセス。６．前記非イオン性界面活性剤が、ラウリルマルトシド、ポリオキシエチレンエーテル、nonidet P-40、（3-[(3-コルアミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1- プロパンスルホネート）(CHAPS)のようなポリオキシエチレン9-ラウリルエーテル、およびオクチルグルコシドからなる群より選択される、請求項５に記載のプロセス。７．工程(c)の前記可溶化されたプロテアーゼが５Ｍ GuHCl溶液であり、そして前記プロテアーゼが該５Ｍ GuHCl溶液を、約10mM DTTおよび0.1％ラウリルマルトシドを含有する緩衝液で希釈することにより還元される、請求項６に記載のプロセス。８．前記変性試薬が、前記プロテアーゼ含有画分を、回収された画分が酸性pHを有する条件下で逆相クロマトグラフィーカラムにアプライすることにより、工程 (c)において除去される、請求項１に記載のプロセス。９．工程(c)の前記プロテアーゼ含有緩衝液を、前記逆相クロマトグラフィーカラムにアプライした後に、99.9％ H₂Oおよび0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を含有する溶液を該カラムに添加する、請求項８に記載のプロセス。１０．99.9％ H₂O＋0.1％ TFAの溶液を添加した後に、10％ H₂O＋90％アセトニトリル＋0.1％ TFAを含む溶液を、前記カラムに０〜60％グラジエントで99.9％ H₂O＋0.1％ TFAの溶液中に添加する工程および前記画分を回収する工程をさらに包含する、請求項８に記載のプロセス。１１．工程(c)の適切にリフォールディングしたタンパク質を含有する前記画分を、まず0.1％ TFAの水溶液中で透析して１未満のpHを有する溶液を得る工程、次いで該画分を、0.01％ TFAの水溶液中で透析して約２のpHを有する溶液を得る工程、および次いで該画分を、0.001％ TFA中で透析して約３のpHを有する溶液を得る工程、次いで該溶液を約６のpHを有する水溶液中で透析する工程、次いで該溶液を約７のpHを有する水溶液中で透析する工程、次いで該溶液を約7.8のpH を有する水溶液中で透析して、適切にリフォールディングした活性なHCV NS3プロテアーゼを含有する7.4〜7.8のpHを有する溶液を得る工程、をさらに包含する請求項１０に記載のプロセス。１２．工程(c)の前記プロテアーゼ含有緩衝液を、前記逆相クロマトグラフィーカラムにアプライした後、該カラムを０％〜60％のアセトニトリルグラジエントを用いて溶出する、請求項８に記載のプロセス。